ISSN : 1300-3100

GA/J ÜNİVERSİTESİ

••

DIŞIIEKIMLIGI FAKÜLTESİ

DERGİSİ

THE JOURNAL OF THE DENTAL FACULTY OF

GAZİ UNIVERSITY

CİLT : 12 OCAK-1995 SAYI : 1

ISSN : 1300-3100

GAZI ÜNİVERSİTESİ

DİŞHEKIMLIGI FAKÜLTESİ

DERGİSİ

.

THE JOURNAL OF THE DENTAL FACULTY OF GAZİ UNIVERSITY

■

CİLT : 12 OCAK - 1995 SAYI : 1

İSİ

T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ

DİŞHEKİMLİĞİ FAKÜLTESİ

YAYIN KOMİSYONU

BAŞKAN Prof. Dr. Mustafa TÜRKER

ÜYE ÜYE Prof. Dr. Oktay ÜNER Prof. Dr. Erol DEMİREL

ÜYE ÜYE Prof. Dr. Şule YÜCETAŞ Prof. Dr. Tayfun ALAÇAM

DERGİ YAZIŞMA ADRESİ :

Emek Mah. 82. Sokak No.: 4 Tel : 212 62 20 06510 ANKARA/TÜRKİYE

GAZİ ÜNİVERSİTESİ İLETİŞİM FAKÜLTESİ BASIMEVİ

İ Ç İ N D E K İ L E R

C O N T E N T E S

ARAŞTIRMALAR

RESEARCH

1 Rekombinant insan Kemik Morfogenetik Proteini-2'nin İnvivo Etkinliğinin Araştırılması. In

vivo efficeacy of recombinant human bone morphogenetic protein-2. Cansu ALPASLAN

7 Rekombinant İnsan Kemik Morfogenetik Proteini-2 Tarafından İndüklenen Kemik Oluşu-muna Hücresel Cevabın İncelenmesi.

Cellular response in recombinant human morphogenetic protein-2 induced bone formation.

Cansu ALPASLAN

13 Süt Dişi Kanal Dolgu Maddelerinin Toksisite Potensiyellerinin İnvitro Değerlendirilmesi. In

vitro evaluation of cytotoxic effects of primary teeth root canal filling materials.

Alev ALAÇAM, Özlem TOLUNOĞLU, Taner KARAOĞLU, İbrahim BURGU

19 İmmünosüpresyonun Tam Kalınlık Deri Allogreftlerinin Rejeksiyonu Üzerine Etkisi. (Histopatolojik Çalışma).

The effect of immunosupression on the rejection of full-thickness skin allografts.

İhsan Levent ARAL

27 interkuspal Pozisyonda Deneysel Engelleyici Okluzal Temasın Anteriortemporal ve Masse-ter Kasların Maksimum Diş Sıkma Sırasındaki Aktivitelerine Etkisi.

The influence on experimental interfering occlusal contact on the activity of anterior temporal and masseter muscles during maximal clenching in the intercuspal position.

Caner YILMAZ, Suat YALUĞ, Engin KOCABALKAN, Arife DOĞAN

33 Alt Tam Protez İçine Yerleştirilen Yumuşak Astar Maddelerinde Elastiklik Modülünün ve Kalınlığın Kuvvet Dağılımına Etkisi.

Effect of young's modules and thickness of soft lining materials in a lower complete denture base on stress distrubition.

Sevda SUCA, Erman TEKKAYA

— Il l —

41 Periodontal Hastalığın Tedavisinde Metroni dazol'ün Etkisi.

The effect of metronidazole in the treatm ent of peri-odontal disease.

Atilla ÖZDEMİR, Ahmet C. BAŞUSTAOĞLÜ

47 hpidermal Büyüme Faktörünün (EGF) Deri Allogreftieri Üzerine Olan Etkilerinin Histopato-lojik Olarak Araştırılması.

Effects of epidermal growth factor (EGF) on the skin allogrofts.

İhsan Levent ARAL, Nadir GÜNGÖR, Tülin OYGÜR, Leyla CİNEL

55 İki Daimi Yumuşak Astar Maddesinin Çekme Gerilimi, Uzama Miktarı, Elastiklik Modülü, Sertliği ve Polimetilmetakrilat Kaide Maddesine Bağlanabiiirliklerinin Karşılaştırılması.

Comparison of tensile strenth elastic modules elongation and bond strengh of two permanent soft denture lining matirals to denture hasa resin.

Sevda SUCA

63 Oral Kanser Riski ile Çeşitli Gıdalar Araş ındaki İlişki. 1988-1994 Yılları Arasında Yapılan Epidemiyoiojik Çalışmaların İncelenmesi.

Diet and the risk of oral cancer : Evalu stion of the epidemiologic studies between 1988-1994.

Cansu ALPASLAN

69 Polietilen ve Karbon Fiber ile Desteklenm iş Akrilik Resinlerin Kırılmaya Karşı Dirençleri.

The fracture resistance of polymethyl - metachylate reinforced with polyethylene and carbon fibers.

Özgül KARACAER, Arife DOĞAN, Rıza GÜRBÜZ

VAKA BİLDİRİMİ

CASE REPORT

75 Gingival Fibromatozis (Olgu Bildirimi). Gingival

Fibromatosis (A Case Report). Nadir GÜNGÖR,

Derviş YILMAZ, Dilek UĞAR

79 Ön Bölgede Tek Diş Eksikliğinde implant Uygulamaları.

Implant application in single anterior tooth replacement.

Osman GÜMRÜ, Çetin KASABOĞLU, Murat AYDIN

— IV —

83 Dehidrate İnsan Kemik Grefti ile Desteklenen Sinüs Lift Operasyonu.

Sinus lift procedure using dehyrated human bone graft. Osman GÜMRÜ

87 İskeletsel 2. Sınıf ve High Angle Olgulara Jasper Jumper Apareyi Uygulaması. (2 Olgu Nedeniyle).

Application of jasper jumper appliance on skeletal class 2 with high angle cases (Case report).

Oktay ÜNER, Sema YÜKSEL, Orhan MERAL

— V —

YAYIN KURALLARI

Gazi Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Dergisi Fakülte'nin yayın organıdır. Dişhe-kimliği ve Tıp Dallarında yapılan araştırma-lar, vaka takdimleri ve derlemeler yayınla- nır.

Gazi Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Dergisi yılda 2 sayı olarak yayınlanır ve iki sayıda bir cilt tamamlanır.

3. Başka yerde yayınlanan yazılar dergiye alınmaz. Çeviriler eser sahibinin imzası, izin belgeleri ve asılları ile birlikte gönde rilmelidir.

4. Araştırmalar ve derlemeler 15, vaka takdim leri 5 daktilo sayfasını geçmemelidir. Da ha uzun yazıları yayın kurulu kısaltmakta serbesttir. Metinler daktilo ile standart daktilo kâğıdına ve sayfanın bir yüzüne iki satır aralıklı olarak yazılarak yayın kurulu na iki nüsha halinde teslim edilmelidir. Sayfanın sağ ve solunda ikişer santimetre aralık bırakılmalıdır. Pelür ya da başka tür kâğıda yazılmış nüshalar kabul edilmez.

5. Başlıklar metne uygun, kısa ve açık ifadeli olmalıdır. Yazarın veya yazarların akade mik unvanları, adları ve soyadları başlığın alt ve ortasına konmalıdır. Yazarların çalış tıkları kurumların adları, soyadlarının sonu na konulacak (*) işareti ile birinci sayfanın altında not halinde bildirilmelidir.

6. Araştırmaların yazılış düzeni şöyle olmalı dır : Özet (Türkçe), Özet (Yabancı dilde, ko nu başlığı ile birlikte), Giriş, Materyal ve Metod, Bulgular, Tartışma, Yararlanılan Kay naklar ve Yazışma Adresi. Yazışma adre sinde gereğinde bağlantı kurulacak yazarın telefon numarasıda bulunmalıdır.

7. Yazının anlamını ifade edecek nitelikte en az 5 satır Türkçe özetle birlikte, bu özetin ingilizce, Almanca veya Fransızca çevirile ri yazılmalıdır.

8. Türkçe özetin altına konuyu tanımlayabile cek en az 2 anahtar kelime ve yabancı dil-

de özetin altına bunların karşılıkları yazılmalıdır.

9. Resimler net ve parlak fotoğraf kâğıdına basılmış ve resim ebatları (13x15) olma-lıdır. Grafik, diyagram ve şemalar çini mü-rekkebi ve aydınger kâğıdına veya şablon kartonuna çizilmelidir. Bunların arkasına yazar adı, yazı başlığı, şekil numarası ve yerleri ayrı bir zart içinde yazıya eklenme-lidir. Klişelerin konulacağı yerler yazı içe-risinde de işaretlenmelidir. Grafik, diyag-ram ve şekil altı yazılar metin dışında ayrı bir daktilo kâğıdına yazılmalıdır. Tablolar bir başlık bulundurmalıdır. Fotomikrograf-larda boyama yöntemi ve büyütme göste-rilmelidir. Elektromikrografiarda ve scan-ning elektronmikrograflarda büyütme bulun-malıdır. Tablo numarası üzerinde romen ra-kamıyla, şekiller altta normal rakamlarla gösterilir.

10. Dergi basım koşulları renkli fotoğraf basımı mümkündür.

11. Yararlanılan kaynaklar ya metindeki geçiş sırasına göre veya yazarların soyadiarma göre alfabetik olarak düzenlenmelidir. Ya-rarlanılan kaynakların yazılış şekli şu sıra-ya göre olmalıdır :

a) Dergiler : Yazarın soyadı, adının ilk harf leri, yazının başlığı, derginin kısaltılmış adı, cilt numarası, sayfa numarası, yılı. Dergi isimleri «Index Medicus»da veri len listeye göre kısaltılmalıdır.

b) Kitaplar : Yazarın soyadı, adının ilk harf leri, kitabın adı, baskı veya cilt numara sı, basıldığı basımevi, basıldığı şehir,

yılı.

Dergiye gönderilecek yazılarda imlâ ve ter-minoloji yönünden şu noktalara dikkat edil-mesi gerekmektedir. Anatomi terimlerinin Latinceleri kullanılmalı ve bunlar tırnak içe-risinde orijinal imlâsı ile yazılmalıdır. Dîş-

— VII —

12.

1.

2,

yabancı dildeki

uygun olduğunda, ücret karşılığında

hekimliği ve Tıp diline yerleşmiş terimler söylendiği şekilde yazıldıktan sonra paran-tez içerisinde orijinal yazılış şekli belirtil-melidir.

13. Metin içindeki sayfa üstlerine yazmak ama cıyla, yazarlar konu başlıklarını beş kelime yi geçmeyecek şekilde kısaltarak birinci sayfanın en başına parantez içerisinde bil dirmek zorundadırlar.

14. Dergide yayınlanacak yazıların bilimsel ni- teliğinden yazar ya da yazarlar sorumludur. Bilimsel yayınlar ile tenkitler ve cevapları «Editöre Mektuplar» bölümünde yayınlanır.

15. Dergi ile ilgili her hususta Gazi Üniversi- tesi Dişhekimliği Fakültesi Dergisi Yayın Komisyonu Başkanlığı ile bağlantı kurulur. Yayınlanması istenilen makalelerin başvu ruları bir dilekçe ile Yayın Komisyonu Baş kanlığına yapılır.

16. Yayın Kurulunun, yayın kurallarına uyma yan yazıları yayınlamamak, düzeltilmek üze re yazarına geri gönderme yetkisi vardır. Yayın komisyonuna gelen yazılar şekil yö nünden incelendikten sonra danışma kuru luna gönderilir. Danışma Kurulunun en az 15 gün içindeki incelemesi sonucunda olum lu rapor alınan makalelere yayınlanabilir raporu verilebilir. Yayınlanması kabul edi len yazılar sıraya alınır.

17. Yayınlanmak üzere gönderilen yazılar her hangi bir siyasal düşünceyi ve uygulamayı içerir, savunur ya da eleştirir mahiyette olamaz.

18. Deî-gide yayınlanan yazıların telif hakkı Ga zi Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi'ne aittir, başka yerde yayınlanamaz. Dergide yayınlanan yazılara Gazi Üniversitesi Rek- törlüğü'nce belirlenecek esaslar içinde te- !if hakkı ödenir.

— VIII —

G.Ü. Dişhek. Fak. Der. Cilt XII, Sayı 1, Sayfa 1 -6, 1995

:

REKOMBİNANT İNSAN KEMİK MORFOGENETİK PROTEİNİ - 2'NİN İNVİVO ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI

Cansu ALPASLAN*

. Ö Z E T

Rekombinant teknikle üretilen insan kemik morfogenetik proteini-2 (rhBMP-2) aktif bir kemik indükleyici molekül olmakla birlikte, klinik uygu-lamalarda kullanılabilmesi için uygun bir taşıyıcı-yı gerektirmektedir. Bu çalışmada polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri ve kan pıhtısı taşı-yıcı olarak kullanılarak rhBMP-2'nin invivo etkin-liği immünohistokimyasal olarak araştırılmıştır. Materyalin deri aitına implantasyonunu takiben deney grubunda birinci haftada kıkırdak ve ke-mik formasyonu, üçüncü haftada kemik iliği for-masyonu gözlenirken, kontrol grubunda altıncı haftada bile kemik veya kıkırdak formasyonu gözlenmemiştir. Polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri deney ve kontrol gruplarında altıncı haftada rezorbe olmuş, istenmeyen herhangi bir reaksiyona sebep olmamış, böylece rhBMP-2 için uygun bir taşıyıcı olarak kullanılabileceğini kanıtlamıştır.

SUMMARY

In Vivo Efficacy of Recombinant Human Bone Mcrphogenetic Prctein-2

Recombinant human bone morphogenetic protein-2 that is an active bone inductive molecule, requires a delivery system for clinical applications. In vivo efficacy of rhBMP-2 was studied immunohistochemicallv, using polyiactic acid Dolyglycolic acid copolymer as a delivery system. Following subcutaneous implantation, cartilage and bone formation was observed by 1 week and bone marrow by 3 weeks in the experimental group; whereas control group did not reveal such findings even at 6 weeks. Polyiactic acid polyglycolic acid copolymer resorbed by 6 weeks both in the experimental and control groups; and proved to be a suitable delivery system for rhBMP-2 without causing unfavorable reactions.

Anahtar Kelimeler Proteini, taşıyıcı.

Kemik Morfogenetik Key Words delivery system.

Bone Morphogenetic Protein,

GİRİŞ

Demineralize kemik parçacıklarının ektopik bir bölgeye implante edildiğinde, embriyolojik kemik oluşumu veya kırık iyileşmesindekine benzer bir şekilde kemik oluşumunu indüklediği ilk kez Urist(1) tarafından deneysel olarak gös-terilmiştir. Demineralize kemikte, kemik olu-şumundan sorumlu tutulan aktif faktörün protein yapısında olduğu belirlenmiş ve kemik morfo-genetik proteini (Bone Morphogenetic Protein -BMP) olarak adlandırılmıştır. Kemik tamir ola-yında ve hatta kemiğin normal yapısının korun-masında önemli rolleri olduğu düşünülen BMP'-lerden bugüne kadar 7 adedinin moleküler ya-

pısı belirlenerek BMP-1'den BMP-7'ye kadar ad-landırılmıştır (2 - 5). Sığır kemiğinde kemik in-düksiyonundan sorumlu aktif proteinler izole edilip, aminoasit dizilimlerinden yararlanarak rncleküler yapıları belirlenmiş ve genetik mü-hendisliği yardımıyla saflaştırılarak üretilebilin-miştir. BMP-1 dışında diğer 6 BMP'nin amino-asit dizillimi benzer olup Transforming Büyüme Faktörü - beta (TGF - beta) grubu ile de çok ya-kın benzerlik göstermektedir (4, 5).

G.Ü. Dişhekimliği Fakültesi, Ağız, Diş, Çene rlasta-lıkları ve Cerrahisi Anabilim Dalı, Öğretim Üyesi.

İnsan Kemik Morfogenetik Proteini-2'nin invivo Etkinliyi G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995

Oral ve maksillofasiyal cerrahi konseptle-rini değiştirebilecek son gelişmelerden birisi BMP'lerin klinik kullanımda yer alması olmuş-tur (6). Ancak BMP'nin elde edilebilmesi için çek fazla miktarda kemiği gerektirmesi yaygın kullanımını olanaksız kılmaktadır (2). En yeni gelişmelerden birisi olan ve BMP'lerin rekom-binant teknik yardımıyla üretilebilmesine olanak sağlayan yöntemlerin geliştirilmesi uygun kemik bulma zorunluluğunu ortadan kaldırmaktadır (7). Bu teknikle rekombinant insan BMP rnRNAsı bir tip insan osteosarkom hücresinden (U2OS) el-de edildikten sonra DNA yapısı belirlenmekte ve insana ait bu DNA dizilimi Chinese Hamster Ovary (CHO) hücrelerine kopyalanarak üretile-bilinmektedir (5). Ancak klinik vakalarda kulla-nımından önce rekombinant insan morfogenetik proteini-2 (recombinant human bone morphoge-netic protein-2, rhBMP-2)'nin uygun bir taşıyıcı kullanılarak kemik oluşumundaki etkinliğinin hay-van çalışmaları ile gösterilmesi gereklidir. Bu çalışma polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri ve kan pıhtısı taşıyıcı olarak kullanıldığında rhBMP-2'nin etki mekanizmasının ve taşıyıcısı-nın etkinliğinin in vivo ortamda immünohisto-kimyasa! olarak incelenmesi amacıyla yapılmış-tır.

MATERYAL VE METOD

Bu çalışmada 32 adet 5 haftalık beyaz Long Evans ratı kullanıldı. Deney hayvanlarının gö-ğüs bölgesine orta hattan deri insizyonu yapı-larak kunt diseksiyonla alttaki kas doku ile deri arasında materyalin yerleştirilmesine uygun boşluk oluşturuldu. 20 |ig rhBMP-2, 200 \x\ kan pıhtısı ve sentetik bir taşıyıcı yardımıyla göğüs bölgesinde deri altına bilateral olarak yerleşti-rildi. Sentetik taşıyıcı olarak 250 um çapında ve polilaktik asit - poliglikolik asit kopolimeri yapı-sında pöröz mikro küreler kullanıldı. Kontrol hayvanlarında ise deri altına sadece kan pıhtısı ve sentetik taşıyıcı yerleştirildi. İnsizyonlar pri-mer olarak kapatılarak deri üzerinde implant ma-teryalinin yerleştirildiği bölge küçük metal küp-ler ile işaretlendi.

implant materyalinin yerleştirilmesini taki-ben 1, 3. 5 ve 6. haftalarda deney ve kontrol

grupları için 4'er hayvan tartılarak eter ve 10 mg/100 gr ketamin ile anestezi altına alındı. Diaframa paralel olarak yapılan deri ve kas in-sizyonu ile intraperitonel boşluğa ulaşıldı ve buradan da göğüs kafesine girilerek kalbin sol ventrikülünden sokulan plastik bir kanül yardı-mıyla hayvanlara fiksatif solüsyon verildi. İmmü-nohistokimyasal inceleme amacıyla hayvanlar 250 cc 1/4 Karnovski solüsyonu ile fikse edildi. Fiksasyonu takiben deri diseke edilerek implan-te edilen materyaller alttaki kas doku ve kabur-galar ile birlikte blok olarak çıkartıldı. Postope-ratif fiksasyon amacıyla elde edilen spesimenler 1 saat 1/4 Karnovski solüsyonunda bekletildi, daha sonra kakodilat bafır içeren şişelere alındı. Spesimenler % 4.13'lük etilen diamin tetra-setik asit (EDTA] da (pH 7.3) 4°C'de 1 0 - 2 1 gün süreyle dekalsifiye edildi. Dekalsifikasyonu takiben spesimenler küçük parçalara kesilerek değişen derecelerde etanol ile (% 70, % 80, % 90, % 95, % 100) ikişer kez 10'ar dakika süreyle dehidre edildi. Spesimenler immünohisto-kimyasal değerlendirme için dehidrasyonu taki-ben Technovit 8100 rezine (Heraeus Kulzer GmbH. Philipp-Reis-Strasse 8. D-6393 Wehrheim /TS) gömüldü. Porter-Blum MT-1 mikrotomu kul-lanılarak cam bıçak yardımıyla 2 jı'luk kesitler alındı. Alınan kesitler tartarik asite dirençli asit fosfataz aktivitesinin (TRAP) tayini için Azo bo-yası ve ardından metilen mavisi ile boyanarak ışık mikroskobunda incelendi.

SONUÇLAR

rhBMP-2'nin kan pıhtısı ve sentetik taşıyıcı yardımıyla deri altına implante edildiği deney grubunda birinci haftada sınırlı bir bölgede lo-kalize kıkırdak formasyonu ve sentetik taşıyıcı-nın periferinde kemik formasyonu gözlendi (Resim 1, 2). Üçüncü haftada kemik formasyo-nunun pöröz mikro kürelerin arasındaki boşluk-larda ve içlerinde de yer aldığı gözlendi (Resim 3). Yeni oluşan kemik yüzeyinde osteoblastlar ve TRAP boyası ile pozitif olarak boyanan oste-oklastlar kemikte aktif bir yeniden şekillenme olduğuna işaret etmekteydi. Üçüncü haftada implantın iç kısımlarında kemik iliği formasyonu olduğu ve hematopoetik hücrelerin yer aldığı gözlendi (Resim 4). Beşinci haftada kemik ve

Cilt 12, Sayı 1 ALPASLAN

Resim 1. rhBMP-2'nin subkutan olarak implante edildiği deney grubunda birinci haftada sınırlı bir böl-gede izlenen kıkırdak formasyonu (Azo boyası ve metilen mavi x 20).

Resim 4. Deney grubunda 3. haftada kemik iliği formas-yonu ve hematopoetik hücreler görülmektedir. (Azo boyası ve metilen mavi x 40).

Resim 2. Deney grubunda 1. haftada taşıyıcının perife-rinde kemik formasyonu görülmektedir. (Azo boyssı ve metilen mavi x 20).

H : ■ ■ : ; . . , ; ■ ; ■ ; ; ; : , - - < - [ .

. . . ' .

IBIIİÎİS

us ■ : ■ ■ ■ ■ ■ . ■ ■ ■ . . .

kemik iliği formasyonu aynı biçimde devam et-mekte olup taşıyıcının büyük bir kısmının rezorbe olduğu dikkati çekti. Altıncı haftada ise taşıyı-cının tamamen rezorbe olduğu saptandı [Re-sim 5).

Deney grubu ile kıyaslandığında kontrol grubunda hiç bir dönemde kemik ve kıkırdak oluşumu gözlenmedi (Resim 6). Sadece sentetik taşıyıcı ve kan pıhtısının implante edildiği kont-rol grubunda iltihabi reaksiyon veya yabancı ci-sim reaksiyonu gözlenmedi. Taşıyıcı deney gru-bundaki ile benzer olarak altıncı haftada rezorbe oldu.

Sil

Resim 3. Deney grubunda 3. haftada pöröz mikro küreler

arasında kemik formasyonu görülmektedir. (Azo boyası ve metilen mavi x 20).

Resim 5. Ceney prubur.da G. haftac'j kemik ve kemik iliği

formasyonunun yamssra taşıyıcının tamamsn rezorbe olduğu izlenmektedir (Azo boyası ve metilen mavi :< 10).

insan Kemik Morfogenetik Proteini-2'nin invivo Etkinliği G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995

Resim 6. Kontrol grubunda 4. haftada bile kıkırdak veya

kemik oluşumu gözlenmemektedir. (Azo boyası ve metilen mavi x 20).

TARTIŞMA ' ■

Bu çalışmada deri altına polilaktik asit polig-likolik asit kopolimeri ve kan pıhtısı ile birlikte implante edilen rhBMP-2 yedinci günde kıkırdak ve kemik oluşumunu, 21. günde de kemik iliği oluşumunu indükleyerek canlı kemik dokusu oluşumunu sağlamıştır. Diğer çalışmalarda (7) bildirilen bulguların aksine kemik oluşumu kı-kırdak oluşumunu takiben oluşmamıştır. Kemik ve kıkırdak oluşumu 7. günde farklı lokalizas-yonlarda gözlenmiştir.

BMP'lerin klinik kullanıma girmesiyle yakın bir gelecekte otojen kemik greftlerinin kullanı-mı azalabilecek veya tamamen ortadan kalka-bilecektir. BMP'lerin klinik kullanımda yer ala-bilmesine yönelik, taşıyıcı olarak kullanılabile-cek biomateryal arayışı ve bu materyallerin da-ha çok geliştirilmesi ise çalışmaların en çok yoğunlastırıIdığı alanlardan birini oluşturmakta-dır. BMP'nin lokal olarak kemik oluşumunu in-dükleyebilmesi için bir taşıyıcı yardımıyla o böl-gede immobilize edilmesi gereklidir. Bu amaçla aktif matriksten arıtılmış allojenik kemik veya otojen kemik taşıyıcı olarak kullanıldığında ke-mik indüksiyonu sağlanmıştır (8 - 10). Ancak BMP'nin insanlarda yaygın olarak kullanılabil-mesi için biyolojik uyumu iyi olan, kolay elde edilebilir ve uygulanabilir olan ve aynı zaman-da kemik dokunun gelişimi için uygun bir yapı

oluşturan sentetik bir taşıyıcının etkinliğinin gösterilmesi gereklidir.

BMP bir taşıyıcı olmaksızın tek başına kul-lanıldığında kemik indüksiyonun oluşması için çok fazla miktarda kullanılması gerekmiştir (7). Taşıyıcının fonksiyonu hücresel cevap gelişince-ye kadar indüktif proteinleri o bölgede immo-bilize etmesi olabilir. BMP'ler için ideal taşıyı-cının belirlenmesi başarılı bir osteoindüktif imp-Isntın geliştirilebilmesi açısından oldukça bü-yük önem taşımaktadır. İdeal olarak taşıyıcı implant sınırları içinde BMP'nin kemik oluşu-munu stimüle etmesini sağlamalıdır. Aynı za-manda biyolojik uyumu iyi olmalı, vücutta yıkı-larak metabolik olarak uzaklaştırılabilmeli, yeni oluşan kemikle tamamen yer değiştirmeli, BMP için inert olmalıdır (11). Bu çalışmada taşıyıcı olarak kullanılan polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri bu özellikleri taşıyarak ideal bir ta-şıyıcı olarak kullanılabileceğini düşündürmüştür.

Yapılan invitro bir çalışmada hücre ataç-manının ve osteoblast gelişiminin en fazla polil-aktid- glikolid yüzeylerde, en az hidroksilapatit yüzeylerde, hidroksilapatit/polilaktid- glikolid yüzeylerde ise orta derecede olduğu gösterilmiş-tir (12). Polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri biyolojik uyumu iyi olan ve biodegrade olabilen bir materyal olup, plak şekli ortognatik cerrahi sonrası osteosentez amacıyla kullanıldığında geç komplikasyonlar olmaksızın normal iyileşme sağlanmıştır (13). Bu çalışmada rhBMP-2'nin ta-şıyıcısı olarak kullanılan polilaktik asit poligliko-lik asit kopolimeri istenmeyen bir reaksiyona sebep olmamış ve kemik indüksiyonuna izin ve-rerek 6. ayda tamamen rezorbe olmuştur. Mi-yamoto ve arkadaşları (14) polilaktik asit-poli-etilen glikol blok kopolimerinin BMP için uygun bir taşıvıcı olduğunu ileri sürerek 3. haftada rezorbe olduğunu bildirmişlerdir. Ancak bu ça-lışmada kemik oluşumunun 3. haftada mikro kü-reler arasındaki boşluklara doğru sokularak de-vam ettiği ve taşıyıcının halen matriks görevini sürdürdüğü gözlenmiştir. Bunun yanısıra degra-de olan polimerlerle 40 gün süresince günlük sabit dozda ilaç sahnımı sağlandığı bildirilmiştir (15). Bu nedenle rhBMP-2 taşıyıcısının 6. haftada rezorbe olması kemik oluşumunun daha uzun ındüklenmesi açısından avantaj olabilir. Kortikal kemik defektlerine implante edilen po-

Cilt 12, Sayı 1 ALPASLAN

lilaktid poliglikolid kopolimerinin absorbsiyonu ile yeni kemik oluşumu arasında bir bağlantı bulunmamakla birlikte degredasyon hızlı oldu-ğunda kemik rejene»asyonunun inhibe olduğu gözlenmiştir (16).

Reddi ve arkadaşları (17, 18) demineralize kemik tozunun kemik indüksiyon kapasitesinin partikül büyüklüğüne bağlı olduğunu bildirerek 74 - 420 um büyüklüğündeki partiküllerin kemik oluşumunu indüklediğini ancak 44-74 [im bü-yüklüğündekilerin indüklemediğini bildirmişler-dir. Yine, Syftestad ve Urist(19) partikül bü-yüklüğü 125 um'den küçük olduğunda kemik indüksiyonunun oluşmadığını bildirmişlerdir. Bunun sebebi implantın yapısının hücreler için bir atinite oluşturması ve vaskülarizasyon için uygun bir iskeletsel yapı sağlaması olabilir. Ni-tekim, demineralize kemik partikülleri sıkıştırı-lıp kes içine imolante edildiğinde vaskülarizas-yonun geciktiği ve buna bağlı olarak da rekal-sifikasyon ve kemik gelişiminin geciktiği bildi-rilmiştir (20). Bu çalışmada da mikro kürelerin 250 fim büyüklüğünde oluşu erken kemik for-masyonunda rol oynayan önemli faktörlerden biri olabilir.

rh.BMP-2'nin polilaktik - poliglikolik asit ko-polimeri ve kan pıhtısı ile birlikte deri altına implantasyonu ile kemik iliğini de içeren canlı kemik dokusunun indüksiyonu, klinik uygulama-larda polilaktik asit poliglikoük asit kopolimeri-nin rhBMP-2 için uygun bir taşıyıcı olabileceğini düşündürmektedir.

K A Y N A K L A R

1. Urist, M R . : Bone: Formation by Autoinduction. Science (Wash. DC), 150: 893-899, 165.

2. Wozney J.M., Rosen V., Celeste A.J., Mitsock L.M., Whitters M.J., Kriz R.W., Hewick R.M., Wang E.A. : Novel Regulators of Bone Formation : Molecular Clones and Activities. Science, 242 : 1528-1534, 1988.

3. Luyten, F.P., Cunningham, N.S., Ma, S., Muthukuma- ran, N., Hammonds, R.G., Nevins, W.B., wood. W.I., Reddi, A.H. : Purification and Partial Amino Acid Sequence of Osteogenin, a Protein Initiating Bone Differentiation. J. Biol. Chem., 264 : 13377-13380, 1989.

4. Celeste A.J., lannazzi J.A., Taylor R.C., Hewick R.M.,

Rosen V., Wang E.A., Wozney J.M. : Identification of Transforming Growth Factor (J Family Members Present in Bone-Inductive Protein Purified from Bovine Bone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 9843-9347, 1990.

5. Wozney, J.M. : Bone Morphogenetic Proteins and Their Gene Expression. In : M. Noda ed. : Cellular and Molecular Biologv of Bone. Academic Press, Inc., San Diego, pp. 131-167, 1993.

6. Stoelinga. P.J.W. : Editorial. Int. J. Oral Maxillofac Surg., 23 : 193, 1994.

7. Wany E.A., Rosen V.. D'alessandro J.S., Bauduy M., Cordes P., Harada T., Israel D.I., Hewick R.M., Kerns, K.M. LaPan, P., Luxenberg, D.P., McQuaid, D., Moutsatsos, I.K., Nove, J. Wozney, J.M.: Recom- binant Human Bone Morphogenetic Protein Induces Bone Formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 2220-2224, 1990.

8. Johnson, E.E., Urist, M.R., Finerman, G.A. : Repair of Segmental Defects of the Tioia With Cancellous Bone Grafts Augmented With Human Bone Morphogenetic Protein. A Preliminary Report. Clin. Orthop., 236 : 249-257. 1988.

9. Johnson, E.E., Urist, M.R., Finerman, G.A. : Bone Morphogenetic Protein Augmentation Grafting of Resistant Femoral Nonunions. Clin. Orthop., 230 : 257-265, 1988a.

10. Johnson, E.E., Urist, M.R., Finerman, G.A. : Resis tant Nonunions and Partial or Complete Segmen- ta! Defects of Long Bones. Treatment With Implants of a Composite of Human Bone Morphogenetic Protein (BMP) and Autolyzed, Antigen-Extracted, Allogenic (AAA) Bone. Clin. Orthop., 277 : 229-237, 1992.

11. Toriumi, D.M., East, C.A., Larrabee, W.F. : Osteo- inductive Biomaterials for Medical Implantation. Journal of Long - Term Effects of Medical Implants. 1 (1) : 53-77, 1991.

12. Elgendy, H.M., Norman, M.E., Keaton, A.R., Lauren- cin, C.T. : Osteoblast-like Cell (MC3T3-E1) Prolife ration on Bioerodible Polymers : an Approach Towards the Development of a Bone-bioerodible Polymer Composite Material. Biomaterials, 14 (4) : 263-269, 1993.

13. Suuronen, R. Laine, P., Pohjonen, T., Lindqvist, C : Sagittal Ramus Osteotomies Fixed With Biodegra dable Screws : A Preliminary Report. J. Oral Ma xillofac. Surg., 52 : 715-720, 1994.

14. Miyamoto, S., Takaoka, K., Okada, T., Toshikawa, H., Hashimoto, J., Suzuki, S., Ono, K. : Polylactic Acid- Polyethylene Glycol Block Copolymer. A New Biodegradable Synthetic Carrier for Bone Morpho genetic Protein. Clin. Orthop., 294 : 333-343, 1993.

İnsan Kemik Morfogenetik Proteini-2'nin İnvivo Etkinliği G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995

15. Refajo, M.F., Arroyo, M.H. : Sustained Delivery of Retinoic Acid from Microspheres of Biodegradable Polymer in Proliferative Vitreoretinopathy. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 34 (9): 2743-2751, 1993.

16. Winet, H., Hollinger, J.O. : Incorporation of Polylac- tide- Polyglycolide in a Cortical Defect: Neoosteo- genesis in a Bone Chamber. J. Biomed. Mater. Res., 27 (5) : 667-676, 1993.

17. Reddi, A.H., Muggins. C.B. : Influence of Transplan ted Tooth and Bone on Transformation of Fibroblasts. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 143 : 634-637, 1973.

18. Sampath, T.K., Reddi, AH.: Importance of geometry of the Extracellular Matrix in Endochondral Bone Differentiation. J. Cell Biol., 98: 2192-2197, 1984.

19. Eyftestad, G., Urist, M.R. : Degradation of Bone Matrix Morphogenetic Activity by Pulverization. Clin. Orthop., 141 : 281-286, 1979.

20. Yamashita, K., Horisaka, Y., Okamoto, Y., Yoshimura, Y. Matsumoto, N., Kawada, J., Takagi, T.: Architec ture of Implanted Bone Matrix Gelatin Influences Heterotopic Calcification and New Bone Formation. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 197 (3): 342-347, 1991.

G.Ü. Dişhek. Fak. Der. Cil t XII . Say ı 1, Sayfa 7 - 1 1 , 1995

REKOMBİNANT İNSAN KEMİK MORFOGENETİK PROTEİNİ-2 TARAFINDAN INDÜKLENEN KEMİK OLUŞUMUNDA HÜCRESEL CEVABIN İNCELENMESİ

Cansu ALPASLAN'

Ö Z E T

SUMMARY

Kemik morfogenetik proteinlerinin kemik oluşumunu indükleyici etkisi olduğu billinmekle birlikte kemik oluşumuna yol açan hücresel olaylar tam olarak bilinmemektedir. Bu çalış-ma rekombinant insan kemik morfogenetik pro-teini-2 (rhBMP-2)'nin deri altına yerleştirilmesi-ni takiben gelişen hücresel olayların belirlenmesi amacıyla yapılmıştır. İmplantasyonu takiben üçüncü günde kemik oluşumunda önemli rolü olduğu düşünülen me7enşimal hücre proliferas-yonu ve yeni damar formasyonu gözlenirken, dördüncü günde kıkırdak, beşinci günde ise ke-mik formasyonu izlenmiştir. rhBMP-2'nin kemik indüksiyonunu kan hücreleri, stromal hücreler ve mezenşimal hücreler arasında ilişkiyi stimüle ederek gerçekleştirdiği sonucuna varılmıştır.

Anahtar Kelimeler : Kemik Morfogenetik Proteini, kemik indüksiyonu.

Cellular Respanse In Recombinant Human Morphogenetic Protein-2 induced Bone Formation

Although bone inductive property of bone morphogenetic proteins is well known, the accurate cellular mechanisms that lead to bone formation is not clear. This study was underta-ken for the characterization of cellular respon-se following subcutaneous implantation of recombinant human bone morphogenetic pro-tein-2 (rhBMP-2). Mesenchymal cell proliferation and angiogenesis, that is thought to be of crucial importance in bone formation was observed on day 3, followed by cartilage forma-tion on day 4 and bone formation on day 5. It was concluded that rhBMP-2 induce bone for-mation by stimulating cell to cell interactions between blood cells, stromal cells and mesench-ymal cells.

Key Words bone induction.

Bone Morphogenetic Protein,

GİRİŞ

Kemik formasyonu pek çok hücrenin lokal ve sistemik regülatörler aracılığı ile etkileşimini içeren oldukça karmaşık bir mekanizmadır. Demineralize kemiğin iskelet dışı bir bölgede kemik oluşumunu indüklediğinin gösterilmesi (1, 2) bu aktiviteden sorumlu moleküllerin araş-tırılması yönünde yapılan çalışmaların başlangı-cını oluşturmuştur. Kemikten farklı yapılara sa-hip çok sayıda büyüme faktörü izole edilerek bu aktiviteden sorumlu tutulmuştur (3 - 6). Son yıllarda yapılan çalışmalarla kemik oluşumun-dan sorumlu moleküllere bir seri Kemik Morfo-genetik Proteini (Bone Morphogenetic Protein-

BMP] eklenmiştir (7, 8). BMP'ler bugüne kadar izole edilebilen büyüme faktörleri arasında kıkır-dak ve kemik oluşumunu stimüle eden en aktif faktörlerdir (9).

Kemik oluşumunda rol oynayan hücreler arası ilişkilerin detaylı olarak anlaşılabilmesi, kemik oluşumunu stimüle eden yeni tedavi yön-temlerinin geliştirilmesi açısından büyük önem taşımaktadır. BMP'ler tarafından oluşturulan ke-

G.Ü. Dişhekimliği Fakültesi Ağız, Diş, Çene Hasta-lıkları ve Cerrahisi Anabilim Dalı Öğretim Üyesi.

Kemik Oluşumunda Hücresel Cevabın İncelenmesi G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995

mik formasyonu, kırık iyileşmesi ve embriyo-lojik kemik oluşumunu taklit ettiği için kemik oluşumu ve kemik rezorbsiyonundan sorumlu hücrelerin ve hücreler arası etkileşimin incele-nebilmesi için oldukça uygun bir model oluş-turmaktadır (11). Kemikten elde edilen BMP'ler gibi rhBMP-2 bugüne kadar kıkırdak ve kemik oluşumunu indüklediği gösterilen tek molekül-dür (11). Ancak kemik oluşumundaki etki meka-nizması tam olarak anlaşılabilmiş değildir.

Bu çalışma rhBMP-2'nin iskelet dışı bir böl-geye implantasyonunu takiben gelişen hücresel cevabın ve hücreler arası ilişkinin incelenerek, kemik doku oluşumundaki etki mekanizmasının belirlenebilmesi amacıyla yapılmıştır.

MATERYAL VE METOD

Steril petri kaplarında her hayvan için 20 [ig rhBMP-2, polilaktik asit-poliglikolik asit kopoli-meri yapısında ve 250 (im çapındaki pöröz-mikro küreler ve diğer bir rattan temin edilen 200 |-il kan ile karıştırıldı (rhBMP-2 Yamanouchi Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo tarafından sağ-landı).

Deney hayvanı olarak kullanılan 24 adet Long Evans ratının göğüs bölgesi traş edilerek deri insizyonu yapıldı ve elde edilen bu karışım deri altına implante edildi. İnsizyonlar primer olarak kapatıldı. İmplantların yerleştirilmesinden 1, 3, 4, 5, 6 ve 7 gün sonra hayvanlar eter ve ketamirı (10 mg/100 gr) ile anestezi altına .alın-dı. Kalbin sol ventrikülünden girilerek önce Rin-ger solüsyonu ve takiben 250 cc % 3 oranında glutaraldehit içeren 0.05 M kakodilat bafır ile fikse edildi. Deri altına yerleştirilen implantlar çevre dokular ile birlikte çıkartılarak gynı fik-satif solüsyon içinde 4°C'de 1 gece bekletildi. Spesimenler % 4.13 etilen diamin tetrasetik asit (EDTA) ile (pH 7.4) 4°C de 7 gün süreyle de-kaisifiye edildi. Dekalsifikasyonu takiben spesi-menler küçük parçalara bölünerek % 1'lik osmi-yum tetroksit (OsCX) ile ikinci kez fikse edildi. Değişen derecelerde etanol ile (% 70, % 80, % 90, % 95, % 100) ikişer kez 10'ar dakika dehidre edildi. Propilen oksitte iki kez 10'ar da-kika bekletildikten sonra Epok 812 (Öken, Tokyo,

Japonya) rezine gömüldü. Işık mikroskobunda incelemek için cam bıçakla C.5 u, kesitler aılna-rak toluidin mavisi ile boyandı. Elektron mik-roskobunda incelemek üzere Porter-Blum MT-1 mikrotomu (Sorvall Porter Blum Ultramicrotome MT-1, Ivan Sorvall Inc., New Town, Conneticut) kullanılarak 60-90 nm kesitler alındı. Bu kesitler bakır gridler iie toplandı; tannik asit, uranil ase-tat ve kurşun sitrat ile boyanarak elektron mik-roskobu ile incelendi.

SONUÇLAR

Birinci günde geçici polimorf nükleer lökosit infiltrasyonu gözlendi. Üçüncü günde yoğun me-zenşimal hücre proliferasyonu, çeşitli hücreler-de mitoz ve yeni damar oluşumunda belirgin artış vardı (Resim 1). Elektron mikroskobu ile incelendiğinde şişkin endotelyal hücrelerle ka-rakterize yeni damarların oluştuğu ve bu da-marların hemen yakınında mezenşimal hücre-lerle kan hücreleri arasında hücrelerarası iliş-kinin olduğu gözlendi (Resim 2). Yine, elektron mikroskobu düzeyinde kemik iliği kökenli stro-mal hücrelerle differansiye olmamış mezenşi-mal hücreler arasında yakın ilişki olduğu göz-

■

Resim 1. İmplantasyonu takiben 3. günde hücre prolife-rasyonu ve yeni damar oluşumunda belirgin bir artış olduğu görülmektedir. (Toluidin ma-visi x 40).

Cilt 12, Sayı 1 ALPASLAN

. , ■ ■

Resim 2. Elektron mikroskobu düzeyinde yeni oluşmuş kan damarının hemen yakınında kan hücresi ile mezenşimal hücre arasındaki ilişki görülmek-tedir.

Resim 4. İmplantasyonu takip eden 4. günde kondrosit formasyonu görülmektedir. (Toluidin mavisi x20).

lendi (Resim 3). Ancak üçüncü günde kıkırdak veya kemik oluşumu gözlenmedi. Dördüncü gün-de mezenşimal hücre proliferasyonunun izlen-diği bölgede, mezenşimal hücreler arasında kondrositlerin oluştuğu gözlendi [Resim 4). Be-şinci günde ise kıkırdak formasyonu yanında ke-mik formasyonu da başlamıştı (Resim 5). Altın-cı günde kemik oluşumunun artarak devam et-tiği ve implantm iç kısımlarına doğru sokularak ilerlediği gözlendi (Resim 6). Yedinci günde ise kalsifiye kıkırdak dokusunun çok çekirdekli dev hücreler tarafından rezorbe edilerek yerini yeni oluşan kemiğe bırakmakta olduğu gözlendi.

s*,-

Resim 5. İmplantasyonu takip eden 5. günde kemik for-masyonu görülmektedir. (Toluidin mavisi x 20).

Z2

Resim 3. Elektron mikroskobu düzeyinde stromal hücre ile mezenşimal hücre arasındaki ilişki görül-mektedir.

Resim 6. İmplantasyon sonrası 6. günde kemik formas-yonundaki artış görülmektedir. (Toluidin mavi-si x 20).

9

Kemik Oluşumunda Hücresel Cevabın İncelenmesi G.Ü. Dişhek, Fak. Der., 1995

TARTIŞMA

Demineralize kemiğin ektopik bir bölgeye implantasyonunu takip eden birinci günde geçici polimorf nükleer lökosit infiltrasyonu gözlen-mekte, bunu üçüncü günde mezenşimal hücre-lerin matrikse ataçmanı izlemektedir. Mezenşi-mal progenitor hücreler hızla çoğlarak 6-7. gün-lerde kondroblast ve kondrositlere dönüşmekte-dir. Vaskülarizasyon 9. günde izlenirken 10-12. günlerde kıkırdak rezorbe olarak yeni oluşan ke-mikle yer değiştirmektedir (1, 2). Kemikten izole edilen BMP'lerden bazılarının endokondral kemik oluşumunda izlenen bu olaylar serisini taklit ederek kemik oluşumunu indüklediği gösteril-mekle birlikte, kemik oluşumunu hangi hücreleri etkileyerek gerçekleştirdiği bilinmemektedir. Bu çalışmada rhBMP-2 de bu olaylar serisini izle-yerek ancak daha kısa sürede, implantasyonu ta-kiben beşinci günde kemik oluşumunu indükle-miştir. BMP saflaştırılmamış şekliyle kullanıldı-ğında az miktarda aktif kemik indükleyici ma-teryal içerdiğinden ve ayrıca kemik formasyo-nunu inhibe edici faktörleri de içerebileceğin-den saflaştırılarak üretilen rhBMP-2 daha erken ve kaliteli kemik oluşumunu indüklemektedir (7).

BMP implantasyonunu takiben 3. günde me-zenşimal hücrelerde belirgin bir çoğalma izlen-miştir. BMP direkt olarak hücrelerde bölünmeye sebep olarak etki edebileceği gibi çevredeki mezenşimal hücreler üzerinde kemotaksik bir etki oluşturarak da hücre artışına sebep olabilir. Yapılan invitro bir çalışmada demineralize rat kemik matriksinin kas kökenli mezenşimal hüc-reler üzerinde kemotaksik etkisi olduğu gösteril-miş ve bu kemotaksik sinyalin demineralize ke-mik matriksi içeriğindeki protein komponenti ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür (12). Üçüncü gün-de mezenşimal hücre proliferasyonu yanında di-ğer önemli bir bulgu da yeni damar oluşumun-daki artıştı. Yeni damar oluşumunun daha son-raki kemik oluşumu için büyük önem taşıdığı bildirilmiştir (13, 14). Yeni damar oluşumu ön-cü hücrelerin kan dolaşımıyla implantasyon böl-gesine gelmesi açısından oldukça önemli ola-bilir. İnvitro ortamda çeşitli hücre tipleri BMP'ye karşı çoğalmalarını arttırarak veya azaltarak ce-vap vermektedir. Osteoblastik ve osteoproge-nitör hücreler genellikle hücre proliferasyonunu

arttırarak cevap vermektedirler. Aynı zamanda BMP mezenşimal hücrelerin çeşitli fenotiplere dönüşümünü sağlamaktadır. Normal şartlarda kemik hücrelerine dönüşmeyecek olan diffe-ransiye olmamış hücreler, BMP'nin stimülasyo-nu ile kemik hücrelerine dönüşmektedir (15). Bu çalışmada invivo olarak da benzer bulgular göz-lenmiş, yeni oluşan kan damarları ve bu yolla bölgeye geldiği düşünülen kan hücreleri ile dif-feransiye olmamış mezenşimal hücreler arasın-daki ilişki elektron mikroskobu düzeyinde gös-terilmiştir. Elde edilen bulgular bu hücreler ara-sındaki ilişkinin kemik hücrelerinin oluşumunda oldukça önemli bir basamağı oluşturduğunu dü-şündürmektedir.

implantasyonunu takiben rhBMP-2 beşinci günde kıkırdak ve kemik oluşumunu indüklemiş-tir. rhBMP-2'nin periost kökenli hücreler üzerin-deki etkisini araştıran invitro bir çalışmada rhBMP-2'nin kemik oluşum süresini azalttığı ve oluşan kemik miktarını arttırdığı ancak kıkırdak oluşumu üzerinde bir etkisi olmadığı gösteril-miştir. Tavuk periost hücrelerinden oluşan kül-tür ortamındaki hücresel ve moleküler olaylar kırık iyileşmesindeki olaylara benzediğinden, kı-rık iyileşmesindeki periostal kemik oluşumunda rhBMP-2'nin kıkırdak oluşumundan değil kemik oluşumundan sorumlu olduğu öne sürülmüştür (16). Benzer olarak bu çalışmada da kemik oluşumu için geçen süre kısalmıştır. rhBMP-2 invivo olarak hem kıkırdak hem kemik oluşumu-nu indüklemiştir. Yani, rhBMP-2 implantasyonu endokondral kemik oluşumunu sağlamıştır an-cak kıkırdak oluşumu için geçen süre kısalma-mıştır.

Gerek kırık iyileşmesinde gerekse de emb-riyolojik kemik gelişimi sırasında osteoblastla-rın mezenşimal öncü hücrelerin farklılaşması sonucu oluştuğu kabul edilmektedir. Osteoblast öncü hücrelerin orijini ise tam olarak bilinme-mekle birlikte periostta ve kemik iliği stroma-sında bulunduğu düşünülmektedir. Kırık iyileş-mesinde osteoblastların ilk olarak periost ile ke-mik arasında gözlenmesi osteoblast öncü hüc-relerin periost kaynaklı olduğunu ve lokal ola-rak salınan sinyallerle osteoblastlara dönüştü-ğünü göstermektedir (17). Ancak bu çalışmada ektopik bir bölgede BMP tarafından kemik olu-

10

Cilt 12, Sayı 1 ALPASLAN

şumunun indüklenmesi osteoblast öncü hücre-lerin sadece periost kökenli olmadığını göster-mektedir.

İnvitro olarak kemik iliği kökenli stromal hücrelerin indükleyici bir maddenin mevcudiye-tinde osteoblastlara, aynı zamanda da osteoblas-tik farklılaşma kapasitesine sahip differansiye olmamış hücrelere dönüştüğü gösterilmiştir (18). Bu çalışmada da kemik oluşumunda rol oynadığı düşünülen stromal hücrelerle differansiye olma-mış mezenşimal hücreler arasındaki ilişki elekt-ron mikroskobu düzeyinde gösterilmiştir.

rhBMP-2 implantasyonunu takiben yeni da-mar oluşumu ve mezenşimal hücre proliferasyo-nunda belirgin bir artış oluşu BMP'nin mezen-şimal hücre proliferasyonu ile yeni damar olu-şumunu stimüle ettiğini ve daha sonra da kan hücreleri ve mezenşimal hücreler, ayrıca kemik iliği kökenli stromal hücreler ve differansiye ol-mamış mezenşimal hücreler arasında etkileşime sebep olarak kemik oluşumunu indüklediğini dü-şündürmektedir.

K A Y N A K L A R

1. Urist, M.R. : Bone : Formation by Autoinduction. Science (Wash. DC), 150: 893-899, 1965.

2. Reddi, A.H., Huggins, C. : Biochemical Sequences in the Transformation of Normal Fibroblasts in Adolescent Rats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 1601-1605, 1972.

3. Urist, M.R., DeLange, R.J., Finerman, G.A.M. : Bone Cell Differentiation and Growth Factors. Science (Wash. DC), 220 : 680-G8G, 1983.

4. Schweiberer, L., Hallfeldt, K., Mandelkow, H. : Osteoid Induction. Crthopade, 15 (1): 3-9, 1986.

5. Hauschka, P.V., Mavrakos, A.E., lafrati, M.D., Dole- man, S.E., Klagsbrun, M. : J. Biol. Chem., 261 (27) : 12665-12674, 1986.

6. Tsutsumi, S.: Purification and Properties of a Growth Factor From Human Bone Matrix, Nippon Seikeigeka Gakkai Zasshi, 61 (11): 1285-1292, 1987.

7. Wozney J.M., Rosen V. Celeste A.J., Mitsock L.M., Whitters M.J., Kriz R.W., Hewick R.M., Wang E.A. :

Novel Regulators of Bone Formation : Molecular Clones and Activities. Science, 242 : 1528-1534, 1988.

8. Celeste A.J., lannazzl .I A.. Tevlor R.C., Hewick R.M., Rosen V., Wang E.A., Wozney J.M. : Identification of Transforming Growth Fr.ctnr 3 Family Members Present in Bone-Inductive Protein Purified from Brovine Bone. Proc. Nail. Acad. Sci. USA. 8 7 : 9843- 9S47, 1990.

9. Wozney, J.M. : Bone Morphonenetic Proteins and Their Gene Expression. In : M. Noda ed. : Cellular and Molecular Biology of Bone. Academic Press, Inc., San Diego, pp. 131-167. 1993.

10. Rospn, V., Thies, R.S. : The Bone Morphcgenetic Proteins in Bone Formation and Repair. Trends Genet., 3 : 97-102, 1992.

11. Wang E.A., Rosen v\, D'aiess&ndro J.S., Bauduy M., Cordes P., Harada T., Israel D.I., Hewick R.M., Kerns, K.M. LaPan, P., i.uxenberg, D.P., McQuaid, D., Moutsatsos, I.K., Neve, J., Wozney, J.M.: Recom- binant Human Bone Mcphogenetic Protein Induces Bone Formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 222C-2224, 1990.

12. Landesman, R.. Reddi, A.H. : Chemotaxis of Muscle- Derived Mesenchymal Cells to Bone Inductive Proteins of Rat. Calcit. Tissue Int., 39 : 259-262. 1986.

13. Foidart, J.M. Reddi, A.H. : Immunofluorescent Lscalization of Type IV Collagen and Laminin during Endochondral Bone Differentiation and Regulation by Pituitary Growth Hormone. Dev. Biol., 75 : 130-136, 1980.

14. Paralkar, V.M., Vukicevic, S., Reddi, A.H. : IGF-beta 1 Binds to Collagen IV of Basement Membrane Matrix: Implications for Development. J. Biol. Chem., 143 : 303-303, 1991.

15. Ekelund, A., Brosio, O., Nilsson, O.S : Experimental Induction of Heterotopic Bone. Clin. Orthop. Rel. Res., 263 : 102-112, 199'.

16. Iwasaki, M., Nakahara, H., Nakase, T., Kimura, T., Takaoka, K., Çaplan, A.I., Ono, K.: Bone IV.orphogenetic Protein 2 Stimulates Osteogenesis but Does Not Affect Chondrogenesis in Osteochond- rogenic Differentiation of Periosteum-Derived Cells. J. Bone Miner. Res., 9: 195-1204, 1994.

17. Sandberg, M.M., Aro, H.T., Vuorio, E.I. : Gene Expression During Bone Repair. Clin. Orthop. Rel. Res., 289 : 292-312, 1903.

18. Rickard, D.J., Sullivan, T.A., Shenker, B.J., Leboy, S.P., Kazhdan, I. : Induction of Rapid Osteoblast Differentiation in Rat Bone Marrow Stromal Cell Cultures by Dexcmethasone and BMP-2. Dev. Biol.. 1G1 : 218228, 1994.

G.Ü. Dişhek. Fak. Der. Cilt XII, Sayı 1, Sayfa 13-18, 1995

SÜT DİŞİ KANAL DOLGU MADDELERİNİN TOKSİSİTE POTANSİYELLERİNİN İN VİTRO DEĞERLENDİRİLMESİ

Alev ALAÇAM*, Özlem TULUNOĞLU**, Taner KARAOĞLLT İbrahim BURGU****

Ö Z E T

Pedodontide, kök kanal tedavisinde kullanı-lan kanal dolgu maddelerinden Kalsin, Çinko-ok-sit öjenol (ZOE), Çinko-oksit öjenol+ glutaralde-hit, (ZOE + GA) İyodoform patı (Kri I) ve Vitapex in etkileri in vitro olarak He-La hücre kültürü üzerinde araştırılarak sitotoksik etkileri karşılaş-tırmalı olarak değerlendirildi.

İncelenen materyaller içerisinde Kalsin en az toksik bulunurken bunu Çinko-oksit öjenol, İyodoform patı, Vitapex ve Çinko-oksit öjenol + glutaraldehit izlemekteydi.

Anahtar Kelimeler : Kök kanal dolgu mad-deleri, Hücre kültürü, Sitotiksik etki.

SUMMARY

In Vitro Evaluation of Cytotoxic Effects of Primary Teeth Root Canal Filling Materials

Five resorbable root canal filling materials Kalsin, Zinc-oxide eugenol, Zinc-oxide-eugenol + glutaraldehyde, lodoform paste (Kri I) and Vita-pex were tested in vitro for cytotoxicity on He-La cells and evaluated comparatively. Kalsin was found to be the least toxic root canal filling material followed by Zinc-oxide eugenol, lodoform paste, Vitapex and Zinc-oxide eugenol + glutaraldehyde.

Key Words : Root canal filling materials, Cell cultures, Ciytotoxic effects.

GİRİŞ

Kanal dolgu maddelerinin en önemli özellik-lerinden biri de, maddenin insan vücudu üze-rindeki biyolojik etkisidir. Dolgular periapikal do-kular üzerinde şiddetliden zayıfa doğru sınıflan-dırılabilecek irritasyona sebep olurlar. Bu ne-denle, kök kanal maddelerinin biyolojik veya farmakolojik etkileri çok dikkatli olarak değer-lendirilmelidir (4, 5, 21, 24).

Süt dişi kanal dolgu patları genellikle pe-riapikal dokularla direkt temas edecek şekilde kullanıldığından seçilen materyalin dokularla bi-yolojik uyum içinde olması en aranılan özellik-lerden biridir (4, 23).

Medikal ve dental materyallerin biyolojik uyumluluğunun denenmesinde in vitro toksisite testleri ilk basamak testleridir. Bu amaçla de-ğişik teknikler (1, 7, 21, 20, 15, 18, 16, 23) ve

farklı hücre kültürleri (5, 13, 15, 23), kullanılarak çok sayıda çalışma yapılmıştır.

Dental materyallerin biyolojik uygunluğunun değerlendirilmesi için önerilen standart yöntem-lerle ilgili İNSİ/ADA (1) dokümanında araştırma-cılara üç farklı test önerilmekte ve belirli ma-teryaller için farklı test yöntemleri arasından se-çim hakkı tanınmaktadır. Önerilen üç test yön-temi membran permiabilitesindeki değişiklikle-rin (Ağar overlay, Cr Release) ve metabolik de-ğişikliklerin sitokimyasal boyanma ve mikrosko-bik olarak tespitine (MMipore Filter) dayanmak-tadır (9, 23, 24). Spangberg (21) ise dental ma-teryallerin değerlendirilmesinde «simulated cavity» metodundan yararlanılabileceğini bildir-mektedir.

G.Ü. Dişhekimliği Fak. Pedodonti A.B.D. Doç. Dr. G.Ü. Dişhekimliği Fak. Pedodonti A.B.D. Araş. Gör. A.Ü. Veteriner Fakültesi Viroloji A.B.D. Araş. Gör. A.Ü. Veteriner Fakültesi Viroloji A.B.D. Bask.. Prof.

13

Süt Dişi Kanal Dolgu Maddelerinin Toksisitesi G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995

In vitro toksisite çalışmalarında hücre kül-türlerinde endodontik malzemelerin ilk kullanım-ları Kerezstezi ve Kellner ile Rappaport ve ar-kadaşları (12, 19) tarafından gerçekleştirilmiş-tir.

Son on yılda pedodontik endodontide kul-lanılan materyallerle ilgili sitotoksisite çalış-maları incelendiğinde Kalsim Hidroksit (Ca(OH)), Çinko Oksit Ojenol (ZOE), Kri I patı ile ilgili az sayıda çalışma olduğu gözlenmiştir (6, 14, 24, 29, 30).

Bu nedenle çalışmamızda pedodontik endo-dontide kullanılan kök kanal patlarının sitotok-sisitelerinin karşılıklı olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

MATERYAL VE METOD

Çalışma Ankara Üniversitesi Veteriner Fa-kültesi Viroloji A.B.D. Laboratuvarlarında yapıl-dı. He-La (İnsan serviks karsinoma) orijinli per-manent hücre kültürü kullanıldı. Hücre kültürü şişelerinde üremesini tamamlayan He-La de-vamlı hücre kültürü, % 0.25 Tripsin (GIBCO Paisley, Scottland, U.K.). solüsyonu ilavesinden sonra çalkalanmak suretiyle şişe yüzeyinden ayrıldı.

Mevcut hücrelerin tripsin solisyonundan ay-rılmaları için, karışım +4°C'de 1000 devirde 10 dakika süre ile santrifüj edildi. Santrifüj tübü tabanındaki hücre pelleti % 10 Fötal Dana Se-rumu (PAESEL GmbH and Co., Frankfurt, Ger-many) içeren EAGLE's Minimum Essential Me-dium (EMEM, GIBCO, Paisley Scottland, U.,K.) hücre üretme vasatında, 150.000 hücre/ml ola-cak şekilde sulandırıldı. Hazırlanan hücre süs-pansiyonu 24 gözlü makro hücre kültürü tablet-lerine (COSTAR TISSUE Culture Cluster, M.A., U.S.A.) 1 ml/göz olacak şekilde ilave edildi. Tab-let üzeri steril, nontoksik, şeffaf bant ile kapa-tıldıktan sonra, + 5 CO: içeren etüvde 37°Cîde 24 saat süre ile inkübe edildi.

Araştırmada kullanılan yöntem Matsumoto ve arkadaşlarının (15) çalışmaları çerçevesinde uygulandı. In vivo olarak apikal foramen ve pe-

riapikal dokular üzerinde oluşacak toksisitenin değerlendirilmesinin in vitro olarak benzer bir or-tama taşımasını sağlamak amacıyla iç çapı 0.4 mm olan polietilen tüpler kullanıldı. (Tablo 1'de) içerikleri verilen beş süt dişi kanal dolgu patın-dan Vitapeks (Neo Dental Chemical Products Co. Japan) ve İyodoform (Güler Kimya kullanıma ha-zır durumdaydı. Diğer patlar ise üretici önerileri-ne uygun olarak hazırlanır hazırlanmaz taze ola-rak 2 cm uzunluğundaki kateterlere dolduruldu. Her kanal dolgu patı için makro hücre kültürü tab-letlerinden 4'er göz kullanıldı. İçleri patlarla dol-durulan kateterler, tablet üzerindeki steril, non-toksik, şeffaf bant kullanılarak hücre üretme va-satına daldırıldı. Kanal dolgu patlarının toksisi-tesini kontrol gurubuyla karşılaştırmak üzere 4 adet göze boş kateter uygulanarak kateter kont-rol, 4 adet göz de boş bırakılarak hücre kont-rol grupları sağlandı.

Tablo 1. Test materyallerinin içerikleri

KALSİN !TOZ: Kalsiyum hidroksit LİKİT Baryum sülfat

Gliserin

ÇİNKO OKSİT ÖJENOL TOZ: Çinko oksit LİKİT: öjenoi

ÇİNKO OKSİT ÖJENOL + GLUTARALDEHİT1 TOZ: Çinko oksit LİKİT: Ojenol Giuıaralaldehit

(%2 İlk) j İYODOFORM SToz: İyodoform LİKİT: Paraklorfenol Kamfır Mentol

VITAPEX TOZ Kalsiyum Hidroksit LİKİT: İyodoform

Silikon yağı

Tabletler, % 5 CO2 ihtiva eden 37°C'lik etüvlerde inkübasyona bırakıldı. 12'şer saat ara-lıklar ile 96 saat kontrol altına alınan örnekler, doku kültürü mikroskobunda toksisite yönünden değerlendirildi.

BULGULAR

Test materyallerinin toksisite yüzdeleri Tab-lo II ve Tablo III*de sunulmuştur. Değerlendir-me süreci sonunda Kalsin (Aktu Ticaret İzmir) en az toksisite gösteren materyal olarak saptandı. Kontrol gruplarında ve Kalsin grubunda hücre ölü-

Cilt 12. Sayı 1 ALAÇAM, TULUNOĞLU, KARAOĞLU, BURGU

Tablo 2: Test materyallerinin zamana göre toksisiteleri

S/ı IAT LE R

Kanal Patı

il2 24 36 48 60 72 84 961 KALSİN W 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2/42 ZOE 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 4/4 3 ZOE+GA 3/4 3/4 3/4 3/4 4/4 4/4 4 İYODOFORM 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 5 VITAPEX 0/4 0/4 0/4 2/4 4/4 4/4

Resim 1. Kalsin örneğinin 96. saatteki görünümü. Resim 4. ZOE ı GA örneğinin 12. saatteki görünümü.

15

Süt Dişi Kanal Dolgu Maddelerinin Toksisitesi G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995

Resim 7. Kateter kontrol.

TARTIŞMA

Dental materyallerin biyouygunluklarmm değerlendirilmesi için önerilen in vitro metodlar deneysel kuruluşu yönünden oldukça farklılık göstermektedir. Bu nedenle de elde edilen sonuçların değişkenlikler göstermesi doğaldır.

En önemli faktör artan hacim/örnek oranı-dır. Keresztezi ve Kellner(12) bu oranı arttıra-rak materyalin toksisitesini önemli ölçüde azalt-mışlardır. Benzer materyallerle artan hacim/ör-nek oranı gözönüne alınarak yapılan değerlen-dirmelerde bir başka önemli konu örnekler ben-zerde olsa zararlı olduğu düşünülen bileşenin konsantrasyonundan kaynaklanmaktadır. Artan volümün sonuca etkisi Wennbery ve arkadaş-larının (27) yöntemi olduğu belirtilen dental ma-teryal ve hücreler arasında direkt kontaktı en-gelleyen filtre yöntemiyle ortadan kaidırılabil-mektedir.

Çalışmada kullanılan yöntemde kanal dol-gu maddelerinin iç çapı 0.4 mm olan polietilen tüpler içerisinde kültür plaklarına uygulanması da in vivo olarak apikal foramen ve periapikal dokular üzerinde oluşacak toksisitenin in vitro olarak benzer bir ortamda incelenmesini sağla-maktadır. Öte yandan patlardaki toz/likit oranla-rına dikkat edilmesi de farklı firmaların veya farklı tiplerin karşılaştırılmasından daha fazla önem taşımaktadır. Toz oranı arttıkça erirlik ve sitotoksisite azalmaktadır (22, 27).

Spangberg ve Pascon (22) da materyal içe-riklerinin ve karıştırma oranlarının sitotoksisite sonuçları ile ilişkili olduğunu bildirmişlerdir.

Toksisite sonuçlarını etkileyen diğer bir konu da malzemenin taze hazırlanmış olması yada sertleştikten sonra test edilmesidir.

Bu çalışmada Vitapeks ve İyondoform ha-zır olarak kullanılmış, diğer kanal dolgu patları ise taze hazırlanmış ve hemen hücre kültürüne uygulanmıştır. Bununla birlikte toksisite yüzde-sinin materyalin uygulanma zamanına bağlı ola-rak azaldığını gösteren çalışmalarda mevcut-tur (22, 30).

Dental materyaller için in vitro elde edilen sonuçlar yalnızca uygulanan testler ve mater-yallerin hazırlanışı ile farklılık göstermez. Aynı zamsnda Mjör ve arkadaşları (17) tarafından da bildirildiği gibi klinik sonuçlarla da tam bir fark-lılık göstermektedir. Bu görüşten hareketle den-tal materyallerin sitotoksisiteleri için kullanılan in vitro yöntemler anatomik yapılar ve in vivo hücre tipleri de gözönüne alınarak geliştirilme-lidir.

16

Resim 5. Vitapex örneğinin 72. saatteki görünümü.

Resim G. Hücre kontrol.

Cilt 12, Sayı 1 ALAÇAM. TULUNOĞLU, KARAOĞLU, BURGU

Deneylerin amacı bu çalışmada olduğu gibi yalnızca materyallerin birbirleri arasındaki tok-sisitelerinin saptanması ise elde edilmesi da-ha kolay olan ve kalitesi tahmin edilebilen daimi hücre kültürleri tercih edilebilir. Ancak pulpal ya da periapikal doku cevabı söz konusu oldu-ğunda primer hücre kültürü hazırlanarak değer-lendirilmesi yerinde olacaktır.

Çalışmada test materyalleri arasında özel-likle kontrol grupları ile karşılaştırıldığında ke-sin farklılıklar gözlenmiştir. En fazla toksik etki ZOE + GA patında saptanmıştır. Bazik Ca(OH)2 ile ZOE ve ZOE + % 5'lik Glutaraldehit ile yap-tığı sitotoksisite çalışması sonucunda Şaher (24) fare embriyonik fibroblast hücreleri ile direkt kontakta bırakıldığında en toksik etkiyi ZOE ile gözlediğini, % 5'lik GA + ZOE'lü ise daha doku dostu bulduğunu bildirmektedir. Bazik kalsiyum hidroksit ise ZOE ünkine yakın toksik etki gös-termiştir. Yapılan pek çok çalışma biyolojik do-ku cevapları yönünden incelendiği zaman ZOE'ün daha fazla yıkıcı potansiyele sahip olduğu gö-rülmüştür (8, 6).

Bu yüksek toksisitenin materyalin içinde bulunan serbest ojenoile ilgisi ise tartışılmak-tadır (10, 12, 6).

Öte yandan Şaher (24) kalsiyum hidroksit preperatının PH'sının bazik yada nötral olması-nın sitotoksisite değerlerini farklı etkilediğini ortaya koymuş, en toksik etkiyi bazik kalsiyum hidroksit ile bulurken, PH'sı nötrale getirilen kalsiyum hidroksit ile en iyi sonuçları elde et-tiğini bildirmiştir.

Yeşilsoy ve Feigal (26) de hazır Ca(OH)2 preperatlarının bazik değerlerinin daha düşük olduğunu ve sulu patlara göre daha kısa sert-leşme zamanının olmasının sonuçları olumlu et-kilediğini bildirmektedirler.

Bu çalışmada kullanılan kalsiyum hidroksit patının uzun süre sitotoksik etki göstermemesi, içerdiği gliserine ve PH'sına bağlı olabileceği gibi diğer kanal patlarına göre daha süratli sert-leşme özelliğinden de kaynaklanabilir.

ZOE + GA gurubunda kullanılan % 2'lik glu-taraldehit reaksiyon etkinliğinin artırılması açı-sından tampolanmış ve bazik PH da bulunan bir fiksatiftir.

Yeşilsoy ve Feigal (26) çalışmalarında for-mokrezol ile en geniş zon çapı ama ortalama bir hücre lizisi gibi farklı değerler bulurken bunu materyalin fiksasyon özelliğine bağlamışlar-dır.

Bu çalışmada ZOE + GA'in en olumsuz so-nuçları vermesinde ortamın PH'sının rolü oldu-ğu düşünülebilir. Ayrıca toksisitenin fenol ve formaldehit gibi simanda kolayca çözünen ma-teryallere bağlı olarak arttığını bildiren görüşler-de (3, 5, 23), elde edilen sonucu açıklamaktadır.

Öte yandan Meryon ve Brook (16) diğer ka-nal patlarının yanı sıra Kri I patını da inceledik-leri sitotoksisite çalışmalarında iyodoformun yüksek toksisite gösterdiğini bildirmektedirler.

Wright ve arkadaşlarıda (30) ZOE ve Kri I patının antimikrobiyal ve sitotoksik etkilerini inceledikleri çalışmalarında ZOE'ün daha iyi an-timikrobiyal etki ve daha az sitotoksisite göster-diğini belirtmişlerdir.

Bu sonuçlar çalışma bulgularımızı destek-lemekle beraber ZOE ve iyodoform arasında 48 saate kadar farklılık olmaması ancak hücre ölü-münün iyodoform gurubunda daha önce ve daha süratli oluşması çalışmamızdaki yöntem farklı-lığından kaynaklanabilir.

Sonuçlarımızın aksine literatürde silikon esaslı kanal dolgularında düşük toksisite bildi-rilmektedir (2, 5, 25). Ne varki bir Ca(OH)2 ve iyodoform patı olan Vitapex'in içeriğinde bulu-nan silikon yağının sonuç üzerindeki rolü tar-tışmalıdır.

ZOE, İyodoform ve Vitapex kanal patları bir-birine oldukça yakın sonuçlar gösterirken, Kal-sin'in pozitif yönde önemli farklılık göstermesi materyalin sertleşme reaksiyonunun daha süratli olmasına bağlanabilir.

Öte yandan endodontik materyallerin klinik uygulamada hücre kültürü ve implantasyon de-neylerine göre daha az irrite edici olduklarıda bir gerçektir.

Araştırmacılar (16) bu sonucu kök apeksi-nin mekanik preperasyon sonucu dentin talaş-ları ile tıkanmasına ve materyali alttaki canlı dokudan ayıran bir separator rolü oynamasına bağlamaktadırlar.

17

Süt Dişi Kana! Dolgu Maddelerinin Toksisitesi G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995

Ancak pedodontik endodonti uygulamaların-da süt dişinin fizyolojik rezorbsiyonu patın pe-riapikal doku ile kaçınılmaz temasına neden ol-duğundan kanal dolgu patlarının seçiminde tok-sisitesi düşük materyal kullanımı tercih edilmeli ve taşkın dolgudan kaçınılmalıdır.

K A Y N A K L A R

1. American Dental Association İNSİ/ADA Document No : 42 for Recomended Standart Practices for Biological Evaluation.

2. Alaçam, T. : Endodonti. G.Ü. Dişhekimliği Fakültesi* Yayınları, ANKARA, 543-591, 1979.

3. Barbosa, S.V., Araki, K., Spangberg, L.: Cytotoxicity of Some Modified Root Canal Sealers and Their Leachable Components. Oral Surg. Oral Med. Oral Pnthol., 75 : 357-61, 1993.

4. Bayırlı, G.S. : Endodontik Tedavi, İst. Ü. Dişhek. Fak Yayınları, İSTANBUL, 389-390, 1985.

Sriseno, M.B., Willershausen, B. : Root Canal Sealer Cytotoxicity on Human Gingival Fibroblast; I. Zinc Oxide Eugenol based Sealers. J. Endodon., 16: 383-386, 1990. Briseno, M.B., Willershouse B. : Root Canal Cealer Cytotoxicity on Human Gingival Fibroblast II. Silicone and Resin-based Sealers. J. Endodon., 17: 537-540, 1991.

Browne, R.M., : The In Vitro Assesment of The Cytotoxicity of Dental Materials - Does It Have a Role?. Int. Endodon. J. 21 : 50-58, 1988. Dahi, B.L., Qrstavik, J. : Cytotoxicity of Temporary Crown and Bridge Materials. J. Oral Rehab., 3: 341, 1976.

Demirel, N. : Çocuklarda Çürüğün Temizlenmesinde Caridex Sistemin Etkilerinin Araştırılması. G.Ü. Diş-hekimliği Fak. Pedodonti A.B.D. Doktora Tezi. AN-KARA. 1992.

Hensten-Petersen, A., Helçıeland, K.; Evaluation of Biologic Effects of Dental Materials Using Four Different Cell Culture Techniques Scand. J. Dent., Res., 85 : 291, 1977.

Kawahara, H., Yamagami, A., Nakamura, N.; Biological Testing of Dental Materials By Means of Tissue Culture, Int. Dent. J., 18 : 443-467, 1968.

12. Kerezstezi, K., Kellner, G. : Der Einiger Zur Ortogra- den Wurzelfullung Gebrauchlicher Materialen Auf Das Gewebe (Versuche an Zellkulturen) Österre. Z. Stomato. 61 : 412, 1964.

13. Kettering, J.D. Torabinejat, M. : Cytotoxicity of Root Canal Sealers. A Study Using HeLa Cells and Fibroblast. Int. Endodont. J., 17 : 60-66, 1984.

14. Maseki, T., Nakata, K., Kohsaka, T., Kobayashi, F. Hirano, S., Nakamura, H. : Lack of Correlation between the Amount of Eugenol Released From Zinc-Oxide Eugenol Sealer and Cytotoxicity of the Sealer J. Endodon., 17: 76-79, 1991.

18

15. Matsumoto, K., Inove, K., Matsumoto, A. : The Effect of Newly Developped Root Canal Sealers On Rat Dental Pulp Cells In Primary Culture J. Endodon., 15 : 60-67, 1989.

16. Meryon, S.D., Brook A.M. : In Vitro Comparison of the Cytotoxicity of Twelwe Endodontic Materials Using A New Technique. Int. J., 23 : 203-210, 1990.

17. Mjor, I. A., Hensten-Petersen, A., Skogedal, O. : Biologic Evalualuation of Filling Materials Alguparison of Results Using Cell Culture Tehniques, implanta tion and Pulp Studies. Int. Dent. J., 27: 124, 1977.

18. Nakamura, H., Sakakibara, F., Matsumoto, Y., Hirano, S., Hayakawa, H. : Study On The Cytotoxicity of Root canal Filling Materials, J. Endodon., 12: 156-160, 1986.

19. Rappaport, H.M., Lilly G.E., Kapsimalis, P. : Toxicity of Endodontic Filling Materials, Oral Surg., 18 : 785- 802, 1964.

20. Safavi, E.K., Spangberg, S.W.L., Sapouros, G. : An In Vitro Method for Longitudinal Evaluation of Endodon tic Sealers J. Endodon., 15: 484 486, 1989.

21. Spanberg, S.W.L. : Experimental Endodontics. E R C Press Inc. Florida. 174-207, 1990.

22. Spanberg, S.W.L., The Importance of Material Prepa ration for The Expression of Biomaterials. J. Endodon•< 14 : 247-250, 1988.

23. Sonat, B., Dalat, D., Burgu, L Özkul, A. : Kanal Dolgu Maddelerinin Toksisite Potansiyellerinin HeLa Hücre Kültürleri Üzerindeki Değerlendirilmesi, A.Ü. Dişhek. Fak. Dergi., 19: 35-42, 1992.

24. Şaher, E. : Üç Değişik Pulpa Kaplama Maddesinin Etkinliklerinin Hücre Kültürleri ve Pulpaları Ekspos Edilen 3. Molarlarda Histopatolojik Olarak İncelen mesi. H.Ü. Dişhek. Fak. A.B.D. Doktora Tezi. ANKARA 1983.

25. Yano, G. : The Vitapex Manual. NeoDental Chemical Products Co. Ltd.

26. Yeşilsoy, G. Frigal, F.G. : Effects of Endodontic Materials On Cell Viability Across Standard Pore Size Alters, J. Endodon., 11 : 401-407, 1985.

27. Welker, D., Newpert, G. : Vergleichende In-Vitro Studie Zellnlörer Reaktionen Auf Löstliche Bestand- teile von EBA und Phosphat-Zement. Dtsch. Zahnartzl. Z., 30, 522, 1975.

28. Wennberg, A., Hasselgren, L. : A Method For Toxicity Screening of Biomaterials Using Cells Cultured On Millipore Filters. J. Biomed. Materi. Res., 13, 109,1979.

29. Woods, R.L., Kildea, F.M., Gabriel, S.A., Freilich, S.L. : A Histologic Comparison of Hydron and Zinc Oxide-Eugenol As Endodontic Filling Materials In The Primary Teeth of Dogs. Oral Surgery.. 58 : 82-93, 1984.

30. Wright, K.S., Barbosa V.S.. Araki, K. : In Vitro Antimicrobial And Cytotoxic Effects of Kri I Paste And Zinc-Oxide Eugenol Used In Primary Tooth Pulpecto- mies, Pediatric Dentistry, 16 : 102-106, 1994.

5.

7.

9.

i 0

11.

G.Ü. Dişhsk. Fak. Der. Cilt XII, Sayı 1, Sayfa 19-26, 1995

İMMÜNOSÜPRESYONUN TAM - KALINLIK DERİ ALLOGREFTLERİNİN REJEKSİYONU ÜZERİNE ETKİSİ (HİSTOPATOLOJİK ÇALIŞMA)

İhsan Levent ARAL*

Ö Z E T

Bu çalışma genel tıpta günümüzde organ transplantasyonlarında üçlü doz (Tripple dose) clarak kullanılan klasik immünosüpresif ajanlar-dan azathioprine [Aza), cyclosporine A(CycA) ve prednisolone'nun (Pred) tam-kalınlık deri allog-reftlerinin rejeksiyonuna olan etkilerini histopa-tolojik olarak araştırılması amacı ile deney hay-vanı olarak seçtiğimiz 36 adet fare üzerinde yü-rütüldü. Bu amaçla deney hayvanlarının sırtlarına tam-kalınlık deri allogreftleri transplante edildi.

Kontrol grubuna dahil edilen deney hayvan-larına hiçbir ilaç verilmezken üçlü doz immüno-süpresyon uyguladığımız gruba sistemik olarak Aza, CyA, Pred verildi.

Sonuçlar 7., 14. ve 21. günlerde değerlen-dirildiğinde; Üçlü doz immünosüpresyon uygula-dığımız grupta deri allogreftlerinin rejeksiyonu-nun önlenmediği aksine kontrol grubuna oranla 14. ve 21. günlerde greftleme bölgesindeki yara iyileşmesininde geciktiği gözlendi.

Anahtar Kelimeler : Azathioprine, Cyclos-porine A, Prednisolone, Deri Allogreftleri, Re-jeksiyon.

SUMMARY

The Effect of Imrruncsupressicn Cn The Rejec-tion of Full-Thickness Skin Allogrrts (Histopat-hological Study).

The present study was conducted in order to histopathological investigation the cumulative immunosuppressive effect of the administration of clasical immunosuppressive agents recently used in organ transplantation including azathiop-rine (Aza), cyclosporine A(CycA) and predniso-lone (Pred) when given in a tripple dose proto-col on the rejection of full-thickness skin allog-rsfs. For this purpose full-thickness skin allog-rafts were transplanted on the dorsum 36 se-lected mice while the mice in the control group no medication, a tripple dose of immunosupp-ression consisting of azathioprine, cyclosporine A and prednisolone was given to the experimen-tal group.

Histopathological examination was perfor-med on the 7th, 14th and 21th days. The findings of the present study demonstrated that the tripple dose protocol did not prevent graft re-jection. Furthermore a retardation in wound healing on the 14th and 21th days was noticed when compared to the control group.

Key Words : Azathioprine, Cyclosporine A, Frednisolone, Skin Allografts, Rejection.

GİRİŞ

Son 30 yıldır öncelikle hayvanlarda özel ba-ğışıklık hoşgörüsü yaratabilmek için uğraş ve-rilmiş ve böyle bir durum immünosüpresif ilaç-lar ve diğer bazı yöntemlerle oluşturulmuştur. Son yıllarda kişilere uygulanan organ greftleri-

nin alıcı tarafından reddedilmeksizin taşınması halinin immünosüpresif tedavinin başarısı ile doğru orantılı olduğu kabul edilmiştir (1).

G.Ü. Dişhek. Fak., Ağiz, Diş, Çene Hast. ve Cerrahisi A.B.D. Araş. Gör. Dr. Dt.

19

immünosüpresyonun Tam - Kalın (Histopatolojik Çalışma) G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995

Transplantasyonda ilerleme allogreft reddin-deki bağışıklık mekanizmasının tam olarak an-laşılamaması nedeni ile uzun süre doyurucu bo-yutlara ulaşamamıştır. Cerrahi riskler 1970 yı-lında % 5'e kadar düştüğü halde immünolojik sorunların çözülememesi belirgin bir ilerlemeye imkan vermemiştir. Azathioprine ve prednisolo-ne'nun red reaksiyonunun tedavisi amacı ile uy-gulammına başlanması sonucu greft yaşam sü-resi % 50'lere çıkarken enfeksiyona bağlı mor-talite % 15'lere ulaşmıştır (1).

Günümüzde kullanılan ve bugün artık rutin uygulanımı terk edilmiş ilaçlara baktığımızda; Steroidler, azathioprine, antilenfatik serum, siklofosfamid, aktinomycin C, heparin, metot-reksat, klorambusil, cyclosporine A'nın uygula-ma sahası bulduğunu görmekteyiz, (1, 2) bunun yanında immün terapiye destek vermek amacı ile ductus thoracicus ffstülü, radyasyon-ışınla-ma, timektomi ve splenektomi gibi immünosüp-resif tekniklerde kullanılan yöntemler arasmda-dır(1).

Günümüzde organ transplantasyonlarında birçok merkezde yaygın olarak uygulanan im-münosüpresif tedavi protokolü, Aza, Pred ve CycA'nın kombine kullanımını içeren üçlü doz terapidir (3).

1 - PREDNİSOLONE (Pred) :

Kortikosteroidler ilk olarak 1949 yılında Hench ve arkadaşları tarafından rheumatoid arthritisin tedavisinde kullanılmıştır (4). 1964 yılında Pred'nun red yanıtındaki etkileri göste-rilerek immünosüpresif ilaçlar arasındaki yerini almıştır M).

Kortikosteroidler immün reaksiyonunun gerek iltihab öncesi ve gereksede iltihab dö-nemini nonspesifik olarak baskılarlar. Ayrıca immünolojik nedenlere dayanmayan iltihabi reak-siyonuda baskılayarak, geniş spektrumlu ve güç-lü bir immünosüpresif etki gösterirler. T ve B lenfositlerinin antijeni tanımasını önlemezler, fakat T lenfositlerinin lenfokin salgılamasını ve böylece hücresel immünolojik reaksiyonu başlat-masını engellerler, B lenfositlerin antikor oluş-turma yeteneğini baskılarlar. Makrofajların ve onların prekürsörü olan monositlerin ve ayrıca

polimorfonükleer lökositlerin migrasyon ve fa-gositoz yeteneğini baskılar, lizozomları stabili-ze ederler. Lenfosit yıkımını hızlandırır, lenfo-peni yaparak lenfatik dokuyu küçültür ve kople-man sisteminin aktivasyonunu engellerler. Kor-tikosteroid ilaçlardan günümüzde genellikle prednisolone kullanılmaktadır (2).

Oral yoldan verilen prednisone prednisolo-ne dönüşerek etkisini gösterir (5, 6). Yapılan deneysel çalışmalar, antijen vücuda girmeden 4-8 saat önce Pred verildiğinde maksimum bir immünosüpresif etki oluşturduğunu bildirmekte-dir. Bu bulgulara dayanılarak prednisolone te-davisine operasyondan 24 saat önce başlanma-sı önerillir, ancak preoperatif olarak verilecek prednisolone miktarı merkezden merkeze değiş-mektedir (1).

2 - AZATHİOPRİNE (Aza) :

Aza purin analoglarındandır. Bu analoglar immünosüpresyonda 1952 yılından bu yana kul-lanılmaktadır (1). Bir purin antimetaboliti olan Aza vücutta yavaş olarak 6-Merkaptopurine (6MP) ve daha sonra bir ribünükleit türevine dönüşmek sureti ile etkinlik kazanır (2). 6MP'nin immünosüpresif etkisi Schwartz ve Dameshek tarafından vurgulanmıştır. Daha sonra 6MP'nin kimyasal yapısındaki yan dallara Calne ve arka-daşları tarafından imidazol halkası ilve edilerek Aza'nın deneysel böbrek allogreftlerinin yaşam süresini uzattığının tespit edilmesi, bu ilacın immünosüpresyon amacı ile yaygın olarak kul-lanılmasını sağlamıştır (1, 7).

Aza metabolitleri hücresel DNA'ya katılıp, purin nükleotit sentezi metabolizmasını baskılı-layarak RNA'nın sentez ve işlevini değiştirirler, lenfatik DNA ve RNA sentezi ile bunların pro-liferasyonu antijenik uyarı sonucu oluştuğun-dan, Aza effektör kolonların proliferatif döngü-sü sırasında B ve T lenfositleri üzerine erken evrelerde etki ederek immünosüpresyon oluş-tururlar (7, 8). Aza'nın immünosüpresif etkisi do-zaj, antijenin kuvveti uygulandığı filojenik gru-ba bağlı olarak değişebilmektedir. Büyük doz-lar insanda gecikmiş aşırı duyarlılığı azaltmakta küçük dozlar ise hasta antijenle karşılaştıktan sonra hassaslaşmış lenfositler üzerinde etkisi-ni göstermektedirler (1).

20

Cilt 12, Sayı 1 ARAL

3 - CYCLOSPORINE A(CyA) :

Cylindrocarpon lucidum ve trichoderma polysporum adlı funguslardan elde edilen ve moleküler ağırlığı 1202,6 olan 11 aminoasitli siklik bir polipeptir (2, 8).

Bu mantarlar birkaç tür Cy üretirler. Bun-lar sırası ile CyA, CyB, CyC, CyD, CyE olarak bilinmektedir (1). İlk kez 1972 yılında Borel ta-rafından yapılan araştırmalarda CyA'nın fungos-tatik özellikler içerdiği tespit edilmiş ve daha sonra aynı araştırmacı bu maddenin immüno-süpresif etkisinin daha ağır bastığını tespit ederek araştırmalarını bu yöne yöneltmiş ve böylelikle yeni bir immünosüpresif ilaç ortaya çıkmıştır (1,8).

CyA mide-barsak kanalından emilir, bu ne-denle ağızdan alınabillir. İlaç alındıktan sonra % 9O'ı plazma proteinlerine bağlanır, lenfosit-lere bağlanan miktar ise toplamın % 4-9'u ka-dardır. 50-100 ng/ml.'lik bir kan konsantrasyo-nu tüm lenfositleri etkilemek için yeterli ol-maktadır (1).

CyA halen kullanılmakta olan immünosüp-resif ilaçların en güçlü ve en spesifik olanıdır. Selektif olarak yardım-edici T lenfositlerini bas-kılar, bu etkisini nükleik asit sentezini engelli-yerek oluşturur ve böylece yardım-edici T len-fositlerinin lenfokinleri sentezlenmesi önlenir. Bu mekanizma lenfositlerin hücresel ve humo-ral immün reaksiyon ve inflamasyon oluşumun-daki stimülan etkisini baskı altına alır. CyA ay-rıca effektör T lenfositlerimde baskılar, ancak alt tipteki T lenfositleri ve doğal öldürücü (Na-turel killer) lenfositlere etkisi yoktur. Makro-fajların etkinliği üzerindeki baskılayıcılığı ye-tersiz derecede olduğundan Pred ile birlikte kullanılmaktadır (2).

İMMÜNOSÜPRESYON TEDAVİSİNİN KOMPLİKASYONLARI

İmmünosüpresif ilaçların özel immünolojik etkileri yanında bazı yan etkilerininde olması klinikte beklenmedik durumların ortaya çıkma-sına neden olabilmektedir. Bu komplikasyonlar

daha çok immünosüpresyonun aşırı uygulan-ması ile ilgilidir, ancak dengeli bir immünosüp-resif tedavide söz konusu riskle karşılaşılma olasılığı yüksek değildir (1).

Bu komplikasyonlara başlıklar halinde ba-kılacak olursa;

1 - BAKTERİYEL ENFEKSİYON :

İmmünosüpresif tedavi enfeksiyon riskini belirgin bir şekilde artırmaktadır. Enfeksiyon özellikle organ transplantasyonlarında hafife alınmaması gereken bir sorun olup, alıcılarda postoperatif dönemdeki en büyük ölüm sebebi-dir. Transplantlı hastalarda görülen erken ölüm-lere yüksek patojenitedeki bakterilerin yarattığı enfeksiyonların neden olduğu bilinmektedir. Di-ğer bir sorunda immünosüpresyonda patojen olmayan mikroorganizmaların patojen hale geç-mesi olgusudur, fırsatçı mikroorganizmalar adı verilen bu elemanlar transplantlı hastalarda ko-layca kolonize olabilmektedirler (1).

2 - MANTAR ENFEKSİYONLARI :

Bilindiği gibi fırsatçı mikroorganizmaların

başında mantarlar gelmektedir. Mantarlar üri-ner sistem yolları, deri ve merkezi sinir siste-mini istila ederek genel bir sepsis yaratabilirler Mantarlar içerisinde en sık enfeksiyon nedeni olarak Candida albicans ikinci olarak aspergillus ve daha ender olarakda rhyzopus oryzae, histop-lasma capsulatum ve criptococcus neoformas sa-yılabillir. Mantar enfeksiyonlarından korunma profilaktik bir ilacın mevcut olmaması nedeni ile ancak immünosüpresif ilaçların azaltılarak verilmesi ile gerçekleşebilir (1).

3 - VİRÜSLER :

Virütik enfeksiyonlar içerisinde en sık kar-şılaşılan herpes virüs enfeksiyonları olup, daha az sıklıkla sitomegalovirüs enfeksiyonlarıda gözlenebilmektedir. Viral enfeksiyonların teda-visinde son yıllarda geliştirilen bazı ilaçlarla ba-şarılı sonuçlar elde edilmekte olup, bu ilaçlar arasında idoksuridin, vidarabin monofosfat, trif-loratimidin ve asiklovir sayılabilir (1).

immünosüpresyonun Tam - Kalın (Histopatolojik Çalışma) G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995

4 - MALIGN TÜMÖRLER .-

Klinik transplantasyonlarda kanser insidansı umulmayacak kadar yüksektir. İmmünosüpresif ilaçlarla sadece bilinen bazı kanser türleri olu-şabilmektedir, bunların % 75'i epiteliyal kay-naklı kanserlerdir. Servikal carcinoma in-situ ve dudak Ca'ya sık olarak rastlamak mümkündür. Yassı epiteliyal hücreli kanser ve bazal hücreli kanser tüm habis tümörlerin % 50'sini oluştu-rurlar. Tümörlerin diğer bölümü lenfoid tipteki tümörler olup, bunların tedavileri oldukça zor-dur ve hemen tüm vakalar kaybedilmektedir. Dudak CA ve carcinoma in-situ standart cerrahi yöntemlerle tedavi edilirler. Transplantlı hasta-lardaki genel olarak yüksek olan bu kanser riski kuramsal olarak lenfositlerin kanserle mücadele veren hücreler oldukları ve işlevce azalmalarının kolayca kansere yol açtığı şeklinde yorumlanmaktadır (1).

İmmünosüpresif ilaçlar tüm bu komplikas-yonlarmın yanında özellikle çocuk hastalarda bü-yüme ve gelişmeyi engellemektedirler. Ayrıca özellikle kortikosteroidlerin yara iyileşmesi üze-rine olumsuz etkilerinin olduğu evvelden beri bilinmektedir (1).

GEREÇ VE YÖNTEM

Araştırmamızın deneysel aşaması A.Ü. Tıp Fak. Hayvan Yetiştirme ve Temin Laboratuva-nnda, histopatolojik değerlendirme aşaması ise G.Ü. Tıp Fak. Patoloji A.B.D.'ında gerçekleştiril-miştir.

Araştırmamız her biri 25 gr. ağırlığında toplam 36 adet Balb/c american türündeki be-yaz erkek fareler üzerinde yürütüldü. Fareler her bir grupta 18 adet olmak üzere kontrol ve üçlü doz immünosüpresyon terapi (Ü.İ.T.) olmak üzere iki gruba ayrıldı.

Kontrol grubuna herhangi bir ilaç verilmez-ken, Ü.İ.T. grubuna pednisolone «Linz» amp. (Fako İl. A.Ş. Levent-İSTANBUL) ve Sandimmun oral sol. (Sandoz İlaç San. Ltd. Şti. Levent-İS-TANBUL) ile İmuran 50 mg tab. (Wellcome İlaç Ürünleri Ltd. Şti. Levent-İSTANBUL) kombine olarak verilmiştir.

Her iki grup kendi içlerinde her biri 6 adet fareden oluşan 7. 14. ve 21. gün histopatolojik değerlendirme alt gruplarına ayrıldı.

Ü.İ.T. grubu olarak seçilen deney hayvan-larına greft transplantasyon işleminden 24 saat önce Pred 1 mg/kg/gün, CyA 8 mg/kg/gün ve Aza 2 mg/kg/gün dozunda olmak üzere verildi. Pred intraperitoneal olarak verilirken Aza ve Cya ağız sondası ile oral yoldan verildi (8). İlaç-lar her bir histopatolojik değerlendirme alt gru-bundaki hayvanlardan nekropsilerin alınacağı günlere kadar yukarıda belirtilen yöntem ve doz-da IXI olarak uygulandı.

Greft uygulanması; Her bir histopatolojik değerlendirme alt grubundaki deney hayvanları üçer üçer iki gruba ayrılarak, bu grublardan bi-rer adet deney hayvanı alındı. Alınan deney hay-vanlarının sırtları tıraşlanarak betadine sıvı sa-bun ile iyice silindikten sonra eter anestezisi altında 1X1 cm boyutlarında tam-kalınlık deri greftleri daha önceden steril gazlı bez üzerin-de çizdiğimiz şablona uygun olarak cerrahi di-siplinler altında alındı. Alınan greftler karşılıklı olarak deney hayvanlarının sırtlarında hazır-lanan alıcı greft yataklarına 6/0 vicryl ile diki-lerek adaptasyonları sağlandı.

Histopatolojik değerlendirme için deney hayvanlarından greftleme bölgesi, çevresi ve al-tındaki subkutan dokuyuda içerecek şekilde çı karılan nekropsiler % 10'luk formolde tespit edildi. Histopatolojik değerlendirmede; dikey boyutu korunarak tespit edilen nekropsi mater-yallerinden elde edilen kesitler hematoksilen ve eosin (H.E.) ile boyanarak Olympus BH5 ışık mikroskobunda yorumlanarak resimlendirildi.

BULGULAR

1 - KONTROL GRUBU :

Transplantasyonu izleyen 7. günde örnekle-rin büyük bir kısmında greftin koagülatif nekroz gösterdiği. Nekrotik greftlerin bazıları tek tük polimorfonükleer lökosit (PMNL) infiltrasyonu içermekteyken bazıları PMNL'den zengindi. PMNL infiltrasyonu göstermeyen nekrotik greft-

22

Cilt 12, Sayı 1 ARAL

le karekterli örneklerde greft yatağına uyan böl-gede kısmen PMNL infiltrasyonu gösteren geniş fibrin sahaları dikkati çekmekte idi (Resim 1).

kuşu ile dolduğu ve epitelizasyonun tamamlan-dığı görüldü (Resim 3).

Resim 1. 7. gün kontrol grubu; Greftte (G) total koagü-

latif nekroz ve greft yatağında seyrek PMNL infiltrasyonu gösteren fibrin tabakası (F) (X 100 Hemotoksilen ve Eosin).

Resim 3. 21. gün kontrol grubu; Greftleme bölgesinde

fibröz bağ doku gelişimi ve epidermisde reje-nerasyon. (X 100 Hemotoksilen ve Eosin).

2 - ÜÇLÜ DOZ İMMÜNOSÜPRESYON (Ü.İ.T.) GRUBU :

Transplantasyonun 14. gününde tüm örnek-lerde değişen şiddette doku iyileşmesi bulgu-landı. Bazı örneklerde greft atılmıştı ve bölge fibroblastik doku ile dolmuştu, epitelizasyon ta-mamlanmak üzereydi (Resim 2). Resim 2. 14. gün kontrol grubu; Greftleme bölgesinde

fibroblastlardan zengin bağ doku gelişimi ve epidermisde rejenerasyon. (X 100 Hemotoksilen ve Eosin).

Transplantasyonun 7. gününde hiçbir örnek-te canlı greftin bulunmadığı greftlerin ya çok az sayıda yada orta yoğunlukta PMNL infiltrasyonu gösteren koagülatif nekrozla karekterli olduğu izlendi. Örneklerin bir kısmında greft yatağın-da PMNL'den zengin fibrin alanların varlığı dik-kati çekerken, grefti çevreleyen dokularda ilti-habi granülasyon dokusu izlendi (Resim 4).

Transplantasyonun 21. gün örneklerinde greftleme bölgesinin arada mononükleer hücre infiltrasyonu içeren hücrelerden zengin bağ do-

Resim 4. 7. gün ü.-.lü doz immünosüpresycn terapi gru-bu; PMNL infiltrasyonu göstermeyen nekrotik greft (G), greft altında fibrin (F) ve daha altta iltihabı granülasyon dokusu (İ). (X 40 Hemotok-silen ve Eosin).

23

TERAPİ

■Wli£P

İmmünosüpresyonun Tam-Kalın (Histopatolojik Çalışma) G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995

14. gün örneklerinin bazılarında ise greftin atıldığı ve bölgenin likefaksiyon nekrozu ile uyumlu görünümü dikkati çekti. Bazı ör-neklerde nekrotik greft atıklarının yüzeyde ka-lın bir kurut tabakası oluşturduğu ve hemen ku-rut altında apse odakları gösteren kısmen orga-nize fibrin izlendi. Komşu canlı dokulardan fib-rin içine girmeye başlamış iltihabi granülasyon dokusu gözlendi (Resim 5). Resim 5. 14. gün üçlü doz immünosüpresyon terapi gru-

bu; Greftleme bölgesinde kurut tabakası, kurut altında fibrin (F) ve apse odakları (A). (X40

Hemotoksilen ve Eosin).

21. günde örneklerde bölgenin tümüyle sü-püratif karekterde olduğu ve iltihabi granülas-yon dokusu ile çevrelendiği izlendi (Resim 6).

Diğer örneklerde ise yara bölgesinde b,ağ doku ve epitel proliferasyonun devam ettiği an-cak orta kısımlarda nekrotik alanın hala varlığını sürdürdüğü görüldü.

TARTIŞMA

Klasik bilgiler hatasız kabul edilen bir cer-rahi işlemden sonra bile transplante edilen bir deri allogreftinin ikinci haftada red edildiğini bildirmektedir (2).

Günümüzde organ transplantasyonlarında red cevabını önlemek amacı ile birçok merkez-de rutin olarak uygulanan immünosüpresif teda-vi protokolü Pred, Aza, CyA'nın kombine kulla-nımını içeren üçlü doz uygulanımıdır (3).

Biz araştırmamızda organ transplantasyon-larında uygulanan bu üçlü doz tedavi