fluoreszcens mikroszkópos mérési technikák (live cell...
TRANSCRIPT
Fény- és fluoreszcens mikroszkópia
Fluoreszcens mikroszkópos mérési
technikák (live cell imaging)
Fluoreszcens live cell imaging - in vivo / in vitro
- brightfield kombináció
- multikolor detekció, detektor
- vastagság: 10 nm – 200 mm; üvegfelszín!
- widefield / rétegek / letapadási
felszín
- időbeliség
- T, pH, CO2, O2, stb – inkubációs kamra
http://www.microscopyu.com/articles/livecelli
maging/fpimaging.html
http://zeiss-
campus.magnet.fsu.edu/articles/livecellimaging/imagingsystems.html
http://www.microscopyu.com/articles/livecellima
ging/culturechambers.html
http://www.microscopyu.com/articles/livecelli
maging/livecellmaintenance.html
http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/
chamberresources.html
FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)
• kvantitatív információ fehérjék, lipidek, enzimek, nukleinsavak közötti
interakció tér- és időbeli változásáról
• távolság-függő, nem-radiativ kvantummechanikai folyamat -> szenzitizált
akceptor emisszió
• Theodor Förster, 1940s
• rezonancián alapuló, dipólus-dipólus
kölcsönhatás
http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/fretintro.html
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/spectralimaging/fretbiosensors/index.html
FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)
• szükséges feltételek:
1. donor emissziója és akceptor gerjesztési
spektruma fedjen át
2. donor és akceptor távolsága < 10 nm
3. donor és akceptor dipólus-szerkezete
megfelelő elrendezésű legyen
Förster távolság (50% E)
energiatranszfer hatékonysága
donor – akceptor
közötti távolság
FRET-re alkalmas távolság
FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)
• legtöbbször a kölcsönhatásra igen/nem válasz – valódi molekuláris távolság
mérésére csak korlátozottan használható
• fontos gyakorlati tényezők:
- donor és akceptor hasonló fényességű legyen
- donor és akceptor sztöchiometria 10:1 – 1:10 között (ideális az 1:1, vagy
az akceptor fölösleg)
- bleed-through és átgerjesztés
• donor gerjesztése az
akceptort is gerjeszti
• donor emissziója az
akceptor emissziójával
átfed
- FRET-pár térszerkezetét a jelölés/negyedleges szerkezet hogyan
befolyásolja
- photobleaching
FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)
• Raichu FRET szenzorok: Ras and interacting protein chimeric unit
http://www.fret.lif.kyoto-u.ac.jp/e-phogemon/
intermolekuláris (bimolekuláris) intramolekuláris (unimolekuláris)
teljes (complete) részleges (incomplete)
FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)
• Raichu FRET szenzorok: Ras and interacting protein chimeric unit
http://www.fret.lif.kyoto-u.ac.jp/e-phogemon/
távolság-függő orientáció-függő
FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)
• Raichu FRET szenzorok: Ras and interacting protein chimeric unit
http://www.fret.lif.kyoto-u.ac.jp/e-phogemon/
- kis GTPáz-ok aktivitásának sejten belüli meghatározására
- donor (CFP), akceptor (YFP), adott GTP-áz (pl.
H-Ras), adott GTP-áz kötőpartnerének a GTP-ázt
kötő doménje (pl. Raf Ras-kötő doménje; RBD)
- nem egyszerű jól kialakítani
• megfelelő kötődomén legyen: endogén GAP-
okkal kompetíció alakulhat ki -> GAP inhibíció ->
nem-stimulált állapotban is magas GTP szint ->
a szenzor szűk dinamikus tartományú lesz
• spacer: ált. (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly)1-6x
• sejten belüli lokalizáció: K-Ras4B CAAX-box –
plazmamembrán lokalizáció
• megfelelő FRET-párok a jó SNR-hez
FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)
FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)
• hogyan lehet mérni?
1. szenzitizált emisszió / két színű, raciomentrikus mérés
• elvileg a legegyszerűbb – DE crosstalk!
• főleg bioszenzoroknál
• sok kontroll kell
FRET+ esetén a 2 molekula ko-lokalizációját fixált sejtekben is ellenőrizni kell!
FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)
• hogyan lehet mérni?
2. akceptor photobleaching (donor dequenching)
• akceptor photobleaching után a donor emissziója megnő – 2
mérés csak (előtte / utána)
• min. 90% akceptor bleaching a donor emisszió változtatása
nélkül!
• gond: irreverzibilis, relatíve lassú, kinetikai mérésekre nem jó –
gyak. csak fixált prepiken
• bleaching alatt fotokonverzió is történhet....
• előny: rel. egyszerű, kivitelezése gyors
FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)
• hogyan lehet mérni?
3. Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
• donor molekula fluoreszcens élettartamát az akceptorral való
interakció befolyásolja
• nagyon gyors kinetikájú (nsec) mérések
• gond:
• előny:
- akceptornak nem kell fluoreszkálnia
- donor gerjesztési műtermékek nem
befolyásolják
- drága berendezés
- gyors változásokhoz rel. lassú imaging
- a fluor élettartam-csökkenés nem mindig illeszthető
exponenciálisan http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/flimintro.html
FRET (Förster / Fluorescent resonant energy transfer)
• hogyan lehet mérni?
4. Spektrális imaging
• 2 gerjesztésnél a teljes emissziós
spektrumot felveszik
• kisebb jel – zaj érték, mint a 2
csatornás detekciónál
5. Fluorescence polarizációs anizotrópia
http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/
fret/fretintro.html
• polarizált gerjesztés: a
gerjesztett molekula fluor.
élettartama alatt nem mozdul
-> emisszió ugyanúgy
polarizált (izotróp)
• FRET -> anizotrópia
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
• detektálni kívánt szabad koncentráció: <50 nM és >50 mM is lehet! ->
festék Kd értéke (ált. 0.1-10x Kd-vel arányos [Ca2+]IC mérhető)
„Bioszenzorok”
- Ca2+, Mg2+, Zn2+, egyéb fémionok
- pH indikátorok
- Na+, K+,Cl-, foszfát, nitrit, egyéb anionok
- membrán potenciál
Ca2+ szenzorok - fő szempontok
• sejtbe való bejuttatás, kompartmentalizáció, diffundálás
- acetoximetil (AM) észter variánsok
• szabad / kötött forma gerjesztési, ill.
detekciós hullámhossza
• kalibrálás, mérés: raciometrikus! (festéktöltés / szivárgás, vastagság / fókusz-drift,
fotobleaching ellen...)
- dextrán konjugátumok
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook/Indicators-for-Ca2-Mg2-
Zn2-and-Other-Metal-Ions/Introduction-to-Ca2-Measurements-with-Fluorescent-Indicators.html#head1
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
• Fura2: raciometrikus,
340/380 nm ex, 510 nm em
- UV gerjesztés
Fluo3
Fura2
- látható fény gerjesztés
• Fluo3, Fura Red: nem
raciometrikusak, de együtt
használhatóak
• gyors gerjesztés-váltás kell:
Shutter DG4 / LED
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Reference
s/Molecular-Probes-The-Handbook/tables/Summary-
of-fluorescent-Ca2-indicators-available-from-
Molecular-Probes.html
http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confo
cal/fluorophoresintro.html
Ca2+ szenzorok
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
• Cameleon: Calmodulin-M13 fehérje + CFP, YFP FRET pár -> Ca2+-
függő konformációváltozás hatására FRET
- fehérje-alapú Ca2+ indikátorok (genetically encoded Ca indicators;
GCaMP; GECI)
Ca2+ free
Ca2+
• Pericam: b-barrel doménhez kapcsolt Ca-szenzor
Ca2+ szenzorok
http://www.olympusmicro.com/primer/techniq
ues/confocal/applications/cameleons.html
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
Ca2+ szenzorok
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
Ca2+ szenzorok
• in vivo mérések: ált. 2PM
2PM
• bulk loading / pipette loading / genetikai
szenzorok
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
fluoreszcens fehérjék (optical highlighters)
• ált. GFP származékok
• fotofizikai jellemzők: emissziós / sötét állapotok, blinking
• adott l-ú fény hatására a b-barrel szerkezet megváltozik -> optikai
sajátságok megváltozása
http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/opticalhighlighters.html
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/highlighterfps.html
• fotoaktiváció
• fotokonverzió
• fotoswitching
Uncaging (pl. glutamát)
Photoactivation
Photo-
conversion
Reverzibilis
photoswitching
Photoactivation (PA)
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
• gerjesztés UV vagy near-UV fénnyel ->
intramolekuláris dekarboxiláció
• PA-GFP: T203H – nagy UV elnyelés, de
450-550 nm között nem gerjeszthető ->
aktiváció után már 488 nm-en
gerjeszthető
• gond, hogy aktiválás előtt nehezen lokalizálható.....
• PA-mCherry: 405 nm megvilágítás -> aktiváció után már 564 nm-en
gerjeszthető, 595 nm emittál -> PA-GFP-vel kettős fotoaktiváció
• Phamret (Photoactivation-mediated resonance energy transfer):
• PA-GFP + ECFP FRET pár
• aktiváció nélkül 458 nm ex -> cián emisszió
• aktiváció (405 nm) után 458 nm ex -> zöld emisszió (FRET alakul ki)
• előny: lokalizálható, csak 1 gerjesztési hullámhossz kell; gond:
dimer-méretű
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
Photoswitching (PS)
• pl. PS-CFP: 405 nm-es gerjesztés
hatására emissziós változás (cián -> zöld),
így aktiválás előtt is lokalizálható
• ált. gyenge emisszió
és fotostabilitás
• irreverzibilis: ált. Glu222
dekarboxilációja
Photoconversion
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
• gerjesztés UV vagy near-UV fénnyel -> backbone
hasítás -> emissziós hullámhossz változás
- Kaede: zöld -> piros emisszió, 2000x arányváltozás - aerob körülmények mellett stabil és irreverzibilis fotokonverzió
- jó kontraszt, de tetramer szerkezet
- Dendra2 : monomer szerkezet
- EosFP / tdEosFP: 405 nm aktiváció -> 518 nm > 581 nm emisszió;
tandem szerkezet
- Kikume GR: 2Pi
aktiváció 760
nm-rel
Photoconversion
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
• gyakoribb jelenség, mint gondolták....
• szuperrezolúcióra, dinamikus folyamatok
elemzésére OK (de pl. FRET, photobleaching során
műtermék is lehet!)
Reverzibilis photoswitching
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
• fotokromizmus: sztohasztikus „blinking” a gerjesztés alatt (wtGFP, YFP)
• Dronpa: 405 / 488 nm gerjesztés az emissziót be / ki kapcsolja
- teljes bleaching előtt akár több százszor is ismételhető
- igen intenzív jel
• Kindling / KFP1: 525-582 nm ex -> 600 nm em, lassú elhalványulás
450-490 nm ex -> azonnali lekapcsolás
• UV -> reverzibilis cisz/transz izomerizáció
Fluoreszcens „stopper” (timer)
Fluoreszcens környezeti jelző molekulák
• DsRed: zöld -> piros emissziós átmenet rel. lassú, időben folytonos
folyamat
• mCherry változatok: kék -> vörös emissziós átmenet gyorsan (<15 min),
közepes (1,2 h) vagy lassú (9,8 h) sebességgel
génaktiváció idejét is jelzi
Photobleaching és fotoaktivációs technikák
FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)
FLIP (Fluorescence loss in photobleaching)
http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/flipandfrap.html
Photobleaching és fotoaktivációs technikák
Fotoaktiváció
uncaging
• biológiai jelzőmolekula (pl. Glu) kovalens kötésekkel fényérzékeny blokkoló
csoport(ok)hoz kötve -> rövid UV fényre fotolízis -> térben és időben
lokalizált felszabadulás
MNI-caged-L-glutamate
(4-Methoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate)
• gond: sejtbe való bejuttatás
UV fény (-> 2PM manapság), fotolízis kinetikája és hatékonysága
fotolízis utáni reakciótermék gyakran mérgező (-> scavenger
megkötés)
Photobleaching és fotoaktivációs technikák
Photobleaching és fotoaktivációs technikák -
optogenetika
Channelrhodopsin2 (ChR2) – halorhodopsin (HR)
• ChR2: kék gerjesztésre Na+ ioncsatorna nyitása -
depolarizáció
• HR:
zöld/sárga
gerjesztésre
inward Cl-
pumpa –
hiperpolari-
záció
bacteriorhodopsin2 (BR)
Photobleaching és fotoaktivációs technikák -
optogenetika
• BR2: kék gerjesztésre outward H+ pumpa
FRAP
FLIP
PA
FLAP
FSM
FRET
TIRF
FCS
2Pi
Az f betűs szavak...
Hasznos honlapok
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html
http://www.olympusmicro.com/index.html
http://www.microscopyu.com/
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook.html