francisco gilberto oliveira
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FRANCISCO GILBERTO OLIVEIRA
ASPECTOS ANATÔMICOS DO OLHO E NEUROQUÍMICOS DA
RETINA DO MOCÓ (Kerodon rupestris)
Tese apresentada à Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, para obtenção do título de
Doutor em Psicobiologia.
NATAL
2013
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FRANCISCO GILBERTO OLIVEIRA
ASPECTOS ANATÔMICOS DO OLHO E NEUROQUÍMICOS DA
RETINA DO MOCÓ (Kerodon rupestris)
Tese apresentada à Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, para obtenção do título de
Doutor em Psicobiologia.
Área de concentração: Psicologia Fisiológica
Orientadora: Profa. Dra. Miriam Stela Maris de
Oliveira Costa
Co-Orientadora: Profa. Dra. Belmira Lara da
Silveira Andrade da Costa
NATAL
2013
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Dedico este trabalho à minha família: Minha esposa Telma, meus filhos Débora,
Diego, Raquel e Filipe, meus netos Gabriel, Rafael e Rebeca, e aos meus pais Raimundo e
Lourdes.
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AGRADECIMENTOS
À Professora Dra. Miriam Stela Maris de Oliveira Costa pela orientação, serenidade,
paciência, ensinamentos, dedicação e amizade, muito obrigado pela oportunidade.
À Professora Dra. Belmira Lara que dedicou muito do seu pouquíssimo tempo,
colaborando com sugestões, protocolos, correções, idéias e muita paciência e boa vontade.
Ao Professor Jeferson, com quem tive o primeiro contato em Natal e desde então se
prontificou a colaborar no que fosse necessário. Fez parte da minha seleção inicial e por força
de compromissos não pode participar da banca. Muito grato pela amizade, pelos ensinamentos
e pela disponibilidade sempre. Receba cordiais saudações rubronegras.
Aos Professores Dr. Fabricio e Dra. Patricia que gentilmente aceitaram nosso convite,
largaram seus afazeres e vieram de Recife e do Rio de Janeiro respectivamente, contribuir
com seus conhecimentos e sugestões para o aprimoramento do nosso trabalho.
Ao Professor Dr. Daniel pela colaborado com o nosso trabalho desde o seu início,
tendo contribuído com sugestões na seleção inicial, na qualificação e agora como membro da
banca.
Ao Professsor Dr. Judney que também compõe a banca e que no dia-a-dia do
laboratório sempre colaborou com o que foi preciso.
Ao Professor Dr. Expedito, chefe do Departamento de Morfologia, pela parceria,
amizade, conselhos e disponibilidade.
Ao incentivo, apoio e amizade de todos os companheiros do Laboratório de
Neuroanatomia, com quem tive a oportunidade e a imensa satisfação de dividir a bancada:
Adriana, Alane, André, Eudes, Fausto, Filipe, Franco, Janaína, Joacil, Karen, Katia, Kayo,
Leandro, Mariana, Melquizedec, Nayra, Paulo, Rayane, Renata, Rodolfo, Rovena, Ruthnaldo,
Twyla, e Wylqui.
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À Miriam Regina Celi, técnica do laboratório de Neuroanatomia pela grande
colaboração e amizade.
Ao Departamento de Morfologia por todo o suporte necessário.
Aos companheiros do laboratório de Neurofisiologia da UFPE, que me deram sempre
muito suporte quando das minhas estadas em Recife: Alinny, Aluizio, Davi, Eraldo, Igor,
Pablo, Priscila, Rafael, Renata e Ricielle
Aos Professores que compartilham o laboratório de Neurofisiologia da UFPE, Ângela,
Catarina, Marcelo, Reginaldo, e Valdir, pela colaboração.
À Socorro, Melina e Lourdinha, pelo auxílio técnico no laboratório de histologia da
UFRN.
À Zenira Cosme Xavier pela assistência técnica no laboratório de Neurofisiologia da
UFPE.
A minha família que me apoiou, incentivou, motivou e proporcionou o suporte
necessário.
Aos amigos Ângela e Cicero pela motivação permanente e grande incentivo.
Ao amigo Davis Landim pela colaboração na elaboração das figuras.
Aos funcionários e Professores do Departamento de Morfologia pela disponibilidade
apoio e amizade.
Ao Instituto Internacional de Neurociências de Natal pelo treinamento em microscopia
e utilização do miscroscópio confocal.
Ao Instituto do Cérebro de Natal pela utilização do microscópio confocal.
Aos Laboratório de Bioquímica da UFRN e de Citogenética da UFPE pela utilização
do microscópio de imunofluorescência.
À Universidade Regional do Cariri (URCA) pela liberação que me foi concedida para
cursar o doutorado.
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À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, pela
bolsa de doutorado, demais órgãos de fomento que deram suporte a pesquisa: CNPq,
FAPERN, FINEP e a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho.
Finalmente quero fazer um agradecimento especial ao Professor Milton Thiago de
Melo, da UNB, pelo grande incentivo que me deu ainda no início da graduação, em 1998,
quando nos encontramos em um congresso em Salvador e tive então o privilégio de conhecê-
lo.
8
Diz o preguiçoso: "amanhã farei".
Exclama o fraco: "amanhã, terei forças".
Assevera o delinqüente: "amanhã, regenero-me".
É imperioso reconhecer, porém, que a criatura, adiando o esforço pessoal, não alcançou,
ainda, em verdade, a noção real do tempo.
Quem não aproveita a bênção do dia, vive
distante da glória do século.
(Chico Xavier)
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RESUMO
O sistema visual representa um importante elo entre o animal e o ambiente, com
profundas influências sobre os hábitos e estilo de vida nos mais diversos habitats.
Mecanismos adaptativos ao nicho temporal estão presentes no sistema visual de muitos
vertebrados, envolvendo modificações nas dimensões e desenho ocular, distribuição de
células retinianas, e organização dos circuitos neuroquímicos relacionados com a resolução ou
sensibilidade retiniana. O sistema sensorial do olho é representado pela retina, cuja
organização é responsável pela recepção, análise inicial, e transmissão da informação para o
cérebro. O conhecimento da posição dos olhos na cabeça e a distribuição das células
retinianas permitem identificar aspectos adaptativos de cada espécie ao seu campo visual, o
qual é característico ao nicho ecológico que ocupa. Nesta pesquisa, estudamos características
anatômicas do olho e neuroquímicos da retina do mocó (Kerodon rupestris), roedor
tipicamente brasileiro da subordem Hystricomorpha, família Caviidae. O mocó tem olhos
laterais, órbita óssea bem constituída e musculatura extrínseca bem diferenciada. O estudo da
anatomia descritiva e morfométrica do olho mostrou valores médios de diâmetro axial
10.7±0,5mm e diâmetro equatorial de 11.6±0.7mm. Possui pupila em fenda e cristalino com
diâmetro axial médio de 5.4±0.03 mm, correspondendo a ~45% do diâmetro axial do olho. A
distância nodal posterior e o fator de magnificação retiniana foram estimados como sendo
6.74 mm e 118 µm/grau, respectivamente. Montagens planas foram processadas para
marcação de Nissl, e a distribuição topográfica de células ganglionares mostrou uma
moderada faixa visual pouco abaixo do disco óptico, com maior densidade na retina ventral.
Secções verticais e montagens planas da retina foram processadas por imunohistoquímica
para visualização de tirosina hidroxilase (TH) e dois tipos de células TH+ foram detectados.
As células do tipo I, apresentaram forte imunorreatividade a TH, corpo celular variando de
120,047 a 269,373 µm2 com estratificação na sublâmina 1 da IPL. As células do tipo II
apresentaram fraca imunorreatividade a TH, corpos celulares localizados principalmente na
IPL variando de 54,848 a 177,142 µm2, constituindo ~10% das células TH
+. Os dois tipos
celulares apresentaram uma similar distribuição topográfica com maior densidade localizada
em uma faixa horizontal ao longo do eixo naso-temporal na porção superior da retina. A
população total de células dopaminérgicas estimada foi em média 2.156±469.4 células, com
uma área média de 198.164 µm2. A presença de cones e bastonetes foi detectada por
imunohistoquímica tanto em secções verticais quanto em montagens planas. Os cones S têm
10
uma densidade aproximadamente 10 vezes menor dos que os cones L, com diferentes graus de
organização espacial. Outras populações neuronais da retina do mocó também foram
detectadas em secções verticais com marcadores específicos. Análise comparativa das
características anatômicas do olho do mocó sugere que o mesmo foi projetado para adquirir
maior sensibilidade à luz, em detrimento da nitidez da imagem, compatível com uma visão
em condições mesópicas. Adicionalmente, a distribuição dos 2 subtipos de células
dopaminérgicas em uma faixa naso-temporal na retina superior parece adequada para um
ganho em sensibilidade, coerente com as características de um animal com padrão de
atividade predominantemente crepuscular.
Palavras-chaves: cones, bastonetes, células ganglionares, dopamina, olho, visão.
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ABSTRACT
The visual system is an important link between the animal and the environment, com
profound influences on the habits and lifestyle in various habitats. Adaptive mechanismsto the
temporal niche are present in the visual system of many vertebrates, involving changins in
ocular dimensios and design, retinal cell distribution and organization of neurochemical
circuits related to the retinal resolution or sensitivity. The sensory system of the eye is
represented by the retina, whose organization is responsible by receipty, initial analysis, and
transmission of the information to the brain. The knowledge of the position of the eyes in the
head and the distribution of retinal cells allow to identify adaptive aspects of each species to
its visual field, which is characteristic to the ecological niche it occupies. In this research, we
study eye anatomical characteristics and retina neurochemical features of the rock cavy
(Kerodon rupestris), a tipical Brazilian rodent from the suborder Hystricomorpha, family
Caviidae. The rock cavy has lateral eyes well constitute bony orbit and well differentiated
extrinsic muscle. The study of the descriptive and morphometric anatomy of the showed mean
values of axial diameter 10.7±0,5mm and equatorial diameter 11.6±0.7mm. The pupil is slit
shaped and the lens has mean axial diameter 5.4±0.03 mm, corresponding to ~45% of the
axial diameter of the eye. The posterior nodal distance and the retinal magnification factor
were estimated at 6.74 mm e 118 µm/grau, respectively. Flat mounts were processed for Nissl
stain, and the topographic distribution of ganglion cells showed a moderate visual band, just
below the optic disc, with higher density in the ventral retina. Retinal vertical sections and flat
mounts were processed for immunohistochemistry to visualize tyrosine hydroxilase (TH) and
thus two types of TH+ cells were detected. Type 1 cells had strong TH-immunoreactivity, the
body cell varied from 120.047 to 269.373 µm2 stratifying in the sublamina 1 of the IPL. Type
2 cells were weakly TH-imunoreactive, had cell body located mostly in the IPL, varying from
54.848 to 177.142 µm2, constituting ~10% of the TH
+ cells. Both cell types exhibited similar
topographic distribution with higher density found in a horizontal band along of the naso-
temporal axis in the dorsal retina. The total population of dopaminergic cells was 2,156±469,4
cells, occupying an average area of 198,164 µm2. The presence of cones and rods was
detected by immunohistochemistry in vertical sections and flat mounts. S cones density is
around 10 times smaller than L cones, with different degree of spatial organization. Other
retinal neuronal populations of the rock cavy were also detected in vertical sections with
specific markers. Comparative analysis of the anatomical characteristics of the rock cavy eye
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suggest that it was designed to acquire higher sensitivity to light, at expense of image
sharpness, compatible with a vision at mesopic conditions. Additionally, the distribution of
the 2 subtypes of dopaminergic cells in a naso-temporal band in the dorsal retina seems
suitable to a gain in sensitivity, coherent with an animal with predominantly crepuscular
activity pattern.
Keywords: cones, dopamine, eye, ganglion cells, rods, vision.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
1.1 Aspectos anatômicos e eco-fisiológicos da visão 14
1.2 O processamento visual e a estrutura interna da retina 17
1.3 O epitélio pigmentar 20
1.4 Fotorreceptores 21
1.5 Células horizontais 24
1.6 Células bipolares 27
1.7 Células amácrinas 29
1.8 Células ganglionares 33
1.9 Opsinas na evolução de mamíferos 36
1.10 Sistemas paralelos de transmissão dos níveis de intensidade luminosa:
vias ON e OFF
38
1.11 A retina como oscilador e os ritmos da retina 41
1.12 Sistemas fotossensíveis na retina interna - Papel da melanopsina 46
1.13 Importância da dopamina para a transição claro/escuro 51
1.14 O mocó como modelo experimental 55
2 OBJETIVOS 59
3 MATERIAIS E MÉTODOS 60
4 RESULTADOS 69
4.1 Primeiro artigo 70
4.2 Segundo artigo 93
4.3 Terceiro artigo 124
4.4 Outros resultados 143
5 CONCLUSÕES 147
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 148
7 ANEXOS 178
14
1. INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos anatômicos e eco-fisiológicos da visão.
O estudo das estruturas anatômicas que evolutivamente foram desenvolvidas por
diferentes animais objetivando a captação de luz e sua utilização como indicativo do ambiente
em sua volta, nos mostra uma imensa gama de tamanhos, formatos e princípios ópticos
envolvidos, fornecendo evidências de que a óptica fisiológica é relativamente plástica,
segundo palavras de Silveira (1985).
Inúmeros mecanismos adaptativos ao nicho temporal estão presentes no sistema visual
de muitos vertebrados. Além de modificações nas dimensões e desenho ocular e na
distribuição de células da retina, estes mecanismos envolvem também alterações na
organização dos circuitos neuroquímicos relacionados com a resolução ou detecção de
mudanças nos níveis de iluminação (Land & Nilsson, 2008), enquanto a simetria de como o
ambiente é percebido é refletido no arranjo das células retinianas.
A qualidade do sistema óptico pode limitar a quantidade de informações que serão
disponibilizadas para o cérebro, uma vez que a retina só pode codificar as informações que
estão presentes nas imagens. Entretanto, a forma, o tamanho da pupila e o ajuste de foco são
também particularmente importantes se um animal tem olhos adaptados para usar sob
condições fotópicas, mesópicas ou escotópicas (Malmström & Kröger, 2006).
O sistema visual como um todo, independente do seu estágio de complexidade na
escala filogenética, apresenta-se como um importante componente do SNC que visa uma
integração do indivíduo com o meio. Trata-se de um sistema sensorial de grande importância
adaptativa e constitui um importante elo entre o animal e o ambiente em sua volta, refletindo
15
profundas influências dos hábitos e estilos de vida nos mais diversos habitats (Walls, 1942;
Hughes, 1977; Peichl, 2005; Collin, 2008).
Nessa perspectiva, o olho funciona como canal de entrada, sendo um órgão bastante
complexo e do ponto de vista funcional, constituído por dois sistemas, que apesar de distintos,
possuem funções complementares: o primeiro, formado por um sistema óptico capaz de
dirigir a penetração dos raios luminosos, tornando possível a formação de imagens do
ambiente e o segundo, por um sistema sensorial, capaz de extrair informações da imagem
formada.
Fazem parte do sistema óptico, os elementos refrativos, as estruturas para
acomodação, a pupila e a hemisfera posterior do olho.
O sistema sensorial é representado pela retina, que organizada radialmente em
diferentes camadas morfofuncionais, é responsável pela recepção, análise inicial e
transmissão da informação para o encéfalo.
Diferentemente de outros órgãos sensoriais, a retina é derivada de uma porção do
mesmo ectoderma neural que origina o resto do sistema nervoso central, com o qual mantém a
conexão após migrar para a periferia (Graw, 1996). Além disso, a organização sináptica da
retina é similar àquela de outras regiões do cérebro, apresentando uma grande complexidade
funcional dentro de uma aparente simplicidade estrutural (Masland & Raviola, 2000). Sobre
esse tecido neural é projetada uma imagem do mundo externo, invertida e focada como numa
câmera fotográfica.
A retina dos vertebrados é uma extensão do encéfalo, um tecido neural sobre o qual é
mapeada uma imagem do ambiente visual de cada espécie particular. Cada ponto no espaço
visual corresponde a um ponto na retina neural a qual é retinotopicamente mapeada nos
centros visuais encefálicos (Hughes, 1977; Collin, 2008). A energia luminosa, ou imagem
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óptica, é transformada em impulsos elétricos, ou linguagem neural, através de uma rede
neuronal que se inicia a partir dos fotorreceptores e, através da participação direta das células
bipolares e da modulação feita por interneurônios (células horizontais, amácrinas e
interplexiformes), ativa as células ganglionares que conduzirão as informações para os
núcleos visuais encefálicos via nervo óptico (Wässle & Boycott, 1991; Wu, 1992;
Reichenbach & Robinson, 1995; Collin, 2008).
A análise topográfica da densidade das células ganglionares da retina proporciona
informações valiosas sobre a presença de especializações definidas pelo padrão de variação da
densidade. Estudos da topografia dessas especializações fornecem informações sobre a
localização de áreas de maior acuidade visual, e de como elas se relacionam com regiões do
campo visual de interesse para os hábitos de vida de cada animal (revisões em Hughes, 1977;
Ali, 1981; Collin, 1999, 2008). Medidas de espaçamento celular em regiões de pico de
densidade de fotorreceptores e de células ganglionares também possibilitam estimar o poder
de resolução espacial de cada especialização (Rolls & Cowey, 1970; Rodieck, 1973; Frisen &
Frisen, 1976; Collin & Pettigrew, 1988a, b; Collin & Pettigrew, 1989; Shand et al., 2000;
Miyazaki et al., 2002).
Dentre as especializações retinianas definidas pela distribuição das células
ganglionares destacam-se a fóvea e a area centralis. Ambas são regiões caracterizadas pela
alta densidade celular em relação a outras regiões da retina. A fóvea caracteriza-se por ser
uma depressão do tecido neural que se origina do afastamento centrífugo das camadas mais
internas de modo que a luz incide diretamente sobre os fotorreceptores. A area centralis é
uma região onde ocorre aumento concêntrico na densidade das células retinianas com um pico
de densidade pontual (Duke-Elder, 1958; Hughes, 1977; Collin, 1999).
Além de uma distribuição topográfica em forma de fóvea ou area centralis, também
foi descrita uma especialização retiniana em forma de faixa, caracterizada por uma variação
17
baixa nos valores de densidade celular em um dos meridianos da retina, que foi designada de
faixa visual ou "visual streak". Chievitz (1889, 1891) e Slonaker (1897) apud Collin &
Pettigrew, 1988b, foram os primeiros a descrever, em vertebrados, uma região da retina em
forma de faixa. Estas regiões em forma de faixa muitas vezes estão associadas com um
espessamento da retina frequentemente observável sem o uso de microscópio óptico. Alguns
autores especulavam que estas áreas eram regiões que permitiam um poder de resolução
maior (Munk, 1970 apud Collin, 1999). Contudo, Walls (1942), sugeriu que estas poderiam
ser também áreas de sensibilidade aumentada.
Postulou-se então, que estas zonas em forma de faixa permitem ao animal
esquadrinhar o horizonte sem a necessidade de movimentos oculares significativos, os quais
são necessários para explorar uma imagem visual quando uma area centralis ou uma fóvea
estão presentes (Rowe & Stone, 1977; Tancred, 1981; Collin & Pettigrew, 1988a; Collin,
1999). A presença de uma faixa visual também possibilita a percepção de movimentos com
um limiar de sensibilidade menor. Em várias espécies de vertebrados, as especializações
retinianas em forma de faixa possuem uma representação desproporcionalmente grande no
tecto óptico, o que ressalta a sua importância funcional (Jacobsen, 1962; Heric & Kruger,
1965; Bravo & Pettigrew, 1981; Ito & Murakami, 1984; Collin & Pettigrew, 1988b; Collin,
1999)
1.2 O Processamento Visual e a estrutura interna da Retina
Desde a primeira sinapse, a retina origina diferentes caminhos de processamento
paralelo, que são especializados para diferentes parâmetros da informação visual, tais como
níveis de intensidade luminosa, cor, contraste, ou detecção de movimento, e que são mantidos
em paralelo por muitas etapas de processamento neural até a percepção consciente, a ser
obtida no neocórtex (Meister & Berry, 1999; Wurtz & Kandel, 2000; Wässle, 2004).
18
Essa organização em rotas paralelas é feita por fibras do tracto óptico que terminam
em diferentes áreas subcorticais, tais como complexo geniculado lateral, pretecto, colículo
superior, núcleos do sistema óptico acessório, núcleo supraquiasmático e outras. Estas áreas
desempenham diferentes papéis no processamento visual e recebem informações de diferentes
tipos de células ganglionares retinianas (Wässle, 2004).
A retina de mamíferos, com uma espessura de aproximadamente 200 micrômetros,
contém cerca de 55 tipos morfológicos de células distribuídas entre as categorias de células
fotorreceptoras, células bipolares, células horizontais, células amácrinas/interplexiformes e
células ganglionares (Masland & Raviola, 2000; Masland, 2001a, b; Wässle, 2004). Seus
corpos celulares, prolongamentos e conexões sinápticas estão arranjados de forma laminar,
podendo-se distinguir na retina as seguintes camadas, a partir da superfície externa: (1) o
epitélio pigmentar (componente não neural) (PE); (2) a camada dos fotorreceptores (PL), que
contém os segmentos externos e internos dos cones e bastonetes; (3) a camada nuclear externa
(ONL), que contém os corpos celulares dos cones e bastonetes; (4) a camada plexiforme
externa (OPL), que contém os terminais axônicos dos cones e bastonetes e os dendritos das
células horizontais e bipolares; (5) a camada nuclear interna (INL), que contém os corpos das
células horizontais, bipolares e amácrinas; (6) a camada plexiforme interna (IPL), que contém
os terminais axônicos das células amácrinas e bipolares e dendritos das células ganglionares;
(7) a camada de células ganglionares (GCL), que contém os corpos das células ganglionares e
amácrinas deslocadas e (8) a camada de fibras ópticas (OFL), representada pelos axônios das
células ganglionares constituindo o nervo óptico, que se projeta para diversas áreas como
acima descrito.
As células ganglionares definem a resolução retiniana das imagens, as quais são
percebidas pelo sistema nervoso central e desempenham um importante papel no seu
comportamento. Assim, se por um lado a população de fotorreceptores determina o número
19
máximo de pontos luminosos disponíveis na retina, as células ganglionares limitam a
proporção dessas informações enviando-as centralmente. O conhecimento da posição dos
olhos na cabeça e da distribuição de células retinianas possibilita identificar adaptações de
cada espécie ao seu campo visual, o qual é peculiar para cada estilo de vida dentro do nicho
ecológico que ele ocupa (Collin, 2008). A distribuição topográfica das células ganglionares
em cada espécie examinada vem a ser única, “uma impressão digital”, que reflete a simetria
de como o mundo é percebido e pode explicar comportamentos visuais, tais como movimento
dos olhos e adaptações para um aumento de resolução no campo visual ao longo de vários
eixos (revisão em Hughes, 1977; Collin, 1997; 1999; 2008).
Um subtipo específico de células ganglionares projeta diretamente para o núcleo
supraquiasmático (SCN) do hipotálamo (Moore et al., 1995; Provencio et al., 1998),
considerado o principal marcapasso circadiano em mamíferos, não estando envolvidas com o
sistema formador de imagens. Investigações recentes confirmam que estas células
ganglionares podem ser diretamente fotossensíveis podendo atuar como fotorreceptores
circadianos (Bellingham & Foster, 2002; Hannibal et al., 2002; Paul et al., 2009).
Além dos tipos neuronais que formam as camadas da retina, há também as células de
Müller, células gliais radiais que abrangem toda a profundidade da retina neural e representam
o principal tipo de células da glia presente na retina de todas as espécies de vertebrados.
Assim como outras células da glia, as células de Müller expressam uma grande variedade de
canais iônicos voltagem dependentes, além de vários tipos de receptores, incluindo receptores
de GABA (Malchow et al., 1989; Reichelt et al., 1996) e de glutamato (Schwartz, 1993). As
células de Müller atuam sustentando, nutrindo e isolando os neurônios da retina, bem como
interferindo na comunicação entre as camadas plexiforme externa e plexiforme interna
(Cormack, 2003).
20
As células de Müller, controlando a concentração de substâncias neuroativas no
espaço extracelular, podem modular significativamente a atividade neuronal. Uma redução na
captação de glutamato ou GABA, pode levar a um aumento da transmissão sináptica. O
acúmulo de K+ no espaço extracelular, resulta de uma redução na remoção de K
+ pelas células
de Müller, o que leva a uma excitabilidade neuronal. Variações no pH também podem
modular a atividade neuronal. Mesmo a pequena despolarização induzida por acidificação
extracelular gerada pelas Células de Müller podem ter um efeito inibitório dramático na
transmissão sináptica. Por exemplo: uma acidificação de 0,05 unidades do pH na retina da
Salamandra, produz uma redução de 24% na transmissão sináptica entre fotorreceptores e
neurônios de segunda ordem (Barnes et al., 1993; Newman & Reichenbach, 1996).
É interessante notar que a luz atravessa todas essas camadas a partir da camada de
células ganglionares, até alcançar os fotorreceptores.
1.3 O Epitélio Pigmentar
O epitélio pigmentar, sobre o qual repousa a camada mais externa da retina, impede a
dispersão de fótons que não tenham sido capturados pelos fotorreceptores. Esse epitélio tem
várias outras funções de suporte para a retina: é parte integrante de uma barreira hemato-
retiniana, e junto com a membrana de Brush promove seletividade no controle do transporte
de íons, nutrientes e metabólitos entre a retina e os capilares fenestrados da coróide (Bharti et
al., 2010). O epitélio pigmentar também desempenha uma importante função no ciclo visual.
A visão começa com a fotoconversão da opsina 11-cis-retinal em todo-trans, levando a uma
mudança na conformação, liberação e início da cascata de fototransdução que culmina com a
conversão de luz em sinais elétricos. Através de uma série de passos, todo trans retinal é
transportado para o epitélio pigmentar, re-isomerizado pela isomerase RPE65, e transportada
de volta para os fotorreceptores (Cai et al., 2009). O retinal é reciclado e torna-se então
21
disponível para ser reutilizado pelos fotorreceptores. Considerando que a luz danifica
segmentos externos dos fotorreceptores por meio da fotoxidação de lipídios, lipoproteínas e
outras moléculas, existe uma necessidade contínua de renovação dos segmentos externos, e é
exatamente o que ocorre. A cada dia, os segmentos externos adicionam cerca de 10% de
comprimento na sua base e o epitélio pigmentar remove de sua porção mais apical (Bharti, et
al., 2010).
1.4 Fotorreceptores
No século XIX, Müller (1872) constatou a existência de dois diferentes tipos de
fotorreceptores em mamíferos, baseado principalmente em sua forma e prevalência quanto a
atividade diurna ou noturna do indivíduo. As duas classes foram denominadas bastonetes e
cones, "Stäbchen" e "Zapfen" (Schultze, 1866), apud Ahnelt & Kolb, 2000. Eles foram
associados com visão escotópica e fotópica respectivamente, e este dualismo de
fotorreceptores foi considerada ser uma característica geral de todas as retinas de vertebrados
(Ahnelt & Kolb, 2000). Esses fotorreceptores clássicos são células alongadas que apresentam
os segmentos externos direcionados para a região posterior do globo ocular, onde estão
envolvidos por epitélio pigmentar. A estrutura geral dos bastonetes e dos cones é similar. Eles
são compostos de quatro partes: um segmento externo contendo a substância fotossensível
(pigmento), um segmento interno, um corpo celular, e um terminal sináptico (pedículo).
Bastonetes e cones humanos estão dentro de um típico padrão geral de vertebrados, sendo que
bastonetes são mais sensíveis a luz de baixa intensidade. A visão periférica depende quase
exclusivamente de bastonetes. Já a visão central, depende principalmente de cones. Sob
baixos níveis de intensidade luminosa, a visão depende unicamente dos bastonetes (visão
escotópica) e o processamento das cores não é possível, porque os sinais provenientes de um
único detector, o bastonete, não podem ser diferenciados entre modulações espectrais. Os
22
cones são menos sensíveis à penumbra, mas são sensíveis à cor. Estudos comparativos
destacam que além do pigmento específico de bastonetes, a rodopsina, há quatro diferentes
famílias de pigmentos de cones, espectralmente distintas: uma classe sensível ao comprimento
de onda longa a média (L), maximamente sensível a região do espectro que vai do verde ao
vermelho (490 – 570 nm), uma classe sensível ao comprimento de onda média (M) que
corresponde ao verde (480 – 535 nm), uma classe sensível ao comprimento de onda curta (S)
que compreende do azul ao violeta (410 – 490 nm), e uma segunda classe S, de onda curta
sensível ao ultra-violeta (355 – 440 nm). Embora alguns pássaros e peixes possuam até 5 tipos
de cones, entre os mamíferos, apenas humanos, alguns macacos e marsupiais australianos são
tricromatas, ou seja, possuem três classes espectrais de cones. (Jacobs, 2002; 2008; Peichl,
2005; Bowmaker, 2008).
O comprimento de onda para o qual os bastonetes e os cones são mais sensíveis
depende das características de absorção do pigmento visual que eles contêm (rodopsina, ou
uma das quatro diferentes opsinas de cone). O pigmento visual é uma molécula encontrada no
segmento externo dos fotorreceptores, que é arranjado em discos membranosos. Nos cones, os
discos são contínuos com a membrana plasmática, enquanto nos bastonetes eles se
desprendem da membrana plasmática e tornam-se organelas intracelulares. Como outros
neurônios, os fotorreceptores não se dividem, mas seus segmentos externos são
constantemente renovados (Tessier-Lavigne, 2000). Os pigmentos visuais consistem de uma
grande proteína, a opsina, e um aldeído que absorve a luz, o retinal, o qual altera sua
configuração quando ativado por um comprimento de onda específico de luz e deflagra uma
cascata de eventos que eventualmente leva a hiperpolarização do potencial de membrana. No
escuro, a concentração da molécula de segundo mensageiro o guanosina 3’-5’ monofosfato
cíclico (GMPc) é alta, e abre canais iônicos dependentes de GMPc levando a uma corrente
constante para dentro, que mantém a célula despolarizada a -40 mV (corrente de escuro). A
23
transdução da luz leva a uma redução do GMPc e assim à hiperpolarização da célula.
Fotorreceptores são sensíveis a pequenas alterações na iluminação. Alterações prolongadas ou
lentas da iluminação levam à adaptação à luz, que é regulada pelas alterações da concentração
de cálcio. Bastonetes adaptados ao escuro são tão sensíveis à luz, que podem detectar um
único fóton. Sob a detecção de um fóton, o potencial de membrana hiperpolariza, e diminui a
liberação de glutamato em suas sinapses.
Os cones respondem aos estímulos luminosos com hiperpolarização graduada e
liberam o glutamato no seu terminal sináptico especializado denominado de pedículo. A
liberação do glutamato é alta em condições de escuro e é reduzida pela luminosidade
(Haverkamp et al., 2000).
O pedículo de cone é provavelmente a sinapse mais completa no sistema nervoso
central. Contém aproximadamente entre 20 e 50 fitas, e cada uma delas é flanqueada por
vesículas sinápticas. Invaginações nessas tiras possibilitam que sejam inseridos dendritos de
células horizontais e de células bipolares de cone do tipo ON. Os contatos das células
bipolares de cone do tipo OFF, são localizados na base dos pedículos de cones (Wässle,
2004). Cada pedículo de cone faz mais de 500 contatos. Embora haja um número menor de
células pós- sinápticas, cada uma delas recebe múltiplos contatos. Dois tipos de células
horizontais e oito tipos de células bipolares de cones estão sempre envolvidos com cada
pedículo de cone. Dessa forma, na primeira sinapse da retina, a informação luminosa é
distribuída para múltiplas vias (Wässle, 2004).
Os pedículos de cones L e M se acoplam aos seus vizinhos imediatos e às esférulas
dos bastonetes (os terminais sinápticos dos bastonetes) através de junções comunicantes,
realizando sinapses elétricas. Os pedículos de cone S são apenas esparsamente acoplados
(Feigenspan et al., 2004; Hornstein et al. 2004; Li & DeVries, 2004; O'Brien et al., 2004).
24
Esses acoplamentos possibilitam que seja aumentada a resposta ao estímulo luminoso (Lamb
et al., 1976).
Os terminais sinápticos dos bastonetes contêm apenas uma zona ativa com uma
sinapse em fita e uma invaginação. A invaginação apresenta dois tipos de processos pós
sinápticos: dendritos de células horizontais e dendritos de células bipolares. As espículas
dendríticas das células horizontais penetram profundamente na invaginação dos bastonetes
para aproximar seus receptores glutamatérgicos do local de liberação das vesículas sinápticas.
Os dendritos de duas ou mais células bipolares penetram na invaginação, mas estão longe do
local de liberação das vesículas sinápticas (Rao-Mirotznik et al., 1995).
Dos terminais sinápticos de cones e bastonetes, os sinais são transferidos para as
células bipolares e células horizontais. As células horizontais proporcionam interações laterais
na OPL. Um tipo de célula bipolar associada a bastonetes e pelo menos nove tipos de células
bipolares associadas cones, transferem os sinais luminosos para a IPL, onde estes sinais
podem interagir com dendritos de células amácrinas e células ganglionares (Wässle, 2004).
O desenvolvimento de anticorpos contra opsinas de bastonetes e cones abriu o
caminho para identificar a população de bastonetes e as subpopulações de cones,
possibilitando estudar as suas distribuições através da retina. Mesmo assim, é importante
destacar que apenas os anticorpos contra a opsina S marcam seletivamente os segmentos
externos dos cones que a contêm, uma vez que, dada a proximidade estrutural entre as opsinas
de cones M e L, não foi possível desenvolver anticorpos seletivos para cada um deles (Ahnelt
& Kolb, 2000).
1.5 Células horizontais
Como população neural, as células horizontais são bastante simples. A grande maioria
dos mamíferos possui dois tipos de células horizontais e ambas promovem feedback para
25
cones ou bastonetes. Entretanto, alguns roedores possuem apenas um tipo e já tem sido
proposto um terceiro tipo em alguns animais (Masland, 2012). A despeito de algumas
variações em sua morfologia, as células horizontais parecem seguir um plano bastante simples
(Müller & Peichl, 1993; Peichl et al., 1998). Elas promovem feedbacks inibitórios para cones,
bastonetes e possivelmente para os dendritos das células bipolares, embora ainda haja
controvérsia (Hermann et al., 2011). A interpretação principal desta função é que ela fornece
um mecanismo de controle de ganho local para a retina. As células horizontais são
moderadamente espalhadas lateralmente, se acoplam por junções comunicantes e medem o
nível médio de iluminação que cai sobre uma região da superfície da retina. Elas então
subtraem um valor proporcional de saída dos fotorreceptores, o que serve para manter o sinal
de entrada para a circuitaria da retina interna dentro de uma determinada faixa, o que vem a
ser uma função extremamente útil no mundo natural, onde uma cena pode conter objetos
individuais com brilhos que variam em várias ordens de magnitude. O sinal que representa o
brilho mais intenso poderia trazer um problema para a retina, da mesma forma como o brilho
de um objeto numa sala escura satura o filme de uma câmera, impossibilitando fotografar o
objeto brilhante e ao mesmo tempo a parte mais escura (Masland, 2012).
Tradicionalmente aceita-se que as células horizontais acentuam o contraste entre as
regiões mais claras com as mais escuras adjacentes (Masland, 2001). A excitação de um cone
central provoca retroalimentação de inibição tanto do cone excitado, como dos que se
encontram situados no entorno. Como tanto o cone central quanto os seus vizinhos
transmitem um sinal para a retina interna, o resultado é que um pequeno estímulo excita
aquelas células ganglionares que se situam diretamente sob o estímulo, mas inibe as células
ganglionares vizinhas. Esta é a clássica organização “centro-periferia”, em que uma célula
ganglionar é excitada ou inibida por estímulos que caem em seu centro do campo receptivo,
enquanto a estimulação da região circundante tem um efeito oposto (Masland, 2001).
26
Adicionalmente, as células horizontais ajustam a resposta do sistema para um nível total de
iluminação – elas medem a iluminação através de um campo bastante amplo e dele subtraem
o sinal que é transmitido para a retina interna acerca de uma imagem local. Com efeito, isto
reduz a redundância do sinal transmitido para a retina interna. A luminância média através de
uma grande região da retina é compartilhada por muitos cones e contém pouca informação.
Quando um estímulo local ocorre, ele excede ou cai abaixo da média; a ocorrência deste
evento local é o principal sinal transmitido para a retina interna (Masland, 2001). Bastonetes
recebem um tipo separado de retroalimentação de células horizontais, realizado por uma
especialização de uma célula horizontal que contata cones (a célula horizontal do tipo b/H2).
Um processo axonal de uma mesma célula que contata cones contata também bastonetes a
uma maior distância do seu soma (Nelson et al., 1975). O sistema de retroalimentação de
bastonetes é assim isolado do sistema de cones, sensivelmente porque as faixas de brilho
cobertas por bastonetes e cones são bastante diferentes. Esta pode ser uma das consequências
da evolução tardia dos bastonetes, o que lhes permite ter uma retroalimentação independente
pelas células horizontais, sem a criação de um outro tipo de célula horizontal (Masland,
2001a, b).
Na porção superior da INL, estão localizados os corpos da células horizontais, embora
seus processos realizem sinapses exclusivamente na OPL. As sinapses pelas quais as células
horizontais promovem os seus sinais de feedback parecem ser tanto mecanismos
convencionais como não convencionais e dessa forma constituem um importante objeto de
investigação (Hirano et al., 2005; Jackman et al., 2011; Klaassen et al., 2011). Contudo,
considerando como populações morfológicas, as células horizontais são bastante simples. Elas
podem ser marcadas com vários marcadores como calbindina, calrretinina e calmodulina
(Cuenca et al., 2002) em diferentes animais e também podem ser quantitativamente mapeadas
através da superfície da retina em muitas espécies (Collin, 2008).
27
As células horizontais se comunicam umas com as outras através de junções
comunicantes. A força desta comunicação varia em estados funcionais e é modulada pela
dopamina secretada por células amácrinas (Weiler et al., 2000).
1.6 Células bipolares
É tarefa das células bipolares transferir as informações recebidas dos fotorreceptores
para as células amácrinas e ganglionares. Modernas técnicas anatômicas, sustentadas por
evidências fisiológicas, indicam que atualmente existem 12 diferentes tipos de células
bipolares (Masland, 2012), sendo uma especificamente para bastonetes e onze que recebem
informações primárias apenas de cones na retina de mamíferos (Wässle et al., 2009). A
exceção fica por conta de um tipo de célula bipolar especializada, que contata seletivamente
cones sensíveis a um comprimento de onda curto, os cones S. Simetricamente, algumas
células bipolares evitam os terminais de cones azuis. De qualquer modo, a regra central que
predomina na organização funcional e estrutural da retina é que cada célula bipolar contata
todos os terminais de cones dentro da propagação da arborização dendrítica. Essa é uma regra
geograficamente simples (Masland, 2012).
Funcionalmente, contudo, este arranjo permite uma complexidade mais ampla.
Ajustando as características das sinapses cone-bipolares, cada tipo de célula bipolar pode
transmitir uma análise diferente da saída do cone. Células bipolares expressam distintos tipos
de receptores, canais iônicos e sistemas de sinalização intracelular. Esta via direta sugere que
cada uma dessas células possui uma fisiologia particular. Consequentemente acredita-se que
cada um dos doze tipos anatomicamente distintos de células bipolares que contatam um
determinado cone transmita para a retina interna um diferente componente extraído daquele
cone.
28
De acordo com sua resposta à luz, as células bipolares podem ser divididas em ON e
OFF (Kolb & Nelson, 1995; Euler et al., 1996; Hartveit, 1997; DeVries, 2000). Células
bipolares ON respondem mais fortemente se o estímulo é mais brilhante do que o background
e células bipolares OFF respondem mais fortemente se o estímulo é mais escuro que o
background. Os axônios das células bipolares ON e OFF terminam em diferentes níveis na
IPL, que pode ser dividida em 5 subcamadas. Os terminais axonais das células do tipo ON são
mantidos na metade mais interna da IPL, enquanto as bipolares OFF tem seus terminais na
metade mais externa (Famiglietti et al, 1977; Nelson et al., 1978).
Essa dicotomia funcional é o resultado da expressão de diferentes receptores
glutamatérgicos (GluRs) nas sinapses entre fotorreceptores e dendritos de células bipolares
(Nomura et al., 1994; Brandstätter et al., 1997; DeVries, 2000; Hack et al., 1999, 2001;
Haverkamp et al., 2001; Wässle et al., 2009).
Similarmente, a distinção entre células bipolares sustentadas e transientes é causada
pelas expressões "rápida ou lenta" inativação dos receptores glutamatérgicos (Awatramani &
Slaughter, 2000; DeVries, 2000). Isso cria quatro classes de células bipolares: ON-sustentada,
ON-transiente, OFF-sustentada e OFF-transiente. Os diferentes tipos estruturais/moleculares
das células bipolares mostram uma grande diversidade de formas de onda de resposta, em
resposta à luz. Além da simples dimensão tônica versus fásica, estas respostas apresentam
complexas misturas de ambas (Wu et al., 2001).
Seguindo a via vertical excitatória de cone para célula bipolar e para célula ganglionar,
há dois estágios de inibição lateral. As células horizontais proporcionam informações
inibitórias tanto para pedículos de cone quanto para dendritos de células bipolares (Werblin &
Dowling, 1969; Kamermans et al., 2001; Hirasawa & Kaneko, 2003) e as células amácrinas
podem conduzir informações tanto de volta para os terminais axonais das células bipolares,
como para diante, para os dendritos de células ganglionares.
29
Além da divisão em ON e OFF, a maior parte das células bipolares é classificada
como células bipolares difusas (DB). São células que realizam entre e 5 e 10 sinapses com
vários cones, e possuem uma arborização dendrítica e axonal bastante ampla. As células DB1,
DB2 e DB3 são células bipolares do tipo OFF, enquanto as células DB4, DB5 e DB6 são
células bipolares do tipo ON (Cohen & Sterling, 1990a; b; Boycott & Hopkins, 1991;
Boycott, Wassle, 1991; Calkins et al., 1994; Calkins & Sterling, 1996).
As células bipolares de bastonetes recebem informações dos bastonetes e conduzem
essas informações para um tipo de neurônio denominado célula amácrina AII, a qual por sua
vez realiza sinapses com terminais de células bipolares de cones e estes com células
ganglionares. Provavelmente esse arranjo seja decorrente da evolução tardia dos bastonetes
(Masland, 2001). Assim sendo, a via de bastonetes utiliza a circuitaria de cones pré-existente,
de tal forma que o complexo circuito da retina interna não precisou ser reinventado para a via
de bastonetes (Masland, 2001).
1.7 Células amácrinas
As células amácrinas ocupam um importante lugar na circuitaria da retina e
consequentemente no processamento da informação visual. Elas constituem cerca de 40% de
todos os neurônios da INL das retinas de mamíferos (Strettoi & Masland, 1995; Jeon et al.,
1998) e participam de 64 a 87%, dependendo da espécie, de todas as sinapses na IPL (Raviola
& Raviola, 1982). No macaco, 50 a 70% de todas as sinapses sobre as células ganglionares da
retina são intermediadas pelas células amácrinas (Jacoby et al., 1996). Com base em estudos
usando o método de Golgi e, posteriormente, o método de “photofilling” baseado em
fluorescência (MacNeil & Masland, 1998) foram identificados 29 tipos morfológicos de
células amácrinas na retina do coelho (MacNeil et al., 1999). Células amácrinas parecem
30
explicar disparos sincronizados entre as células ganglionares. Entrada compartilhada de uma
célula amácrina comum tende a produzir disparo uníssono das células ganglionares. A
correlação cruzada é ampla, se mediada por sinapses químicas e mais limitada se mediada por
junções comunicantes, sabidamente existentes entre células amácrinas e ganglionares (Vaney,
1994). Tem sido proposto que o disparo correlato entre células ganglionares representa uma
forma de multiplicação de sinal, que poderia expandir a capacidade de condução da
informação pelo nervo óptico (Masland, 2001a, b).
Muitas células amácrinas são neurônios sem axônios, e a falta de uma clara polaridade
dificulta o reconhecimento de suas entradas e saídas. Por conta de suas múltiplas
conectividades, elas são difíceis de conceituar. Elas retroalimentam as células bipolares que as
dirigem, fazem sinapses com as células ganglionares e também com outras células amácrinas
(Dowling & Boycott, 1966; Eggers & Lukasiewicz, 2011, Jusuf et al., 2005; Lin et al., 2000).
Sua grande diversidade estrutural termina por desencorajar determinadas pesquisas, mas
apesar de tudo, algum progresso está sendo feito, especialmente nos casos onde uma célula
amácrina é estruturalmente distinta ou pode ser geneticamente marcada (Masland, 2012).
Dos diversos tipos morfológicos de células amácrinas, alguns têm papéis específicos,
bem definidos. Assim, a célula amácrina AI é uma célula em espícula com uma árvore
dendrítica de campo médio e processo tipo axônio amplamente difuso, que atravessa grandes
distâncias através da retina. Devido a sua geometria, estas são células centrífugas, que enviam
ondas de inibição através da retina em um padrão radial (Stafford & Dacey, 1997; Taylor,
1996; Cook & Werblin, 1994; Masland, 2001a). Elas podem estar relacionadas com efeitos de
mudança e oscilação de longo alcance (Masland, 2001a). A célula amácrina AII funciona
como uma ponte entre a via de bastonete e as células ganglionares, ou seja, recebe
informações de células bipolares de bastonete, estabelece contato com os terminais das células
bipolares de cone e, a partir destas, com as células ganglionares, evidenciando que a via de
31
bastonete surgida filogeneticamente mais tarde utiliza a já existente rede de cones. Um grupo
de células amácrinas catalogadas como A17 (Menger & Wässle, 2000) sustentam uma sinapse
de retroalimentação recíproca sobre as células bipolares de bastonetes. Elas recebem
informações de células bipolares de bastonete e imediatamente enviam de volta um sinal
GABAérgico inibitório. Este retorno inibitório das células amácrinas GABAérgicas sobre os
terminais axônicos das células bipolares é um importante fator que contribui para modificar a
faixa dinâmica das células bipolares (Euler & Masland, 2000), aumentando a fidelidade da
informação transmitida pelas células bipolares de bastonetes (Grimes et al., 2010; Sandell et
al., 1989). Essa é a principal tarefa das células A17 e talvez a única, devendo-se considerar
inclusive, que a atividade das células A17 são irrelevantes para eventos que ocorrem à luz do
dia (Masland, 2012).
Outra célula amácrina bastante especializada, descoberta recentemente na retina do
esquilo, cria uma propriedade de campo receptivo específico em um tipo único de células
ganglionares (Chen & Li, 2012; Sher & DeVries, 2012). Uma célula ganglionar ON–azul é
bem conhecida: ela é excitada pelas células bipolares ON–azul, que seletivamente contactam
cones azuis. Registros eletrofisiológicos encontraram uma célula ganglionar OFF–azul,
inibida quando o estímulo se situa na extremidade do espectro de comprimento de onda curto.
Como isso pode ocorrer se a única via através da retina é a bipolar ON–azul, conduzindo um
sinal excitatório? A resposta é que uma amácrina específica é dirigida diretamente pela célula
bipolar ON–azul. A célula amácrina, assim como basicamente todas as células amácrinas, é
inibitória para suas parceiras pós-sinápticas. Quando excitada pela célula bipolar ON–azul,
esta célula amácrina realiza uma inversão de sinal: ela inibe a célula ganglionar sobre a qual
realiza a sinapse e isso cria uma célula ganglionar que é seletiva ao estímulo azul pela
diminuição do disparo, ou seja, uma célula ganglionar OFF–azul (Masland, 2012).
32
Há ainda as células amácrinas “starburst”. Estas células parecem estar intimamente
associadas com um circuito computacional particular. Elas arborizam em finos estratos dentro
da camada plexiforme interna, onde fazem sinapses colinérgicas excitatórias sobre
determinadas células ganglionares, notadamente aquelas particularmente sensíveis a estímulos
em movimento. Por ação sobre as células ganglionares do tipo excitação e/ou inibição,
considerando que estas células liberam acetilcolina e GABA (O’Malley et al., 1992), elas são
importantes para selecionar direção (Yoshida et al., 2001; Masland, 2001a, b; Masland &
Raviola, 2000; Wässle, 2004).
O corpo das células amácrinas pode estar localizado tanto na INL como na GCL. As
células amácrinas localizadas na GCL são denominadas células amácrinas deslocadas, e
podem ser facilmente distinguidas das células ganglionares por seu pequeno soma e pela
ausência de axônios que projetam para o cérebro. A primeira evidência que células pequenas
na GCL são neurônios e não células da glia foi apresentado por Hughes & Wieniawa-
Narkiewicz (1980) para a retina de gatos. Desde então, a morfologia e padrão de arborização
das células amácrinas deslocadas tem sido examinados: seis tipos de células amácrinas
deslocadas foram identificadas na retina de rato (Perry & Walker, 1980), 11 tipos no
porquinho da índia (Kao & Sterling, 2006), 4 na retina de gatos (Wässle et al., 1987a) e 11
tipos na retina de camundongos (Gustincich et al., 1997; Badea & Nathans, 2004; Lin &
Masland, 2006).
As Células amácrinas deslocadas compreendem entre um e dois terços de todos os
neurônios presentes na GCL (Perry & Walker, 1980; Hughes & Vaney, 1980; Hughes &
Wieniawa-Narkiewicz, 1980; Linden & Esbérard, 1987; Abreu et al., 1993; Jeon et al., 1998)
e compreendem vários diferentes tipos celulares (Perry & Walker, 1980; Wässle et al., 1987a;
Völgyi et al., 2001; Badea & Nathans, 2004; Kao & Sterling, 2006). Embora células
amácrinas deslocadas tenham sido encontradas em quase todas as retinas de vertebrados, a
33
proporção de neurônios da GCL que são células amácrinas difere de espécie para espécie.
Correspondem aproximadamente a um terço na retina de coelho (Hughes & Vaney, 1980;
Vaney, 1980) e salamandra (Zhang et al., 2004); 40% na retina de hamster (Linden &
Esbérard, 1987); 50% na retina de rato (Perry & Walker, 1980), porquinho da índia (Kao &
Sterling, 2006), esquilo (Abreu et al., 1993); e 75–80% na retina periférica de gato (Hughes &
Wieniawa-Narkiewicz, 1980; Wässle et al., 1987a) e humana (Curcio and Allen, 1990). Na
retina de camundongos, as células amácrinas correspondem a 59% dos neurônios na GCL
(Jeon et al., 1998; Müller et al., 2007).
Várias observações sugerem que as células amácrinas deslocadas provavelmente têm
papéis modulatórios no processamento visual. Células amácrinas com pequeno campo
dendrítico podem estar envolvidas no caminho direto do fluxo de informações, enquanto as
células com maiores campos dendríticos são moduladoras, com uma influência indireta na
transmissão de informações (Masland, 1988). Assim, embora existam muitos diferentes tipos
de células amácrinas na GCL, as células starbust representam a grande maioria (Vaney et al.,
1981), novamente sugerindo um papel modulatório no processamento visual (Masland, 1988;
Müller et al., 2007).
1.8 Células ganglionares
As células ganglionares da retina têm seus dendritos na camada plexiforme interna e
seus corpos celulares especialmente na camada de células ganglionares e alguns na camada
nuclear interna. Seus axônios se projetam através da superfície interna da retina em direção ao
disco do nervo óptico, onde ele é formado. Os diferentes padrões de resposta das células
ganglionares podem ser identificados por registros de microeletrodos. Células ganglionares
têm características de resposta de centro “ON” e centro “OFF”. Dentro de cada subgrupo há
cinco a sete tipos celulares adicionais. Suas propriedades variam com respeito às dinâmicas
34
temporais (tônica ou fásica), tamanho do campo receptivo, sensibilidade de contraste e sua
capacidade de detectar direção de movimento.
Atualmente, considera-se que ~20 tipos de células ganglionares cobrem a retina
(Masland, 2012). A identificação dos diferentes tipos morfológicos, ocorre através do estudo
com marcadores retrógrados que são injetados nos alvos encefálicos ou mesmo pela aplicação
de marcadores seletivos para populações específicas. No gato por exemplo, 3% das células
ganglionares possuem grandes corpos celulares, arborização dendrítica ampla e esparsamente
ramificadas, são denominadas de células alfa, e são imunomarcadas contra neurofilamentos.
A ramificação dendrítica e a densidade das células alfa mostram uma relação inversa
através da retina: a grande arborização dendritica e a baixa densidade celular ocorre nas
regiões mais periféricas da retina enquanto na região central, há uma grande densidade celular
com pequena arborização dendrítica.
As células alfa, provavelmente possuem o axônio mais espesso de todas as células
ganglionares da retina e se projetam para vários centros visuais subcorticais, com a ocorrencia
de registro desse tipo celular na retina de todos os mamíferos estudados, como gato, furão,
coelho, porquinho da índia, camundongo, rato e bovinos (Peichl, 1991), e têm como prováveis
homólogas na retina de primatas as células ganglionares magnocelulares (células M). As
células tipo alfa (ou M primata) também correspondem ao tipo “brisk-transient” ou célula Y
dos fisiologistas (Wässle & Boycott, 1991). Um outro tipo de célula ganglionar descrito na
retina do gato é a célula beta. Mesmo não existindo um marcador imunohistoquímico seletivo
para as células beta, elas podem ser marcadas retrogradamente por injeção de traçadores no
núcleo geniculado lateral, quando produzem o mosaico de corpos celulares. As células beta
são o tipo mais frequente na retina do gato, compreendendo cerca de 50% de todas as células
ganglionares e representam, devido a sua alta densidade e pequena árvore dendrítica, o
sistema de acuidade das células ganglionares do gato. Elas também foram descritas nas retinas
35
de outros mamíferos, como cão, furão, coelho e camundongo (Peichl, 1991) e têm como
prováveis homólogas na retina de primatas as células ganglionares parvocelulares (células P).
As células tipo beta (ou P primata) correspondem ao tipo “brisk-sustained” ou células X dos
fisiologistas (Wässle & Boycott, 1991). Células ganglionares parvocelulares são o tipo de
célula ganglionar mais frequente na retina de primatas, correspondendo a cerca de 70–80%
(Kolb & Marshak, 2003), e na retina central seus campos dendríticos são extremamente
pequenos, de tal modo que elas contatam uma única célula bipolar parvocelular, a qual é
conectada a um único cone (Kolb & Marshak, 2003). Dessa forma, elas representam o sistema
de acuidade da retina de primatas e são as células ganglionares seletivas para cones L–M
(Dassey, 1993; Wässle, 2004).
Entre as células ganglionares, fisiologicamente são encontrados os tipos centro
ON/periferia OFF e centro OFF/periferia ON, classicamente descritos (Wässle & Boycott,
1991). A maioria de todas as retinas de mamíferos contém uma célula ganglionar azul–ON, a
qual recebe a saída das células bipolares de cone azul. Em primatas, outras variantes
morfológicas foram identificadas, porém ainda não caracterizadas fisiologicamente. No
coelho, uma célula ganglionar bi-estratificada é a célula direcionalmente seletiva ON–OFF.
Uma célula monoestratificada, algumas vezes denominada célula delta é a célula seletiva de
direção tipo ON, que se projeta para o sistema óptico acessório e fornece um sinal de erro
para a velocidade do olho no nistagmo optocinético. Uma célula pequena, não estratificada,
corresponde ao detector de borda local descrita nos estudos eletrofisiológicos clássicos
(Wässle & Boycott, 1991; Masland, 2001a, b). Um tipo de célula ganglionar, grande, tem
respostas tônicas à luz e se projeta para a área pré-tectal e o núcleo supraquiasmático, estando
relacionado com o controle da pupila e regulação circadiana (Lucas et al., 2001; Gooley et al.,
2001; Bellingham & Foster, 2002). Curiosamente, estas células se revelaram serem
diretamente fotossensíveis pela presença do pigmento melanopsina, o qual pode ser
36
identificado através de imunoistoquímica (Lucas et al., 2001; Berson et al., 2002; Berson,
2003; Gooley et al., 2003).
Cada um dos tipos de células ganglionares provê cobertura completa da retina com
suas árvores dendríticas, o que tem consequências importantes para o processamento visual na
retina. Um feixe de luz projetado sobre a retina – após transdução nos fotorreceptores e
transferência para a camada plexiforme interna pelas células bipolares – pode estimular pelo
menos uma célula ganglionar de qualquer tipo. Como os diversos tipos de células
ganglionares são dedicados a processar diferentes aspectos deste feixe de luz (contraste,
tamanho, movimento, comprimento de onda e outros), a informação contida no feixe de luz é
canalizada em canais paralelos (Wässle, 2004).
É interessante destacar que os dendritos dos diferentes tipos de células ganglionares
estratificam em diferentes níveis da camada plexiforme interna, sem superposição. Dentro dos
respectivos estratos elas encontram os terminais axônicos das células bipolares e os processos
das células amácrinas que elas necessitam contactar. Embora na retina de primatas as células
ganglionares do tipo magnocelular (M) e parvocelular (P) sejam predominates e representem
juntas 80% do total, as demais células ganglionares também estão presentes, seguindo o
padrão geral de mamíferos com vários tipos de células ganglionares (Masland, 2001a, b;
Dacey et al., 2003; Wässle, 2004; Abbot et al., 2012).
1.9 Opsinas na evolução de mamíferos
A molécula fotossensível de rodopsina e seus correlatos consiste de uma porção protéica
- uma opsina - e uma porção não protéica, o cromóforo. As opsinas são proteínas acopladas a
uma proteína G em animais, e mais de mil foram identificadas até agora. A análise detalhada
da árvore filogenética molecular mostra que a família de opsinas é dividida em sete
37
subfamílias, as quais correspondem a uma classificação funcional que tem como parâmetro o
tipo de proteína G acoplada a receptores. As subfamílias são as seguintes: a subfamília
acoplada a transducina visual de vertebrados e a opsinas não visuais, a subfamília neuropsina,
a subfamília da opsina encefalopsina, a subfamília da opsina melanopsina, acoplada a uma
proteína Gq, a subfamília de opsinas acopladas a proteína Go, a subfamília peropsina e a
subfamília fotoisomerase retinal. As subfamílias diversificaram inicialmente em
deuterostômios (incluindo vertebrados) e protostômios (maioria dos invertebrados), sugerindo
a existência de um ancestral comum animal para essas opsinas. As opsinas têm uma estrutura
sete alças transmembrana similar aquelas de outras proteínas G acopladas a receptores de
membranas, mas se distinguem por apresentarem um resíduo de lisina, que é um sítio de
ligação da retina na sétima hélice. Evidências acumuladas sugerem que muitas opsinas atuam
como pigmentos que ativam proteínas G, de forma dependente de luz tanto em sistemas
visuais como não visuais, enquanto poucas servem como fotoisomerases, gerando o
cromóforo usado por outras opsinas, e algumas opsinas têm função ainda desconhecida
(Terakita, 2005).
Antes da separação de protostômios e deuterostômios, uma opsina primordial estava
dividida em três ramos principais: um ramo rabdomérico, um ramo fotoisomerase e um ramo
ciliar. Em vertebrados, os dois primeiros ramos originaram a melanopsina, que é expressa nas
células ganglionares da retina e o ramo ciliar tem dado origem a muitas opsinas, as quais são
expressas no complexo pineal, na retina e em outras regiões mais profundas do cérebro.
Todos esses ramos de opsinas da retina de vertebrados só foram elucidados em 1992 por
Shichida e colaboradores, que deduziram que as quatro classes de pigmentos dos cones
estavam presentes antes da evolução do pigmento dos bastonetes, a rodopsina (Lamb et al.,
2007).
38
1.10 Sistemas paralelos de transmissão dos níveis de intensidade luminosa: vias ON
e OFF
O primeiro estágio de processamento neuronal que percebe a informação de luz e extrai
diferentes características, as quais são então processadas em paralelo e projetadas da retina em
direção ao cérebro, é realizada por quatro principais tipos de neurônios: células horizontais,
células bipolares, células amácrinas e células ganglionares. É tarefa das células bipolares
projetar as informações dos fotorreceptores para as células ganglionares. A maioria dos
contatos sinápticos na retina ocorre em duas camadas plexiformes. A camada plexiforme
externa contém os prolongamentos das células fotorreceptoras, células bipolares e células
horizontais, enquanto a camada plexiforme interna contém os prolongamentos de células
bipolares, amácrinas e ganglionares. Assim, as células horizontais têm uma influência
modulatória no nível das sinapses entre o fotorreceptor e as células bipolares (camada
plexiforme externa), e as células amácrinas têm uma influência modulatória no nível das
sinapses entre as células bipolares e as células ganglionares (camada plexiforme interna). Na
via de bastonetes há células amácrinas AII interpostas entre as células bipolares de bastonete e
as células ganglionares. Desta forma, as células na retina processam os sinais de um ou mais
fotorreceptores resultando em pequenos ou grandes campos receptivos.
Um campo receptivo corresponde a uma região no espaço em que um estímulo de luz
pode induzir uma resposta neuronal, que tanto pode ser um aumento (resposta “on”) como
uma redução (resposta “off”) da freqüência de disparo do potencial de ação das células
ganglionares (Tessier-Lavigne, 2000).
Na condição de escuro, os fotorreceptores do tipo cone liberam o transmissor
glutamato em seu terminal sináptico (os pedículos dos cones), os quais excitam células
bipolares “off” e inibem as células bipolares “on” e as células horizontais. As células
horizontais, por sua vez, liberam o transmissor inibitório ácido gama-amino-butírico (GABA)
39
na sua zona de terminação, a qual é novamente nos pedículos de cone. Este arranjo sináptico
foi denominado de tríade. Em primatas, cerca de 10 diferentes tipos morfológicos de células
bipolares projetam da sinapse de cone para a camada plexiforme interna (Boycot & Wässle,
1999). Quatro delas são tipos de células bipolares “off” e seis delas são tipos de células
bipolares “on”. Duas células bipolares de cone, uma “on” e uma “off”, são especialmente
sensíveis à informação de contraste, outras duas são responsivas à porção verde-vermelho da
luz, e uma é devotada à luz azul (Calkins et al., 1998). Além disso, há três tipos de células
bipolares de cone especializadas em detectar informação direcional, ou seja, fluxo retiniano
ou movimento (Berry II et al., 1999). Na via fotópica, células bipolares de cone fazem
sinapses de cone em díades sobre dendritos de células ganglionares e amácrinas.
As células bipolares de bastonete não fazem sinapse diretamente sobre as células
ganglionares, mas sobre dois tipos de células amácrinas, uma delas sendo a célula amácrina
AII. As células amácrinas AII fazem sinapses inibitórias com células bipolares de cone “off” e
células ganglionares “off” e contactam sobre células bipolares de cone através de grandes
junções comunicantes. Desta forma, elas são neurônios que produzem sinais de polaridade
oposta em células ganglionares “on” e “off” (Morgans et al., 2009; Shen et al., 2009). As vias
clássicas são ON1 e OFF1. Na via ON1, bastonetes são hiperpolarizados pela luz e transferem
seus sinais para a invaginação de dendritos das células bipolares de bastonetes. Células de
bastonetes expressam o receptor para glutamato mGluR6, provocando uma inversão do sinal
na sinapse, sendo despolarizadas pela luz. Elas transferem seu sinal através de uma sinapse
glutamatérgica (AMPA; α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) para
células amácrinas AII. Células amácrinas AII formam junções comunicantes com os axônios
das células bipolares ON de cone, as quais por sua vez, fazem sinapse com as células
ganglionares ON. Na via OFF1, a via dos bastonetes para as células AII é idêntica a ON1,
mas a saída das células AII difere. Elas estão invertidas, sinapses glicinérgicas com os
40
axônios de células bipolares OFF de cones, as quais por sua vez, formam sinapses com
células ganglionares OFF. Na via ON2 o sinal dos bastonetes é transmitido para os pedículos
de cone através de junções comunicantes e então segue a via de cone para as células
ganglionares ON. A via OFF2 é comparável àquela de ON2 para as células ganglionares OFF.
Na via OFF3, células bipolares OFF de cone formam contatos sinápticos diretos com a base
de esférulas de bastonetes e transfere sinal diretamente para células ganglionares OFF. A
recente avaliação de um camundongo nocaute para a conexina 36, tem mostrado que
diferentes vias operam sob diferentes condições de luz (Wässle, 2004). O processamento das
informações através dos cones e bastonetes ao longo das vias on e off está esquematizado na
figura 1.
Figura 1. A via dos fotorreceptores na retina de mamíferos. OS/IS, segmentos externos e internos de
bastonetes e cones; ONL, camada nuclear externa; OPL, camada plexiforme externa; INL, camada nuclear
interna; IPL, camada plexiforme interna; GCL, camada de células ganglionares. (Wässle, 2004).
41
1.11 A retina como oscilador e os ritmos da retina
A alternância entre claro e escuro no ambiente é provavelmente um dos eventos mais
importantes na vida diária de um organismo. A diferença de intensidade nos níveis de
iluminação entre noite e dia é de tal magnitude (0,1 a 100.000 lux) que tanto a retina como
outras estruturas fotorreceptoras, capazes de detectar tais mudanças, desenvolveram um
sistema de temporização endógeno, capaz de permitir antecipar tais alterações e desenvolver
mecanismos de adaptação às mesmas (Tosini & Fukuhara, 2002).
Na retina, muitos dos processos em nível fisiológico, celular e molecular exibem um
ritmo circadiano. Como exemplos, podemos citar sensibilidade visual, renovação dos discos
dos segmentos externos dos bastonetes e fagocitose pelo epitélio pigmentar da retina,
expressão de genes imediatos e genes dos pigmentos visuais em fotorreceptores, níveis de
segundos-mensageiros e atividades de enzimas nas vias de transdução do sinal, expressão de
arilalquilamina N-acetiltransferase (NAT), enzima de síntese do neurohormônio melatonina, e
a própria liberação desta substância das células fotorreceptoras, além da liberação do
neuromodulador dopamina dos neurônios retinianos internos (Cahill & Besharse, 1995;
Iuvone et al., 2005).
Em mamíferos, o oscilador circadiano principal situa-se no par de núcleos
supraquiasmáticos do hipotálamo, mas evidências apontam a existência de um oscilador na
retina, responsável pela geração dos seus próprios ritmos. A síntese de melatonina e o seu
padrão de ritmo circadiano têm sido usados como parâmetros na investigação desse oscilador.
Assim, a identificação de um oscilador na retina começa com a demonstração, em Xenopus,
de que a atividade da enzima de síntese da melatonina, a NAT, expressa um ritmo circadiano
(Besharse & Iuvone, 1983). Trabalho subseqüente mostrou que a NAT era localizada em
células fotorreceptoras (Cahill & Besharse, 1992) e que uma camada isolada de
fotorreceptores era capaz de manter um ritmo circadiano de produção de melatonina (Cahill &
42
Besharse, 1993, 1995), indicando que esse ritmo não é dependente do oscilador principal.
Subsequentemente, a presença de um relógio circadiano na retina foi também demonstrada em
várias outras espécies de vertebrados (ver Tosini & Fukuhara, 2002), incluindo mamíferos
(Tosini & Menaker, 1996, 1998; Sakamoto et al., 2000).
Em mamíferos, a primeira evidência de um oscilador circadiano na retina foi fornecida
por um estudo em hamster (Mesocricetus auratus), em que retinas em cultura exibiram ritmo
circadiano da síntese de melatonina por pelo menos 5 dias. Os ritmos foram sincronizados por
ciclos de luz aplicados in vitro e entraram em livre-curso em escuro constante. Além disso, o
período em livre-curso da síntese de melatonina em retinas de hamsters homozigotos com
mutação tau, os quais têm o período do ritmo circadiano em livre-curso 4 horas mais curto
que o selvagem, foi correspondentemente mais curto. Donde se concluiu que a retina de
mamífero contém um oscilador circadiano geneticamente programado que regula a síntese de
melatonina (Tosini & Menaker, 1996). Um ritmo circadiano na liberação de melatonina foi
referido para cultura isolada ou enriquecida de células em retinas de camundongo (Tosini &
Menaker, 1998) e rato (Tosini et al., 1998). Assim, experimentos com uma cepa particular de
camundongo (C3H/rd), cujos fotorreceptores tipo bastonete sofreram degeneração durante o
desenvolvimento pós-natal, demonstraram que, embora a biossíntese de melatonina
permaneça, o seu ritmo circadiano desaparece com a perda completa de bastonetes (Tosini &
Menaker, 1998). Esta observação sugere que bastonetes não são necessários para a síntese de
melatonina, mas o são para a sua expressão rítmica (Tosini & Fukuhara, 2002).
Um estudo em rato mostrou que a lesão do núcleo supraquiasmático não abole o ritmo
circadiano do RNA mensageiro da enzima NAT retiniana, mas abole os ritmos do RNA
mensageiro de rPer2 e Dbp, sugerindo que a retina de mamíferos tem dois mecanismos
oscilatórios circadianos, em que um pode gerar ritmicidade circadiana independente do núcleo
43
supraquiasmático e o outro depende da sua presença para manter a oscilação circadiana
(Sakamoto et al., 2000).
O mecanismo responsável pela geração da oscilação circadiana requer a presença
intracelular de determinados genes relógio, os quais podem ser identificados pelo método de
hibridização in situ para identificar quais células expressam o RNA mensageiro (mRNA) para
os genes relógio. A expressão de genes relógio foi identificada no núcleo supraquiasmático
(ver por exemplo, Shearman et al., 2000; Ko & Takahashi, 2006), porém na retina é ainda
matéria de investigação. Na retina de Xenopus foi concluído que os fotorreceptores continham
um relógio circadiano, porque estes mantinham o ritmo circadiano da síntese de melatonina,
mesmo quando mantidos em isolamento (Cahill & Besharse, 1993, 1995). Subsequentemente,
foi encontrado que o homólogo do gene clock é expressado fortemente nos fotorreceptores
bastonetes e cones, e apenas fracamente nas camadas neurais da retina de Xenopus (Zhu et al.,
2000; Hayasaka et al., 2010).
Contrariamente à retina de anfíbios, em mamíferos, a distribuição de mensagens para
genes relógio, tais como clock, Bmal1, e Period1 (Per1) é distribuída entre as camadas
retinianas. Por exemplo, na retina de camundongo foi mostrado que transcriptos de clock,
Bmal1, e mPer1 foram expressados fortemente nas camadas de fotorreceptores e nuclear
interna, com expressão mais fraca na camada de células ganglionares (Gekakis et al., 1998).
Ainda no camundongo, o RNA mensageiro para os genes criptocromos Cry1 e Cry2, os quais
são componentes essenciais do mecanismo do relógio circadiano molecular, foram localizados
na retina interna e não na camada de fotorreceptores (Miyamoto & Sancar, 1998). Usando um
camundongo transgênico, em que uma proteína fluorescente verde (GFP) de vida média curta,
é induzida pelo promotor do gene relógio Per1, a imunomarcação para Per1-GFP e proteína
PER1, foi encontrada nas camadas de células amácrinas e ganglionares, mas não na camada
de fotorreceptores. Adicionalmente, dupla marcação imunoistoquímica mostrou que GFP foi
44
co-localizado em células amácrinas com dopamina, calbindina e cal-retinina, mas não com
acetilcolina, nem tampouco foi expressada nas células ganglionares melanopsinérgicas
(Witkovsky et al., 2003). Na retina de rato foi visto que RNA de Per1 e Per2 são do mesmo
modo distribuídos difusamente entre todas as camadas nucleares (Zhuang et al., 2000). Outros
dados disponíveis sobre a localização celular de gene relógio na retina do rato dão conta de
que Clock e BMAL1 exibem intensa expressão, com fortes sinais dos transcritos na camada
nuclear interna e camada de células ganglionares (Namihira et al., 1999). Per1 e Per2
expressam-se nos fotorreceptores, mas a grande maioria dos transcritos parece estar localizada
na camada nuclear interna (Namihira et al., 2001). Dados obtidos em um estudo com a técnica
de microdissecção por captura a laser e reação em cadeia transcriptase-polimerase reversa,
indicam que Per1, Per3, Cry1, Cry2, Clock, Bmal1, Ver-erba e Rora RNAs, e não Per2 e
Npas2 estão presentes na camada de fotorreceptores na retina de ratos, acompanhado de um
ritmo circadiano robusto da síntese de melatonina (Tosini et al., 2007). Estes dados
demonstram que a retina de mamíferos deve conter um marcapasso circadiano funcional na
camada de fotorreceptores, além da retina interna.
A resposta à luz dos genes relógio também foi investigada na retina de rato. Uma
variação diária em escuro constante, estatisticamente significante, foi detectada no nível do
transcrito para Clock, atingindo um pico em ZT18, mas não para BMAL1. ZT (Zeitgeber time,
hora de zeitgeber) é um termo referencial utilizado em experimentos com animais em
condições de sincronização, em que ZT0 significa o horário em que as luzes são acesas e
ZT12 o horário em que são apagadas. Um pulso de luz (300 lux) por 30 minutos aumentou
significativamente os níveis de transcrição 60 minutos após o início do pulso de ambos os
genes, sendo dependente de fase para Clock (significativo em ZT2), mas não para BMAL1,
cujo aumento pós-pulso ocorreu em praticamente todas as fases (Namihira et al., 1999). Per1
e Per2 são também induzidos pela luz, com Per1 sendo induzido em ZT2, ZT6, ZT10 e ZT14,
45
e Per2 sendo induzido apenas em ZT2 (Namihira et al., 2001). Estes resultados sugerem que a
responsividade à luz dos genes relógio na retina são diferentes da responsividade à luz dos
mesmos genes no núcleo supraquiasmático. Neste núcleo, os genes respondem à iluminação
de uma maneira mais restrita, ou seja, suas respostas são dependentes da fase circadiana. Per1
aumenta em ZT16-24, e Per2 aumenta apenas em ZT16 (Miyake et al., 2000), enquanto os
transcritos de BMAL1 alcançam um pico em ZT2 (Honma et al., 1998). Clock responde à luz
apenas durante a noite (Abe et al., 1999). Além disso, um estudo referiu que após lesão do
núcleo supraquiasmático, a ritmicidade de Per2 na retina desaparece, a despeito da
permanência de um robusto ritmo circadiano do RNA mensageiro de NAT (Sakamoto et al.,
2000). Isto poderia sugerir que a presença de um mecanismo de relógio na retina não depende
da transcrição rítmica de genes Per.
Do exposto, torna-se evidente a existência de algumas diferenças no padrão de
expressão dos genes relógio na retina em comparação com o núcleo supraquiasmático.
Entretanto, ainda há muito a ser esclarecido com relação a essa questão. Sobretudo, é
fundamental identificar com precisão as células que constituem o marcapasso e medir nestas
células o padrão de expressão dos genes-relógio (ver Tosini & Fukuhara, 2002; Tosini et al.,
2008).
Finalmente, um aspecto interessante do relógio retiniano é o mecanismo pelo qual o
relógio circadiano controla a síntese de melatonina e a sua relação com a dopamina. Ritmos
circadianos para melatonina (ou para as enzimas envolvidas em sua síntese) foram descritos
na retina de vários roedores. Todos esses estudos têm mostrado que, como ocorre na glândula
pineal, picos da síntese de melatonina ocorrem à noite (Pang et al., 1980; Yu et al., 1981;
Lucas & Foster 1997; Sakamoto & Ishida, 1998a, 1998b; Pozdeyev & Lavrikova, 2000;
Fukuhara et al., 2001), enquanto a dopamina e seus precursores e/ou metabólitos apresentam
picos de síntese/liberação durante o dia (Adachi et al., 1998; Pozdeyev & Lavrikova, 2000;
46
Ribelayga et al., 2002; Doyle et al., 2002a, b; Tosini & Fukuhara, 2002; Iuvone et al., 2005).
Além disso, a melatonina inibe a síntese/liberação de dopamina através de uma ação sobre
receptores de melatonina MT2 (Dubocovich, 1983; Ribelayga et al., 2004) e, ao mesmo
tempo, a dopamina inibe a síntese/ liberação de melatonina a partir de células fotorreceptoras
atuando sobre receptores D2/D4 (Nguyen-Legros et al., 1996; Tosini & Dirden, 2000). Esses
dados sugerem que a regulação dos níveis de melatonina e dopamina na retina pode ser parte
de um complexo mecanismo de retroalimentação no qual a melatonina é rítmica e regula a
liberação da dopamina e a dopamina modula o ritmo da melatonina, embora não seja
necessária para a geração daqueles ritmos (Cahill & Besharse, 1995).
Embora nem todos os ritmos descritos ocorram em todas as classes de vertebrados, há
inúmeras evidências de que a ritmicidade circadiana é altamente conservada na fisiologia da
retina. É geralmente aceito que os ritmos circadianos da retina permitem ao organismo
antecipar e adaptar-se a grandes variações na intensidade de luz durante o período de 24
horas, possibilitando uma otimização das funções visuais para cada situação fótica (Iuvone et
al., 2005).
1.12 Sistemas fotossensíveis na retina interna – Papel da melanopsina
A melanopsina é uma proteína opsina, originalmente identificada nos melanóforos
dermais da rã (Provencio et al., 1998, 2000), e agora estabelecida como um fotopigmento
sensorial funcional (Newman et al., 2003; Fu et al., 2005; Melyan et al., 2005; Panda et al.,
2005; Qiu et al., 2005). Em mamíferos, ela é expressa no olho, quase que exclusivamente
numa pequena porcentagem de células ganglionares da retina, compreendendo cerca de 1 a
3% de toda a população das células ganglionares (Provencio et al., 2000, 2002; Hannibal et
al., 2002; Hattar et al., 2002; Wässle, 2004). A melanopsina produzida nas células
ganglionares da retina é diretamente sensível à luz, constituindo uma terceira classe de
fotorreceptores na retina dos mamíferos, em adição aos cones e bastonetes. Por essa razão as
47
células ganglionares que expressam melanopsina foram denominadas células ganglionares
intrinsecamente fotossensíveis (ipRGCs) (Berson et al., 2002; Berson, 2003; Warren et al.,
2003).
É importante considerar as muitas diferenças estruturais e funcionais existentes entre
os fotorreceptores clássicos e as ipRGCs, que se projetam diretamente para o cérebro. Entre
os alvos dessas projeções estão o núcleo supraquiasmático, principal marcapasso e
sincronizador dos ritmos circadianos ao ciclo claro-escuro (Gooley et al., 2001; Berson et al.,
2002; Hannibal et al., 2002; Hattar et al., 2002; Berson, 2003) e o folheto intergeniculado
(Hattar et al., 2002; Morin et al., 2003), que também participa da regulação dos ritmos
circadianos (Harrington, 1997). Também recebe terminais das ipRGCs o núcleo olivar pré-
tectal (Hattar et al., 2002; Morin et al., 2003), um elemento chave nos circuitos de mediação
dos reflexos pupilares à luz (Trejo & Cicerone, 1984; Clarke & Ikeda, 1985; Young & Lund,
1994). Outros alvos das ipRGCs, implicando sua participação em diversas outras funções,
incluem a região pré-óptica, a zona subparaventricular do hipotálamo, o núcleo geniculado
lateral ventral e o colículo superior (Hattar et al., 2002; Gooley et al., 2003; Morin et al.,
2003; Hannibal & Fahrenkrug, 2004).
Registros eletrofisiológicos de ipRGCs revelaram que elas são intrinsecamente
sensíveis à luz, à qual responde com grande despolarização e potenciais de ação rápidos,
superpostos, e resistentes a bloqueio sináptico na retina (Berson et al., 2002). Em condições
de luminosidade limiar, as ipRGCs exibem resposta de longa latência (Berson et al., 2002;
Hattar et al., 2002; Warren et al., 2003; Tu et al., 2005), havendo, com aumento da
intensidade de luz, um correspondente decréscimo na latência de resposta e um aumento na
magnitude de corrente despolarizante, implicando que ipRGCs codificam tonicamente
intensidades de luz. Suas respostas lentas, especialmente a baixos níveis de luminosidade, são
consistentes com observações de que a sincronização fótica circadiana é menos sensível do
48
que a visão normal, exigindo um período de tempo que vai de segundos a vários minutos de
iluminação para reiniciar o relógio biológico. É interessante destacar que o espectro de ação
das respostas à luz nas ipRGCs corresponde àquele da fotossincronização circadiana (Nayak
et al., 2007).
A fotossensibilidade das ipRGCs exibe adaptação tanto à luz quanto ao escuro. Sob
iluminação constante, a fotorresposta de fundo diminui gradualmente, enquanto a resposta a
flashes luminosos superpostos aumenta. Após um período de exposição ao escuro, as ipRGCs
readquirem completa sensibilidade à luz (Wong et al., 2005). Tal adaptação pode
proporcionar ao organismo uma fina sintonia que o habilita a perceber pequenas mudanças
nas condições de luminosidade (Nayak et al., 2007).
Os campos dendríticos das ipRGCs proporcionam completa cobertura da retina. Nas
retinas adaptadas à luz, a resposta à iluminação das ipRGCs é feita acima de um componente
rápido, derivado da entrada de cones, e um componente mais lento, baseado numa resposta
intrínseca a luz. Na retina de primatas há cerca de 3.000 células contendo melanopsina.
Aproximadamente 40% delas estão localizadas na camada nuclear interna e seu pico de
densidade é na fóvea. Seus dendritos estratificam-se na camada nuclear interna ou na camada
de células ganglionares, mas elas parecem ser células centro ON (Wässle, 2004).
Um estudo em linhagem de rato com degeneração de fotorreceptores (RCS a P60)
mostrou que os níveis de RNA mensageiro de melanopsina foram acentuadamente diminuídos
e não rítmicos, em comparação com controles congênicos ou ratos RCS a P21 (antes da
degeneração dos fotorreceptores), nos quais os níveis de RNA mensageiro de melanopsina
exibem um ritmo circadiano em condições de claro-escuro e escuro constante, com um pico
no início da fase de escuro (Sakamoto et al., 2004). Isto sugere que, apesar da
fotossensibilidade intrínseca das ipRGCs, a regulação da produção de melanopsina por essas
células é de alguma forma influenciada pelos fotorreceptores clássicos. Essa concepção é
49
fortalecida pela evidência morfológica de que as ipRGCs recebem entrada de fotorreceptores
retinianos via células bipolares e amácrinas. Esta evidência foi obtida em estudos de
microscopia eletrônica em camundongo, no qual foi visto que dendritos imunorreativos a
melanopsina na região interna (ON) da camada plexiforme interna são pós-sinápticos a
terminais de células bipolares e amácrinas, enquanto que dendritos imunorreativos a
melanopsina estratificando-se na região externa (OFF) da mesma camada recebem apenas
terminais de células amácrinas. Isto sugere que os sinais provenientes de bastonetes e/ou
cones podem ser capazes de modificar a capacidade intrínseca de resposta à luz destas células
ganglionares que expressam melanopsina (Belenky et al., 2003).
Há indicações de que a atividade das ipRGCs também pode ser modulada pela
atividade circadiana de neurônios da retina interna adjacente. Os principais candidatos nesse
caso são os neurônios dopaminérgicos, os quais se ramificam na borda das camadas
plexiforme interna e nuclear interna. Assim, um estudo realizado em retina de ratos e
humanos demonstrou uma interrelação entre células imunorreativas a melanopsina (ipRGCs)
e imunorreativas a TH (células amácrinas dopaminérgicas) na camada plexiforme interna e,
adicionalmente, demonstrou que esta estrutura é mantida nos ratos distróficos, com
degeneração de fotorreceptores. Tripla imunomarcação usando marcadores sinápticos
proporcionaram evidências para a unidirecionalidade da transferência de informação entre os
dois tipos celulares, com processos das ipRGCs (marcados pelo anticorpo anti-melanopsina)
sendo diretamente adjacentes aos sítios de liberação de dopamina (marcados pelo anticorpo
anti-transportador vesicular de monoamina2, VMAT2). Isto é uma característica fundamental
da arquitetura da retina de mamíferos que parece resistente à degeneração dos fotorreceptores
clássicos e pode prover o substrato anatômico pelo qual as células dopaminérgicas
influenciam a fisiologia dos alvos circadianos centrais no cérebro (Vugler et al., 2007). É
sugerido que a justaposição anatômica dos processos de dopamina e melanopsina na camada
50
plexiforme interna de ratos e humanos é um produto da pressão seletiva. Esta associação
anatômica pode ser adaptativa e reflete algum grau de vantagem evolutiva adquirida por ter os
dendritos das ipRGCs adjacentes aos sítios de liberação de dopamina. Isto é particularmente
importante quando considerada a curiosa associação aparente entre dendritos de células
expressando melanopsina e pericários imunorreativos a TH (Vugler et al., 2007).
Sabe-se que a dopamina modula a sensibilidade de células ganglionares ao estímulo
luminoso (Jensen & Daw, 1986) e certamente também as ipRGCs. A inferência óbvia nesse
caso seria que variações circadianas no conteúdo de dopamina afetariam a sensibilidade das
ipRGCs à luz, de tal modo que a transmissão dopaminérgica atuaria de maneira preditiva,
preparando as células melanopsinérgicas para alterações na iluminação externa. Esta hipótese
é fortalecida pelos dados mostrando ciclos circadianos de dopamina (Doyle et al., 2002a, b) e
a expressão de componentes chaves da maquinaria do relógio molecular em neurônios
retinianos dopaminérgicos, mas não em melanopsinérgicos (Witkovsky et al., 2003;
Gustincich et al., 2004). Conforme mencionado anteriormente, a dopamina desempenha um
importante papel na regulação da fisiologia da retina sendo considerada um mediador
parácrino de adaptação à luz (Iuvone et al., 1978), sendo a sua síntese e liberação na retina
reguladas principalmente pelos cones e bastonetes através da circuitaria da retina (Doyle et
al., 2002b; Sakamoto et al., 2005). É proposto que a dopamina tem um importante papel na
mediação da sinalização de luz que é usada para a sincronização circadiana e outras respostas
mediadas pelo sistema não formador de imagem, considerando-se as evidências de que a
dopamina está envolvida na regulação do RNA mensageiro de melanopsina, possivelmente
via receptores D2 localizados nas ipRGCs (Sakamoto et al., 2005). Como as células
dopaminérgicas na retina parecem funcionar pelos menos em alguma extensão
independentemente dos fotorreceptores da retina externa (Puopolo et al., 2001; Doyle et al.,
2002b), então a implicação é que neurônios dopaminérgicos da retina podem servir como a
51
origem de sinais circadianos que, ao modular a função das ipRGCs, influenciam
indiretamente o núcleo supraquiasmático.
1.13 Importância da dopamina para a transição claro/escuro
Uma população de células amácrinas da retina se caracteriza por expressar dopamina,
(Prakash & Wurst, 2006; Björklund & Dunnett, 2007). Estas células podem ser identificadas
por imunoistoquímica, usando o anticorpo contra tirosina hidroxilase (TH), enzima que
participa da síntese da dopamina. Desta forma, a dopamina retiniana tem sido localizada em
um tipo de célula amácrina, cujo soma é encontrado na fileira mais interna da INL e os
processos se ramificam no extrato mais externo da IPL (Brecha et al., 1984; Oyster et al.,
1985; Hokoc & Mariani, 1987; Wulle & Schnitzer, 1989), podendo algumas delas serem
encontradas deslocadas na IPL e na camada de células ganglionares. As células amácrinas
dopaminérgicas são células esparsas, representando cerca de 0,2% de todas as células
amácrinas e aproximadamente 0,005% de todas as células retinianas (Gustincich et al., 1997;
Jeon et al., 1998). São células de campo dendrítico grande, com arborizações amplamente
difusas na camada plexiforme interna e, apesar da baixa densidade, cada célula origina
inúmeros processos que se irradiam à distância o suficiente para se sobreporem aos das
células vizinhas. Nesse emaranhado de processos dopaminérgicos estão imersos os pericários
(Witkovsky, 2004). Em várias espécies de vertebrados, a dopamina é localizada em outro tipo
de célula, a célula interplexiforme. Células interplexiformes dopaminérgicas são neurônios
que permanecem na camada nuclear interna e, como as células amácrinas, emitem processos
para a camada plexiforme interna, mas, além disso, possuem processos adicionais que
atravessam a camada nuclear interna, alcançando também a camada plexiforme externa
(Oyster et al., 1985; Mangel & Dowling, 1987; Savy et al., 1989). Como as células amácrinas
dopaminérgicas, as células interplexiformes desempenham um papel essencial na adaptação
ao claro-escuro e parecem estar ligadas a uma alça de retroalimentação (Cohen & Dowling,
52
1983; Mangel & Dowling, 1987), levando informações da camada plexiforme interna,
primariamente relacionada com aspectos dinâmicos e temporais do estímulo visual, de volta
para a camada plexiforme externa, que parece corresponder ao estágio do processamento da
informação visual, em que são processados aspectos estáticos e espaciais da iluminação
(Brandies & Yehuda, 2008). Em algumas retinas de vertebrados, o neurônio dopaminérgico é
uma célula amácrina, em outras é uma célula interplexiforme, mas em algumas espécies,
como o gato (Oyster et al., 1985) o rato e o camundongo (Witkovsky et al., 2008), os dois
tipos estão presentes. Algumas células dopaminérgicas co-localizam com o ácido gama-
aminobutírico (GABA), o que pode ser a base de uma modulação intracelular de dopamina
por GABA (Nguyen-Legros et al., 1997).
Dois tipos morfológicos de células amácrinas dopaminérgicas (tipo 1 e tipo 2) foram
descritos pela primeira vez na retina de macaco Rhesus (Mariani & Hokoc, 1988). As células
tipo 1 têm comparativamente grandes corpos celulares, são densamente coradas, estão
situadas quase exclusivamente na fileira mais interna da camada nuclear interna, seus
processos arborizam no extrato mais externo da camada plexiforme interna e dão origem a
finas fibras orientadas radialmente na camada nuclear interna. As células tipo 2 têm
comparativamente às células tipo 1, pequenos corpos celulares, menor intensidade de
coloração para TH, a maior parte encontra-se localizada na INL, seguido da IPL e GCL, e
seus processos arborizam no centro da camada plexiforme interna (Mariani & Hokoc, 1988).
Uma categorização semelhante, embora com variações na relação entre os dois tipos, foi
encontrada na retina de coelho (Tauchi et al., 1990) e do camundongo transgênico (Gustincich
et al., 1997; Feigenspan et al., 1998). Em camundongos selvagens, albinos ou pigmentados,
apenas um tipo morfológico foi identificado (Versaux-Botteri et al., 1984).
Estudos de microscopia eletrônica confirmaram a entrada de células bipolares sobre as
células amácrinas dopaminérgicas na retina de macaco Rhesus (Hokoc & Mariani, 1987) e de
53
gato e coelho (Hokoç & Mariani, 1988). Por esta via, em mamíferos, a produção e liberação
da dopamina retiniana são estimuladas pela exposição à luz (Kramer, 1971; Iuvone et al.,
1978; Witkovsky et al., 2004), embora os neurônios dopaminérgicos sejam tonicamente
ativos, apresentando disparos espontâneos de repouso, moduladas pela luz (Gustincich et al.,
1997; Feigespan et al., 1998). Uma vez liberada, a dopamina atua tanto localmente como
através de sinapses com os neurônios adjacentes, e dependendo da transmissão parácrina,
pode afetar as funções de inúmeras células da retina não necessariamente adjacentes às células
dopaminérgicas (Jensen & Daw, 1986; Bjelke et al., 1996). Nesse ponto é importante
mencionar que neurônios dopaminérgicos estão perfeitamente posicionados na retina interna
para facilitar a propagação de dopamina pela transmissão volumétrica, podendo receber
influências provenientes da entrada de mais de um tipo de célula bipolar e fazendo sinapses
morfologicamente definidas com dois tipos de células amácrinas, as células AII e as células
A17, ambas as quais fazem parte da via dos bastonetes (Voigt & Wässle, 1987; Witkovsky,
2004). Elas liberam dopamina extrassinapticamente de seu próprio soma (Puopolo et al.,
2001) e ao que parece, a grande maioria das células na retina possui receptores
dopaminérgicos (Nguyen-Legros et al., 1999), de modo a capturar e utilizar este
neurotransmissor.
As células dopaminérgicas controlam a sensibilidade de muitos neurônios retinianos
durante adaptação ao claro e ao escuro. Estas células ajustam globalmente a responsividade da
retina sob luz brilhante ou penumbra. A dopamina afeta muitos elementos da circuitaria da
retina, altera a condutância nas junções comunicantes entre células horizontais e células
amácrinas, potencializa as respostas de receptores de glutamato ionotrópicos sobre células
bipolares, afeta o equilíbrio centro-periferia das células ganglionares e é até capaz de causar
migração do pigmento em células do epitélio pigmentar retiniano, um tecido não neural
(Witkovsky, 2004). Neste caso e também em outros, isto é mediado não sinapticamente, e sim
54
através de uma liberação difusa, parácrina, do neurotransmissor. Experimentos usando células
amácrinas transgenicamente marcadas em cultura mostraram que a liberação extrassináptica é
controlada por potenciais de ação espontâneos na ausência de entrada sináptica e modulada
por entradas, presumivelmente também parácrinas, de outros neurônios retinianos (Gustincich
et al., 1997; Puopolo et al., 2001).
É interessante destacar que a dopamina exerce um papel antagônico ao da melatonina
na regulação da fisiologia adaptativa da retina. Enquanto a dopamina funciona como um sinal
químico para a luz, produzindo mecanismos fisiológicos de adaptação à luz, a melatonina tem
efeitos adaptativos ao escuro (Green & Besharse, 2004; Iuvone et al., 2005). Ao que tudo
indica, os fotorreceptores secretores de melatonina e as células amácrinas/interplexiformes
secretoras de dopamina, formam uma alça de feedback celular, funcionando na regulação da
fisiologia retiniana circadiana (Iuvone et al., 2005). Além disso, foi visto que as células
dopaminérgicas da retina atuam também modulando a expressão de melanopsina em células
ganglionares intrinsecamente fotossensíveis (Sakamoto et al., 2005; Vugler et al., 2007). As
interações envolvendo dopamina, melatonina e melanopsina foram abordadas anteriormente
no contexto dos ritmos da retina e sistemas fotossensíveis da retina interna.
Resumindo, a integridade do sistema dopaminérgico é fundamental para a expressão
de muitas funções retinianas, podendo a sua disfunção explicar muitos dos distúrbios visuais
que ocorrem em consequência do envelhecimento e doenças degenerativas (Djamgoz et al.,
1997; Witkovsky, 2004; Brandies & Yehuda, 2008). No sistema visual, as funções da
dopamina incluem adaptação à luz, visão de cores, controle de sensibilidade,
resolução/acuidade espacial e sinalização temporal. Além disso, também está envolvida em
funções tróficas, incluindo crescimento ocular, desenvolvimento e morte celular (Witkovsky,
2004; Brandies & Yehuda, 2008).
55
1.14 O mocó como modelo experimental
O mocó (Kerodon rupestris), é uma espécie tipicamente Brasileira, nativa da região
Nordeste, sendo encontrado desde o Piauí até o norte de Minas Gerais (Cabrera, 1961).
Taxonomicamente, o mocó é classificado na ordem Rodentia, superfamília Cavioidea,
família Caviidae, subfamília Caviinae, gênero Kerodon, juntamente com Cavia (Cavia
porcellus), Galea (Galea spixii) e Microcavia (Microcavia niata) (Cabrera, 1961; Lacher,
1981).
O mocó pertence a um grupo de roedores que tem sido estudado por pesquisadores
neurocientistas brasileiros desde os anos oitenta, compreendendo a cutia (Dasyprocta aguti e
outras espécies), capivara (Hydrochaerus hydrochaeris), e a paca (Cuniculus paca) (Silveira,
1985; Silveira et al., 1989; Picanço-Diniz et al., 1991; Rocha et al., 2009), e também o
porquinho da índia (Cavia porcellus), o qual tem sido estudado em laboratórios de diferentes
partes do mundo (Jacobs & Deegan, 1994; Peichl & González-Soriano, 1994; Parry &
Bowmaker, 2002). De acordo com a classificação que usa a forma do crânio como
característica primária (Carleton & Musser, 2005) – Anomaluromorpha, Castorimorpha,
Hystricomorpha, Myomorpha, e Sciuromorpha, este grupo é parte da subordem
Hystricomorpha, uma das cinco subordens de roedores aceita no padrão de classificação de
Rodentia.
Estudos filogenéticos utilizando uma abordagem molecular (Rowe & Honeycutt,
2002) tem relacionado o gênero Kerodon com o gênero Hydrochaeris ao qual pertence a
capivara (família Hydrochaeridae), e também estreitamente alinhado com o gênero Dolichotis
da subfamília Dolichotinae, cujo representante na América do Sul é o lebre patagônico
(Dolichotis patagonum).
56
Os mocós são animais endêmicos da caatinga, habitando a região do semi-árido
nordestino, onde estão localizadas as rochas graníticas, que lhes servem como refúgio e abrigo
contra os predadores, os quais são principalmente os gatos macambira e vermelho, as raposas,
o gavião pé de serra e o jacurutu (Carvalho, 1969; Lacher, 1981). São altamente adaptados às
condições ecológicas regionais, como o calor, a escassez de água e de alimentos,
principalmente nos períodos das grandes secas nas regiões do semi-árido nordestino. São
herbívoros e costumam se alimentar de cascas de árvores, brotos, pequenos arbustos e ramos
de algumas espécies de plantas trepadeiras (Mendes, 1985; 1987). Em cativeiro aceitam bem
frutas como banana, mamão, jambo, manga, e raízes como batata doce, além de capim fresco
e folhas de mangueira (observações próprias). Atingem a fase adulta aos 200 dias, podendo
atingir até 50 cm de comprimento e 1 quilo de peso corporal (Roberts et al., 1984).
Os mocós apresentam coloração quase sempre homogênea em torno do castanho
dourado em praticamente todo o corpo (observações próprias) embora na literatura seja
descrita também a ocorrência de exemplares com coloração cinzenta, com pêlos pretos e
amarelos ou esbranquiçados na parte superior, marrons na região posterior e um pouco
acastanhada nas pernas, e brancos na região do pescoço (Carvalho, 1969). O gênero Kerodon
possui o mesmo corpo básico dos outros cavíneos, embora apresente algumas características
morfológicas e craniais únicas para a subfamília. As mãos e os pés são acolchoados com
epiderme semelhante à pele-couro e não possuem garras. O pé tem unhas subcutâneas sobre
todos os dígitos, exceto um no interior dos pés onde a unha foi modificada como uma
pequena garra usada para pentear o pêlo. O crânio, especialmente o focinho, é maior e mais
estreito do que nos outros cavíneos, assim como a distância entre os incisivos e os pré-
molares é proporcionalmente maior (Lacher, 1981). O mocó é um animal trepador
extremamente ágil, apesar de não possuir garras nem cauda, duas adaptações normalmente
associadas com arborealidade. Tem o olfato bem desenvolvido, principalmente nos machos,
57
que podem detectar a presença do homem e de outros animais a longas distâncias. A audição é
também bastante aguçada, de modo que qualquer ruído curto, de pequena intensidade, como
um assobio, um pequeno galho quebrado, ou o barulho de folhas roçando o solo, costumam
atlertar o mocó (Carvalho, 1969). Quanto à reprodução, ocorrem nascimentos ao longo do
ano, exceto no período que vai de abril a junho. As fêmeas apresentam estro pós-parto,
podendo acasalar-se poucas horas após o nascimento dos filhotes. Embora as proles sejam
pequenas a cada parto (cerca de 1 a 2 filhotes), o curto período gestacional (75 dias) garante
uma elevada produção de crias a cada ano. Os animais atingem o tamanho do adulto aos 200
dias, embora a primeira concepção das fêmeas possa ocorrer aos 115 dias de vida (Lacher,
1981; Roberts et al., 1984).
A partir de observações e de informações colhidas em campo, Carvalho (1969) relatou
que os mocós saem para alimentar-se de manhã e à tarde nos dias mais escuros. Nos dias
claros, eles se alimentam apenas à noite. Nos dias nublados, depois de uma chuva, costumam
sair a qualquer hora do dia, permanecendo fora da toca o tempo necessário para a secagem das
rochas, o que algumas vezes pode durar o dia inteiro. Lacher (1981) verificou que, no campo,
esse roedor sai para forragear ao longo do dia e da noite, porém a maior parte da atividade
ocorre durante o dia, com picos de atividade no crepúsculo. De acordo com Mendes (1987),
os mocós são animais gregários, de hábitos crepusculares, que passam o dia abrigados em
tocas de rochas, saindo à tardinha e ao amanhecer para alimentar-se. Sousa & Menezes
(2006), estudando o mocó sob condições controladas de laboratório, registraram para esta
espécie a expressão de atividade locomotora ao longo das 24 horas do dia, com picos nas
fases de transição de luminosidade, caracterizando um comportamento predominantemente
crepuscular. Estes dados sugerem que o mocó possa apresentar adaptações ópticas e retinianas
relacionadas com a transição claro-escuro, o que motivou a realização do presente trabalho.
58
Esta espécie foi escolhida como um modelo animal de roedor regional para estudos de
ritmos circadianos no Laboratório de Cronobiologia-UFRN. Além da caracterização do ritmo
de atividade e outras respostas circadianas deste animal (Sousa & Menezes, 2006), estudos
prévios do nosso laboratório demonstraram a existência de proteínas ligantes de cálcio nos
centros circadianos do mocó (Cavalcante et al., 2008), além de projeções da retina diretas aos
núcleos talâmicos paraventricular (PVT) (Nascimento Jr. et al., 2008) e mediodorsal (MD)
(Nascimento Jr. et al., 2010a), envolvidos nos ritmos circadianos e modulação de
reconhecimento visual, respectivamente. Foi descrito também que este roedor tem uma
projeção retino-hipotalâmica semelhante ao descrito para outros mamíferos diurnos ou
noturnos, além de peculiaridades no que diz respeito a distribuição de neurônios positivos ao
peptídeo intestinal vasoativo (VIP) e vasopressina (VP) no núcleo supraquiasmático
(Nascimento Jr. et al., 2010b). Recentemente, também foram descritos os grupamentos
serotoninérgicos do mocó (Soares et al., 2012). Várias publicações estão em andamento com a
participação de estudantes de pós-graduação e iniciação científica.
Além disso, deve-se levar em conta que o conhecimento da anatomia do olho, a sua
posição na cabeça e da distribuição das células na retina possibilita identificar adaptações de
cada espécie ao seu campo visual, o qual é peculiar para cada estilo de vida dentro do nicho
ecológico que ele ocupa (Collin, 2008). Assim sendo, torna-se plenamente justificado
estender este estudo de modo a abranger a anatomia do olho e a caracterização da retina numa
espécie regional sobre a qual não há nenhum registro de estudo desta natureza até o presente.
59
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Este trabalho tem como objetivo estudar características anatômicas do olho e aspectos
citoarquitetônicos e neuroquímicos da retina do mocó (Kerodon rupestris).
2.2 Objetivos específicos
1. Descrever aspectos anatômicos do olho;
2. Analisar a distribuição topográfica de densidade de células ganglionares;
3. Caracterizar as células amácrinas dopaminérgicas quanto aos subtipos e sua
distribuição na retina;
4. Identificar as subpopulações de fotorreceptores quanto à presença de opsinas
para comprimentos de onda curta (S), média/longa (M/L), e sua distribuição na
retina;
5. Caracterizar as diversas populações neuronais da retina com marcadores
imunohistoquímicos específicos.
60
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Nesta pesquisa foram utilizados 18 mocós adultos jovens provenientes do município
de Jucurutu, Região do Seridó do Rio Grande Norte, conforme autorização do Instituto
Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis – IBAMA (SISBIO número
22403-1, de 24/12/2009). Todos os cuidados foram tomados no sentido de evitar dor e
sofrimento aos animais durante os procedimentos experimentais, seguindo estritamente as
normas estabelecidas pelo National Research Council of the National Academy publicadas no
livro “Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behavioral
Research”. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética para Uso de Animais-UFRN sob
número 015/2009.
Não foi possível determinar a idade dos animais, uma vez que foram todos capturados
na natureza. Entretanto, utilizamos o parâmetro do peso corporal para estabelecer uma faixa
compatível com indivíduos nem muito jovens, nem excessivamente velhos. Após a captura os
animais foram acomodados em um ambiente com paredes de tela de arame presa a suporte de
alvenaria, teto de telhas de cerâmica e piso de solo natural com vegetação rasteira e pedras,
simulando o habitat natural do animal. Desta forma, os animais ficaram expostos às condições
ambientais naturais de temperatura, umidade do ar e luminosidade, com alimentação e água
ad libitum continuamente.
Do total de 18 animais (36 olhos), foram utilizadas 18 retinas para montagens planas
(6 para marcação com anticorpo anti-TH, 3 com anti-opsina para cones S, 3 com anti-opsina
para cones L/M, 4 para coloração por técnica de Nissl (cresil violeta), 1 para marcação com
anti-Beta-tubulina e 1 para marcação com anti-calbindina); 4 olhos foram congelados em
metanol com gelo seco e cortados num micrótomo de deslizamento (Leica SM 2000R) para
estudo da anatomia macroscópica, 2 olhos foram emblocados em parafina/bouin para análise
61
da estrutura do olho e da retina, e 3 foram cortados em criostato para montagem em lâminas e
análise da estratificação de cones, bastonetes, de células expressando dopamina, proteínas
ligantes de cálcio, inclusive com a utilização de duplas marcações.
Anestesia e perfusão
Os animais foram adaptados ao escuro por um período de 2 a 3 horas, sendo então pré-
anestesiados com cloridrato de tramadol e xilazina, ambos 5mg/Kg, e após 15 minutos,
anestesiados com uma injeção intramuscular de cloridrato de ketamina (100 mg/kg), sendo
mantidos com isoflurano e oxigênio por inalação. Uma vez anestesiados, foram tomadas
medidas da rima palpebral com o auxílio de um paquímetro digital (Digimess). Os olhos
foram fotografados dentro da órbita e sob anestesia profunda, foram perfundidos
transcardiacamente inicialmente com 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato pH
7.4 (PB) com heparina (Parinex Hipolabor, 2 ml/1000 ml de solução salina) seguido de 700
ml de solução fixadora, consistindo de solução de paraformaldeído 4% em PB pH 7.4. As
soluções foram impulsionadas através do leito vascular do animal por uma bomba de perfusão
(Cole-Parmer), à qual foi conectada uma agulha inserida no ápice do ventrículo esquerdo, na
direção da aorta ascendente, tendo sido feita prévia incisão na aurícula direita. Todo
procedimento durou em torno de 30 minutos.
Concluída a perfusão, procedeu-se a enucleação dos olhos. Os crânios foram
descarnados e macerados para estudo da órbita óssea e os encéfalos removidos e armazenados
para estudos de outros projetos desenvolvidos no laboratório.
Os eixos dorsoventral e nasotemporal do olho foram devidamente registrados para
posterior orientação da retina. Foram obtidas medidas morfométricas com o paquímetro
digital: diâmetro axial do olho (AD), diâmetro equatorial do olho (ED) e diâmetro equatorial
da córnea (EDC). Feito isso, foram feitas aberturas na córnea e os olhos foram imersos em
62
paraformaldeído 4% (Sigma-Aldrich) por 2 horas e depois armazenados em tampão fosfato
(PB) 0,1 M, pH 7.4. Para as montagens planas, as retinas foram cuidadosamente dissecadas e
mantidas em tampão fosfato 0,1 M, pH 7.4, 4º C. Para obtenção de secções verticais, três
retinas de animais distintos foram crioprotegidas com sacarose 30% em PB 0,1 M, e áreas
representativas das regiões central e periférica foram seccionadas (20 µm de espessura), em
criostato (Leica CM 1900, Alemanha). As secções foram montadas em lâminas gelatinizadas
e armazenadas a -20°C até o momento de sua utilização em procedimentos de
imunoistoquímica.
Análise da anatomia do olho
Para identificação dos músculos extra-oculares, uma vez concluída a perfusão, 3
animais tiveram um olho mantido na órbita, quando então os crânios foram descarnados para
facilitar a cuidadosa dissecação dos músculos, com o devido cuidado para manter os olhos
sempre adequadamente hidratados. Uma vez concluída a dissecção, os músculos foram
identificados e fotografados e em seguida os olhos foram excisados e armazenados em PB
0,1M, pH 7.4.
Para o exame macroscópico das estruturas internas do olho, quatro olhos foram
enucleados previamente à fixação, imediatamente congelados por imersão em metanol com
gelo seco e seccionados no plano ântero-posterior, em micrótomo horizontal de deslizamento.
Ao longo de toda microtomia foram obtidas fotografias para posterior análise das seguintes
dimensões: diâmetros axial e equatorial do olho, diâmetros axial e equatorial do cristalino,
diâmetro equatorial da córnea, distância entre a córnea e a face anterior do cristalino e entre a
face posterior do cristalino e a esclera. Essas medidas foram registradas no nível do nervo
óptico e no nível do maior eixo do olho.
63
Dois olhos foram imersos em fixativo de Bouin (solução saturada aquosa de ácido
picrico – 75 ml, formol 37 ou 40% - comercial – 20 ml, e ácido acético glacial – 5 ml) por 24
horas, desidratados em soluções de etanol em concentrações ascendentes, e emblocados em
parafina. Foram obtidas secções transversais de 5 μm de espessura e coradas com
Hematoxilina-Eosina para análise da organização em camadas do olho e estratificação da
retina.
Imunoistoquímica em montagens planas
Montagens planas de 18 retinas foram obtidas seguindo o método de Stone (1981). Em
algumas retinas, o epitélio pigmentar permaneceu firmemente aderido ao tecido retiniano, e
para sua remoção foi adotado o protocolo descrito em Hemmi & Grünert (1999), com
pequenas modificações, utilizando peróxido de hidrogênio (H2O2) 10% em tampão fosfato-
salina (PBS) por 24h. Após esse procedimento, as retinas foram lavadas várias vezes em PBS
e tratadas com uma solução de Hialuronidase (510 UI/ml) em PBS por 30 minutos (37ºC)
para retirar o humor vítreo. A recuperação antigênica do tecido foi obtida em tampão borato
0,2M pH 9 (70°C) por 60 minutos, seguida de três lavagens em PBS por 5 min. cada. Foi feita
inativação da peroxidase endógena (100 µl metanol + 100 µl H2O2 30% + 800 µl de PBS)
durante 15 minutos, seguida de três lavagens em PBS por 5 min. cada e uma lavagem em PBS
+ Triton X-100 a 5% por 30 minutos. Subsequente a três lavagens em PBS (5 minutos cada),
a preparação foi incubada em 10% de soro normal (compatível com os respectivos anticorpos)
em PBS + triton X-100 0,3% (PBSTX) por 2 horas, seguida pelo anticorpo primário e 1% de
soro normal por 5 dias (4º C). Após várias lavagens em PBS o tecido foi incubado no
anticorpo secundário biotinilado durante três dias (4ºC) e em seguida, lavado e incubado no
complexo Avidina - Biotina - Peroxidase (1:200, kit ABC Vector) por três dias (4º.C). Todos
os anticorpos foram diluidos em PBSTX. A visualização do anticorpo foi obtida utilizando-se
64
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (2,5 mg de DAB em 10 ml de tampão
fosfato 0,1 M pH 7,4 por 20 minutos com agitação contínua, acrescida de H2O2 0,3%). Após a
reação, as retinas foram lavadas em PBS, feitos alguns pequenos cortes periféricos para
aplainar e possibilitar a montagem sobre lâminas de vidro gelatinizadas, mantendo a
orientação naso-temporal e súpero-inferior. Após um período de 24h à temperatura ambiente,
verificando que as retinas estavam bem aderidas às lâminas, as mesmas foram desidratadas
em soluções crescentes de álcool, diafanizadas em xilol e montadas em lamínula, usando
Entellan (Merck). A imunohistoquímica realizada nas secções verticais foi semelhante a das
montagens planas, exceto pelos períodos de incubação mais curtos para o anticorpo primário
(24 h) secundário e ABC (1h) e omissão do tratamento com hialuronidase, peroxidase
endógena e triton X-100 5%.
Dupla marcação
Em secções verticais foram realizadas duplas marcações para investigar colocalização
de: GABA e tirosina hidroxilase (TH); Parvalbumina (PV) e colina acetiltransferase (ChAT),
calbindina (CB) e calrretinina (CR), CB e TH, opsinas S e L/M. Neste caso, as secções foram
incubadas inicialmente numa solução de bloqueio contendo 5% de albumina bovina (BSA),
0,3% triton X-100 por 60 min e simultaneamente então com os anticorpos primários por 24 h
a 4°C. As secções foram lavadas em PB e incubadas com os secundários fluorescentes
também simultâneamente, por 4 h. Após lavagens em PB as lâminas foram montadas em
glicerol 40% em PB e analisadas utilizando um microscópio de epifluorescencia (Leica, DM
LB)
No caso das duplas marcações com anticorpos primários obtidos num mesmo animal
(opsina S - L/M), foi inicialmente feita a incubação em um anticorpo primário individual e
reação com DAB, e após a marcação com DAB, os cortes ficaram 30 minutos no tampão
65
glicina pH 2,2. Foram então lavados com PB e incubados no outro anticorpo primário seguido
pelo fluorescente.
Foi feita uma dupla marcação também numa montagem plana para investigar
colocalização de CB em células dopaminérgicas. Todos os passos antes descritos para as
montagens planas foram mantidos, alterando apenas a partir da incubação dos anticorpos
primários. Estes foram incubados simultaneamente. Anti-TH diluição 1:500 + anti-CB 1:500
+ 1% de soro normal em PBSTX durante 5 dias (4º C). Após 3 lavagens de 5 minutos cada
em PBS, o tecido foi incubado nos anticorpos secundários Fluorescein anti-rabbit e TritC anti-
mouse 1:200, durante 3 dias (4º C). Após lavagens em PBS o tecido foi colocado numa
lâmina gelatinizada. Após secagem, colocado em glicerol 40% em PB, coberta com lamínula
e analisada utilizando um microscópio de epifluorescencia (Leica, DM LB)
Análise dos dados
Células dopaminérgicas
Para a distribuição das células dopaminérgicas, seis montagens planas foram usadas
para medir a área da retina, densidade celular espacial total, gradiente centro-periferia e
tamanho do corpo celular. Análise da distribuição topográfica das células dopaminérgicas foi
obtida a partir da obtenção de imagens digitalizadas de campos adjacentes e sucessivos ao
longo de toda a extensão retiniana de modo a permitir uma contagem de todas as células
dopaminérgicas. Entre as seis retinas examinadas, foram obtidas de 227 a 312 janelas de
amostragem de 0,8 mm2. Os valores obtidos em cada janela foram transferidos para um mapa
da retina em papel milimetrado, de modo a representar a distribuição numérica das
populações de células dopaminérgicas
Para caracterizar as populações de células dopaminérgicas presentes ao longo de toda
a extensão retiniana, foram analisados parâmetros morfométricos, tais como tamanho e
66
diâmetro do corpo celular, além de parâmetros relativos ao padrão de estratificação na INL e
intensidade de imunorreatividade em diferentes excentricidades. As análises de corpo celular
foram realizadas a partir de imagens digitalizadas obtidas através de video camera (Nikon
DXM1200) acopladas ao microscópio, objetivas de 100 X com óleo de imersão. Para as
medidas de área, diâmetro e contagens de células, foi utilizado o software Image J 1.45s,
(National Institutes of Health, USA).
Fotorreceptores
Análise da distribuição topográfica de cones verde/vermelho e azul foram obtidas de
campos de amostragem de 138 x 110 µm, a cada 0,5mm através de toda a extensão da retina.
Em média 510 ± 96 janelas de amostragem foram analisadas em 6 retinas (3 montagens
planas para cones S e 3 para cones L) usando objetivas de 100 X em óleo de imersão. Imagens
digitais dos campos de amostragem foram obtidos via video camera (Nikon DXM1200)
acoplada a um microscópio Olympus (BX41). Para contagens de células, foi utilizado o
software Image J 1.45s, (National Institutes of Health, USA). Todos os dados foram
transferidos para mapas em papel milimetrado e convertido para células/mm2.
Células ganglionares - Marcação de Nissl.
Quatro montagens planas foram coradas com cresil violeta para análise da distribuição
topográfica de células ganglionares, de acordo com um protocolo previamente descrito
(Oliveira et al., 2006). Foram obtidas imagens digitalizadas da GCL a cada mm de distância
por toda a extensão da retina, com o uso de um microscópio óptico Olympus BX50, (objetiva
de 40 X) acoplado a uma video camera (Nikon DXM1200). Para a contagem das células, foi
utilizado o software Image J 1.45s (National Institutes of Health, USA).
67
Todos os dados foram transferidos para mapas em papel milimetrado e convertido para
células/mm2. Foram obtidas entre 169 e 176 janelas de amostragem por retina examinada.
Todos os neurônios observados na GCL foram contados, de acordo com o critério
estabelecido por Stone (1981). Avaliação da densidade e número total das células se fez por
um método de integração considerando a área ocupada por linhas de isodensidade e o valor de
densidade de cada uma das linhas.
68
Tabela de anticorpos
Anticorpos primários Diluição Anticorpos secundários Diluição
rabbit polyclonal anti-blue
opsin (Millipore)
1:200 W
1:1000 SV
Goat-anti-guinea pig (Jackson
Immuno Research Lab)
1:1000
Rabbit monoclonal anti-β-
tubulin EP1569Y
(Millipore)
1:200 Goat-anti-Rabbit (Vector) 1:200
mouse monoclonal anti-
calbindin D (CB) C-8666
(Sigma)
1:500 Donkey-anti-goat (Jackson
Immuno Research Lab)
1:1000
rabbit policlonal anti-
calretinin (CR) AB 5054
(Chemicon)
1:1000 Donkey-anti-mouse (Jackson
Immuno Research Lab)
1:1000
goat policlonal anti-Choline
acetyltransferase (ChAT)
(Millipore)
1:500 Goat-anti-mouse (Jackson
Immuno Research Lab)
1:1000
guinea pig anti-GABA
(Protos Biotech Inc.)
1:500 Donkey anti-rabbit (Jackson
Immuno Research Lab)
1:1000
mouse monoclonal anti-
neurofilament [NF-01] to
200kD - ab7795 (abcam)
1:500 Goat-anti- rabbit biotinylated
(Jackson Immuno Research
Lab)
1:1000
mouse monoclonal anti-
Parvalbumin (PV) P-3171
(Sigma)
1:1000 Alexa fluor 594 goat anti-
mouse
1:200
mouse monoclonal anti-
Protein Kinase C P7504
(Sigma-Aldrich)
1:2000 Alexa fluor 594 donkey anti-
mouse
1:200
rabbit polyclonal anti-
red/green opsins (Millipore)
1:200 W
1:2000 SV
Fluorescein goat anti-rabbit
(Vector)
1:200
Anti-rodopsina 1:100 Fluorescein goat anti-guinea
pig IgG (Vector)
1:200
rabbit polyclonal anti-TH
AB152 (Millipore)
1:500 Fluorescein Trit C donkey anti-
mouse (Jackson Immuno
Research Lab)
1:200
Fluorescein Trit C donkey anti-
goat (Jackson Immuno
Research Lab)
1:200
Rhodamine-conjugated 546
donkey anti-rabbit IgG
(Jackson Immuno Research
Lab)
1:200
Rhodamine Fit C donkey anti-
mouse
1:200
Alexa fluor 488 goat anti-
rabbit
1:200
Alexa fluor 488 goat anti-
mouse
1:200
69
RESULTADOS
1° Artigo
The eye of the crepuscular rodent rock cavy (Kerodon rupestris) (Wied, 1820)
Submetido à revista "Journal of Zoology".
Classificação no QUALIS: B1
70
The eye of the crepuscular rodent rock cavy (Kerodon rupestris) (Wied, 1820)
FRANCISCO GILBERTO OLIVEIRA1,2
, BELMIRA LARA DA SILVEIRA ANDRADE
DA COSTA3, EXPEDITO SILVA DO NASCIMENTO JÚNIOR
2, JUDNEY CLEY
CAVALCANTE2, JEFERSON DE SOUSA CAVALCANTE
2,4, RUTHNALDO
RODRIGUES MELO DE LIMA2, SEBASTIÃO FRANCO DA SILVA
2,5, NAYRA SILVA
RESENDE2, JOACIL GERMANO SOARES
2, MIRIAM STELA MARIS DE OLIVEIRA
COSTA2*
1Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde
Universidade Regional do Cariri (URCA), Crato, CE, Brazil
2Departamento de Morfologia, Laboratório de Neuroanatomia, Centro de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, RN, Brazil
3Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE, Brazil
4Departamento de Fisiologia, Laboratório de Neuroanatomia, Centro de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, RN, Brazil
5Departamento de Anatomia, Universidade Potiguar (UNP), Natal, RN, Brazil
*Corresponding author: E-mail: [email protected]
Running head title: Rock cavy eye
It contains 1 Table and 6 Figures
Keywords: eye, extraocular muscles, Kerodon rupestris, orbita, pupil, retina.
71
Abstract
The rock cavy (Kerodon rupestris) is a crepuscular Caviidae rodent belonging to suborder
Hystricomorpha, inhabiting semiarid areas of the Brazilian Northeast region. The rock cavy
has lateral eyes housed in well constituted bony orbit and endowed of well differentiated
extrinsic musculature. Descriptive and morphometric anatomical study of the rock cavy eye
showed mean values of axial diameter 10.7 ± 0.5 mm and equatorial diameter 11.6 ± 0.7 mm.
It has a vertical slit pupil and a crystalline lens with mean axial diameter of 5.4 ± 0.03 mm,
which correspond to ~ 45% eye axial diameter. The posterior nodal distance and the retinal
magnification factor were estimated as 6.74 mm and 118 µm/grau, respectively. Anatomical
features of the rock cavy eye suggest that it was designed to acquire greater light sensitivity,
at the expense of a reduced resolution, compatible with a vision under mesopic conditions,
befitting an animal of predominantly crepuscular activity pattern.
72
Introduction
The rock cavy (Kerodon rupestris) is a rodent inhabiting semiarid Caatinga of the
Brazilian Northeast, although it can be also found in the southeast region as Minas Gerais
State. Colonies of rock cavies usually live in cracks and crevices of granitic rocks, which
serve as refuge and shelter from predators (Cabrera, 1961; Lacher, 1981). This species
reaches adulthood by completing 200 days, and can reach up to 50 cm length and 1 kilogram
body weight (Roberts et al., 1984). According to traditional taxonomy, the rock cavy belongs
to the order Rodentia (Storer & Usinger, 1971). According to classification using the skull
shape as a primary characteristic – Anomaluromorpha, Castorimorpha, Hystricomorpha,
Myomorpha e Sciuromorpha (Carleton & Musser, 2005), the rock cavy is part of the suborder
Hystricomorpha, one of the five suborders of Rodentia, infraorder Caviomorpha, superfamily
Cavioidea (Carleton, 1984), family Caviidae, subfamily Caviinae, genus Kerodon (rock cavy)
(Moojen, 1952). Phylogenetic studies using molecular approach (Rowe & Honeycutt, 2002)
have connected the genus Kerodon with the genus Hydrochaeris, which includes the capybara
(family Hydrochaeridae), and is closely aligned with the genus Dolichotis of the subfamily
Dolichotinae, whose representative in South America is the Patagonia hare (Dolichotis
patagonum).
Behavioural studies carried out in field reported that this rodent species comes out to
forage throughout the day and night, but most of the activity occur during the day, with peaks
of activity at dawn and dusk (Carvalho, 1969; Lacher, 1981). In line with these observations,
an investigation performed under controlled laboratory conditions showed that the rock cavy
was active throughout the 24-h day, with peaks during sunrise and sunset phases, featuring a
predominantly crepuscular behavior (Sousa & Menezes, 2006). These data suggest that the
rock cavy can exhibit optical and retinal adaptations related to light-dark transition, which
73
motivated us to use this animal as a suitable animal model of regional rodent for studying
circadian rhythms. In this direction the retinal projections were traced to circadian timing
system centers, such as the hypothalamic suprachiasmatic nucleus and the thalamic
intergeniculate leaflet (Nascimento Jr et al., 2010b), as well as direct retinal projections were
showed to paraventricular (Nascimento Jr. et al., 2008) and mediodorsal (Nascimento Jr et al.,
2010a) thalamic nuclei. Studies on targets of retinal projections constituting the primary
visual and accessory optic systems, as well as projections to other hypothalamic targets are
ongoing. However, to our knowledge, nothing is known about anatomical features of the rock
cavy eye.
The knowledge of the eye anatomy, its location in the head and retinal cell distribution
have allowed to identify adaptations of each species to its visual field, which are peculiar to
each lifestyle in its ecological niche (Collin, 2008). Some rodent species of the
Hystricomorpha order such as diurnal agouti and capybara (Silveira, 1985; Silveira et al.,
1989; Picanço-Diniz et al., 1991), nocturnal paca (Silveira, 1985; Silveira et al., 1989), guinea
pig (Jacobs & Deegan, 1994; Peichl & González-Soriano, 1994; Parry & Bowmaker, 2002),
crepuscular chinchilla (Detwiler, 1949; Lima et al., 2010; Müller et al., 2010) and degus
(Chávez et al., 2003; Jacobs et al., 2003), have been utilized as model for several aspects of
visual system. Nevertheless, adaptive mechanisms to the temporal niche are present in the
visual system of most of vertebrates. These mechanisms involve modifications in the ocular
dimensions and design, organization of neural circuits related to the retinal resolution or
detection of changes in the levels of luminance (Land & Nilsson, 2008; Land, 2009). The
quality of the optical system may limit the amount of information that can be made available
to the brain since the retina can only encode information that is present in the image (Hall &
Ross, 2003). Therefore, shape and size of pupil and adjustment of focus are also particularly
74
important if an animal has eyes adapted for use under photopic, mesopic or scotopic
conditions (Malmström & Kröger, 2006).
Taking into account the importance of these ocular features to the temporal niche of
each species, the present study investigated morphometric parameters of the rock cavy eye in
order to analyze how these features contribute to the gain in visual sensitivity and resolution
in conditions of crepuscular levels of lighting. Under a comparative point of view, this study
could contribute to understand visual adaptations into the biodiversity. Moreover, it can
support previous and future investigation on the visual and circadian timing system of this
species.
75
Materials and Methods
In this study, young adult rock cavies from rural municipalities in Rio Grande do
Norte state, Northeastern Brazil, were used, with the authorization of the Brazilian Institute of
Environment and Renewable Natural Resources (IBAMA, SISBIO license no. 22402-1,
2009/12/24). Approval for the experiments was obtained from the local Animal
Experimentation Ethics Committee (CEUA-UFRN, protocol no. 015/2009), in compliance
with National Institute of Health (NIH) guidelines. All efforts were made to minimize the
number of animals and their suffering.
Six animals (2 males and 4 females), weighting between 338 and 641 g were used. It
was not possible to determine their ages, since all of them were captured from the nature.
However, we utilized the body weight as a parameter to establish a range compatible with
individuals neither too young nor too old. After capture, individuals were housed in a room
with four wire mesh walls attached to masonry support, ceramic tile ceilings and natural soil
floor, with creeping vegetation and rocks to simulate their natural habitat. Thus, the animals
were exposed to natural environmental conditions of temperature, humidity and light, with
food and water continuously available. All experimental procedures were performed in the
Laboratory of Neuroanatomy, Department of Morphology, UFRN. Morphometric measures
were also taken of other animals utilized in other researches of the laboratory.
The animals were pre-anesthetized with an intramuscular injection of tramadol
chloridrate (5mg/kg) and, after 15 minutes, anesthetized with an intramuscular injection of
ketamine chloridrate (100 mg/kg) and xylazine (5 mg/kg). Upon deep anesthesia, with the aid
of a digital calliper (Digimess), they were subjected to measurement of the palpebral fissure
length, and then the eye was photographed into the orbit to measure pupil diameters. The
orientation of each eye was labeled by a small incision in the lateral angle of the cornea.
76
Still deeply anesthetized, the animals were subjected to transcardiac perfusion, with
300 ml of 0.9% saline solution in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4 (PB), containing heparin
(Parinex, Hipolabor, 2 ml/1000 ml of saline solution), followed by 700 ml of fixative solution,
consisting of 4% paraformaldehyde solution in PB. Solutions were driven on the vascular bed
of the animal by a peristaltic pump (Cole-Parmer), to which a needle inserted in the apex of
left ventricle directed to ascending aorta was connected, having been made previous incision
in the right auricula. All procedure expends around 30 minutes.
Ended perfusion, the eyes were enucleated. Skulls were scrawny and macerated for
studying of the bony orbit.
In 3 animals, one of the eyes was kept in the orbita in order to facilitate the dissection
of the extraocular muscles. Ended the dissection, the muscles were identified and
photographed.
After that, eyes were finally excised. It was examined the position of the optic nerve in
the posterior pole, and, after removal of fat tissue and extraocular muscles, with aid of a
digital calliper, the following measures were taken: axial diameter (anteroposterior, AD),
from the anterior pole of the cornea to posterior pole of the sclera; equatorial diameter
(transversal, ED) of the eye, between the extreme side points of both eyes sides; and corneal
diameter (CD), with the tips of the caliper between from a side and another of the cornea-
sclera limit.
Next, the lateral incision of the cornea was extended, remaining attached only on the
medial side by around 2 mm. This allows keep the orientation of each eye (right-left) and in
each one, the orientation medial (nasal)-lateral (temporal), superior-inferior. Opening the
window of the cornea, it was noted the iris, the pupil aperture and the lens through this
aperture. Next, the eyeball was stored in fixative solution during 2 hours to overnight, and
then transferred to PB.
77
The posterior hemisphere was also examined by its internal surface (eyecup), after
removal of the iris and lens and registered the output of the optic nerve (disc of optic nerve).
To macroscopic exam of internal structures of the eye, 4 eyes were enucleated
previously to fixation, immediately frozen by immersion in methanol and dry ice and
sectioned in the antero-posterior plane, in horizontal sliding microtome. Throughout this
procedure, photographs were taken to posterior analysis of intraocular dimensions of lens,
corneal diameter and axial and equatorial diameters of the eye, distances between the cornea
and the lens and between the lens and sclera.
Two eyes were immersed in Bouin fixative (aquous satured solution of picric acid in
formaldehyde and glacial acetic acid) for 24 horas, dehidrated in ethanol solutions in
increasingly concentrations, and included in paraffin. It was obtained 20 μm thick transversal
sections, which were stained with Hematoxilin-Eosin, for analysis of the layer organization of
the eye and the retina.
78
Results
The rock cavy eye is lateralized and it is housed in a bony orbit, manned by two
skinfold, the superior and inferior eyelids, which delimit a palpebral fissure, measuring 10.25
± 0.9 mm (n=5 eyes) (Fig. 1 A). The bony orbit is constituted by components of the following
skull bones: frontal, which contributes to superior (ceiling), medial and posterior walls, the
maxillar, which takes part in the formation of the medial wall, and the temporal, which
complements laterally the posterior wall. The anterior and ventral (floor) walls are devoid of
bony elements. The lateral aperture of the orbit is circumvented anterior and ventrally by the
zygomatic arch, constituted in the postero-anterior direction by the zygomatic process of the
temporal bone, the temporal process of the zygomatic bone, the dorsal border of the
zygomatic bone, the frontal process of the zygomatic bone and the zygomatic process of the
frontal bone. The anterior wall, opened, is limited dorsally by the zygomatic process of the
frontal bone and ventrally by the maxillar process of the zygomatic bone (Fig. 1 B).
Around the eye it was evidenced a orbital fascia, involving the extraocular muscles,
having been well identified the rectus dorsalis (RD), rectus ventralis (RV), rectus medialis
(RM), rectus lateralis (RL), obliquus dorsalis (OD) and obliquus ventralis (OV) muscles (Fig.
2 A-B).
Measurements of ocular dimensions were taken in 15 eyes after fixation of the animals
by transcardiac perfusion. These measures allow to infer that the rock cavy eye is
approximattelly ellipsoidal shaped, with the antero-posterior (axial) diameter (AD) ranging
from 9.65 mm to 11.47 mm, equatorial diameter (ED) from 10.39 mm to 12.65 mm. The
corneal equatorial diameter (CD) varied from 7.72 mm to 9.57 mm. The individual and mean
values related to these parameters are listed in the Table 1.
Measurements of axial diameter obtained in 15 eyes allowed to estimate the retinal
magnification factor (RMF) and the posterior nodal distance of the eye (PND). Using the
79
equation proposed by Hughes (1977), based on comparison among several mammalian
species, RMF = 0.011 x eye axial length and PND = 0.63 x eye axial length and applying
these equations to the measurements obtained in the rock cavy eye, we found a value of
118µm/degree of visual angle for RMF and 6.74 mm for PND.
At the anterior pole of the eye, the black iris and the vertical slit shaped pupil was
noted through the cornea (Fig. 3). The pupil aperture in the fixed eye measured 3.6 mm x 2.38
mm in mean values (n=3). Both pupil and lens were better visualized after removal of the
cornea (Fig. 3B). At the posterior pole, we identified the trunk of the optic nerve, from its
emergency, positioning eccentrically toward temporal and ventral direction (Fig. 4A). After
removal of the lens, the examination of the retina in situ does not allow to identify at the
naked eye, any tissue depression or thickening, suggesting the presence of some retinal
specialization, nor a lucidum tapetum (Fig. 4B), which can be observed without the use of an
optical microscope in some animals. Retinal vessels were not observed too, characterizing an
anangiotic retina. The figure 4C illustrates the retina after dissected from the eyecup and
removal of the pigment epithelium.
After hemissectomy of eyes freshly frozen in methanol with dry ice, it was possible
better visualize the curvature of the cornea and the asymmetrical shape of the lens, with
curvature more pronounced in its posterior aspect. Measurements of axial diameter of the
cornea and axial and equatorial diameters of the lens through the horizontal axis were taken in
ocular sections of 4 animals. The maximum axial and equatorial diameters of the lens were on
average 5.39 ± 0.03 mm and 6.78 ± 0.2 mm, respectively, and it were obtained in dorsal
position to emergency of the optic nerve. At the same level, the equatorial curvature of the
cornea was on average 8.71 ± 0.8 mm. The distance between the cornea and the anterior
aspect of the lens was 2.2 ± 0.3 mm and from the posterior aspect of the lens to the sclera was
6.01 ± 0.4 mm. The figure 5 illustrates images of eye sections at the level of optic nerve
80
emergency and at its longest axis. The mean value of the eye axial diameter obtained in 4
sectioned eyes were 11.99 ± 0.5 mm, Such values are similar to those obtained after
enucleation immediately after fixation by perfusion as are listed in the table 1. The lens axial
length/ eye axial length ratio obtained after hemissectomy provided a mean value of 0.45 ±
0.14.
Transversal sections of the rock cavy retina stained with hematoxilin/eosin (HE),
showed the laminar organization of this tissue, characterized by the presence of the layers of
outer segments of photoreceptors, outer and inner nuclear and plexiform layers, ganglionar
cell layer and optic nerve fibers layers. The thickness of such layers varied according to
eccentricity. The figure 6 illustrates retinal transversal sections at far periphery and central
eccentricities. As can be noted, while in the extreme periphery, the outer nuclear (ONL) and
inner nuclear (INL) layers exhibited around 3 and 2 row of cells, respectively, in the central
region we observed in the same layers, around 6 and 4 cell rows respectively. In the
ganglionar cell layer (GCL) only one cell row was observed either at central or far periphery
retinal regions.
81
Discussion
Evolutionary attempts in modify the ocular structure may appear relatively quickly in
the geologic time span, suggesting that eyes themselves are highly responsive to modify its
structure face to environmental pressures. A plethora of visual adaptations and solutions to
ecological requirements for special niches provide evidence that the optic physiology is
relatively plastic. Adaptive mechanisms to the temporal niche are present in the visual system
of most of vertebrates. Present data show that the rock cavy eye has a roughly ellipsoidal
shape with a slight predominance of the equatorial on the axial diameter, similar to described
to other rodent species of the suborder Hystricomorpha, such as the agouti (Dasyprocta
aguti), paca (Cuniculus paca), capybara (Hydrochaerus hydrochaeris) (Silveira, 1985;
Silveira et al., 1989; Picanço-Diniz et al., 1991; Rocha et al., 2009), guinea pig (Cavia
porcellus) (Jacobs & Deegan, 1994; Peichl & González-Soriano, 1994; Parry & Bowmaker,
2002), chinchilla (Chinchilla lanigera) (Detwiler, 1949; Lima et al., 2010; Müller et al., 2010)
and degu (Octodon degus) (Chávez et al., 2003; Jacobs et al., 2003), with which the rock cavy
keeps close phylogenetic relationships.
The axial length of the eye is closely related to the focal length, which is equivalent to
posterior nodal distance (PND), estimated as two-thirds of the axial length in vertebrates.
More precisely, from comparative ophthalmoscopy studies, the focal length can be calculated
multiplying the axial length by the factor 0.665 (Murphy & Howland, 1987). Applying this
formula for the rock cavy, considering the mean axial lenght estimated as 10.7 mm, it was
obtained a focal length, whose mean value is 7.11 mm. Using the empirical equation de
Hughes (1977) we also estimated the focal length of the rock cavy eye as 6.74 mm, similar to
obtained by Murphy & Howland (1987) equation. In other hystricomorpha species, such as
agouti, paca and capybara, which exhibit eye axial lengths (15.68mm, 18.46mm and 22.30
mm respectively) (Silveira, 1985) longer than the rock cavy, the focal length evaluated to
82
these animals corresponds to 9.88 mm (agouti), 11.63 mm (paca) and 14.05 mm (capybara).
The focal length influences the size of the image formed on the retina and hence it is related
to the amount of information that reaches the brain. The retinal magnification fator (RMF) is
expressed in millimeters of retina per degree og visual angle. This factor and the
photoreceptors or ganglion cells density are directly related to retinal resolution power.
According to the Shannon and Weaver (1949) theorem, the maximal retinal sampling
frequency can be obtained by the following equation: vc = (RMF. (where vc
is the sectioning range and dmax is the maximum density celular). Thus, the gain in visual
resolution can be obtained by decrease of the distance among photoeceptors or increase of
their density, and also by increase in eye size (Silvleira, 1985; Silveira et al., 1989; Land,
2012). Using the empirical equation proposed by Hughes (1977), we estimated for the rock
cavy, a RMF equivalent to 118µm/degree, which is inferior to those estimated for agouti (164
µm/degree), paca (203 µm/degree) and capybara (245µm/degree). Although the main
characteristics of the eye can be preserved in the phylogeny, the history of each family or
genus add specific features that can be more involved with the lifestyle within a temporal
niche than with the relationship among the species. The axial length of the eye per se is not
the most important parameter to define the suitability of an eye to activity pattern of
vertebrates. The axial dimension and the curvature of the lens relative to the eye size must be
considered, because these parameters influence the rate of retinal illumination.
In diurnal animals, the optic design favours a gain in resolution, given a greater PND
and a smaller axial thickness of the lens. In this case there a loss in sensitivity considering that
the index of retinal illumination is inversely proportional to PND (Hughes, 1977; Land &
Nilsson, 2008). On the other hand, in some nocturnal animals, an increase in the eye size and
RMF improve the retina sensitivity without reduce its resolution when compared with eyes of
diurnal animals. In this case, the increase of the rate of retinal illumination is favored by a
83
thickner lens and it occupies a larger area inside the eye. In the rock cavy, the 4.8 mm axial
diameter of the lens correspond to 45% of the axial length of the eye. Such value is
compatible with an eye adapted to an environment predominantly crepuscular, when
compared to those obtained in hystricomorpha of diurnal habit, such as agouti (39%) and
capybara (33%), of crepuscular habit, as chinchilla 48% (Lima et al., 2010) and of nocturnal
habit, as paca (51%) (Silveira, 1985; Silveira et al., 1989). When compared to other typically
nocturnal mammals, the value calculated for the rock cavy is lower than that described for the
mouse, rat, opossum, bush baby and cat, which vary between 60 and 80% (Hughes, 1977;
Land & Nilsson, 2008).
Another anatomic important aspect of the rock cavy eye to be emphasized is the
presence of a slit pupil. In three anesthetized animals, the major axis of this slit pupil was
estimated to be 3.6 mm. This feature is similar to described in the agouti, in which, at extreme
photopic conditions, the pupil is around 3 mm in its greatest axis diameter. In the paca, when
fully contracted, the slit pupil perpendicular to the eyelid line, measures about 1.43 mm length
and 0.48mm width (Silveira, 1985; Silveira et al., 1989). Other Hystricomorpha species, such
as the degu (Detwiler, 1949) and chinchilla (Lima et al., 2010) present vertical slit pupil
aperture.
According to the literature (Smith and Atchison, 1996), the slit pupil allows a better
use of the total lens diameter even in bright light. Additionally, the slit pupil is often
associated with multifocal optical systems, in which the lens is provided with concentric
zones of different refractive powers for each wavelength. The combination of a slit pupil with
a multifocal lens has been described for a large number of vertebrates (Malkki & Kröger,
2005; Malmström & Kröger, 2006; Karpestam et al., 2007; Gustafsson et al., 2008; Hanke et
al., 2008; Lind et al., 2008; Kröger et al., 2009) as a characteristic that favors the chromatic
perception (Malmström & Kröger, 2006). The multifocality of the lens is a compensation to
84
correct the longitudinal chromatic aberration. Animal eyes that are primarily used under low-
light conditions, for example, usually have optical systems of short depth of focus, such that
chromatic defocus may lead to considerable blurring of the images. For maximum light-
gathering ability, the eyes of nocturnal and crepuscular vertebrates have pupils that are large
relative to the focal lengths of the optical systems. A multifocal lens combined with slit pupil
was also described in the eye of vertebrates of monochromatic vision (Malmström & Kröger,
2006). Although we have not performed refractive measurements in the rock cavy eye, it is
possible that this species is endowed with a multifocal lens, compatible with slit pupil and
color vision. In line with this hypothesis, recent evidence of our laboratory has indicated that
the rock cavy has a retina dominated by rods, but with cones sensitive to short (blue, S) and
middle and long (green-red) wavelength (unpublished data).
Thus, we can conclude that, at comparative point of the view, the rock cavy eye has
general similarities with the eye of other rodents of suborder Hystricomorpha. However,
peculiarities inherent to the shape and dimensions of its optical elements enable it to a greater
gain in sensitivity to light, at the expenses of the image sharpness, if compared to diurnal
species. Taken together, results are compatible to a vision suitable to mesopic conditions,
reinforcing previous data indicating this animal has a predominantly crepuscular locomotor
activity pattern.
Acknowledgments
This work was supported by National Council for Scientific and Technological Development
(CNPq), Coordination for High Level Staff Improvement (CAPES), Research and Projects
Financing (FINEP), and Foundation for the Support of Research of the State of Rio Grande do
Norte (FAPERN), Brazil.
85
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88
LEGENDS OF FIGURES
Figure 1. (A) Lateral view of the head of the rock cavy, showing the eye manned by superior
(SP) and inferior (IP) palpebrae; (B) Lateral view of the skull, showing the bony orbit,
constituted by parts of frontal (1), maxillar (2) and temporal (3) bones and limited
ventrolaterally and rostrally by the zygomatic arc, formed by zygomatic process of the
temporal bone (4) connected to temporal process of the zygomatic bone, zygomatic bone (5),
frontal process of the zygomatic bone connected to zygomatic process of the frontal bone (6)
and maxillar process of the zygomatic bone (7) connected to zygomatic process of the
maxillar bone. Bar: 2.7 cm
Figure 2. Rock cavy eye partially housed in the orbit, with the extraocular muscles dissected.
(A) Dorsal view showing retcus medialis (RM), retcus dorsalis (RD), retcus lateralis (RL) and
obliquus dorsalis (OD) muscles. OC, optic chiasm. (B) Ventral view showing RM, RL, retcus
ventralis (RV) and obliquus ventralis (OV) muscles. Bar: 0.5 cm.
Figure 3. (A) In situ rock cavy eye; (B) Magnification of square in A showing the cornea and
through this, the dark iris and the slit pupil; (C) The iris and the slit pupil after removal of the
cornea.
Figure 4. A: Posterior view of the right eye, showing the emergency of the optic nerve; B:
Inner view of the posterior segment of the eye, showing the disc of the optic nerve, C: The
retina after dissected from the eyecup and removal of the pigment epithelium. Bar: 0.5 cm.
Figure 5. Images of sections of the dry ice frozen eye at level of (A) emergency of the optic
nerve and (B) at the longest axis of the eye. Bar: 0.5 cm.
Figure 6. Transversal sections of the rock cavy retina stained with hematoxilin-esosin (HE) at
(A) extreme periphery and (B) central region. PE= pigment epithelium, PL=photoreceptor
layer, ONL=outer nuclear layer, OPL=outer plexiform layer, INL=inner nuclear layer,
89
IPL=inner plexiform layer, GCL=ganglion cells layer, OFL=optic nerve fibers layer. Bar: 20
µm.
Table 1. Eye rock cavy parameters
Animal
(Eye fixed)
Wheight
(g)
AD
mm
ED
mm
EDC
mm
ADL
mm
EDL
mm
C-Ld
mm
L-Ed
mm
LF
%
1 RE 363 9.65 10.39 7.80 56
2 RE 503.5 11.28 12.54 8.97 48
3 RE 596.5 10.76 12.62 8.57 50
4 RE 603 10.69 11.35 7.72 50
5 RE 467 10.74 11.46 8.76 50
6 RE 558.5 10.93 11.97 9.56 49
1 LE 363 9.66 10.42 7.72 56
2 LE 503.5 11.35 12.24 8.99 47
3 LE 596.5 11.47 12.65 8.62 47
4 LE 603 10.31 11.43 7.95 52
5 LE 467 10.92 11.59 8.63 49
6 LE 558.5 10.47 11.23 9.57 51
7 RE 387 11.04 11.61 8.26 49
8 LE 338 10.21 11.36 8.24 52
9 LE 377.5 10.52 11.71 8.30 51
Mean 485.7 10.67 11.64 8.51 50.0
SD 99.06 0.55 0.69 0.60 2.72
Animal (eyes frozen in dry ice)
8 RE 338 11.63 12.38 8.16 5.36 6.57 1.89 6.59 46
9 RE 377.5 11.61 12.35 8.03 5.38 6.64 2.19 5.58 46
10 LE 641 12.72 13.28 9.87 5.43 7.12 2.56 5.87 43
11 LE 600 12.01 12.68 8.78 5.39 6.76 2.19 5.98 45
Mean 489 11.99 12.67 8.71 5.39 6.77 2.21 6.01 45
SD 153 0.518 0.431 0.84 0.03 0.24 0.27 0.42 1.41
RE, Right eye; LE, Left eye; AD, Eye axial diameter axial; ED, Eye equatorial diametr; EDC,
Corneal equatorial diameter; ADL, Lens axial diametr; EDL, Lens equatorial diametr; C-Ld,
Distance between the cornea and the anterior aspect of the lens; L-Ed, Distance between the
posterior aspect of the lens and the sclera; LF, Fraction of the lens em relative to eye axial
diameter. Animals 1 to 6 only fixed eyes were used and are utilized in other studies of the lab.
Animals 7 to 11 had only one eye dry ice frozen an the other one fixed.
90
Figure 1
Figure 2
Figure 3
91
Figure 4
Figure 5
Figure 6
92
2° Artigo.
Dopaminergic cell populations in the rock cavy (Kerodon rupestris) retina:
Morphometry and topographic distribution
Submetido à revista "Visual Neuroscience"
Classificação no QUALIS: A1
93
Dopaminergic cell populations in the rock cavy (Kerodon rupestris) retina:
Morphometry and topographic distribution
FRANCISCO GILBERTO OLIVEIRA1,3
, BELMIRA LARA DA SILVEIRA ANDRADE-
DA-COSTA2, EXPEDITO SILVA DO NASCIMENTO JÚNIOR
3, JUDNEY CLEY
CAVALCANTE3, FAUSTO PIERDONÁ GUZEN
4, JEFERSON DE SOUZA
CAVALCANTE3,5
, JOACIL GERMANO SOARES3, JOSÉ RODOLFO LOPES DE PAIVA
CAVALCANTI4, EUDES EULER DE SOUZA LUCENA
6, LEANDRO MOURA DE
FREITAS3, PAULO LEONARDO ARAÚJO DE GÓIS
3, MIRIAM STELA MARIS DE
OLIVEIRA COSTA3*
1 Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde,
Universidade Regional do Cariri - URCA, Crato, CE, Brazil
2 Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Pernambuco - UFPE, Recife, PE, Brazil
3 Departamento de Morfologia, Laboratório de Neuroanatomia, Centro de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, Natal, RN, Brazil
4 Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Ciências Biomédicas, Universidade do
Estado do Rio Grande do Norte - UERN, Mossoró, RN, Brazil
5 Departamento de Fisiologia, Laboratório de Neuroanatomia, Centro de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, Natal, RN, Brazil
6 Departamento de Odontologia, Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - UERN,
Caicó, RN, Brazil.
Running title: Dopaminergic cell types in the rock cavy retina
Text pages: 23; Tables: 02; Figures: 08
*Corresponding author:
Tel.: +55 84 32153431
Fax: +55 84 32119207
E-mail address: [email protected]
94
Abstract
The rock cavy (Kerodon rupestris) is a Brazilian crepuscular rodent with some
peculiarities in its circadian timing system, which has been used as animal model in
Chronobiology studies. This study aims to analyze parameters for retinal light sensitivity,
characterizing dopaminergic cell populations, also involved in the rhythmicity of this tissue.
Retinal vertical sections and whole-mounts of 6 adult animals were processed for tyrosine
hydroxylase (TH) enzyme immunoreactivity. The coexistence of GABA in TH-
immunoreactive (TH-IR) cells was also analyzed. In retinal whole-mounts, the total TH-IR
cell population was 2,156 ± 469 cells in retinas with total area of 198.164 ± 20.4 µm2.
Considering the topographical distribution, level of stratification in the inner plexiform layer
(IPL) and morphometric parameters, two types of TH-IR cells were detected. Type 1 cells,
soma cell body size ranging from 120.047 to 269.373 µm2 and processes stratifying in
sublamina 1 of the IPL. Type 2 cells had smaller cell bodies size (54.848 to 177.142 µm2),
were faintly labelled and located mainly into the IPL. These cells comprised ~10% of the total
TH-IR cell number. A few TH-IR cells were also detected in the ganglion cell layer. Types 1
and 2 cells showed a similar topographic distribution characterized by a region of higher
density located in a streak along the naso-temporal axis of the superior retina. In this region,
type 1 and type 2 cells showed maximum density of 22 ± 3 and 8.2 ± 2 cells/mm2
respectively. The presence of GABA was detected in both TH-IR cell types. A similar
topographic distribution of two distinct dopaminergic cell types in the rock cavy retina
suggests that both cell types could contribute to increase the sensitivity gain in the superior
retina under photopic and especially under mesopic conditions when this species maintains
the peak of its exploratory activity.
Keywords: Dopamine, Kerodon rupestris, Light-adaptation, Retina, Tyrosine hydroxylase.
95
Introduction
The rock cavy (Kerodon rupestris, order Rodentia, family Caviidae) is a Brazilian
rodent found in the northeastern Brazil, inhabiting the caatinga (Cabrera, 1961; Lacher, 1981).
Phylogenetic studies using a molecular approach (Rowe & Honeycutt, 2002) have associated
the genus Kerodon with the genus Hydrochaeris which includes the capybara (family
Hydrochaeridae). It is also closely related to the Dolichotis genus of the subfamily
Dolichotinae, whose representative in South America is the Patagonian Hare (Dolichotis
patagonum).
Although the rock cavy can be active during photophase and scotophase, studies
investigating circadian motor activity indicate that this species has predominantly crepuscular
habits (Sousa & Menezes, 2006). Previous studies from our laboratory have shown that this
rodent has a retino-hypothalamic projection similar to that described for other diurnal or
nocturnal mammals (Nascimento Jr. et al., 2010b), but peculiarities were found with regard to
the distribution of vasoactive intestinal peptide (VIP) and vasopressine (VP) positive neurons
in the suprachiasmatic nucleus (Nascimento Jr. et al., 2010b). Analysis of other visual
pathways showed that the rock cavy has direct retinal projections to the thalamic
paraventricular (PVT) (Nascimento Jr. et al., 2008) and mediodorsal (MD) (Nascimento Jr. et
al., 2010a) nuclei, involved in circadian rhythms and modulation of visual recognition,
respectively. Such features are also different from those found in other mammals. To our
knowledge, however, none of these previous studies have investigated the retinal organization
of this species, or retinal parameters related to light sensitivity or circadian activity.
In the retina, several physiological phenomena follow a circadian rhythm, including
those related to visual sensitivity, such as changes in the rod outer segment disc shedding and
phagocytosis by the retinal pigment epithelium (Iuvone et al., 2005). In addition, the
expression of visual pigment genes, the levels of second messengers and the activity of
96
enzymes involved in the visual signal transduction, are also cyclic (Iuvone, 1990). Circadian
changes in the luminosity directly influence the synthesis and release of melatonin from
photoreceptors and dopamine from amacrine and interplexiform cells (Iuvone & Gan, 1995;
Iuvone et al., 2005). On the other hand, dopamine release in response to light and circadian
clocks drives daily rhythms of protein phosphorylation in photoreceptor cells (Pozdeyev et al.,
2008).
The retinal dopaminergic system is fundamental to the light/dark adaptation process and
contrast perception, contributing also to the circadian rhythmicity either by the presence of
core circadian clock genes or by interaction with intrinsically photosensitive ganglion cells
containing melanopsin (Djamgoz et al., 1997; Hatar et al., 2003; Witkovsky et al., 2003;
Vugler et al., 2007; Pozdeyev, 2008; Cameron et al., 2009). Interplexiform dopaminergic cells
play an essential role in light adaptation transferring inner plexiform layer (IPL) information,
primarily related to dynamic and temporal aspects of visual stimulus, back to the external
plexiform layer (OPL), mainly related to static and spatial aspects of lighting (Witkovsky et
al., 2008). Related to this, dopamine is able to modify horizontal cells activity, modulating the
coupling among these cells (Cohen & Dowling, 1983; Mangel & Dowling, 1987; Weiler &
Akopian, 1992; Dong & McReynolds, 1992). Most of these dopaminergic functions, both in
the outer or inner retina, are fundamental for the contrast gain in environments under different
lighting conditions (Sannita, 1995; Witkovisky, 2004) and can be modulated by gamma-
aminobutyric acid (GABA).
A comparative analysis of several vertebrate retinas has indicated that dopaminergic cell
types, their topographic distribution and concomitant expression of GABA can differ among
the species (Mitrofanis et al., 1988; Nguyen-Legros et al., 1997). Moreover, the dopamine
activity enhancing the retinal sensitivity to light through photoreceptors or ON bipolar cells
97
depends on reciprocal interactions between dopaminergic and GABAergic amacrine cells
(Witkovsky, 2004).
Therefore, considering the crepuscular activity pattern of rock cavy and some
peculiarities previously described, with respect to its retinal projections to circadian timing
system (Nascimento Jr. et al., 2010b) we decided to analyze retinal parameters related to light
sensitivity. In the present work, we started a series of these studies, analyzing the retinal
dopaminergic cell populations in relation to their topographic distribution, stratification
pattern and morphometric parameters, as well as on the coexistence of GABA in these cell
populations.
Materials and methods
Animals and tissue preparation
The eyes were obtained from 6 adult rock cavies coming from the municipality of
Jucurutu, Northeast region of the Rio Grande do Norte, Brazil, as authorized by the Brazilian
Institute of Environment and Renewable Natural Resources (IBAMA, SISBIO #22403-1).
Maximum care was taken to prevent pain and suffering to animals during the experimental
procedures, according to the criteria established and approved by the Ethics Committee for
Experimental Animal Care of the Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), #
0152009, in accordance with the National Research Council of the National Academy
published in the book "Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and
Behavioral Research". The animals were first submitted to dark adaptation for three hours,
then were pre-anesthetized with tramadol hydrochloride (Cristalia, Brazil) and xylazine
(Agener União, Brazil), both 5 mg/kg, and maintained with isoflurane (Biochimico, Brazil)
and oxygen 100%. Under deep anesthesia, animals were perfused transcardially with 300 ml
of 0.9% saline solution in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4 (PB), containing heparin (Parinex,
98
Hipolabor, 2 ml/1000 ml of saline solution), followed by 700 ml of fixative solution,
consisting of 4% paraformaldehyde solution in 0.1 M phosphate buffer (PB), pH 7.4.
After perfusion, the eyes were enucleated and dorsoventral and nasotemporal axes were
properly identified with an incision in the superior and temporal eye regions for posterior
retinal orientation. Then, the eyecups were immersed in buffered PA 4% (Sigma-Aldrich) for
2 hours followed by immersion in PB 0.1 M, pH 7.4. For whole-mount preparations, the
retinas were carefully dissected and kept in 0.1 M PB, pH 7.4, 4°C. In order to obtain vertical
sections, three distinct animal retinas were crioprotected with 30% sucrose in PB 0.1 M, and
representative pieces of central and peripheral regions were sectioned (20 µm thickness), in a
cryostat (Leica CM 1900, Germany). The sections were placed on gelatin-coated slides and
stored at -20°C until their use for immunohistochemical procedures.
Whole-mounts preparation and immunohistochemistry
Retinal whole-mounts from 6 different animals were obtained according to Stone
(1981). For removal of pigment epithelium firmly adhered to the retinal tissue, the protocol
described in Hemmi & Grünert (1999) was adopted, with minor modifications, using
hydrogen peroxide (H2O2) 10% in phosphate buffered saline (PBS) by 24h. After this
procedure, the retinas were washed several times in PBS and treated with Hyaluronidase (510
UI/ml) in PBS for 30 minutes at 37 °C to remove the vitreous humour. The tissue antigenic
recovery was obtained by imersion in 0.2 M borate buffer, pH 9 for 60 minutes at 70 °C,
followed by three washes in PBS for 5 minutes each. Inactivation of endogenous peroxidase
was obtained using 10% methanol + 3% H2O2 in PBS, for 15 min, followed by three washes
in PBS (5 min each) and one wash in PBS + 5% Triton X-100 for 30 min. Following three
rinses in PBS (5 min each), the preparation was incubated in 10% normal goat serum (NGS)
in PBS+ 0.3% Triton X-100 (PBSTX) for 2 h, followed by rabbit polyclonal anti-TH primary
antibody (1:500, Millipore) and 1% NGS for 5 days at 4 °C. After several rinses in PBS, the
99
tissue was incubated in the goat-anti- rabbit biotinylated secondary antibody (1:1,000,
Jackson Immuno Research Lab) for three days at 4 °C and then in avidin-biotin-peroxidase
complex (1:200, ABC kit Vector) for three days at 4 °C followed by 3.3'-diaminobenzidine
tetrahydrochloride (DAB). All antibodies were diluted in PBSTX. After the reaction, the
retinas were whole-mounted on gelatin-coated slides, with the ganglion cells layer upwards
keeping their orientation. After being dried at room temperature, the retinas were dehydrated,
cleared with xylene and mounted using Entellan ® (Merck). The immunohistochemistry
procedure adopted in retinal vertical sections was similar to the description above, except for
shorter incubation periods for the primary and secondary antibodies (24 and 1 h, respectively),
and ABC (1 h). In this case hyaluronidase treatment was not used.
Double-labelling
In retinal vertical sections, double-labeling experiments were also carried out to
investigate GABA co-localization in TH-IR cells. In this case, the sections were incubated
first in a solution containing 1% bovine serum albumin (BSA) plus 0.3% Triton X-100 for 60
min and then simultaneously with polyclonal rabbit anti-TH (1:500; Millipore) and
polyclonal guinea pig anti-GABA (1:500; Protos Biotech Inc.) antibodies for 24 h at 4°C.
Then, the sections were rinsed in PB and incubated with fluorescein anti-guinea pig IgG
(Vector) and Rhodamine-conjugated 546 anti-rabbit IgG (Jackson Immuno Research Lab) for
4 h. After rinsed in PB, the double-labeled sections were mounted in glycerol 40% in PB and
analyzed using epifluorescence microscope (Leica, DM LB).
Analysis of the data
Six whole-mounted retinas were used to measure total retinal area, TH-IR cell
morphometric parameters and center-periphery cell density. Analysis of topographic
distribution of TH-IR cells was obtained from adjacent sampling windows throughout all
100
retinal extension in order to obtain a count of all TH-IR cells. Around 227 to 312 sampling
windows (size frame = 0.98 mm wide x 0.78 mm high x 0,2 mm thick) were analyzed in 6
rock cavy retinas using 10 X objective. The count values in each sampling window were
transferred to a map of the retina in order to obtain numerical distribution of TH-IR cell
populations.
Analyses of cell body size and stratification pattern of TH-IR cells were made from
digital images obtained via video camera (Nikon DXM1200) coupled to a Olympus (BX41)
microscope, 100 X/1.25 aperture oil immersion lens. Cell counts and body cell size
measurements were carried out using Image J 1.45 s (National Institutes of Health, USA)
software. The non-parametric Mann-Whitney test, α = 0.05, was used to analyze differences
in the cell body size among TH-IR cell subsets.
RESULTS
Characterization of dopaminergic cells in retinal vertical sections
Figure 1 illustrates a panel containing vertical sections of rock cavy retina
immunoreacted for TH showing various types of dopaminergic cells, their localization and
stratification pattern in the IPL. Analysis of these sections showed that the majority of TH-IR
cells have their cell bodies located in innermost region of the INL and stratify mainly in the
sublamina 1 of the IPL forming a dense plexus (Fig. 1A); but a number of these cells send
their processes to the innermost layers of the IPL (arrows in Fig. 1B). Some TH-IR neurons
might be defined as interplexiform cells, by the presence of processes extending from the INL
to the OPL, both coming from the cell body itself (Fig. 1B-D) as well as from the IPL
outermost sublamina (not shown). A smaller proportion of TH-IR cell bodies was observed in
the transition between INL and IPL (Fig. 1E) or in the middle portion of the IPL (Fig. 1F).
Occasionally some TH-IR cells were seen in the GCL (Fig. 1G-H). Dopaminergic cell
101
processes forming rings around a number of cell bodies were visualized along the entire
extension of the retina (Fig. 1B, arrow head).
Please insert Figure 1 around here
TH-immunoreactivity on whole-mounts
Analysis of TH-IR cells in whole-mounts showed that these cells display several types
of arborization patterns. Some cells show only a primary dendrite, while others have 2-4
primary dendrites emerging from the cell body forming a wide net of fibers in the IPL. This
net of fibers exhibits a non homogeneous pattern, with many varicosities and ring structures
along the entire extension of the IPL (arrows in Fig. 2). Double labelling experiments for TH
and calbindin show the presence of TH-IR interplexiform cell processes at the level of the
horizontal cell somata, near OPL (Fig. 3).
Please insert Figures 2 and 3 around here
Cell subtype analysis
According to amount of immunolabelling, location and level of arborization in the IPL,
two subpopulations of TH-IR cells were identified in the rock cavy retina, which were
classified as type 1 and type 2. Type 1 cells were more intensely stained for TH than type 2
cells, were located in the INL and arborized predominantly in the sublamina 1 of IPL. Type 2
cells were located predominantly into the IPL and arborized mainly in the innermost
sublaminae of IPL. Figure 4 illustrates digital images of retinal whole-mounts in high (Fig.
4A) and low (Fig. 4B) magnifications showing the two types of TH-IR cells using DAB
reaction. Upon examination of retinal whole-mounts stained for TH immunofluorescence and
confocal microscopy it was possible to see that perikarya and proximal dendrites of type 1
TH-IR cells are specifically located in the innermost region of INL and IPL (Fig. 5).
102
Please insert Figure 4 and 5 around here
Based on these previous parameters analyzed, we investigated whether these two TH-IR
subpopulations could differ with respect to cell body size. Type 1 cells exhibited a spectrum
of cell body area ranging from 120.047 to 269.373 µm2 and a diameter ranging from 13.280
to 23.060 µm (N=300 cells of 6 retinas). These values are significantly higher than those
detected in the type 2 cells, whose area varied from 54.848 to 177.142 µm2 and the diameter
from 9.491 to 17.470 µm (N=300 cells of 6 retinas, p < 0.001; MannWhitney test). Figure 6A
illustrates the cell body size spectrum of both TH-IR cell subpopulations and figure 6B
compares the median values, maximum and minimum obtained for each cell subpopulation.
Please insert Figure 6 around here
Topographic distribution of dopaminergic cells in whole-mounts
Analysis of topographic distribution of the TH-IR cells, including the interplexiform
and amacrine cells was carried out in retinal whole-mounts of 6 animals. This analysis was
obtained from the count of cells in adjacent and successive fields along the extent of each
retina examined in order to obtain the total number of TH-IR cells. Data of body weight,
retinal area, number of sampling windows and the total number of TH-IR cells of each animal
are described in Table 1. Such analysis showed an asymmetry in the topographic distribution
of the total TH-IR cell population as well as in each one cell sub-population (Fig. 7).
Regarding to the total TH-IR cell population, the region of higher cell density was detected in
a horizontal band along the naso-temporal axis, in the superior retina, above the optic disc. In
this region the higher number of cells per sampling window (0.78 mm x 0.98 mm x 0.2 mm)
was 19 ± 2.0 cells which corresponds to 25 ± 3 cells/mm². A horizontal band below the optic
disc was also observed in the inferior retina, where the higher number of cells per sampling
103
window was 14 ± 2.0 cells, corresponding to 18 ± 3.0 cells/mm2. Considering the total
number of TH-IR cells and the retinal total area, an average TH-IR cell density of 11 ± 2
estimated. The total number of cells obtained for type 1 and 2 cell subpopulations was
respectively 1,931 ± 424 and 226 ± 65 cells. Table 2 compares morphometric and distribution
parameters of type 1 and type 2 cells obtained from 6 retinal whole-mounts.
Please insert Figure 7 and tables 1 and 2 around here
Co-localization of GABA in TH-IR cells
In retinal vertical sections stained for TH and GABA immunofluorescence, we detected
that some of type 1 (Fig. 8, panel A, C, E) and type 2 (Fig. 8, panel B, D, F) TH-IR cells
contain GABA.
Please insert Figure 8 around here
DISCUSSION
Retinal dopaminergic cells are especially important for the contrast gain in
environments with different lighting conditions, contributing to retinal sensitivity and
rhythmicity. In the present study, morphological parameters and topographic distribution of
TH-IR neurons were analyzed in order to characterize retinal dopaminergic cell populations in
the rock cavy Kerodon rupestris, which has predominantly crepuscular activity. Two
subpopulations were described as having type 1 and type 2 cells corresponding to 90 and
10%, respectively of the total number of TH-IR cells. These cell subpopulations are
morphologically similar to dopaminergic cell subtypes described for the retina of rat, guinea
pig, cat, rabbit and primates (Mitrofanis et al., 1988; Mariani & Hokoc, 1988; Mitrofanis &
Provis, 1990; Tauchi et al., 1990; Guimarães & Hokoç, 1997). However, a peculiarity in the
retina of rock cavy is that both type 1 and type 2 cells are mainly concentrated at the same
104
region of the superior retina, defining a horizontal visual streak just above the eccentric
position of optic disc. Such distribution shows the absence of a topographic subdivision
between these cell populations along the vertical axis of the retina, unlike that observed for
dopaminergic cell subtypes of most mammals studied so far (Oyster et al., 1985; Mitrofanis et
al., 1988; Mariani & Hokoc¸ 1988; Mitrofanis & Provis, 1990; Tauchi et al., 1990; Guimarães
& Hokoç, 1997; Eglen et al, 2003).
In the rock cavy retina, the partial coexistence of GABA in both TH-IR subpopulations
reinforces the idea that they may share some of the neurochemical features involved in a
modulatory activity in the inner retina. However, we cannot discard the possibility that type 1
and type 2 cells display distinct functional roles, taking into account their differences in cell
body size, dendritic arborization, intensity of TH immunoreactivity and stratification pattern
into the IPL. Early and recent studies on the retina of a number of mammals have shown that
type 2 cells expressing low levels of TH, potentially express other catecholamines (Mitrofanis
& Finlay, 1990; Knop et al., 2011). In mice, for example, such cells stratify predominantly in
the innermost sublaminae of IPL, where they receive input of ON and OFF bipolar cells, can
contain GABA and are physiologically distinct from type 1 cells (Knop et al., 2011). With
respect to photic sensitivity, it has also been demonstrated in mice that these cells display
remarkably uniform responses in both scotopic and mesopic conditions (Knop et al., 2011).
Although functional analyses have not been carried out in the present study, it is possible that
in rock cavy, that these cells contribute to increase sensitivity gain in the superior retina in
photopic and especially under mesopic conditions when this species maintains the peak of its
exploratory activity and uses its inferior visual field in order to capture diverse food items
during foraging behavior (Lacher, 1981).
The density of dopamine neurons in the retina of vertebrates is low, but each cell gives
rise to numerous processes that radiate far enough to overlap processes of other dopaminergic
105
and non-dopaminergic cells. This arrangement allows dopamine to act both locally and in
distant synapses through a volume transmission which contributes to modulatory functions in
different type of cells located either in the inner or outer retina (Kramer, 1971; Bjelke et al.,
1996) considering that almost all the retinal layers contain receptors for dopamine (Tran &
Dickman, 1992; Nguyen-Legros et al., 1999). The average density by mm2 of the two type of
TH-IR cells in the rock cavy was 11, a value very close to that described for the hamster, 12
(Mitrofanis & Finlay, 1990) and rhesus monkey, 14 (Dacey, 1990), but lower than what has
been observed in the cat retina, 17 (Oyster et al., 1985); rabbit, 19 (Brecha et al., 1984);
guinea pig, 20 (Mitrofanis et al., 1988); gerbil, 20 (Mitrofanis & Finlay, 1990); humans, 21
(Nguyen-Legros et al., 1984) cynomolgus monkey, 23 (Nguyen-Legros, 1988); ferret, 23
(Eglen et al., 2003), tree shrew, 25 (Müller & Peichl, 1991); rat, 26 (Martin-Martinelli et al.,
1994); and mouse, 32 (Versaux-Botteri et al., 1984).
It is well established that dopaminergic neurons may receive information from more
than one type of bipolar cells and send synapses to AII glycinergic amacrine cells and A17
GABAergic cells which are involved in the rod pathway (Witkovsky, 2004; Knop et al., 2011;
Demb & Singer, 2012). Evidence obtained in several mammals indicates that the perikaryon
of AII and A17 amacrine cells are located within the rings formed by axon-like processes of
dopaminergic cells (Nguyen-Legros et al., 1997; Witkovsky et al., 2005). In retinal vertical
sections and flat mounts of rock cavy retina, TH immunohistochemistry demonstrated the
presence of multiple rings along the full extension of the dopaminergic processes, whose
diameters varied from 8 to 14 µm, therefore, similar in size to that described for the retina of
mice (Versaux-Boteri et al., 1984; Wulle & Schnitzer, 1989). Contini & Raviola (2003), using
electron microscopy concluded that retinal dopaminergic cells of rats and mice whose
extensions form rings involving the AII amacrine cells are also GABAergic. Although
dopamine and GABA may be released from these cells exerting paracrine actions in the inner
106
retina, these two bioactive substances may exert different roles in the information transfer
from rod bipolar to cone bipolar cells. It has been discussed that GABA can inhibit the action
of dopamine via inhibition of TH activity or synthesis (Nguyen-Legros et al., 1997).
Therefore, considering that in the rock cavy retina, co-existence of GABA occurs in part of
both type 1 and type 2 TH-IR cell subpopulations, it is possible that each one of these
subpopulations can be also subdivided into distinct functional subtypes regarding retinal
sensitivity and light-dark adaptation process.
The percentage of dopaminergic amacrine cells located into the GCL varies greatly between
species and represents approximately 1 and 2.5% in the retina of Sprague-Dawley and Wistar
rats respectively (Martin-Martinelli et al., 1994), 4% in the hamster (Mitrofanis & Finlay,
1990), 6% in the cat (Oyster et al., 1985) while it reaches 40% in the retina of dogs (Peichl,
1991). Moreover, even within the retina of dogs this proportion varies greatly, ranging from
10 to 85%, with no consistent pattern among the specimens (Peichl, 1991). The presence of
these cells was not observed in the retina of rabbits (Müller & Peichl, 1991). In the rock cavy
retina, TH-IR cells were detected in the GCL in greatly reduced numbers. Considering the
stratification pattern, some of these extend their processes to the outer and others to the
innermost sublayers of IPL, suggesting that they may participate in more than one type of
synaptic circuit along the ON and OFF pathways. The presence of dopaminergic cells located
in the GCL in rodent retinas has been discussed as an accidental displacement promoted by
errors during retinal development. Even differences in their stratification pattern in the IPL do
not necessarily mean that they compose separate cell populations (Martin-Martinelli et al.,
1994). Eglen et al. (2003) showed that in the ferret retina, dopaminergic amacrine cells found
in both the INL and the GCL form a single regular mosaic suggesting that they should be
regarded as one single population even though a subset randomly migrated into the GCL.
Although we have not carried out a systematic quantitative assessment throughout the retina,
107
it is possible that the low number of TH-IR cells located in the rock cavy GCL represents the
same trend seen in other rodents regardless of their daily activity rhythms.
In conclusion, we have shown that in the rock cavy retina TH-immunreactivity occurs
in amacrine and interplexifom cell subtypes which were grouped in two distinct TH-IR cell
subpopulations with regard to morphometric parameters and stratification pattern of their
processes in the IPL. The topographic distribution pattern of TH-IR cells in the rock cavy
retina is distinct from that described in other rodents, reinforcing the heterogeneity of
dopaminergic cell distribution observed along the phylogenetic scale. Nevertheless, the visual
streak formed by both TH-IR cell subpopulations in the rock cavy superior retina seems to be
coherent with a sensitivity gain in the inferior visual field. This visual field is predominantly
used during foraging behavior under photopic and particularly under mesopic conditions,
when this species maintains the peak of its exploratory activity.
108
Acknowledgments
The authors are grateful to Dra. Ana Maria de Lauro Castrucci who gently assisted us in
the purchase of antibodies and suggestions; the Instituto Internacional de Neurociências de
Natal (IINN-ELS) and the Instituto do Cérebro de Natal (ICE-UFRN) for the use of their
Confocal Laser Microscope and the Laboratório de Bioquímica da UFRN and Laboratório de
Citogenética da UFPE, where we used the Immunofluorescence Microscope.
This work was supported by National Council for Scientific and Technological Development
(CNPq), Coordination for High Level Staff Improvement (CAPES), Research and Projects
Financing (FINEP), and Foundation for the Support of Research of the State of Rio Grande do
Norte (FAPERN), Brazil.
109
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116
LEGENDS OF FIGURES
Figure 1. Vertical sections of rock cavy retina immunostained for TH showing in A:
presumed amacrine cells with soma located in the innermost region of INL; B, C and D:
presumed interplexiform cells. Note an apical process extending to the OPL. E: presumed
amacrine cell body in the interface between INL and IPL. F: presumed amacrine cell body
into the IPL; G and H: presumed amacrine cell bodies in the GCL. PL, photoreceptor layer;
ONL, outer nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; INL, inner nuclear layer; IPL, inner
plexiform layer; GCL, ganglion cell layer. Scale bar = 20 µm.
Figure 2. Whole-mounted rock cavy retina immunostained for TH showing immunoreactive
cells and their varicosities. Arrows indicate ring-like structures. Scale bar = 40 µm.
Figure 3. Whole-mounted retina immunostained for calbindin (red) and TH (green) showing
dendritic arborization of a presumed interplexiform cell at the same level of calbindin positive
horizontal cell bodies in the outermost region of INL. Scale bar = 60 µm.
Figure 4. Whole-mounted retina immunostained for TH showing immunoreactive cells in A,
better visualized in high magnification in B, in which it is distinguished type 1 (arrow) and
type 2 (arrow head) cells. Scale bar = 20 µm in A and 100 µm in the B.
Figure 5. Confocal photomicrographs of whole-mounted retina stained for TH, taken at
different focal levels of the same field, detaching a type 1 dopaminergic cell trough retinal
layers. Focus on the: A-C, inner nuclear layer; D, sublamina 1 (S1) of the inner plexiform
layer; E, sublamina 3 (S3); F, nerve fiber layer. Arrows head indicate ring-like structures.
Scale bar = 60 µm.
Figure 6. A: Comparative frequency histograms of type 1 and type 2 dopaminergic cells soma
area in the rock cavy retina, showing the predominant classes of size between these cell
117
subpopulations. B: Note the significant difference between the values of medians, maximum
and minimum of these two cell subpopulations (p<0,001 Mann Whitney test).
Figure 7. Topographic distribution of total (A), Type 1 (B) and Type 2 (C), TH-immunoreactive
cells in a representative rock cavy retina. The optic disc is represented by an open circle. Black
circles of different sizes represent the number of cells. Adjacent sampling windows were sampled,
covering the retina systematically. Scale bar = 2 mm.
Figure 8. Vertical sections of rock cavy retina double fluorescence stained for TH (red) and
GABA (green). A-C: type 1 cells; D-F: type 2 cells. Arrows indicate points of co-localization.
Scale bar = 60 µm.
118
Figure 1.
119
Figure 2.
Figure 3.
Figure 4.
120
Figure 5.
121
Figure 6.
Figure 7.
122
Figure 8.
123
Table 1. Animals and retinas data.
Animal Weight Retinal area
(mm2)
Sampling
windows
TH-IR cell
number
01 542.5 g 210.287 270 2,651
02 725.5 g 210.622 279 2,080
03 418.5 g 167.586 225 2,196
04 647.0 g 188.189 240 1,360
05 390.5 g 188.532 235 2,046
06
Mean
SD
483.0 g
534.5
131.2
223.767
198.164
20.42
308
259.5
31.7
2,607
2,157
469
Table 2. Comparative data between type 1 and type 2 dopaminergic cells.
Type 1 cells Type 2 cells
Maximum density
22 ± 3/mm2
8 ± 2/mm2
Minimum density 2 ± 1/mm2 1/mm
2
Center-periphery gradient 17 ± 5/mm2 7 ± 2/mm
2
Cell body area 120.047 to 269.373 µm2 54.848 to 177.142 µm
2
Cell body diameter 13.280 to 23.060 µm 9.491 to 17.470 µm
Total number of DA cells/retina 1,931 ± 424 226 ± 65
124
3° Artigo
The topography of cone photoreceptors in the retina of a crepuscular
rodent, the rock cavy (Kerodon rupestris)
A ser submetido à revista "Visual Neuroscience"
Classificação no QUALIS: A1
125
The topography of cone photoreceptors in the retina of a crepuscular rodent, the rock
cavy (Kerodon rupestris)
FRANCISCO GILBERTO OLIVEIRA*1,3
, BELMIRA LARA DA SILVEIRA ANDRADE
DA COSTA2,
EXPEDITO SILVA DO NASCIMENTO JÚNIOR3, JUDNEY CLEY
CAVALCANTE3, FAUSTO PIERDONÁ GUZEN
4, JEFERSON DE SOUZA
CAVALCANTE,3,5
, JOACIL GERMANO SOARES3, MARIANA DIAS LEITE
3,
LEANDRO MOURA DE FREITAS3, MIRIAM STELA MARIS DE OLIVEIRA COSTA
3
1Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde
Universidade Regional do Cariri - URCA, Crato, CE, Brazil
2Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Centro de Biociências Biológicas, Universidade
Federal de Pernambuco - UFPE, Recife, PE, Brazil
3Departamento de Morfologia, Laboratório de Neuroanatomia, Centro de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, Natal, RN, Brazil
4Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Ciências Biomédicas, Universidade
Estadual do Rio Grande do Norte - UERN, Mossoró, RN, Brazil
5Departamento de Fisiologia, Laboratório de Neuroanatomia, Centro de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, Natal, RN, Brazil
Running title: Photoreceptors in the rock cavy retina
Text pages: 13;
Tables: 2;
Figures:
*Corresponding author:
Francisco Gilberto de Oliveira
Departamento de Ciências Biológicas,
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde
Universidade Regional do Cariri - URCA, Crato, CE, Brazil
Tel.: +55 88 31021212
Fax: +55 88
E-mail address: [email protected]
126
ABSTRACT
Retinal photoreceptors exert a crucial role in the circadian organization of the whole
organism, and their distribution and subtypes can affect the temporal niche at which the
animals are more active. The rock cavy (Kerodon rupestris, Caviidae) is a crepuscular
rodent belonging to suborder Hystricomorpha, which has been used as a suitable model for
cronobiological investigations. Adopting an immunohistochemical approach, the present
study analyzed how rods and cone photoreceptor subtypes are distributed along the retina of
this rodent. The results shows that the rock cavy retina is rod-dominated but contains cones
for short, medium and long wavelengths distributed along all its extension. Short wavelength
sensitive cones (S-cones) correspond to ~10% of total cone population. Their density ranged
from 7 to 428 cells/mm2 with a peak located in the superior retina, around 3-4 mm dorsal to
the optic disc. Medium and long wavelength sensitive cones (M/L cones) were more
homogenously distributed. Their density varied from 652 to 3,472 cells/mm2
with a discrete
peak located in the ventral retina. Double labeled experiments showed the absence of co-
expression of S and M/L opsins in the rock cavy cones. Altogether, the results indicate a
distinct distribution of S and M/L cones along the retina, suggesting a differential chromatic
or light sensitivity along the visual field of the rock cavy.
Keywords: Cone opsin, immunohistochemistry, Kerodon rupestris, photoreceptors, retina,
rhodopsin.
127
Introduction
Throughout evolution, the order Rodentia has been one of the most successful, and
thanks to its great adaptive success, became the most varied and abundant among terrestrial
mammals (Anderson & Jones, 1967; Hartenberg, 1981). Considering its characteristics,
Rodentia is divided in several suborders, each one comprising many species endowed with
peculiarities related to the ecological niche which they occupy. Someone maintained diurnal,
while others have adopted nocturnal or crepuscular activity pattern (Kolb & Famiglietti, 1974;
Kolb & Nelson, 1983), which suggest a number of retinal adaptations within these suborders.
These adjustments include, among others, changes in the organization of the neural circuitry
involved in retinal resolution and sensitivity. In addition to the position of the eyes in the
head, shape and size of lens and pupil, the distribution of photosensitive cells in the retina can
identify adaptations of each species to the its temporal niche (Land and Nilsson, 2008).
Understanding the arrangement and organization of the retinal sensory cells provides a
basis for understanding the organization of the visual pathways and the degree of visual
perception of each species in particular (Ahnelt & Kolb, 2000). The retinal photoreceptor
layer of vertebrates is a highly specialized light sensor, formed by millions of individual
photoreceptors, which contributes to encode information present in the image to be conducted
to the brain. The photoreceptors are divided into two basic categories: rods, more sensitive to
light, therefore adapted for vision at low light intensity levels (scotopic vision) and cones,
which are used for daylight vision (photopic), need higher levels of illumination. At
intermediate levels (mesopic), both rods and cones contribute to the vision (Peichl, 2005).
Different amounts of visual pigments and different magnification factors in the
cascade of phototransdution contribute significantly to different sensitivity between cones and
rods. The high convergence of the rods to their postsynaptic neurons, the rod bipolar cells,
128
increases their sensitivity. The ratio between cones and rods varies considerably among
mammals and is strongly correlated with the daily activity pattern (Peichl, 2005).
Many rodents have dichromatic vision, showing the two classes of cone visual
pigments, in that one is more sensitive to short wavelength and has a maximum absorbance in
ultraviolet or violet parts of the spectrum (called S opsin) and another is more sensitive to
medium or long wavelength, with a maximum of absorbance in the yellow or green regions of
the spectrum (called L opsin) (Rocha et al., 2009).
In several groups of rodents, the study of the identification and distribution of visual
pigments in the photoreceptors have included many representatives. As part of the suborder
Hystricomorpha, we can relate species such as guinea pig (Jacobs & Deegan, 1994; Peichl &
González-Soriano, 1994; Parry & Bowmaker, 2002), degus (Jacobs et al., 2003), african mole
rat (Peichl et al., 2004), cururo (Peichl et al., 2005) and agouti (Rocha et al., 2009).
The rock cavy (Kerodon rupestris) is a Brazilian rodent found in the northeastern
Brazil, inhabiting the caatinga (Cabrera, 1961; Lacher, 1981). It belongs to Hystricomorpha
suborder, that has been studied by Brazilian visual neuroscientists since the eighties
comprising agouti (Dasyprocta aguti and other species), capybara (Hydrochaerus
hydrochaeris), and spotted paca (Cuniculus paca) (Silveira et al., 1989; Picanço-Diniz et al.,
1991; Rocha et al., 2009). Another hystricomorph species, the guinea pig (Cavia porcellus),
has been studied in other laboratories around the world as well (Jacobs & Deegan, 1994;
Peichl & González-Soriano, 1994; Parry & Bowmaker, 2002). The Hystricomorpha suborder
is one of the five rodent suborders accepted in the standard classification of Rodentia using
the shape of the lower jaw (sciurognath or hystricognath) as the primary character –
Anomaluromorpha, Castorimorpha, Hystricomorpha, Myomorpha, and Sciuromorpha.
129
Although the rock cavy can be active along 24h-day, studies investigating circadian
motor activity indicate that this species has predominantly crepuscular habits (Sousa &
Menezes, 2006).
Thus, considering the pattern of crepuscular activity of the rock cavy and some
peculiarities previously described about retinal projections to the circadian timing system
(Nascimento Jr. et al., 2010a, b), we decide to analyze the types of opsin present in the retinal
photoreceptors of this animal . The present work follows up to a series of studies in which
retinal parameters related to light-sensitivity were analyzed using this experimental model,
started by the topographic distribution of ganglion cells, anatomy of the eye, morphometric
and topographic analysis of dopaminergic cell populations in the retina (unpublished data).
130
Materials and methods
Animals and tissue preparation
The eyes were obtained from 06 adult rock cavies coming from the municipality of
Jucurutu, Northeast region of the Rio Grande do Norte, Brazil, as authorized by the Brazilian
Institute of Environment and Renewable Natural Resources (IBAMA, SISBIO #22403-1).
Maximum care was taken to prevent pain and suffering to animals during the experimental
procedures, according to the criteria established and approved by the Ethics Committee for
Experimental Animal Care of the Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), #
0152009, in accordance with the National Research Council of the National Academy
published in the book "Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and
Behavioral Research". The animals were submitted to dark adaptation for three hours, then
they were pre-anesthetized with tramadol hydrochloride (Cristalia, Brazil) and xylazine
(Agener União, Brazil), both 5 mg/Kg, and maintained with isoflurane (Biochimico, Brazil)
and oxygen by inhalation. Under deep anesthesia, animals were transcardially perfused with
paraformaldehyde (PA) 4% in 0.1 M phosphate buffer (PB), pH 7.4.
After perfusion, the eyes were enucleated and dorsoventral and nasotemporal axes
were properly identified with an incision in the superior and temporal eye regions for
posterior retinal orientation. Then, the eyecups were immersed in buffered PA 4% (Sigma-
Aldrich) for 2 hours followed by immersion in PB 0.1 M, pH 7.4. For whole-mount
preparations, the retinas were carefully dissected and kept in 0.1 M PB, pH 7.4, 4°C. In order
to obtain vertical sections, three distinct animal retinas were crioprotected with 30% sucrose
in PB 0.1 M, and representative pieces of central and peripheral regions were sectioned (20
µm thickness), in a cryostat (Leica CM 1900, Germany). The sections were placed on gelatin-
coated slides and stored at -20°C until their use for immunohistochemical procedures.
131
Whole-mounts preparation and immunohistochemistry
Retinal whole-mounts from 06 different animals were obtained according to Stone
(1981). After this procedure, the retinas were washed several times in PBS and treated with
Hyaluronidase (510 UI/ml) in PBS for 30 minutes at 37 °C to remove the vitreous humour.
The tissue antigenic recovery was obtained by imersion in 0.2 M borate buffer, pH 9 for 60
minutes at 70 °C, followed by three washes in PBS for 5 minutes each. Inactivation of
endogenous peroxidase was obtained using 10% methanol + 3% H2O2 in PBS, for 15 min,
followed by three washes in PBS (5 min each) and one wash in PBS + 5% Triton X-100 for
30 min. Following three rinses in PBS (5 min each), the preparation was incubated in 10%
normal goat serum (NGS) in PBS+0.3% Triton X-100 (PBSTX) for 2 h, followed by rabbit
polyclonal anti-blue opsin or anti-red/green opsins primary antibodies (1:200, Millipore) and
1% NGS for 5 days at 4 °C. After several rinses in PBS, the tissue was incubated in the goat-
anti- rabbit biotinylated secondary antibody (1:1000, Jackson Immuno Research Lab) for
three days at 4 °C and then in avidin-biotin-peroxidase complex (1:200, ABC kit Vector) for
three days at 4 °C followed by 3.3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB). All
antibodies were diluted in PBSTX. After the reaction, the retinas were whole-mounted on
gelatin-coated slides, with the photoreceptor layer upwards keeping their orientation. After
being dried at room temperature, the retinas were dehydrated, cleared with xylene and
mounted using Entellan ® (Merck). The immunohistochemistry procedure adopted in retinal
vertical sections was similar to the description above, except for shorter incubation periods for
the primary and secondary antibodies (24 and 1 h, respectively), and ABC (1 h). Some
vertical sections were also stained for rodopsin using a primary antibody – anti-rodopsin,
raised in mouse at dilution 1:100 and a goat anti-mouse (Vector), 1:200. For vertical sections
hyaluronidase treatment was not used.
132
Analysis of the data
Eight whole-mounted retinas were used to measure total retinal area. Analysis of
topographic distribution of blue and green/red cones was obtained from sampling fields of
138 x 110 µm, spaced at 0.5 mm throughout all retinal extension. In average 510 ± 96
sampling windows were analyzed in 6 rock cavy retinas using 100 X oil immersion objective.
Digital images of sampling field were obtained via video camera (Nikon DXM1200) coupled
to a Olympus (BX41) microscope, 100 X/1.25 aperture oil immersion lens. Cell counts were
carried out using Image J 1.45 s (National Institutes of Health, USA) software.
133
Results
Rod and cone photorreceptors in vertical sections
Figure 1 depicts vertical sections of the rock cavy retina stained for hematoxilin-eosin
(fig 1A), and immunoreacted for rodopsin (Fig 1B), blue opsin (fig 1C) and red-green opsin
(fig 1D) showing rod, blue cone and red-green cone outer segments respectively. As can be
seen in figs 1A and 1B, photoreceptor cell bodies are distributed in three to four tiers of outer
nuclear layer (ONL). There is a high proportion of rods as compared to cones.
Cone photorreceptor distribution in whole-mounted retinas
The distribution of S-cones was analyzed in retinas of three animals. In two of them,
465 and 661 sampling windows were used along all retinal extension. In one animal, this
analysis was carried out in 342 sampling windows of the hemiretina, along dorsal-ventral
portion of the temporal retina. The topographic distribution of these cones showed a dorsal-
ventral asymmetry with most of cells located in the dorsal retina. In all animals analyzed, the
density of S-cones ranged from 7 to 428 cells/mm² peaking around 3 to 4 mm dorsal to the
optic disc. Figure 2 shows a map containing S-cone isodensity lines in a representative
animal. Figures 3A and 3B illustrate digital images of retinal fields containing low and high
densities of S-cones.
The distribution of L-cones was analyzed in retinas of three animals. Between 507 and
549 sampling windows were used along all retinal extension. The topographic distribution of
these cones showed density ranged from 652 to 3,472 cells/mm², being more homogeneously
distributed, although with a discrete peak in the ventral retina. Figure 4 shows a map
containing L/M-cone isodensity lines in a representative animal. Figures 5A and 5B illustrate
digital images of retinal fields containing low and high densities of L-cones. In retinal vertical
134
sections stained for S-opsin and L-opsin immunofluorescence, we detected the absence of
opsin coexpression (Fig.6).
135
Discussion
In the rock cavy retina, the presence of cones and rods was detected by
immunohistochemical technique. Both vertical sections and flat mounts showed cone outer
segments expressing opsins sensitive to blue and green/red of the spectrum band. The analysis
of the results shows that S cones have a density approximately ten times smaller than L cones,
with different degrees of spatial organization.
M/L cones are distributed almost homogeneously throughout the retina, despite a light
peak cell density in the ventral retina. S cones exhibit a more pronounced dorso-ventral
asymmetry, but their higher density are located in the dorsal retina. Recent data of our lab has
indicated that a "horizontal visual streak" is the neuronal topographic distribution defined by
specialization of ganglion cells, similar to that found in the topographic distribution of
dopaminergic cells (unpublished data), and similar to that found in other Histricomorphas, as
agouti, paca and capybara (Silveira et al., 1989). S cones show a higher density in the dorsal
retina, with peak of density dorsal to the optic nerve. Although M/L cones display a small
peak in the ventral retina, their distribution do not follow a tendency for a specialization like a
visual streak. Recent data on rock cavy retina also shows asymmetry in the distribution of
dopaminergic cell populations, which are more concentrated in the dorsal retina, forming a
visual streak just above the optic disc, (data not shown).
It was previously reported that in the guinea pig retina cone distribution is highly
asymmetric, with the dorsal retina dominated by L cones, containing only 5% of S cones,
while in the ventral retina a large predominance of S cones was found. Additionally, there was
a transition zone, in which the most of cones exhibited co-expression of L and S opsins (Parry
& Bowmaker, 2002). In the agouti retina a rod density around 47.000-64.000/mm2 and a
relatively high average proportion of cones, around 8%, reaching 17% in some points, which
136
indicates characteristic adaptation to diurnal vision, and consistent with the agouti habits
(Rocha et al., 2009).
By comparing the distribution of ganglion cells (Silveira et al., 1989) and
photoreceptors (Rocha et al., 2009) of the agouti, there is a correspondence between the
topography of L cones and the ganglion cells, in which both exhibit a central specialized
region, the visual streak, and a similar dorsoventral asymmetry. The S cones do not form a
characteristic visual streak, but they have a flatter, with a floating distribution along all the
retina, and have a density of more than 1000 cells/mm2 in the ventral retina.
In the rabbit (Oryctolagus cuniculatus) retina, the visual streak is quite pronounced
(Chievitz, 1891) and the density of cones and ganglion cells overlaps in a horizontal band
slightly below the head of the optic nerve (Hughes, 1971). In the guinea pig (Cavia porcellus)
retina, the ganglion cells form a visual streak, but there is no higher density of cones in this
region (Peichl & Gonzales-Soriano, 1994). The tree shrew retina, cone-dominated, is another
example of incompatibility between photorreceptors and ganglion cells densities. While
ganglion cells form a central peak, both cones and rods have their densities higher in the
ventral retina (Muller & Peichl, 1989; Petry et al., 1993).
Thus, the results herein obtained in the rock cavy, compared to that reported for other
mammals reinforces the idea that the topographic distribution of photoreceptors do not
necessarily reflect those of other cell types of the retina (Szél et al., 1996), but shows
peculiarities of their retinal organization. The present data also suggest a differential light and
chromatic senstitivity along the visual field of the rock cavy.
137
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139
LEGENDS OF FIGURES
Figure 1. - Vertical sections stained with HE and different opsins. (A) - HE; (B) - rodhopsin;
(C) - blue opsin; (D) - red/gree opsin; Scale bar = 20 µm.
Figure 2. - Map of topographic distribution of S-opsin in a wholenounted retina of rock cavy.
The fields in green represent lower densities and higher densities in yellow. The darker
regions represent an increase in these densities. S-top. N-Nasal.
Figure 3. - Wholemounted retina with low density of S-cones in A and high density in B.
Scale bar = 20 µm.
Figure 4. - Map of topographic distribution of L-opsin in a wholemounted retina of rock
cavy. The fields in green represent lower densities and higher densities in yellow. The darker
regions represent an increase in these densities. S-top. N-Nasal.
Figure 5. - Wholemounted retina with low density of L-cones in A and high density in B.
Scale bar = 20 µm.
Figure 6. - Vertical section stained with fluorescence L-opsin, and dab S-opsin, showing
absence of co-expression. Scale bar = 20 µm.
140
Figure 1
Figure 2
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50
X Axis
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
141
Figure 3.
Figure 4.
6
8
10
12
14
16
18
20
22
X Axis
0
100
200
300
400
500
600
142
Figure. 5.
Figure. 6
Table 1. L-opsins
Animal Windows Total cones Minimum Maximum Density/mm2
01 549 175.917 147 527 1,158.871
02 534 132.001 99 400 869.570
03 507 109.305 113 460 720.058
Table 2 - S-opsins
Animal Windows Total cones Minimum Maximum Density/mm2
04 465 12.191 1 71 80.309
05 661 12.229 1 44 80.560
06 342 5.309 2 38 34.974
143
Outros Resultados
144
Fig.1 - Células ganglionares marcadas com cresil violeta, visualizadas com objetiva de 40-X A - região central superior; B - região periférica superior; C - região central inferior; D - região periférica inferior. Barra de calibragem = 20µm.
Fig. 2 - (A) Axônios marcados com o anticorpo anti β-tubulina, em montagem plana (B) - Visualização em menor aumento de montagem plana marcada com cresil violeta. Barra de calibragem = 400 µm.
145
Fig. 3 - Visualização em maior aumento de fibras ópticas e células ganglionares marcadas com o anticorpo anti β-tubulina. Barra de calibragem = 20µm.
Fig. 4 - Células horizontais em uma secção vertical marcada com o anticorpo anti-CB em A, e numa montagem plana em B. Barra de calibragem = 20µm.
Fig. 5 - (A) -Dupla marcação com CB-TH ilustrando células horizontais e algumas amácrinas em vermelho, e uma célula amácrina dopaminérgica em verde. (B) Dupla marcação com CB-CR, ilustrando também células horizontais, onde ocorre co-localização do dois anticorpos, e células amácrinas, sem co-localização (B).
A
B
146
Fig. 6 - Em menor aumento a figura mostra células horizontais e amácrinas marcadas com CR em verde e com CB em vermelho.
Fig. 7 - Secção vertical ilustrando as subcamadas da IPL,marcada com o anticorpo anti-
Neurofilamento. Barra de calibragem = 20 µm
Fig. 8 - (A) Marcação de células amácrinas com PV; (B) células amácinas e fotorreceptores
marcadas com ChAT. Barra de calibragem = 20 µm
Fig. 9 - (A) Células amácrinas marcadas com GABA em (A) e células bipolares marcadas com PKC em (B). Barra de calibragem = 20µm.
A B
A B
147
5. CONCLUSÕES
Um “visual streak” ou faixa visual horizontal é a especialização neuronal definida pela
distribuição topográfica das células ganglionares;
A retina do mocó é anangiótica e destituída de tapetum;
Na retina do mocó, células amácrinas e interplexiformes apresentam
imunorreatividade a Tirosina Hidroxilase, evidenciando dois tipos distintos de células
dopaminérgicas, com diferentes padrões de imunorreatividade, tamanho do corpo celular e
padrão de distribuição topográfica.
A retina do mocó contém cones e bastonetes e os cones possuem sensibilidade
cromática para o azul (S) e para o verde/vermelho (L);
Os cones S apresentam uma densidade mais elevada na porção dorsal da retina, e os
cones L estão distribuídos de forma mais homogênea;
Do ponto de vista comparativo, o olho do mocó tem similaridades com olhos de outros
roedores da subordem Hystricomorfa, mas apresenta peculiaridades inerentes a forma e
dimensões dos seus elementos ópticos, que o habilitam para um maior ganho em sensibilidade
à luz, em detrimento de uma melhor resolução, compatível com seu padrão de atividade
crepuscular.
148
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS*
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será submetido.
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