gen terapisi

ZET

Anahtar Szckler:

ABSTRACT

Key words:

Gen tedavisi hastalklar tedavi etmek veya nlemek amacyla bir kiinin genlerinin

ekspresyonunun deitirilmesi olarak tanmlanabilir. Akademik ve ticari laboratuvarlarn

zorlu almalar ile 2006 yl verilerine gre 1273 gen tedavisi klinik deneme protokol

etik evrelerce onaylanmtr. Ancak henz sadece ba-boyun kanserleri iin gelitirilen

bir gen tedavisi rn rutin kullanm iin in'de lisans alabilmitir. Gen tedavisi

denemelerindeki baar s z l k lar teraptik genler in yeters iz l i inden

kaynaklanmamaktadr. Baarl gen tedavisinin nndeki en nemli engel toksik olmayan

gen aktarm sistemlerinin olmaydr. Gen tedavisinde viral ve viral olmayan eitli

vektr sistemleri kullanlmaktadr ve her biri kendine zg avantaj ve dezavantajlara

sahiptir. Gnmzde en etkili gen aktarm aralar, genlerini hedef hcreye aktarma

zellikleri nedeniyle, virslerdir. Gen tedavisi kaltsal tek gen hastalklar ve

kardiyovaskler hastalklar da iine alan bir dizi hastaln tedavisi amacyla

gelitirilmekteyse de zellikle kanser tedavisi daha ne kmaktadr. Gen tedavisinin

pratikte yaygn uygulama alan bulabilmesi tedavi genlerinin hcrelere yeterli dozlarda

aktarlabilmesine, genin hastalkl hcreleri hedefleyebilmesine ve aktarlan yeni

genlerin vcut tarafndan sk kontrol altnda tutulabilme yollarnn gelitirilmesine ve

dolaysyla da biyogvenlik problemlerinin almasna baldr. Bu derlemede gen

tedavisinde kullanlan vektr sistemleri anlatlacak ve biyogvenirlik asndan

deerlendirme kriterleri tartlacaktr.

Gen tedavisi, biyogvenlik, viral vektrler, non-viral vektrler

Gene therapy can be described as the approach to change gene expression of an

individual to treat a disease. According to the annual gene therapy records in 2006, hard

work of both academic and industrial laboratories resulted 1273 gene therapy clinical

protocols that have been approved by ethical commitees. In spite of all these attempts

there is only one licence so far and that has recently been given by China for the routine

use of head and neck cancer treatment. A major obstacle to the successful application of

gene therapy trials is not a insufficient amount of therapeutic genes, but the lack of

nontoxic gene delivery systems. A variety of viral and non-viral systems are used for gene

therapy and each system owns its specific advantages and disadvantages. In the current

status, the most effective gene delivery tools are viruses because of their natural ability to transfer genes to target

cells. Gene therapy is being developed for a range of diseases including inherited monogenic disorders and

cardiovascular diseases, but this approach has been most evident for cancer. In order that gene therapy can be used in

clinical practice, delivery of therapeutic genes to cells at efficient doses, gene-targetting to the disease cells and

tight-control of the delivered genes should be improved, by another means, biosafety problems needs to be solved. In

this review, vector systems used in gene therapy will be explained and evaluation criterias for their biosafety will be

discussed.

Gene therapy, biosafety, viral vectors, non-viral vectors

Krkkale niversitesi

Tp Fakltesi

Tbbi Biyoloji ve Genetik AbD

KIRIKKALE

letiim:

Ayen GNEL ZCAN

Krkkale niversitesi

Tp Fakltesi

Tbbi Biyoloji ve Genetik AbD

71100 KIRIKKALE

Tel: 0318 357 35 71/1019

E-posta: [email protected]

GEN TEDAVS VE BYOGVENLK

Ayen GNEL ZCAN

Gene Therapy and Biosafety

Derleme/Review

35Trk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi 2007; 64 (1): 35-50

Cilt 64 < Say 1 < 2007

GR

Germ hcre serisi gen tedavisinde Gen deiimi

Gen ifadesinin basklanmas

Somatik hcre serisi gen tedavisinde Spesifik hcrelerin ldrlmesi

GEN TEDAVSNDE KULLANILAN GEN

Gen ilavesinde AKTARIM ARALARI

Ex vivo gen tedavisinde,

yaklam sonu vermeyecektir. Kanser tedavisinde

Gen tedavisi hastalklar tedavi etmek veya tmre kar immn cevab artrmann veya kusurlu

nlemek amacyla bir ki inin genlerinin tmr basklayc genin ilevsel kopyasnn ilavesinin

ekspresyonunun deitirilmesine denir. Gen tedavisi amaland durumlarda da bu yntem uygundur.

deiiklie urayan hcrelerin tipine ve deiikliin Gen ilavesi, hipertansiyon kontrolnde damarlar

ekline gre snflandrlmaktadr (1). korumak (r. endotel nitrik oksid sentetaz gen

Gen tedavileri hcre tipine gre, germ aktarm) veya koroner arter hastalarnda vaskler

hcrelerine ve somatik hcrelerine yaplan tedaviler bymeyi uyarmak (r. VEGF gen aktarm) amacyla

olarak snflandrlabilir: da denenmektedir.

yaplan ise ok daha zor ve karmaktr.

deiiklik soylar boyu aktarlabilecek ekilde Ama, mutant geni fonksiyonel kopyas ile

kalcdr. Gamet, zigot veya erken dnem embriyoda deitirmek veya mutasyonu in situ dzeltmektir.

yaplan deiiklik ile mmkndr. ou lkede etik Mutant gen rnnn hcreye zarar verdii ilevin

olarak gelecek kuaklar etkileme yetisi nedeniyle geri kazanm sonucu dzelebilecek genetik

germ hcre serisi tedavisi yasaklanmtr. Ancak, hastalklarda tercih edilecek bir yntemdir.

mitokondriyal hastalklar iin ekirdek gen transferi zellikle

etik adan kabul edilebilir bulunmaktadr. enfeksiyon hastalklarnn tedavisinde kullanlan bir

Mitokondri DNA's sitoplazmada bulunduundan yaklamdr. Bu yntemde hedef patojenin

dolay in vitro fertilizasyonu takiben (drt hcre fonksiyonunun basklanmas amalanr. Ayrca bu

aamasnda) tm hcrelerin ekirdekleri izole edilir yaklam kanserde aktif hale gemi onkogenlerin

ve ekirdei karlm donrn yumurta hcrelerine sessizletirilmesinde, otoimmn hastalklarda ve

verilir. ekirdek transferi olan bu yntem aslnda belki fonksiyon kazanmna bal genetik

teknik anlamda klonlamadr. hastalklarda kullanlabilir.

ise ama yntemi ise

bir hastann belli hcreleri veya dokularnda ilgili zellikle kanser tedavisinde yer bulmaktadr. Bu

hastal dzeltecek ekilde genetik deiiklik amala toksik kemoteraptik ajan, toksik olmayan

yapmaktr. Somatik gen tedavisinde kiinin genomu n ila (prodrug) formunda vcuda verilirken, bu n

deiiklie uramakta ancak bu deiim gelecek ilac aktifleyen enzimi kodlayan gen de kanser

kuaklara aktarlmamaktadr. Gnmzdeki tm gen hcrelerine aktarlmaktadr. Bu yaklama gen

tedavisi denemeleri ve protokolleri somatik hcre gdml enzim prodrug tedavisi (gene directed

serisi tedavileri iindir. enzyme prodrug therapy-GDEPT) veya intihar gen

Somatik hcreler eitli yollarla deiiklie tedavisi denilmektedir. Uygulamada, aktif n ila

uratlabilir. Bu gen tedavisi yaklamlarn drt grup hedeflenmemi komu hcrelere de yayldndan

altnda toplayabiliriz: gen ilavesi, gen deiimi, gen gl bir ilave (bystander) etki oluturmaktadr.

ifadesinin (ekspresyonunun) inhibisyonu, zgn

hcrelerin ldrlmesi:

bozuk genin ilevsel kopyasnn

verilmesi amalanr. Hcrede mutant gen kalmakta Genlerin alc hcreye aktarlmas laboratuvar

ancak buna fonksiyonel gen ilave edilmektedir. ortamnda (ex vivo) veya hastann vcudunda (in

Fonksiyon kaybna yol aan genetik hastalklarn vivo) gerekletirilebilir:

dzeltilmesinde faydaldr. rnein kistik fibrozis gen hcreler hastadan

ilavesi iin uygun bir hastalktr. Ancak kalc alnr ve hcre kltr ortamnda oaltlarak

hasarlarn meydana gelmi olduu durumlarda bu klonlanan gen aktarlr. Gen aktarmnn


36 Trk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi

gerekletii hcreler seilerek hcre kltrnde in Aktarlacak gen, alc hcrenin kromozomuna

vitro olarak oaltlr ve hastaya verilir. Hastann girecek ya da epizom olarak kalacak ekilde

baklk sistemi tarafndan bu hcrelerin red tasarlanabilir. Uzun sreli gen ifadesinin

edilmemesi iin mmkn olduunca hastann kendi salanabilmesi iin yabanc genin alc hcrenin

hcreleri (otolog hcreler) tercih edilir. Ancak bu kromozomuna entegre olmas (zellikle kk

yntem, hastadan alnabilecek hcrelere hcrelerde) tercih edilebilir. Bylelikle hcre

(Hematopoetik sistem hcreleri, deri hcreleri vs.), dngsnde hcre blndke gen de oalacaktr.

hcrelerin engraft indklenebilmesi ve hastaya Ancak kromozoma entegrasyon baz sorunlar

tekrar verildikten sonra uzun sre yaayabilmesi ile tamaktadr. ou genin kromozoma entegrasyonu

snrldr. rasgele olmaktadr ve bu entegrasyon hastann

ise, alc hcrelerin in vitro deiik hcrelerinde farkl ekilde gerekleir.

kltrnn yetersiz olduu (r. beyin hcreleri) veya Entegre olan genin ekspresyonu kromozomdaki

kltr yaplan hcrelerin hastaya re-implantnn yerleimine bal olarak beklenmeyen etkiler ortaya

etkili bir ekilde yaplamad durumlarda tek kartabilecei gibi, gen ekspresyonunun tamamen

seenektir. Doku hedeflemesi bu yntemde nemli bir durmas da sz konusudur. Genin dk dzeyde

sorundur. Transfer edilen gen dorudan hedef dokuya eksprese edilebilmesi veya ksa sreli ifade edilip

veya genel dolama verilebilir ancak aktarm iin tamamen sessizlemesi de mmkndr. Daha da

kullanlan vektr sadece hedeflenen hcreler kts endojen genlerin ekspresyonunu

tarafndan alnacak ekilde veya sadece hedeflenen deitirebilir. En byk endie ise yksek dzeyde

hcrelerde gen ifadesi olacak ekilde tasarlanm ifade edilen bir genin kromozoma entegre olduu

olmaldr. Bu yntemde geni alm veya ifade eden blgedeki bir onkogeni uyarmasdr. iddetli

hcreleri oaltma ve seme imkan olmadndan in kombine immn yetmezlik (SCID; Severe Combined

vivo gen tedavisinin baars gen aktarm ve Immune Deficiency) iin tedavi edilen hastada

ifadesinin (ekspresyonunun) etkinliine baldr. teraptik geni tayan retroviral vektrn

In vivo gen tedavisi

Cilt 64 < Say 1 < 2007

1

1

2

2

3

3

4

4

5

56

6

7

7

8

8

9

9

10

10

11

11Adenovirus 26% (n=322)

Retrovirus 23% (n=293)

plak/Plazmid DNA 18% (n=230)

Lipofektin 9% (n=99)

Vaccinia virus 7% (n=88)

Poxvirus 6.8% (n=85)

Adeno-associated virus 3.7% (n=46)

Herpes simplex virus 3.4% (n=43)

RNA transfer 1.3% (n=16)

Dierleri 4% (n=31)

Bilinmeyenler 2.9% (n=36)

The Journal of Gene Medicine, 2007 John Wiley and Sons Ltd www.wiley.co.uk/genmed/clinical

ekil 1. Gen tedavisinde kullanlan vektrler ( www.wiley.co.uk/genmed/clinical )

A. GNEL-ZCAN

37Trk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi

6kromozoma entegrasyonu sonucunda 10 modifiye T srdrlebilmesidir. Eer hedef hcreler aktif

hcresinden birinde LMO2 onkogeni aktive olmu ve olarak blnyorsa hcre poplasyonu geniledike

lsemi gelimitir (2, 3). Tedavi sonras, hastalarn T epizomlar seyrelecektir. Dolays ile kalc bir tedavi

hcrelerinde 50 farkl insersiyon blgesi saptanm, imkanszlaacak ve tedavinin tekrarlanmasn

ancak bu klonlardan bir tanesi dierlerinden daha gerektirecektir. Baz durumlarda, rnein kanser

fazla oalarak T-hcre lsemisine yol amtr. Bu hcrelerinin ldrlmesi veya akut bir enfeksiyonun

olumsuz gelimeler, kromozoma rastgele entegre tedavisi amalandnda, bu yntem problem tekil

olan vektrleri gen tedavisi arac olarak kullanan etmez nk tedavi amal aktarlan genin uzun

klinik protokollerin reddine yol am ve tm dnyada sreli ifadesine gerek yoktur. Genin epizomal

retroviral transdksiyonu yaplm geni lenfosit ekspresyonu snrl olmas istenmeyen ve

havuzlarnn kullanm yasaklanmtr. Tm bu beklenmedik durumlarn ortaya kt durumlarda

nedenlerden dolay, 2006 yl verilerine gre onay ise avantaj salamaktadr.

alm 1273 gen tedavisi klinik deneme protokollerinin deal bir gen transferi yntemi henz mevcut

%23' retroviral kaynakl olmasna ramen, deildir. Herbirinin farkl avantaj ve dezavantajlar

ekstrakromozomal olarak kalan (epizomlar halinde) vardr (Tablo 1). nsan hcrelerine transdksiyon

vektrler gen tedavisinin ana arac olarak etkinliinin yksek olmas nedeni ile memeli

grlmektedir (ekil 1). Epizomal vektrlerin virsleri gen transferinde en ok kullanlan

dezavantaj gen tedavisinin snrl bir sre vektrlerdir. Onaylanm gen tedavisi klinik deneme

Cilt 64 < Say 1 < 2007

Aktarlan

gen

bykl

(kB)

5-7 +

+

-

-

-

-

-

+(?)

8-30

2-4

< 30

< 25

~ 8

> 20

> 20

6-7

10

6-7

10

11-12

10

6-9

10

8-10

10

Veri yok

Veri yok Deiken

Veri yok

Titre1

(cfu.ml )

Genoma

entegrayon

In vivo

transfeksiyon

etkinlii

Dezavantajlar AvantajlarVektr

RV

AV

Sadece blnen hcrelere

transfeksiyon

RCV*

Blnen hcrelere

kararl transfeksiyon

Blnen hcrelere

kararl transfeksiyon

Geni klonlama

kapasitesi

Geni klonlama

kapasitesi, sadece

kasda ekspresyon

sreklilii

Kararl transfeksiyon

Byk klonlama

blgesi, nron

zgnl

ok eitli hcreyi

etkin olarak enfekte

edebilme

Hem blnen hem

blnmeyen

hcrelere

transfeksiyon

Sadece blnen hcrelere

transfeksiyon

RCV*

mmnojenite

+ RCV

Geici ekspresyon

mmnojenite

+ RCV

iek asyla alanmam

immn yetmezlii olmayan

kiilerle snrl

Kk klonlama blgesi

AAV

HSV

HSV

Vaccinia

Lipozom

plak

DNA

Geici ekspresyon

Baz hcrelere toksisite

Geici ekspresyon

Tablo 1. Gen tedavisinde kullanlan vektrlerin karlatrmas

*RCV: replikasyon komponenti virs



protokollerinin %70'i viral vektrleri kullanmaktadr yeteneinden dolay bu olasl ortadan kaldrmak

(ekil 1) ve bu virslerin balcalar retrovirsler iin gen tedavisinde kullanlan retrovirsler genetik

(RV), adenovirsler (AV), adenoasosiye virsler (AAV), olarak deitirilmitir. Retrovirslerin normalde

herpessimpleks virs (HSV), ve vaccinia virs'dr. transkripsiyon nitesi vardr. Bunlar; gag, pol ve

Seilecek virs, hedef hcreye ve geici veya uzun env'dir. sis-etkili RNA eleman ise viral proteinlerin

sre l i gen ekspresyonu iht iyac na gre RNA'y paketleyebilmesi iin gerekli olan RNA

belirlenmektedir. Gelitirilen eitli vektr sistemleri tanma blgesidir. Vektrde gag, pol ve env genleri

aada zetlenmitir (4). karlmtr ve bu blgeye teraptik gen klonlanr.

Retroviral vektrlerin klonlama kapasitesi 8 kb'dir.

Teraptik geni tayan vektrn paketlenmesi gag,

pol ve env fonksiyonu olan ama btn retroviral

ounlukla Moloney fare lsemi virs (MoMLV) genomu iermeyen zel bir hcre ile salanr (ekil

kaynakl vektrlerdir(5). Retrovirsler RNA 2). Homolog rekombinasyon ile vektrn bu

virsleridir ve tadklar reverz transkriptaz hcrelerden viral proteinleri kodlayan genleri

sayesinde genomlarndan cDNA sentezleyebilirler. tekrar kazanmamas, yani replikasyon kompenenti

Retrovirsler, enfekte ettikleri hcrelerin virs (RCV) oluumunu nlemek iin, bu genlerin

sitoplazmalarna nkleoprotein kompleksi hcrede lokalizasyonu tek bir ekspresyon vektr

(preintegrasyon kompleksi) tarlar. Bu kompleks zerinde bulundurulmamaktadr. Her bir gen farkl

viral RNA genomunun reverz-transkripsiyonunu ve ekspresyon vektr zerinde bulunacak ekilde

oluan cDNA'nn konak hcrenin kromozomunda hcre tasarm yaplmaktadr. Bylelikle gen

herhangi bir yere rastgele girmesini salar. Konak tedavisinde kullanlan retroviral vektrn doal

kromozomuna ulaabilmesi iin retroviral cDNA v i r s f o rmuna dn me o l a s l o k

gereklidir ve eriim sadece hcre

blnmesi esnasnda ekirdek

m e m b r a n k a y b o l d u u n d a

gerekleebilir. Bu nedenle

retrovirsler sadece blnen

hcreleri enfekte edebilirler. Bu

durum retroviral vektrlerin

kullanmn snrlamaktadr. Ancak

sadece oalan hcrelere gen

aktarabilme potansiyeli olmas

kanser tedavisinde avantaj

yaratmaktadr. rnein beyin

t m r l e r i n d e k u l l a n m

(oalmayan normal beyin

hcreleri arasnda aktif olarak

oalan kanser hcrelerine

teraptik geni seici olarak

aktarabi leceinden dolay )

olduka gvenlidir.

Doal retrovirslerin hcreleri

t r a n f o r m a s y o n a u r a t m a

1.VRAL SSTEMLER:

a.Retroviral vektrler:

Cilt 64 < Say 1 < 2007

Tropatik gen

Retroviral Genom

Vektr Genom

Paketleme

hcreleri

gag pol env

3'5'

3'5'

Gag/Pol

proteinleri

Vektr genom

ekirdek

ekil 2. Retroviral vektrler ve paketleme hcre serileri

Resim, Strachan ve Read'den modifiye edilmitir (1).

Env proteinleri

A. GNEL-ZCAN


azaltlabilmektedir. Gag ve pol'un bir vektrde, denemelerinin ounluunda kullanlmlardr.

env'nin dier vektr zerinde bulunduu hcre Ancak, insersiyonal mutasyon riski nedeni ile

serilerinde (rekombinasyon olaslnn 1/10 000 aada anlatlan dier vektrlere ynelinmitir.

olduu gz nne alndnda) retroviral vektrn

-8

patojenite kazanma olasl 10 olacaktr. Retroviral Adenovirsler (Ad) insanlarda st solunum yolu

vektrlerin retildii paketleme hcrelerinin (virus enfeksiyonu yapan zarfsz ift iplikli DNA

producer cells-VPC) fare kaynakl olmas insanlarda virsleridir. imdiye kadar 51 farkl insan adenovirs

antikor oluumu ve kompleman aktivasyonuna bal serotipi bilinmektedir. Gen tedavisi vektrleri

olarak gen tedavisi etkinliinin dk olmasna yol genellikle Ad2 ve Ad5 virs kaynakldr. Ad virsler,

aabilmektedir (6). Bu nedenle insan hcresi kaynakl yksek nkleer transfer etkinlii, geni doku

paketleme hcre serileri gelitirilmeye ve klinik tropizmi ve dk patojenite zellikleri nedeniyle

deneme protokolleri oluturulmaya allmaktadr vektr gelitirilmesinde tercih sebebi olmulardr.

(7). Retroviral vektrlerin uzun u tekrarlar (5'-LTR) Adenovira l vektr ler yksek t i t re lerde

blgesindeki promotor blgeleri dokuya zg (retrovirallerden ok daha fazla)retilebilmektedir

promotorlar ile deitirilerek gen tedavisinde doku ve hem oalan hem de oalmayan hcrelere etkin

hedeflemesi de salanabilmektedir (8). gen transferi yapabilmektedirler. Lineer ift-sarmal

Retroviral vektrlerin hcrelere DNA aktarm DNA's hcre nkleusunda konak genomuna

etkinlii yksektir ve erken dnem gen tedavisi entegre olmadan epizomal kalmaktadr. Yukarda

anlat ld zere, bu zel l ik

biyogvenlik asndan avantaj, uzun

sreli ekspresyon salayamadndan

dezavan ta j o l u t u rmak tad r.

Retroviral vektrler de olduu gibi

a d e n o v i r a l v e k t r l e r i n d e

retilebilmesi iin yardmc hcrelere

ihtiya vardr. Adenoviral vektrlerin

genomu (26-45 kb; r. Ad5 35 kb'dr)

byk olduundan dolay balangta

farkl defektif gen blgeleri ieren

eitli vektrler retilebilmitir (9).

Birinci kuak vektrlerde DNA

sentezini ve ge viral ekspresyou

kodlayan E1 blgesi karlmtr.

kinci kuak vektrler de ise E1'e

i laveten E2 ve E4 blgeler i

karlmtr (ekil 3). Ancak bunlarn

adenov i ra l p rote in lere ba l

immnojenitesi yksek olduundan

dolay, daha sonra tm viral genlerin

karld ve replikasyon orijin

blgesinde olan ITR ('tersdnm u

tekrarlar-inverted terminal repeats-'

ve paketleme sinyalinin (Y) brakld

b.Adenoviral vektrler:

Cilt 64 < Say 1 < 2007

ekil 3. Adenoviral Vektrler

Adenoviral vektrlerin 1. kuanda E1(+/- E3)-delesyonlar, 2. kuanda E1(+/-

E3) ve E2/4 delesyonlar vardr.3.kuakta viral genomun kodlayan ksmnn byk

blm karlmtr. Onkolitik vektrler ise E1B geni dnda tm viral genomu

tamaktadr. Resim, Volpers ve Kochanek'in makalesinden modifiye edilmitir (9).

E1; Erken fonksiyonlar dzenler. Virs replikasyonu iin gerekli, E2; Replikasyonda rol

oynayan proteinler ve DNA polimeraz kodlar, E3; Patojenitede nemli: Enfekte olmu

hcrelerin yzeyine MHC I'in gelmesini engeller, enfekte hcrelerin lizisini nler, E4;

Gen ekspresyonunu dzenleyen genleri kodlar.

Nukleotidler

Ad5 Genomu

1. Kuak Vektrler

2. Kuak Vektrler

Onkolitik Vektrler

3. Kuak Vektrler

('Gutless')

10 000

E1A E1B

Transgen

Transgen

Transgen 1

Kodlamayan DNA blg

Transgen 2

E1

E1B

E2 E3 E4

E3

E2 A E4

20 000 30 000



' gutless ' veya yardmc-baml vektrler immn supresyon yaplmas yan sra tekrarlayan

gelitirilmitir (9). 'Gutless' vektrler 35 kb'lk uygulamalarda farkl serotip veya hayvan

teraptik DNA'y tayabilmektedir. Viral gen adenovirs kaynakl vektr alternatifleri zerinde

ekspresyonunun olmamas bu vektrlerin toksisitesini allmaktadr (13, 14).

ve immnojenitesinin ok azaltmtr. 'Gutless' Ad Belki de adenoviral vektrler gerek kullanm

vektrler karacier hcrelerinde transgen yerini yksek fakat geici transgen ekspresyonunun

ekspresyonunu bir yldan fazla salayabilmektedir. istendii durumlarda bulacaklardr (rnein kanser

Ancak, 'gutless' vektrlerin retilebilmesi iin viral hcrelerinin ldrlmesi iin). Bu amala, Ad

gen fonksiyonlarnn saland yardmc hcrelere virslerin onkolitik vektr olarak tasarlanan

ihtiya vardr. Dzenleyici ve yapsal viral formlarnda, virsn sadece replikasyon orijininde

proteinlerin hepsini gerektii zamanda ve miktarda modifikasyon vardr. Kondisyonel replikatif vektr

retebilen hcre serileri henz istenilen dzeyde olarak da isimlendiren bu vektrler herhangi bir

gelitirilebilmi deildir. Bu nedenle, 'gutless' transgen tamaz (ekil 3). Ad vektrlerin

vektrleri retmek halihazrda ok zordur. replikasyon blgeleri baz hcre dngs

Ad2 ve 5 serotipinin, birok hcrede bulunan dzenleyici proteinlerine balanmaktadr. rnein

Coxsackie ve adenovirs reseptrleri ile primer Ad-E1A replikasyon blgesi pRB'e balanr. E1A, S-

olarak hcreye tutunmas ve a integrinler ile de fazna girii uyarr ve viral enfeksiyon iin kritik olan v

hcreye girmesi geni doku tropizmi salamaktadr viral ve hcresel genleri trans-aktive eder. E1A

(10, 11). Dolays ile hedeflenmeyen dokularda da gen blgesi defektif virsler (dl922-947) pRB'e

ekspresyonuna yol aacandan sistemik kullanmlar balanamadndan E2F'i (hcreyi S fazna geiren

saknca oluturmaktadr. En byk problem ise yksek faktr) pRB'den kurtaramaz ve dolays ile virs

immnojeniteleridir. 1999 ylnda Faz I ornitin oalmas gerekleemez. Bu nedenle normal

transkarbamilaz (OTC) yetmezlii gen tedavisi hcrelerde Ad-E1A virsleri oalamaz, ancak pRB

13

denemesi esnasnda Jesse Gelsinger 6x10 ikinci yola anormallikleri olan tmrlerde oalarak

kuak rekombinant adenoviral partikln intra- tmr hcrelerini lizise uratmaktadr. Ad-E1B ise

hepatik enjeksiyon ile aldktan iki gn sonra kuvvetle p53'e balanarak virsn oald hcrelerin

muhtemel Ad vektrn tetikledii sitokin salnmn apoptozise gitmesini nler. E1B blm defektif

yol at yaygn intravaskler koaglasyon, akut adenoviral virsler (ONYX-015 veya dl1520) normal

pulmoner ve multiorgan yetmezlii nedeniyle hcrelerde p53 blokaj yapamayacandan

lmtr (12). Dier denemelerdeki hastalar daha az apoptozis ve byme tutuklanmas nedeniyle

ama belirgin bir inflamatuvar cevap gelitirmitir. oalamayacaktr, p53 mutasyonu ile giden kanser

Adenoviral vektrlerin dier bir dezavantaj ise ksa hcrelerinde ise virsler oalarak hcreleri lizise

sreli ekspresyon salayabilmeleridir. Birinci kuak uratacaktr. ONYX-015, ba-boyun kanserlerinde

rekombinant adenoviral vektrlerin kullanld kistik faz II klinik denemelerde kemoterapi ile birlikte

fibrozis gen tedavisi denemelerinde transgen kullanlmaktadr (15). Dier bir yaklam ise E1A ve

ekspresyonu ikinci hafta sonunda azalmaya balam, E1B gen ekspresyonunu tmr veya doku tipine zg

drdnc haftada ise kaybolmutur. Srekli promotorlarn kontrolunda salamaktr. Onkolitik

ekspresyon iin tekrarlayan uygulamalar adenovirsler ile elde edilen snrl klinik denemeler

gerekmektedir ve bu da immn cevab bu ajanlarn gvenli olduunu, ancak kombine

iddetlendirmektedir. Ad vektr partikllerine kar tedaviler ile yeterli klinik cevaplar alnabildiini

tipe zg ntralizan antikorlarn gelimesi vektrn ortaya koymutur. Bu nedenle, intihar (GDEPT) gen

tekrarlayan uygulamalarn snrlayabilmektedir. Bu veya immn-modulatr gen eksprese eden

sorunu zmek iin gen transferi esnasnda geici rekombinant onkolitik vektrler gelitirilmeye

Cilt 64 < Say 1 < 2007A. GNEL-ZCAN


allmaktadr (16). uygulanmas nedeniyle karacier hasar ve vektre

kar immn cevap gelitirme potansiyeli

Adeno-assosiye virsler (AAV) zarfsz, tek-iplikli tamaktadr. AAV vektrler iin dier bir sorun da,

DNA virsleridir. Parvovirs ailesine ait olan AAV'lerin ok kiide ntralizan antikorlarn bulunmasdr.

replikasyonlar iin adeno- veya herpes virslerin Deiik serotiplerin kullanlmas bu sorun iin bir

yardmna ihtiyalar vardr. ou AAV-kaynakl zm olabilir (16).

vektrlerde AAV serotip 2 kullanlmtr. AAV-2'nn

primer reseptrleri heparin slfat proteoglikanlar, HSV vektrleri santral sinir sistemi iin tropizm

yardmc reseptrleri ise fibroblast byme faktr 1 gsterir. 152 kb'lk ift-iplikli DNA genomu ve en az

reseptr ve a b integrinler'dir ve yaygn doku 80 gen iermesi ile kompleks bir virstr. v 5

tropizmleri vardr. Retina ve havayolu epitel hcreleri Kromozoma entegre olmaz ancak duyusal

tropizmi olan AAV-5, iskelet kaslarna gen aktarm ganglionlarda yaam boyu sren latent enfeksiyon

ok etkin olan AAV-6, karacier tropizmi gsteren oluturabilirler. Latent kalma mekanizmas ile

AAV-8 serotipleri sras ile kistik fibroz, kas distrofileri transgenin uzun sreli ekspresyonunu salayabilme

ve hemofili gen tedavileri iin gelitirilmektedir (16). potansiyeli mevcuttur. Parkinson hastal ve santral

Patojenik olmayan modifiye edilmemi AAV 2, insan sinir sitemi tmrleri gibi durumlarda nronlara gen

hcrelerinde 19. kromozomun q13.3-qter blgesinde transferi ana uygulama alan olabilecektir ancak

zgn bir blgeye entegre olarak latent enfeksiyona pratikte kullanm iin henz erken dnemde olan

yol aar. Bu zellii sayesinde, risk oluturmadan vektrlerdir (18). Gen tama kapasitesinin en az 30

uzun sreli transgen ekspresyonu yapabilmektedir. kb olmas en nemli avantajdr. Ayrca sistemik

Ancak, spesifik entegrasyonu salayan virsn rep toksisite kt taktirde asiklovir gibi antiherpetik

proteinidir ve rep geni gen tedavisi vektrlerinden ilalar ile viral replikasyonun durdurulma

karlmtr. AAV vektrlerinde rep geni yan sra cap avantajna sahiptir. Ancak latent duruma geince

geni de olmak zere AAV genomunun %96's HSV'nin, vektre taklan teraptik gen dahil tm

karlmtr. Vektrde virsten sadece ulardaki ters genlerin ekspresyonunu susturmas dezavantaj

dnm tekrarlar kalmtr. Dier sistemlerde oluturmaktadr. Latent dnemde sadece HSV'nin

olduu gibi virs partikllerinin retilmesi iin gerekli LAT blgesi aktif kalmaktadr. LAT blgesi LATP1 ve

genler (rep ve cap AAV genleri, E2a, E4 adenoviral LATP2 promotorlarnn kontrol altndadr ve latent

genleri dahil) paketleme hcreleri (HEK 293) srele ilikili transkriptleri oluturmaktadr.

tarafndan salanmaktadr. Paketleme hcrelerinde Teraptik genin LAT blgesine klonlanmas belki de

eksik olan ise AAV'nin ters dnm u tekrarlardr. bu problemi zebilecektir (19). HSV I genleri de

Rekombinant vektr hi viral gen iermediinden m o d i f i y e e d i l e r e k o n k o l i t i k z e l l i k

yksek dzeyde gvenlik salar. Ancak, AAV genomu kazandrlabilmektedir. Onkolitik HSV I vektrleri

ok kk olduundan sadece 4.5 kb uzunluunda ve klinik denemeleri ile ilgili daha ayrntl bilgi

DNA tayabilir. Nispeten ksa DNA dizileri Young ve ark. tarafndan yaynlanan derlemede

tayabilmesi ve yksek titrelerde retilememesi bu bulunabilir (16).

vektrn de kullanm alann snrlamaktadr (17).

AAV vektrler ile kistik fibrozis faz I klinik iek hastalnn eradikasyonundan nce a

denemelerinde cesaret verici sonular alnm ve suu olarak kullanlan Poxvirs kaynakl Vaccinia

hcresel immn cevabn gzlenmemi olmas AAV virs gnmzde gen tedavisi arac olarak tekrar

vektrlerin gen tedavisinde etkili bir sistem gndeme gelmitir. 200 kb byklnde genoma

olabilecei konusunda umut olmutur. Ancak sahip Vaccinia virsnn klonlama kapasitesi

Hemofili B deneme protokol intrahepatik artere yksektir (25 kb) ve konak genomuna entegre

c. Adeno-asosiye viral vektrler:

d.Herpes simplex virs (HSV) vektrleri:

e.Poxvirus/Vaccinia virs vektrleri:

Cilt 64 < Say 1 < 2007 GEN TEDAVS VE BYOGVENLK


Cilt 64 < Say 1 < 2007

olmaz. ou memeli hcresini enfekte edebilir. Ancak blnmeyen hcrelere transdksiyon kabiliyetinin

tm virs genlerini bnyesinde bulundurmas ve korunmas iin ok aba harcanmtr. Gvenlii

replikasyon zellii olmas nedeniyle immn cevap artrmak amacyla kendini inaktive eden vektrler

gibi yan etkiler oluturabilir. Tmr hcreleri sz gelitirilmeye allmaktadr (23). Rekombinasyon

konusu olduunda ba k yant avantaj komponenti virslerin oluma potansiyeli nedeniyle

olabilmektedir. Vaccinia i le melanomada domestik kedilerde HIV benzeri tabloya yol aan FIV

immnoterapinin Faz III klinik deneme verileri (feline immunedeficiency virs) ve atlarda anemiye

aklanmtr (20). yol aan bir lentivirs olan EIAV (equine infectious

anemia virus) virs tabanl vektr sistemleri

Klinik deneme protokolleri oluturulmu gelitirilmeye allmaktadr. Lentiviral vektrleri

yukardaki vektrlere ilaveten laboratuvarlarda kullanan snrl sayda klinik deneme protokol

birok farkl virs grubundan da vektr gelitirilmeye onaylanm bulunmaktadr.

allmaktadr. Bunlarn balcalar ise Alfavirs ve

Lentiviral vektrlerdir. Alfavirsler, Togaviridae

ailesinin bir yesidir ve tek-iplikli RNA virsdr. Virs haricindeki vektr sistemlerinin retimi

Vektr olarak benzer zelliklere sahip deiik virs kolay ve greceli olarak ucuzdur, paketleme

kullanlmaktadr. Bunlar: Semliki forest virs (SFV), kapasiteleri byktr ve hereyden nemlisi

Sindbis virs (SIN), ve Venezuelan equine encephalitis biyogvenirlilii yksektir. Laboratuvarda yabanc

virs (VEE)'dir. Gen aktarm arac olarak kullanlan DNA'y hcre iine aktarma grece olarak kolaydr ve

ou alfavirs vektr replikasyon yapamaz ve viral sistemlerin gvenlik problemlerinin kontrol

replikasyonu iin gerekli genler yardmc hcrelerden altna alnamad durumlarda bu yntemlerin

salanr. Ancak intratmral gen aktarmnda bazlarnn gen tedavisinde kullanlma potansiyeli

kullanlmak iin replikasyon zellii olan vektrler de vardr. Ancak gnmzde tm bu yntemlerin,

yaplmtr. Bu vektrler doal alfavirsn tm dk gen transfer etkinlii ve ksa sreli ekspresyon

genlerini tamaktadr. Alfavirslerin hcre toksitesi oluturabilme problemleri vardr.

yksek ve hcre tropizmi geni olduundan birok

tmrn gen tedavisi iin uygundur. Rekombinant Lipozomlar, memeli hcrelerinin membran

alfavirslerin intratmral enjeksiyonu tmr yaps model alnarak yapay olarak belli lipidlerin

hcrelerinde apoptozisi tetiklemektedir (21). sv ortamda kartrlmas ile oluturulan sentetik

Lentiviral virsler ise blnmeyen hcreleri de aralardr. Lipozomlar, virozomlar, katyonik lipidler,

enfekte edebilen zellemi diploid retrovirslerdir lipopolilizinler, polikatyon konjugatlar gibi eitli

(22). mmn sistemi tetiklememeleri ve yksek formlar vardr. rnein fosfolipidler, biyolojik

dzeyde gen ekspresyonu salamalar dier nemli membranlarn yapsn taklit eden ift tabakal ara

avantajlardr. ou lentiviral vektrlerin kayna oluturur. Fosfolipidlerin oluturduu arata

insan HIV (human immunedeficiency virs) virsdr. hidrofilik fosfat gruplar d tarafta, hidrofobik lipid

Dier retrovirsler gibi genoma rastgele entegre kuyruklar i tarafta bulunur. Aktarlacak DNA in

olmas nedeniyle benzer gvenlik sorunlar vitro lipozom ile paketlenir ve in vivo hedef dokuya

tamaktadr. HIV genomu standard retrovirslerin dorudan gen transferi iin kullanlr. Lipozom-DNA

genomundan ok daha karmaktr. Standard kompleksi lipopleks, polimer-DNA kompleksi ise

retrovirslerde bulunan transkripsiyon nitelerine polipleks olarak adlandrlr. Katyonik lipozomlarn

ilaveten tat ve rev genleri vardr. Gereksiz genlerin pozitif yzey yk olduundan DNA ile doal olarak

karlmas, gvenli paketleme hcre serilerinin kompleks oluturur. Ancak anyonik ve ntral

oluturulmas ve bunlar yaparken vektrn lipozomlarn DNA ile kompleks oluturabilmesi iin

f. Dier:

2. VRS HARC VEKTR SSTEMLER :

a.Lipozomlar:

A. GNEL-ZCAN


Cilt 64 < Say 1 < 2007

DNA'nn baka aralarn iine konulmas gerekir. partikl bonbardman (biyolistik veya 'gene gun')

DNA'nn lipid klf ile sarlmas DNA'nn in vivo ortamda tekniidir. Metal (altn) paracklarnn zerine

paralanmasn nler ve hcre iine endositoz ile kaplanan DNA zel bir tabancadan hcreye yksek

alnmasn salar. Katyonik lipozomlarn gen aktarm basn ve hz altnda (sktrlm helyum yardm

etkinlii daha iyi olduundan (negatif ykl ile) atelenir. Bu basit ve nispeten gvenli yntemle

membranlara kolaylkla penetre olur) ve hcre iinde baz dokulara baarl gen aktarm yaplmtr.

aktarlan DNA'y ykmdan etkin bir ekilde Ancak bu enjeksiyon yntemiyle de gen aktarm

koruyabildiinden, gen aktarm deneylerinde en fazla etkinlii dktr ve enjekte edilen DNA hcre

tercih edilen formdur (24). Viral vektrlerden farkl genomuna karar l b i r ek i lde entegre

olarak DNA-lipid kompleksini hazrlamak kolaydr ve olamamaktadr. Kas gibi dzenli olarak oalmayan

aktarlan genin bykln snrlayan bir durum dokularda DNA dayank l ok neml i

yoktur. Ancak, gen aktarm etkinlii viral olmayabileceinden ve aylarca enjekte edildii

vektrlerden 10 000 kez dktr ve aktarlan DNA kasda ekspresyonuna devam edebileceinden

kromozomal DNA iine entegre olacak ekilde dolay, bu yntemin ilk uygulamalar 'Duchenne

tasarlanmamtr. zellikle oalan hcrelerde gen muscular dystrophy' fare modelinde (mdx fareleri)

younluunun dmesi nemli bir problemdir ve distrofin geninin aktarm eklinde olmutur (26).

transgen ekspresyonunun ksa sreli olmasna yol Distrofin geninin bykl nedeni ile bir minigen

amaktadr. kullanlmtr. Minigen, distrofin cDNA ve buna takl

yksek dzeyde ekspresyonu gvence altna alan

plak DNA, baz durumlarda hedef dokuya, dzenleyici bir dizi (rnein kuvvetli bir viral

rnein kasa, enjeksiyon ile dorudan uygulanabilir. promotor) iermitir ve kasa dorudan

Direkt uygulamada dier bir seenek ise intramskler enjeksiyon ile uygulanmtr.

elektroporasyondur. Bu metod, ksa elektrik uyarlar

v e r e r e k t r a n s m e m b r a n p o t a n s i y e l i n i n Bu yntemde aktarlacak DNA, zgn hcre

indklenmesine ve hcre zarnda kk aralklar yzey reseptrne balanabilen ve dolays ile

almasn salar. Oluan bu aralklardan DNA hcreye endositozu indkleyip DNA'nn hcre iine

daha kolay girer. Her doku zgn ve kendine has alnmasn salayabilecek hedefleyici bir molekle

zellikleri olduundan dolay etkin bir transfeksiyon t ak l r. rne i n ; hepa to s i t l e r s e rumu

iin optimal elektroporasyon koullar yoktur. asialoglikoproteinlerden yzeylerindeki reseptrler

Transfeksiyon etkinlii hem elektrik akmnn sayesinde temizleyebilirler. Polilizine (pozitif ykl)

amplitd ve sresine hem de DNA younluuna kovalan bala bal asialoglikoproteinler DNA'ya

baldr. n vitro koullarda birka kilovoltluk voltaj (negatif ykl) elektrostatik etkileimler ile

ve birka mikrosaniyelik akm sresi optimal dnebilir nitelikte balanr. Eer bu kompleksin

olabilirken, in vivo koullarda onlar hatta yzlerce karaciere infzyonu safra yolu veya vaskler olarak

kilovolt ve milisaniyelik akm gereklidir (25). gerekletirilirse hepatositler tarafndan seici

Elektroporasyonun in vivo uygulamas hedef dokuya alnr. Daha genel bir yaklam ise, bir ok hcrede

in situ elektrodlar taklarak uygulanmaktadr. Kas, eksprese edilen ancak prolifere olan hcrelerde ve

beyin, deri, karacier ve tmr dokularna hematopoetik hcrelerde daha fazla olan

elektroporasyonla baarl gen aktarmlar transferrin reseptrn kullanmaktr.

yaplmtr. Bu ekilde alnan maddeler genelde lizozoma

ynlendirilir ve DNA'nn hcre ekirdeine

ulaabilmesi iin baz ka mekanizmalar olmas

Elektroporasyona benzer dier bir yntem gerekir. zellikle tad DNA'y sitoplazmaya

b. Elektroporasyon:

d. Reseptr aracl endositoz:

c. Dorudan enjeksiyon veya partikl

bonbardman:



Cilt 64 < Say 1 < 2007

brakamayan baz polipleksler endozom-litik ajanlar tmr bymesini basklamtr (29). Fakltatif

ile birlikte kullanlmaldr. Bir seenek adenovirs anaerobik olan Salmonella'nn ise onkolitik

veya adenovirs proteinlerini birlikte vermektir. Bu potansiyeli hipoksik merkezli byk tmrlerin

erken endozomu ykar ve ieriinin kamasn salar yansra oksijenlenen kk metastatik lezyonlarda

(17). Gen transfer etkinlii yksektir ancak bu metod da vardr. mmnomodulatr sitokin (TGF-1, IL-10)

transfer edilen genin hcrenin genomuna genlerini tayan invaziv E. coli ve Lactococcus lactis

entegrasyonuna izin vermez. sular ise enflamatuar barsak hastalklarnda

denenmektedir.

Bakteri aracl DNA aktarm son yllarda allan Bu yntemin aktarm etkinlii yksek olmasna

yeni bir gen aktarm yaklamdr. Saklama ve retme r a m e n b i z i m ( h e n z y a y n l a n m a m

koullarnn kolayl, tayabilecekleri ve bulgularmzda) ve dier birok alma grubunun

aktarabilecekleri DNA miktarnn byk olmas, gzlemledii nemli bir problem, plazmid

hcreden hcreye yaylabilme zellii ile non-replike kararszl ve bunun sonucunda plazmidin hcrede

vektrlerin ulaamayaca yerlere gidebilmesi kaybolmas ve kararsz ekspresyon gstermesidir

nedeniyle gerek in vitro gerekse in vivo transgen (30). Bu problemlerin en nemli sebeplerinden birisi

uygulamalar iin umut vermektedir. Bakteri aracl yksek kopya sayl plazmidler kullanlmasdr.

gen transferinde aktarlacak gen ncelikle karyotik Rekombinant proteinlerin retiminde tercih edilen

ekspresyon vektrne taklr. Bakteriyel sistemler yksek kopya sayl plazmidler yksek gen dozajna

enfeksiyon hastalklarnda heterolog antijen bal yksek ekspresyon dzeyi salamaktadr.

tayarak alama iin kullanlabildii gibi onkolojide Ancak baz durumlarda kopya saysnn artmas gen

immnotedavi, onkolitik ve tmr hedefleme yetisi rnn artn salayamaz. Bu muhtemelen

vardr. Bu amala kullanlan bakteriler arasnda hcrenin snrl transkripsiyon ve translasyon

zayflatlm S. typhimurium sular bata olmak kapasitesinden dolaydr. Plazmid replikasyonu ve

zere L. monocytogenes, Shigella, Clostridium, rekombinant gen ekspresyonundan kaynaklanan

Bifidobacterium ve invaziv E. coli saylabilir (27). metabolik yk byme hzn yavalatarak rn

Bifidobacteria ve Clostridia zorunlu anaerobik oluumunu dmesine yol aabilir. Protein

bakteri olmalarndan dolay nekrotik/hipoksik ekspresyonu sadece plazmid kopya saysna deil,

merkezli byk tmrlerin lizisini salayabilmekte ayn zamanda promotor gcne, mRNA kararllna,

ancak kk metastatik lezyonlarda etkisiz proteolize, ve protein katlanmasna da baldr.

kalmaktadrlar. 1960'l yllarda insan klinik Tm bu faktrler plazmid kararl l n

denemelerinde kullanlan toksin oluturmayan etkilemektedir. eitli aratrma merkezleri daha

Clostridia sporlar tmr kitleleri iinde abse kararl dk kopya sayl plazmidler gelitirmeye

oluturmasna ramen tmr gerilemesini alrken dier yandan da aktarlan plazmidin hcre

sa layamam t r ( 28 ) . K l i n i k e tk in l i i n iindeki kaderini belirleyen olaylar aydnlatmaya

saptanamamasndan dolay klinik denemelere devam almaktadr (30, 31). Regulasyon veya replikasyon

edilmemitir. Son zamanlarda Clostridium'un tmr proteinlerini kodlayan yapsal genlerdeki delesyon,

hedefleme zellii pro-drug aktive eden enzimlerin insersiyon veya nokta mutasyonlar kopya saysn

selektif aktarm iin denenmeye balamtr ve deitirebilir. Plazmid zerindeki ters dnm

baarl sonular elde edilmitir. Clostridia'nin daha tekrarlar veya zgn ikincil yaplar DNA onarm

gvenli alternatifi nonpatojen ve spor oluturmayan sistemlerinin hedefi haline gelmekte, UV onarm

Bifidobacteria'dr. Endostatin genini kodlayan sistemi ve SOS sistemi tarafndan plazmid DNA'sn

plazmidi tayan Bifidobacterium adolescentis paralara ayrabilmektedir. lgili DNA onarm

deneysel karacier tmrlerinde anjiogenezi ve genlerini tamayan retim sular plazmid

e. Bakteri aracl gen transferi:

A. GNEL-ZCAN


Cilt 64 < Say 1 < 2007

kararlln artrmaktadr. (33). Segregasyon sonras plazmidsiz hcrelerin

Tropatik geni tamak zere kullanlan eleyen dier bir sistem ise Hok/sok stabilizasyon

plazmidlerin hcre blnmesi esnasnda dalm eit sistemidir (34). Hok gen rn ldrcdr. Hok

olmamakta ve baz hcreler birden fazla plazmid geni bakteri kromozomu zerinde zayf konstitf

ierirken bazlar ise hi plazmid iermemekte, promotor altndadr fakat mRNA's kararldr. Katil

dolays ile bir sre sonra ortama rekombinant Hok genini basklayan Sok geni ise plazmid zerine

plazmidi iermeyen hcreler hakim olmaktadr. Bu takldr. Sok geni Hok mRNA'sna komplementer

nedenle bakteri aracl gen tedavisinde plazmid 'antisense' RNA kodlar ve plazmid zerinde gl

kararll iin selektif ortamlar kullanlmaktadr. konstitf promotor altndadr fakat mRNA's

Rekombinant protein retiminde en yaygn kullanlan kararszdr. Dolays ile hcre blnmesi sonras

selektif sistemler antibiyotiklerdir. Ancak, bakteri plazmid iermeyen bakteriler kontrolsz kalan Hok

aracl gen tedavisinde kullanlan plazmidler protein rn nedeniyle eleneceklerdir.

antibiyotik geni tamamaldr nk direnlilik Daha kararl plazmid sistemlerinin geliitilmesi

genleri horizantal gen transferi ile patojenik retilme ve kontol kolayl olan bakteri aracl gen

mikroorganizmalara aktarlabilir. Ayrca allerjik transferinin daha etkin bir hale getirilmesini

problemler ortaya kabilmektedir. Amerikan Besin salayabilecektir.

ve la Ynetimi FDA tarafndan onaylanan tek

antibiyotik ise insanlarda az kullanlmalar nedeni ile

kanamisindir (www.cfsan.fda.gov/~dms/opa- Her vektr sisteminin kendine zg avantaj ve

armg.html). Plazmidlere diren geni eklemeden ama dezavantajlar bulunduundan vektrlerin kombine

yine antibiyotikli ortamda kararll salanabilen bir olarak kullanlmalar dezavantajlarn aabilmenin

yntem Williams ve arkadalarnn gelitirdii bir yolu olabilir. eitli hibrid vektrler bilinmekte

represr titrasyon metodudur (32). Bu yntemde olup bunlarn balcalar virozomlardr (17, 24).

direnlilik geni plazmidi tayan suun kromozomuna Virozomlarn baz formlar, Lipopleks (DNA-lipozom

rnein lac promotorunun aasna entegre edilir. kompleksi) ve inaktive HVJ virs (Japon

Lac represr geni de kromozoma lokalizedir. Normal hemaglutinasyon virs) veya influenza virs

koullarda direnlilik geni ekspresyonu represr kombinasyonu ile oluturulmulardr. Solunum

protein nedeniyle basklanm durumdadr ve yoluna gen transferi potansiyeli yalnz bana

kanamisinli ortamda remez. Bir veya birden fazla lac katyonik lipozomlar veya viral vektrleri uygulayan

promotor tayan yksek kopya sayl plazmid hcreye yntemlere gre daha yksektir. mmnolojik olarak

aktarlnca represr yetersiz kalacandan hcreler iyi tolere edildiklerinden tekrarlayan uygulamalarn

kanamisinli ortamda reyebilir. Bunun yansra transfer etkinlii ve gvenlii zerinde olumsuz

antibiyotiksiz seleksiyon sistemleri gelitirilmeye etkisi yoktur. Katyonik lipozomlar veya polimerler

allmaktadr. Bunlardan pCOR sistemi klinik basite adenoviral vektrler ile kartrlp

denemelere girmitir. pCOR plazmidi supresr tRNA uygulanr. Bu yntem zellikle viral reseptr

geni tamaktadr ve bunun protein rn antibiyotik olmayan hcrelere gen aktarmnda faydaldr.

yerine seleksiyonda kullanlmaktadr. oaltld Ayrca, inaktif adenovirsler katyonik lipozomlarn

E.coli hcresinde ise argE geninde amber mutasyon veya polimerlerin transfer etkinliini artrmaktadr.

vardr. Yani arginin iin 'auxotrophic'tir. argE arginin Virs-virs kombinasyonlar dier bir hibrid

sentezinde nemli olan N-asetil ornitinaz kodlar. sistemdir. Bylelikle, her bir viral vektrn

Supresor tRNA ise amber mutant blgeyi okuyup avantajlarndan faydalanlr. rnein adenovirs ile

protein sentezinin devamn salayabilir. Bylelikle Epstein-Barr virsnn (EBV) hibridleri yksek

ancak plazmidi tayan hcreler oalabilmektedir titrelerde elde edilebilir (adenovirs sayesinde) ve

3. HBRD VEKTR SSTEMLER:



Cilt 64 < Say 1 < 2007

hcrede epizom olarak uzun sreli kalabilir (EBV'in enzimlerin fazla ekspresyonu, veya byme

EBNA1 geni vektrn nkleusa transferini gvence faktrleri veya byme faktr reseptrlerinin uzun

altna alarak gen dilsyonunu nler). sreli ekspresyonu sonucu ortaya kabilmektedir.

Dolays ile aktarlan genin yeri, dalm ve

i s t e n m e y e n e k s p r e s y o n d z e y l e r i d e

deerlendirmeye alnmaktadr. Genin ex vivo

Gen tedavisinin pratikte yaygn uygulama alan transdksiyonu yaplarak, genetik modifikasyona

bulabilmesi tedavi genlerinin hcrelere yeterli uram teraptik hcrelerde meydana gelen

yksek dozlarda aktarlabilmesine, genin hastalkl deiiklikler (morfoloji, fonksiyon ve proliferasyon,

hcreleri hedefleyebilmesine ve aktarlan yeni lmszlk gibi davranlar veya malign-transforme

genlerin vcut tarafndan sk kontrol altnda fenotip indksiyonu) incelenmelidir. Ayrca

tutabilme yollarnn gelitirilmesine ve dolays ile transdksiyon, hcrelerin in vivo trafiini ve

biyogvenlik problemlerinin almasna baldr. dalmn etkileyebileceinden hayvan deneyleri

Dier biyoteknoloji rnlerinde olduu gibi preklinik ile teraptik hcrelerin etkinlii saptanmaldr.

hayvan modellerini kullanarak gvenli l ik Gen tedavisi vektrlerinin gvenirliliinin

deerlendirmesinde iki nokta gz nnde deerlendirilmesi iin 1999 ylnda Amerikan Ulusal

bulundurulur: 1) hayvan trnn ve fizyolojik/hasta Salk Enstits, NIH, tarafndan detayl bir yol

durumun seimi ve; 2) doz, uygulama yolu ve tedavi haritas izilmitir. Buna gre gen tedavisi

rejimini (skl ve sresi) kapsayacak ekilde aktarm vektrlerinin gvenirlilii, aktarm sistemi, gen

yolunun deerlendirilmesi. Biyogvenlilik iin transferi ve ekspresyonu, retrovirs aktarm

deerlendirme teraptik genin retiminden verili sistemleri, retrovirs harici aktarm/ekspresyon

sonrasna kadar (aktarlacak genin gvenirlilii, sistemleri olmak zere drt ana snfta

vektrn gvenirlilii, patojenite, etrafa yaylma, incelenmektedir (35):

genom iine girme, konakdaki viral gen dizileri ile

rekombinasyon, paketleme hcre serilerinin

gvenirlilii, yardmc hcre kontaminasyonu, ex- Rekombinant DNA'nn hedeflendii hcreler

vivo oaltlan alc hcrelerin gvenirlilii ve nedir? Hangi hedef hcreler ex vivo olarak ilem

aktarlan DNA'nn gen ekspresyonunun dzenlenmesi grecektir ve bu hcrelerin ilemden nce ve sonra

olmak zere) birok aamada yap lmas karakterizasyonlar nasl yaplacaktr?

gerekmektedir. Gen rnnde deiiklie yol aan Aktarm sistemi etkin midir? Hcrelerin yzde

genetik dizi modifikasyonlarnn yaplmas, veya ka aktarlan DNA'lar iermektedir?

alternatif promotor/enhancer dizilerinin kullanlm Aktarlan DNA dizisinin yaps nasl monitorize

olmas hayvan almalarnda ilave gvenlilik edilecektir ve analizin duyarll nedir?

deerlendirmelerini gerektirebilir. Bu tip yaklamlar Aktarlan DNA ekstrakromozomal mdr yoksa

iin bilimsel gereklilik ortaya konmak zorundadr. kromozoma entegre olacak mdr? Aktarlan DNA

Teraptik gen rnnn immnomodulatr aktivitesi tekrar dzenlenmi midir?

varsa baklk sisteminin ar uyarmna bal Hcre bana aktarlan DNA kopya says

geliebilecek otoimmnite potansiyeli de gz nnde nedir? Eklenen DNA'nn hcrede gerek kalmll ve

bulundurularak gvenirlilii deerlendirilmelidir. gerekse yaps kararl mdr?

stenmeyen yan etkiler eksprese olan teraptik genin

istenmeyen blgelerde ve/veya istenmeyen

miktarlarda, rnein, reseptr/iyon kanallarnn Laboratuvar almalarnda gen transfer

normalde eksprese olmayan yerlerde ekspresyonu, sisteminin in vivo ve in vitro etkinliini belirlemek

G E N T E D AV S V E K T R L E R N N

GVENRLL

1. AKTARIM SSTEMLER:

a.

b.

c.

d.

e.

2. GEN TRANSFER VE EKSPRESYONU

a.

A. GNEL-ZCAN


Cilt 64 < Say 1 < 2007

iin hangi hayvan ve hcre kltr modelleri test etmek iin hangi laboratuvar almalar

kullanlmtr? Bu sistemlerin insan tedavisi ile ne gibi yaplmtr ve analizlerin duyarll nedir?

benzerlik ve farkllklar bulunmaktadr? Hayvan almalarnda vektr DNA'nn tedavi

nsanda baarl olabilmesi iin ilgili gen edilmeyen hcrelere, zellikle germ hcre serisine

transfer protokolnde tahmin edilen gen transfer girii ile ilgili bir bulgu mevcut mu? Bu amala

ve/veya ekspresyonunun minimal dzeyi nedir? Bu yaplan analizlerin duyarll nedir?

dzey nasl saptanmtr? Klinik deneme iin nerilen protokoln insan

Gen transfer ve ekspresyonunun minimum d primatlar ve/veya dier hayvanlarda yaplm

gerekli dzeyini elde edebilmek iin kullanlan benzerleri mevcut mu? Sonular nelerdir? zellikle

aktarm sisteminin etkinliini deerlendiren hayvan retroviral vektrn herhangi bir endojen veya dier

ve hcre kltr model deneylerine ait tm sonular viral DNA dizileri rekombine olduuna dair hayvan

detayl aklanm mdr? deneylerinde bulgu var m?

Ekspresyonun ne kadar sadece istenen

gendendir (ve ne kadar etraftaki dier DNA'dandr)?

Gen insersiyonu dier genlerin ekspresyonunu ne

dzeyde deitirmektedir? a. nsana uygulanacak retrovirs harici aktarm

Aktarlan DNA'dan ekspresyon, hcrelerin sistemlerinin de gvenlilik deerlendirilmesi

yzde kanda gereklemektedir? Normal aktivitenin titizlikle yaplmaldr. Nkleik asitler rnein

yzde ka eklenen genden kaynaklanmaktadr? lipozomlar ile kompleks haldeyse ve inhalasyon yolu

Gen, hedef hcreler dnda da eksprese ile uygulanacaksa kompleks halde olmayan

olmakta mdr? Eer oluyorsa, hangi dzeydedir? lipozomlardan farkllk gsterebilecei gz nnde

bulundurulmal ve klinik alma iin nerilen

l ipozom /DNA kompleks in in gven l i l i k

Retroviral vektr hazrlanmas aamasnda deerlendirilmesi kompleks olmayan lipozomlardan

hangi hcre tipleri enfekte olmutur? Eer varsa, bamsz olarak deerlendirilmelidir. Eksprese

hangi hcreler enfeksiyz partiklleri retmektedir? olacak geni tayan plazmidin tamamnn

Retroviral vektrn ve oluan provirsn tasarlanmas promotor, dier transkripsiyonel

(kayp, yeniden dzenlenme, rekombinasyon, veya elemanlarn ve homolog rekombinasyonu

mutasyon asndan deerlendirildiinde) kararll tetikleyebilecek herhangi bir dizinin seim nedenini

nedir? Hastann hcrelerinde aktarlan genin endojen de kapsayacak ekilde aklanmaldr. Aktarm

veya dier viral DNA dizileri ile yeniden dzenlenme sisteminin patolojik ve istenmeyen etkileri olup

veya rekombinasyona ne dzeyde maruz kalaca olmadna ynelik (DNA'nn tedavi edilen hcreler

hakknda mevcut bilgi nedir? Karaszlk veya dndaki hcrelere zellikle germ hcre serisi

varyasyonu azaltmak iin vektr tasarmnda hangi hcrelerine girip girmediini de saptar ekilde)

nlemler alnmtr? Kararll test etmek iin hangi yaplan hayvan almalar, tedaviden sonra

laboratuvar almalar yaplmtr, ve analizlerin hayvanlarn ne kadar sre boyunca incelendii ve

duyarll nedir? hangi gvenlik almalarnn yrtld, bu

Transfer sonucu oluacak potansiyel zararl analizlerin duyarllk dzeyleri ile ilgili verilerle

etkiler (r. neoplazi geliimi, zararl mutasyonlar, birlikte bildirilmelidir.

enfeksiyz partikllerin yeniden olumas veya Bir gen tedavisi protokol onay almadan nce

immn reaksiyon) hakknda laboratuvar verileri yukardaki sorulara ilaveten halk sal asndan

nelerdir? Patojeniteyi azaltmak iin vektr da aadaki kayglar gidermelidir:

tasarmnda hangi nlemler alnmtr? Patojeniteyi Aktarlan DNA'nn hastadan dier kiilere veya

d.

b.

e.

c.

d.

4.RETROVRS HARC AKTARIM/

EKSPRESYON SSTEMLER

e.

f.

3. RETROVRS AKTARIM STEMLER

a.

b.

c.

a.



Cilt 64 < Say 1 < 2007

evreye yaylmas ile ilgili belirgin bir olaslk sz Rekombinant DNA Danma Komitesi (RAC-The

konusu mu? Recombinant DNA Advisory Comittee) tarafndan

Byle bir yaylm durumunda hangi nlemler t bb i , e t i k ve b i yogven l i k a s ndan

alnacaktr (r. ayn oday paylaan hastalar, salk deerlendirilmektedir. Her bir gen tedavisi klinik

grevlileri veya aile bireyleri iin)? denemesine balanmadan nce ise enstitnn IRB

Halk salna riskler varsa bunu hafifletmek (Institutional Review Board) ve IRC (Independent

iin hangi nlemler alnacaktr? Review Consulting) kurulular tarafndan

Yenidoanlarn maruz kalabilecei olas onaylanmak zorundadr. Gelecein tedavi

riskleri, dikey aktarm da dahil, nlemek amacyla metodlarna hazrlkl olabilmek ve bu alanda

hastalara doum kontrol nlemleri nerilecek mi? l k e m i z d e d e g v e n l i a r a t r m a l a r n

Benzer kayglar salk personeli iin de geerli midir? yrtlebilmesini gvence altna almak iin benzer

yaplanmalara ihtiya vardr ve en ksa zamanda

gerekli alt yap kurulmaldr.

Gen tedavisi klinik denemelerine gnmze kadar

tm dnyada binlerce hasta katlm olmasna ramen

baarl sonular henz ok azdr. OTC yetmezli olan

bir hastann hepatik artere teraptik geni tayan

adenoviral vektrlerin enjeksiyonu sonucu lm ve

retroviral aracl gen tedavisi alan 17 SCID

hastasndan 3'nde retroviral insersiyon sonucu

lsemi gelimesi viral vektrlerin toksisiteleri ile ilgili

kayglar artrmtr. Tm bu sre iinde ba-boyun

kanserleri iin gelitirilen ve p53 tmr basklayc

geni tayan rekombinant adenoviral vektr

(Gendicine) rutin kullanm iin in'de lisans almtr

ve hepatoseller kanserlerde kullanlmaya

balanmtr (36, 37). nsan gen-transfer rnlerinin

ve protokollerinin deerlendirilmesi bu makalenin

ieriinden anlalaca zere olduka karmaktr ve

buna uygun yaplanmay gerektirmektedir. Amerikan

Gda ve la daresi (FDA) Amerika Birleik

Devletlerindeki gen tedavisi almalarnn

denetimini yapmaktadr. ABD'de klinik denemelere

girecek bir gen tedavisi rn nce FDA'dan onay

almaldr(www.fda.gov/cber/infosheets/genezn.ht

m). Amerikan Ulusal Salk Enstits (NIH-National

Institute of Health) gen tedavisi aratrmalarnn

gvenliinde rol oynayan dier nemli bir kurulutur.

NIH aratrmaclar ve enstitler iin gen tedavisi

klinik denemelerinde izlenecek klavuzlar

salamaktadr. Klinik deneme protokolleri veya

planlar ncelikle NIH Biyoteknoloji Aktiviteleri

Ofisine kayd yaplmakta, daha sonra NIH

b.

c.

d.

SONU

KAYNAKLAR:

1. Strachan T, Read AP. Chapter twenty one: New appro-

aches to treating disease. New York: Garland Science,

2004.

2. Hacein-Bey-Abina S, von Kalle C, Schmidt M, ve ark.

LMO2-associated clonal T cell proliferation in two

patients after gene therapy for SCID-X1. Science, 2003;

302: 415-19.

3. Cavazzana-Calvo M, Lagresle D, Hacein-Bey-Abina S, ve

ark. Gene therapy for severe combined immunode-

ficiency. Annu Rev Med, 2005; 56: 585-602.

4. Kay M, Glorioso JC, Naldini L. Viral vectors for gene

therapy: the art of turning infectious agents into

vehicles of therapeutics. Nature Med, 2001; 7: 33-40.

5. Pages JC, Bru T. Toolbox for retrovectorologist. J Gene

Med, 2004; 6: 67-82.

6. Takeuchi Y, Porter CD, Strahan KM, ve ark. Sensitization

of cells and retroviruses to human serum by (alpha 1-3)

galactosyltransferase. Nature, 1996; 379: 85-88.

7. Cosset F, Takeuchi Y, Battini JL, ve ark. High-titer pac-

kaging cells producing recombinant retroviruses resis-

tant to human serum. J Virol, 1995; 69: 7430-36.

8. Diaz R, Eisen T, Hart IR, ve ark. Exchange of viral

promoter/enhancer elements with heterologous

regulatory sequences generates targeted hybrid long

terminal repeat vectors for gene therapy of melanoma.

J Virol, 1998; 72: 789-95.

9. Volpers C, Kochanek S. Adenoviral vectors for gene

transfer and therapy. J Gene Med, 2004; 6: 164-71.

10.Bergelson J, Cunningham JA, Droguett G, ve ark. Iso-

lation of a common receptor for Coxsackie B viruses

and adenoviruses 2 and 5. Science, 1997; 275: 1320-23.

11.Wickham T, Mathias P, Cheresh DA, ve ark. Integrin-

A. GNEL-ZCAN


Cilt 64 < Say 1 < 2007

alpha-V-beta-3 and integrin-alpha-V-beta-5 promote 9: 67-72.

adenovirus internalization but not virus attachment. 25.Gehl J. Electroporation: theory and methods,

Cell, 1993; 73: 309-19. perspectives for drug delivery, gene therapy and

12.Report of the National, Institutes of Health Recom-binant research. Gene Ther, 2003; 177: 437-47.

DNA Advisory Committee. NIH Report. Assessment of 26.Acsadi G, Dickson G, Love DR, ve ark. Human dystrophin

adenoviral vector safety and toxicity. Hum Gene Ther, expression in mdx mice after intramuscular injection of

2002; 13: 3-13. DNA constructs. Nature, 1991; 352: 815-18.

13.Havenga M, Lemckert AAC, Ophorst O, ve ark. Exploiting 27.Vassaux G, Nitcheu J, Jezzard S, ve ark. Bacterial gene

the natural diversity in adenovirus tropism for therapy therapy strategies. J Pathol, 2006; 208: 290-98.

and prevention of disease. J Virol, 2002; 76: 4612-20. 28.Carey R, van Zijl P, Foz ME, ve ark. Clostridial oncolysis

14.Roy S, Gao GP, Lu Y, ve ark. Characterization of a family of in man. Eur J Cancer, 1967; 3: 37-46.

chimpanzee adenoviruses and development of mole- 29.Li X, Fu GF, Fan YR, ve ark. Bifidobacterium longum as

cular clones for gene transfer vectors. Hum Gene Ther, an oral delivery system of endostatin for gene therapy

2004; 15: 519-30. on solid liver cancer. Cancer Gene Ther, 2003; 10: 105-

15.Kirn D, Niculescu-Duvaz I, Hallden G, ve ark. The emer- 11.

ging fields of suicide gene therapy and virotherapy. 30.Bauer H, Darji A, Chakraborty, T, ve ark. Salmonella-

Trends Mol. Med, 2002; 8: S68-S73. mediated oral DNA vaccination using stabilized

16.Young L, Searle PF, Onion D, ve ark. Viral gene therapy eukaryotic expression plasmids. Gene Ther, 2005; 12:

strategies: from basic science to clinical application. J 364-372.

Pathol, 2006; 208: 299-318. 31.Zelmer A, Krusch S, Koschinski A, ve ark. Functional

17.Gardlik R, Palffy R, Hodosy J, ve ark. Vectors and delivery transfer of eukaryotic _expression plasmids to

systems in gene therapy. Med Sci Monit, 2005; 11: RA110- mammalian cells by Listeria monocytogenes: a

21. mechanistic approach. J Gene Med, 2005; 7: 1097-112.

18.Fink D, Glorioso JC. Engineering herpes simplex virus 32.Williams SG, Cranenburgh RM, Weiss AME, ve ark.

vectors for gene transfer to neurons. Nature Med, 1997; Reprsessor Titration: A Novel System for Selection and

3: 357-59. Stable Maintenance of Recombinant Plasmids. Nucleic

19.Carpenter D, Stevens JG. Long-term expression of a Acids Research, 1998; 26 (9): 2120-24.

foreign gene from a unique position in the latent herpes 33.Soubrier F, Cameron B, Manse B, ve ark. pCOR: a new

simplex virus genome. Hum Gene Ther, 1996; 7: 1447-54. design of plasmid vectors for nonviral gene therapy.

20.Wallack M, Sivanandham M, Balch CM, ve ark. Surgical Gene Ther. 1999; 6(8): 1482-8.

adjuvant active specific immunotherapy for patients 34.Gerdes K, Thisted T, Martinussea J. Mechanism of post-

with stage III melanoma: the final analysis of data from a segregational killing by the hok/sok system of plasmid

phase III.randomized, double-blind, multicenter R1: sok antisense RNA regulates formation of a hok

vaccinia melanoma oncolysate trial. J Am Coll Surg, mRNA species correlated with killing of plasmid-free

1998; 187: 69-77. cells. Mol Microbiol, 1990;4(11):1807-18.

21.Lundstrom K. Alphavirus vectors as tools in cancer gene 35.Doblhoff-Dier O, Collins CH. Biosafety: future priorities

therapy. Technol Cancer Res Treat, 2002; 1: 83-8. for research in health care. J Biotechnology, 2001; 85:

22.Vigna L, Naldini L. Lentiviral vectors: excellent tools for 227-39.

experimental gene transfer and promising candidates for 36.Peng Z. Current status of gendicine in China:

gene therapy. J Gene Med, 2000; 5: 308-16. recombinant human Ad-p53 agent for treatment of

23.Miyoshi H, Blomer U, Takahashi M, ve ark. Development cancers. Human Gene Ther, 2005; 16: 1013-24.

of a self-inactivating lentivirus vector. J Virol,1998; 72: 37.Guan YS, Liu Y, Zhou XP, ve ark. p53 gene (Gendicine)

8150-57. and embolisation overcame recurrent hepatocellular

24.Schmidt-Wolf GaS-WI. Non-viral and hybrid vectors in carcinoma. Gut, 2006; 55(11): 1684

human gene therapy: an update. Trends Mol Med, 2003;



gen terapisi

Documents