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Fontes de Microrganismos• Os microrganismos de Interesse Industrial
pode ser obtidos:
• Isolamento de recursos naturais: (solo, água, plantas, etc);
• Compra em coleções de cultura: (Agricultural Research Service Culture Collection (EUA), Coleção de Cultura Tropical (Campinas);
• Obtenção de mutantes naturais;
• Obtenção de mutantes induzidas por métodos convencionais;
• Obtenção de microrganismos recombinantes. 1
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Características Desejáveis do Microganismo
• Os microrganismos de Interesse Industrial devem:
• Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto;
• Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a ser elevada concentração do produto no caldo fermentado;
• Não produzir substâncias imcompatíveis com o produto;
• Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico;
• Não ser patogênico;
• Não exigir condições de processo muito complexas;
• Não exigir meios de cultura dispendiosos;
• Permitir rápida liberação do produto para o meio.2
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Características Desejáveis do Microganismo
• Exemplo da Fermentação Alcoólica:
• C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2
Fator estequiométrico teórico=0,511
Cada grama de glicose é convertida em 0,511g de etanol
Saccharomyces cerevisiae, alcança 90% deste rendimento, enquanto outros microrganimos produzem etanol, mas com rendimentos muito inferiores;
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Características Desejáveis do Microganismo
• Exemplo da Fermentação Alcoólica:
• C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2
Por outro lado, sabe-se que quando se atinge 8 à 10% em volume de álcool no meio, ocorre inibição da levedura e diminui a velocidade de conversão de açúcar em álcool.
Portanto no caso de obtenção de álcool combustível, deve-se trabalhar com valores que não ultrapassem esta concentração alcoólica.
Neste caso, a matéria prima incide em 60% do valor do custo do etanol.
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Características Desejáveis do Microganismo
• Exemplo da produção de enzimas ou antibióticos:
• Açúcar + O2 Células + CO2 + Produtos + Intermediários
Oxigênio, faz com que aumente consideravelmente a produção de células, enquanto pequena quantidade do produto é obtida.
A matéria-prima é barata, mas a recuperação do produto é onerosa, chegando a 70% do valor do custo, porém o produto tem maior valor agregado.
Portanto, buscar microrganismo, que cresçam menos, ou que acumulem menos intermediários, podem diminuir o custo do processo.
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Características Desejáveis do Microganismo
• Exemplo da produção de glicoamilase por Aspergillus:
• Glicoamilase, enzima que hidrolisa amidos em glicose;
• Transglicosidase, enzima que polimeriza a glicose formando amido;
• Um microrganismo ideal, seria aquele que produz o mínimo de substâncias competitivas, ao mesmo tempo sintetize muito bem o produto pretendido.
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Características Desejáveis do Meio de Cultivo
• Ser o mais barato possível;• Atender as necessidades nutricionais do microrganismo;• Auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser
ligeiramente tamponado, o que evita variações drásticas de pH, ou evitar excessiva formação de espuma;
• Não provocar problemas na recuperação do produto;• Os componentes devem permitir algum tempo de
armazenamento, a fim de estarem disponíveis para o uso a qualquer tempo;
• Ter composição razoavelmente fixa;• Não causar dificuldades no tratamento final do efluente. 7
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Meio de Cultivo
• Os microrganismos utilizam:• Fonte de carbono e energia, diversos açúcares, como glicose,
sacarose, frutose, polissacarideos como amido e celulose;
• Fonte de nitrogênio: sais como (NH4+)2SO4, (NH4)2HPO4, aminoácidos e uréia;
• Fonte de fósforo: Monoamônio fosfato ou Diamônio fosfato;• Outros elementos: Na, K, Ca, Fe, Cu, Mg, Mn, Co, etc. em
concentrações bem reduzidas, porém necessárias.• Meios constituídos apenas por estas substâncias são
denominados de meios sintéticos.8
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SUBSTRATOS Monossacarídeos (glicose, frutose, galactose, manose, ribose, xilose,
arabinose) Dissacarídeos: Sacarose (glicose + frutose) Lactose (galactose + glicose) Maltose (glicose + glicose) Trissacarídeos: Rafinose (glicose + frutose + galactose) Maltotriose (glicose + glicose + glicose) Polímeros de alto peso molecular: Amido (amilose + amilopectina) Amilose: cadeia linear de glicose ligações alfa 1-4 Amilopectina: cadeia ramificada com ligações alfa 1-4 e alfa 1-6 Celulose: polímero de glicose em ligações beta 1-4 Glicogênio: polímero de glicose com ligações alfa 1-4 e alfa 1-6 Pectina: polímero de ácidos galacturônico, raminose, arabinose e galactose
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Perfil de Utilização de Fontes de Carbono
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Meio de Cultivo
• Meios de cultivo preparados com fatores de crescimento:• aminoácidos;• Vitaminas (biotina, tiamina, riboflavina, etc.);• Extratos de leveduras, extratos de malte, extratos de carne,
peptona, hidrolisados de proteínas;
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Meio de Cultivo
• Meios mais complexos e menos onerosos, por esta razão empregados na maioria dos processos fermentativos em grande escala:
• Caldo de cana-de-açúcar;• Melaço,• Cereais (trigo, milho, cevada, soja);• Frutas (uvas, jaboticabas, laranjas, bananas)• Estas matérias-primas são de composição química
desconhecidas, mas os teores de açúcares, nitrogênio e fosforo, devem ser determinados para avaliar sua complementação ou não.
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Considerações Finais
• A definição adequada do microrganismo a ser empregado, assim como do meio de cultura para este microganismo, é etapa fundamental para o sucesso de um processo fermentativo;
• No entanto, é sempre importante lembrar que a definição de um processo fermentativo mais adequado, assim como as preocupações com a recuperação do produto, são etapas da mais alta importância;
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Considerações Finais
• Em alguns casos o emprego de microrganismos disponíveis em coleções de cultura pode levar ao desenvolvimento de processos produtivos que sejam atraentes;
• É necessário lembrar, no entanto, que presentemente se dispõem de muitos recursos para o aprimoramento de linhagens produtivas, o que torna os processos fermentativos cada vez mais promissores;
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Considerações Finais• Essas considerações trazem também um importante
alerta sobre a constante necessidade de desenvolvimento do processo produtivo já instalado, justamente por essa grande variedade de desenvolvimentos possíveis;
• Presentemente e bastante dificial imaginar que uma dada empresa disponha do microrganimso “ótimo” ou do meio de cultura “otimizado”;
• É da mais alta importância que essa empresa continue a busca por melhores condições, em termos de microrganismos e de meio, caso contrário, poderá ser ultrapassada pela concorrente. 15
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Biografia• Biotecnologia Industrial. Engenharia Bioquímica.
SCHMIDELL, W. LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W. Editora Edgard Blucher, São Paulo, 2007.
Prof. Dr. João Batista de Almeida e [email protected]
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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE FERMENTAÇÃO POR
AQUECIMENTO A VAPOR
• MUITOS PROCESSOS FERMENTATIVOS EXISTEM A PRESENÇA DE MICORRGANISMOS ESTRANHOS “CONTAMINANTES”;
• EXEMPLO:
• 1. PINICILINA OS CONTAMINANTES PODEM PRODUZIR PENICILINASE;
• 2. FERMENTAÇÃO ACETONA-BUTANÓLICA, A BACTÉRIA PODE SER DESTRUÍDA POR VIRUS BACTERIÓFAGOS;
• OS CONTAMINANTES CONSOMEM AÇÚCARES E NUTRIENTES, COMPETINDO COM OS MICRORGANISMOS DE INTERESSE.
• O GRAU DE ELIMINTAÇÃO DOS CONTAMINANTES DEPENDE DE CADA CASO.
Prof. Dr. João Batista de Almeida e [email protected]
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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• PROCESSOS DE ESTERILIZAÇÃO POR AQUECIMENTO
• PROCESSOS DESCONTÍNUO:
• O MEIO É COLOCADO NO FERMENTADOR E ENTÃO TODO O SISTEMA É AQUECIDO COM VAPOR. ESTERILIZA-SE O MEIO E O FEMENTADOR AO MESMO TEMPO, PODENDO SER POR VAPOR DIRETO OU INDIRETO;
• O AQUECIMENTO COM VAPOR DIRETO, PROVOCA DILUIÇÃO DO MEIO ENTRE 10 E 15%;
• A ESTERILIZAÇÃO DESCONTÍNUCA TEM AS SEGUINTES FASES:
• 1. AQUECIMENTO: elevação da temperatura próximo de 120 oc;
• 2. ESTERILIZAÇÃO: temperatura é mantida constante durante o tempo de esterilização;
• 3. RESFRIAMENTO: refrigera-se o sistema por serpentina ou pela camisa do fermentador. 18
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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• PROCESSOS DE ESTERILIZAÇÃO POR AQUECIMENTO
• A DESTRUIÇÃO TÉRMICA DOS MICRORGANISMOS OCORREM QUANDO A TEMPERATURA ESTÁ ACIMA DA TEMPERATURA MÍNIMA LETAL (80 A 100 oC).
• DESVANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO DESCONTÍNUA:
a) Manutenção do meio em teperaturas relativamente altas por períodos longos, favorecendo o desenvolvimento de reações químicas e decomposição de nutrientes;
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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• DESVANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO
DESCONTÍNUA:
a) Elevados consumos de vapores no aquecimento e de água no resfriamento;
c) Problemas de corrosão nos equipamentos;
d) Tempo não produtivo relativamente elevados,
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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA:
• Pode ser por vapor direto ou indireto também.
O meio preparado é bombeado para um trocador de calor de placas ou tubos,
A temperatura sobe instantâneamente e mantida por um determinado tempo de residência;
O meio é enviado para outro trocador de calor para o resfriamento;
O meio é enviado para um fermentador, já esterilizado;
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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA:
• ALGUNS VALORES NUMÉRICOS DE ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA
• a) vapor de aquecimento: vapor saturado (6,8 a 8,5 atm
• b) bombas de recalque do mosto não esterilizado podem ser bombas centrífugas, rotativas ou de pistão;
• c) tempo de enchimento do fermentador: não superior a 8 hs;
• d) temperatura de esterilização: 130 A 165 oC;22
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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• VANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO
CONTÍNUA:
• Temperaturas mais altas, porém tempos de permanência entre 5 e 10 minutos, o que diminui a destruição dos nutrientes melhorando a fermentação;
• Meios com densidade ou viscosidade altas, como mostos de cereais, o processo contínuo dispensa motores de potencia elevada, o que seria necessário no caso do processo descontínuo;
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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS
• VANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA:
• Economia de vapor, de água de resfriamento;
• Os esterilizadores podem ser utilizados nos processos de cozimentos e de sacarificação;
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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• CINÉTICA DA DESTRUIÇÃO TÉRMICA DOS
MICRORGANISMOS:
• A VELOCIDADE DE DESTRUIÇÃO DEPENDE:
• a) dos microrganismos
• b) do meio
• c) da temperatura
• Do ponto vista cinético a destruição é dada pela equação de primeira ordem:
• onde: N= número de mo vivos após determinado tempo de
aquecimento
• k= constante de destruição térmica 25
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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• CINÉTICA DA DESTRUIÇÃO TÉRMICA DOS
MICRORGANISMOS:
• A VELOCIDADE DE DESTRUIÇÃO DEPENDE:
• a) dos microrganismos
• b) do meio
• c) da temperatura
• Do ponto vista cinético a destruição é dada pela equação de primeira ordem:
• onde: N= número de mo vivos
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