DİZEL EGZOZ PARTİKÜLLERİ VE SERUM OKSİDATİF STRESE DUYARLI HÜCRE İÇİ SİNYAL

İLETİ YOLAKLARINI ETKİLEMEK SURETİYLE HAVAYOLU HÜCRE CANLILIĞINI ETKİLEMEKTEDİR

Füsun FAKILI1,2, Bülent GÖĞEBAKAN2, Recep BAYRAKTAR2,Serdar ÖZTUZCU2, Hasan BAYRAM1,2

Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi 1 Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı, 2 Hücre Kültürü Laboratuvarı

Türk Toraks Derneği 13. Yıllık Kongresi 2010

Giriş-1

• Artmış 10µm partiküler madde (PM10) ile solunumsal ve

kalp hastalıklarına bağlı mortalite ve morbidite arasında yakın bir ilişki mevcut

- McConnell R et al, AJRCCM 2003,

- Pope CA et al, NEJM 2004

• Dizel egzoz partikülleri (DEP) hava yolu epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımını arttırırlar - Bayram H et al, AJRCMB 1998

Giriş-2

• DEP, serumsuz ortamda, oksidatif stresi artırmak,

p21CIP1/WAF1 ekspresyonunu baskılamak, JNK ve NF-B

yolaklarını uyarmak suretiyle A549 hücre

proliferasyonunu artırabilir ve apopitozisi baskılayabilir.

-Bayram H et al, Eur Respir J 2006

Giriş-3

• Astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) gibi hava yolu inflamasyonu ile seyreden hastalıklarda c-Jun N-Terminal Kinaz (JNK), ‘Extra Cellular Regulated Kinase’ (ERK) ve Nuclear Factor (NF)-kB yolakları aktive olmaktadır.

- Hoshino S et al, Biochemical and Biophysical Research Com. 2005- Rahman I. Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2003- Lee YC at al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2008- Edwards MR et al, Pharmacology & Therapeutics 2009.

Amaç

• İn vitro hücre kültürü ortamında serum kullanarak inflame hava yolu modeli oluşturmak

• Sürece oksidatif stresin etkisini ve c-jun N Terminal Kinase (JNK), Extra Regulated Kinase (ERK) ve Nuclear Factor (NF)-κB sinyal ileti yolaklarının rolünü araştırmak

• DEP’nin bu koşullarda hava yolu epitel hücre canlılığı, apoptozi ile p21, p27 ve p53 ekspresyonuna etkisini araştırmak

Metodlar-1• A549, BEAS-2B ve primer bronş epitel hücre

kültürleri %0, 1, 3.3 ve 10 FCS varlığında 48 saat süreyle, N-asetil sistein (NAC), JNK inhibitörü (SP600125), ERK inhibitörü (PD 98059) ve NF-B inhibitörü (SN50) varlığında veya yokluğunda 0, 50, 100, 200, 400 ve 1000 g/ml DEP 'ne maruz bırakıldı

• Hücre canlılığı MTT boyama yöntemi ile değerlendirildi

Metodlar-2

• Hücreler Annexin V-PE (turuncu floresan) ve

7AAD (kırmızı floresan) içeren kit ile aynı anda

boyanarak apoptotik hücrelerle nekrotik hücreler

akım sitometri ile değerlendirildi.

• p21, p27 ve p53 ekspresyonu ‘real time’ PCR

yöntemi ile değerlendirildi.

DEP’nin Farklı Serum Konsantrasyonlarında A549 Hücre Canlılığına Etkisi

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

DEP (g/ml) + FCS (%0)

*** ******

**

Opt

ik D

ansi

te

0 50 100

200

400

1000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

***

DEP (g/ml) + FCS (%1)

Opt

ik D

ansi

te

0 50 100

200

400

1000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

* **** ***

***

DEP (g/ml) + FCS (%3.3)

Opt

ik D

ansi

te

0 50 100

200

400

1000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

***

DEP (g/ml) + FCS (%10)

Opt

ik D

ansi

te

*p<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001 - 0µg/ml DEP

DEP’nin Farklı Serum Konsantrasyonlarında BEAS-2B Hücre Canlılığına Etkisi

0 50 100

200

400

1000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0**

***

*** ***

DEP (g/ml) + FCS (%1)

Opt

ik D

ansi

te

0 50 100

200

400

1000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

***

*** *** ***

*

DEP (g/ml) + FCS (%0)

Opt

ik D

ansi

te

0 50 100

200

400

1000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*** ***

*

*

DEP (g/ml) + FCS (%3.3)

Opt

ik D

ansi

te

0 50 100

200

400

1000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

***

***

DEP (g/ml) + FCS (%10)

Opt

ik D

ansi

te

*p<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001 - 0µg/ml DEP

DEP’nin Farklı Serum Konsantrasyonlarında Primer Bronş Epitel Hücre Canlılığına Etkisi

0 50 100 2000.0

0.5

1.0

1.5

*

***

DEP (g/ml) + FCS (%0)

Opt

ik D

ansi

te

0 50 100 2000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

****

DEP (g/ml) + FCS (%3.3)

Opt

ik D

ansi

te

0 50 100 2000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*

***

DEP (g/ml) + FCS (%1)

Opt

ik D

ansi

te

0 50 100 D2000.0

0.5

1.0

1.5

*** ******

DEP (g/ml) + FCS (%10)

Opt

ik D

ansi

te

*p<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001 - 0µg/ml DEP

NAC ve JNK İnhibitörlerinin Serumun (%3.3) ve DEP(200µg/ml)’in Modifiye Ettiği A549 Hücre Canlılığına Etkisi

0 3.3 10 33 0 3.3 10 330.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

%3.3 FCS + NAC(mM)

DEP (200g/ml)

*** ***

***

***

Opt

ik D

ansi

te

0DMSO 3.3 10 33 0

DMSO 3.3 10 33

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

***

***

DEP (200g/ml)

%3.3 FCS+JNK inh.(M)O

ptik

Dan

site

NAC JNKinh.

***p<0.0001- 0µg/ml DEP♦p<0.0001- 200µg/ml DEPΦp<0.01- 200µg/ml DEP + DMSO

ERK ve NF-κB İnhibitörlerinin Serumun (%3.3) DEP(200µg/ml)’in Modifiye Ettiği A549 Hücre Canlılığına Etkisi

0

DMSO 3.3 10 33 0

DMSO 3.3 10 33

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

****** ***

DEP (200g/ml)

***

%3.3 FCS+ ERK inh.(M)

Opt

ik D

ansi

te

0 3.3 10 33 0 3.3 10 330

1

2

3

*** ******

DEP (200g/ml)%3.3 FCS+ NFKB inh.(M)

Opt

ik D

ansi

te

***p<0.0001- 0µg/ml DEP

ERKinh. NF-kBinh.

DEP’nin (200 μg/ml) %3.3’lük FCS Ortamında A549 Hücre Apoptozisine Etkisi

LL(A-/P-) LR(A+/P-) UR(A+/P+) UL(A-/P+)0

5

10

15

20

60

90

120FCS (% 3.3)

FCS (%3.3) +DEP (200g/ml)

Kadranlar

Hücr

eler

%

SF 0 50 2000.00

0.05

0.10

0.15

0.20

%3.3 FCS + DEP(g/ml)

** **p<0.05; **p<0.005 -0g/ml DEP

p53

mR

NA

Eks

pres

yonu

(% G

APD

H)

SF 0 50 2000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

%3.3 FCS + DEP (g/ml)

p21

mR

NA

Eks

pres

yonu

(% G

APD

H)

SF 0 50 2000.00

0.05

0.10

0.15

%3.3 FCS + DEP(g/ml)

p27

mR

NA

Eks

pres

yonu

(% G

APD

H)

DEP’nin %3.3’lük FCS Ortamında A549 Hüc.de p53, p21, p27 mRNA Ekspresyonuna Etkisi

p21 p27

p53

Özet-1• DEP serumsuz ortamda hücre canlılığını artırırken, serumlu ortamda (%3.3),

A549 hücre canlılığını baskılamaktadır

• Oksidatif stres ve oksidatif strese duyarlı yolaklar (JNK ve ERK) ile NF-κB yolağının bu süreçteki rolü sınırlı görünmektedir

• NAC ile JNK, ERK ve NF-κB inhibitörleri serumun olduğu ortamda A549

hücre canlılığını baskılamaktadır.

• DEP serumlu ortamda A549 hücre apoptozis/nekrozunu etkilememektedir.

• DEP %3.3’lük serum ortamında A549 hücrelerinden p53 ekspresyonunu artırmaktadır.

• DEP düşük konsantrasyonlarda hem serumsuz hem de serumlu ortamda BEAS-2B hücre canlılığını arttırmakta ancak yüksek konsantrasyonlarda baskılamaktadır

• DEP hem serumsuz hem de serumlu ortamda primer bronş epitel hücre canlılığını baskılamaktadır

Özet-2

• BEAS-2B hücrelerinde %0-3.3 FCS ortamında düşük DEP konsantrasyonları hücre canlılığını artırırken, yüksek konsantrasyonlar hücre canlılığını baskıladı. %10 FCS kullanıldığında ise yüksek DEP dozları hücre canlılığını baskıladı.

• Primer bronş epitel hücrelerinde ise yüksek DEP konsantrasyonları % 0-10 FCS ortamında hücre canlılığını baskıladı.

Sonuç• Hava yollarında inflamasyonun eşlik ettiği KOAH ve astım

gibi hastalıklarda görülen JNK, ERK ve NF-kB aktivasyonundan hava yolu mukozasına olan serum sızıntısı kısmen de olsa etkili olabilir.

• Bu koşullarda DEP gibi kirleticilerin hücre düzeyindeki toksik etkileri artabilir.

• Hava yollarının farklı kökendeki epitel hücreleri DEP’nin toksik etkilerinden değişen derecelerde etkilenebilirler.

• Altta yatan mekanizmaların daha fazla araştırılması gerekmektedir.

• Bu çalışma Gaziantep Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

Teşekkürler…