UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE FARMÁCIA

BRUNA ALAYDE TRIDAPALLI CHAVES

FLAVONOIDE MORINA: AVALIAÇÃO IN VITRO DO SISTEMA DE

OXIDAÇÃO E IMPLICAÇÕES DA DOENÇA DE ALZHEIMER

Itajaí

2013

BRUNA ALAYDE TRIDAPALLI CHAVES

FLAVONOIDE MORINA: AVALIAÇÃO IN VITRO DO SISTEMA DE

OXIDAÇÃO E IMPLICAÇÕES DA DOENÇA DE ALZHEIMER

Monografia apresentada como requisito para obtenção do título de farmacêutico pela Universidade do Vale do Itajaí, Centro de Ciências da Saúde.

Orientadora: Profª. Dra. Márcia M. de Souza Co-orientadora: Profª. Dra. Cristiani Bürger

Itajaí (SC)

Junho de 2013

Aos meus pais, Achilles e Solange, por serem esses guerreiros incríveis e servirem

de exemplo para eu continuar seguindo em frente nos momentos difíceis.

Ao meu marido, Edson, pela compreensão e amor cedido em todos os momentos.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus, por me ofertar a dádiva da vida e a

serenidade para buscar meu próprio caminho.

É difícil agradecer todas as pessoas que de algum modo, fizeram ou fazem

parte da minha vida, por isso primeiramente agradeço a todos de coração.

Quero agradecer meus amados pais Achilles e Solange, pela minha

educação, dedicação e por todo amor concedido por eles. Vocês são as pessoas

que mais admiro e mais tenho orgulho na vida.

Ao meu irmão, Vitor Gabriel, essa criança maravilhosa, que me faz aprender

coisas novas sempre e se faz meu incentivo para eu ser uma pessoa cada vez

melhor, para que ele um dia, possa ter como exemplo.

Ao meu marido, Edson, por ser um homem incrível, sempre me apoiando, me

incentivando, me compreendendo em qualquer situação da minha vida.

Agradeço a toda a minha família pelo carinho cedido e pela compreensão das

minhas ausências, em especial minha tia Ana Paula que independente de qualquer

situação sempre esteve e esta ao meu lado me oferecendo muito carinho e ajuda.

A todos os meus amigos que me deram força e me aguentaram durante todo

esse período. Guardo lembranças especiais de cada um.

Aos queridos professores que desempenharam com dedicação as aulas

ministradas, que com certeza, fez a diferença para meu aprendizado e conclusão

deste trabalho.

Com enorme carinho agradeço a professora Márcia Maria de Souza que

aceitou me orientar com total dedicação neste projeto, assim como, agradeço a

minha co-orientadora, professora Cristiani Bürger, pessoa na qual me fez crescer

muito como profissional e como pessoa.

A todos os funcionários e colaboradores da UNIVALI, em especial, Maria

Angélica de Azevedo e Pedro Pablo Perez Neto, que atenciosamente me auxiliaram

nos experimentos.

Agradeço a todos que de forma direta ou indireta, na minha vida pessoal ou

acadêmica, me ajudaram a conquistar mais essa vitória.

Meus sinceros agradecimentos a todos vocês.

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse

feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes.”

(Martin Luther King)

FLAVONOIDE MORINA: AVALIAÇÃO IN VITRO DO SISTEMA DE

OXIDAÇÃO E IMPLICAÇÕES DA DOENÇA DE ALZHEIMER

Bruna Alayde TRIDAPALLI CHAVES

Orientadora: Profª. Drª. Márcia Maria de Souza

Co-orientadora: Profª. Drª. Cristiani Bürger

Defesa em: junho de 2013

Resumo:

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa, progressiva, de início insidioso com deterioração cognitiva progressiva. As hipóteses mais prováveis para o surgimento da DA, sugerem processos de inflamação e estresse oxidativo oriundos do depósito dos peptídeos β-amiloide e da hiperfosforilação da proteína TAU, culminando na deficiência da neurotransmissão colinérgica. Diversos estudos têm demonstrado o potencial terapêutico dos flavonoides sobre vários aspectos biológicos, principalmente no que diz respeito àquelas relacionadas ao envelhecimento. A morina (MO), composto fenólico obtido de várias espécies vegetais, apresenta potencial protetor do sistema cardiovascular via controle do estresse oxidativo, assim como efeito antiinflamatório, ambos comprovados na literatura. Considerando a relação estresse oxidativo, DA, inflamação e flavonoides, o objetivo do presente estudo foi avaliar, o efeito da MO (v.o) sobre a atividade das enzimas antioxidantes: superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR), assim como, os níveis de lipoperoxidação em tecido cerebral de animais normais e com DA induzida pela estreptozotocina (STZ). Para tal propósito foram utilizados os cérebros de camundongos tratados com a MO (25, 50 e 100mg/kg, v.o) após os experimentos comportamentais, os quais avaliaram o efeito do tratamento sobre a memória dos mesmos. A avaliação da atividade antioxidante foi realizada através de métodos enzimáticos in vitro. No tecido cerebral dos animais normais tratados com a MO nas diferentes concentrações estudadas, houve uma diminuição da atividade da CAT em relação ao grupo controle. Nestes mesmos animais tratados com MO na concentração de 100 mg/kg, observou-se um aumento expressivo da atividade da SOD. Em adição, o índice de lipoperoxidação diminuiu significativamente nas as concentrações de 50 e 100mg/kg. As atividades das enzimas GR e GPx não apresentaram diferença estatística quando comparados ao grupo controle. Em animais com DA induzida por STZ observou-se aumento da atividade das enzimas GR e GPx nas doses de 50 e 100mg/kg, assim como, houve um aumento da SOD em todas as doses testadas (25, 50 e 100mg/kg). Entretanto, foram observados diminuição da atividade da CAT para todos os grupos tratados, quando comparados com ao grupo controle. Nesses animais, nas doses de 25, 50 e 100mg/kg houve uma diminuição significativa do índice de lipoperoxidação. Os resultados obtidos até o momento permitem sugerir que a MO possui atividade protetora contra o estresse oxidativo gerado em tecido cerebral, principalmente no cérebro de animais com DA induzida pela STZ. Os dados em conjunto corroboram com resultados da literatura sobre a importância dos flavonoides como neuroprotetores e apontam a MO como uma molécula de interesse para a terapêutica da DA.

Palavras-chave: Alzheimer. Estresse oxidativo. Morina. Streptozotocina.

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Placa neurítica formada pelo depósito do peptídeo β-

amiloide.......................................................................................

26

Figura 02 Emaranhados neurofibrilares decorrentes do depósito da TAU

hiperfosforilada...........................................................................

27

Figura 03 Estrutura básica dos flavonoides e sistema de

numeração..................................................................................

33

Figura 04 Estrutura do flavonoide morina...................................................

34

Figura 05 Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg

v.o) sobre a atividade da enzima SOD presente no tecido

cerebral dos camundongos normais...........................................

43

Figura 06 Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg

v.o) sobre a enzima GR presente no tecido cerebral dos

camundongos normais................................................................

44

Figura 07 Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg

v.o) sobre a atividade da enzima GPx presente no tecido

cerebral dos camundongos normais..........................................

45

Figura 08 Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg

v.o) sobre a atividade da enzima CAT presente no tecido

cerebral dos camundongos normais...........................................

46

Figura 09 Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg

v.o) sobre os níveis de TBARS em tecido cerebral de

camundongos normais................................................................

47

Figura 10 Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e

100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima SOD presente em

tecido cerebral dos camundongos DA induzida por

STZ.............................................................................................

48

Figura 11 Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e

100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima GR presente em

tecido cerebral dos camundongos DA induzida por

STZ.............................................................................................

49

Figura 12 Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e

100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima GPx presente em

tecido cerebral dos camundongos DA induzida por

STZ.............................................................................................

50

Figura 13 Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e

100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima CAT presente em

tecido cerebral dos camundongos DA induzida por

STZ.............................................................................................

51

Figura 14 Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e

100mg/Kg v.o) sobre os níveis de TBARS em tecido cerebral

de camundongos DA induzida por STZ.....................................

52

LISTA DE ABREVIATURAS

A - Beta amiloide

AChE - Acetilcolinesterase

APP - Proteína precursora da amiloide

ATP - Trifosfato de Adenosina

BuChE - Butirilcolinesterase

BHT - Di-terc-butil metil fenol

CAT - Catalase

CHAT - Acetiltransferase

DA - Doença de Alzheimer

D-GAL - D-Galactose

EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético

FDA - Food and Drug Administration

GPx - Glutationa peroxidase

GR - Glutationa redutase

GSH - Glutationa reduzida

GSSG - Glutationa oxidada

I.C.V - Intracerebroventricular

MDA - Malondialdeído

Medicare - Programa Nacional de Seguro Social

MO - Morina

NaCl - Cloreto de sódio

NADP+ - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidado

NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

NFT- Novelos neurofibrilares

NMDA - N-metil D-Aspartato

O2 - Oxigênio

EROS - Espécies reativas de oxigênio

SNC - Sistema nervoso central

SOD - superóxido dismutase

STZ - Estreptozotocina

TAU - Proteína TAU

TBARS - Substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico

v.o - Via oral

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 21

2.1 Objetivo geral ...................................................................................................... 21

2.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 21

3 EMBASAMENTO TEÓRICO .................................................................................. 23

3.1 Doença de Alzheimer .......................................................................................... 23

3.1.1 Caracterização e sintomas da doença ............................................................. 23

3.1.2 Epidemiologia ................................................................................................... 24

3.1.3 Achados patológicos do Alzheimer .................................................................. 25

3.1.4 Tratamento atual da doença de Alzheimer ....................................................... 28

3.2 A administração I.C.V de estreptozotocina como modelo animal ........................ 29

3.3 Relação estresse oxidativo e a doença de Alzheimer ......................................... 30

3.4 Flavonoides ......................................................................................................... 32

3.5 Do flavonoide em estudo: Morina ........................................................................ 34

4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 37

4.1 Materiais .............................................................................................................. 37

4.1.1 Reagentes ........................................................................................................ 37

4.1.2 Equipamentos ................................................................................................. 37

4.2 Animais................................................................................................................ 38

4.3 Ensaios bioquímicos: “Testes in vitro” ................................................................. 38

4.3.1 Preparo dos animais para os testes “in vitro” .................................................. 38

4.3.2 Preparo das amostras de tecido cerebral ....................................................... 39

4.3.3 Medida de sistemas e produtos oxidativos ..................................................... 40

5 RESULTADOS ....................................................................................................... 43

5.1 Medidas de sistemas e produtos oxidativos ........................................................ 43

5.1.1 Tratamento agudo com o flavonoide morina em animais normais ................... 43

5.1.2 Tratamento subcrônico com o flavonoide morina em animais DA induzida por

estreptozotocina ........................................................................................................ 47

5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 53

6 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 59

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 61

ANEXO A – Parecer comitê de ética ......................................................................... 69

19

1 INTRODUÇÃO

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa

devastadora que afeta mais de 25 milhões de pessoas em todo o mundo

(CASTELLANI; ROLSTON; SMITH, 2010). É responsável por cerca de 50-60% do

número total de casos de demência em pessoas acima de 65 anos (SHIMMYO et al.,

2008).

A DA é considerada um dos principais problemas de saúde devido ao enorme

impacto causado ao indivíduo, famílias, sistema de saúde e à sociedade como um

todo, uma vez que, a metade dos pacientes é internada em instituições médicas

necessitando cuidados especiais (LUZARDO; GORINI; SILVA, 2009).

A doença torna-se clinicamente aparente como um comprometimento

elevado e insidioso da função intelectual, com alterações no humor e no

comportamento. Mais tarde, ocorre desorientação progressiva, perda de memória e

afasia, sintomas esses que indicam severa disfunção cortical. Nos próximos 5 a 10

anos, o paciente torna-se profundamente incapacitado, mudo e imóvel devido à

progressão do processo neurodegenerativo em áreas cerebrais medianas

(ROBBINS et al., 2008).

A genética e os estudos clínicos sugerem que a geração de oligômeros

peptídeo da proteína precursora amiloide (APP) é o evento inicial da DA. A forma de

peptídeo oligomérica Aβ desencadeia uma série de eventos secundários, incluindo a

hiperfosforilação da proteína TAU, a formação de emaranhados neurofibrilares,

degeneração sináptica, lesão oxidativa, ativação astrocitária, desmielinização,

ativação da cascata de apoptose das células, morte neuronal, e os déficits de

transmissores, como por exemplo, a acetilcolina (ACh). Estes eventos resultam em

perda da função neuronal e dano sináptico, com subsequente comprometimento da

memória, da coordenação motora e do raciocínio, além de perda da capacidade

cognitiva (SALLOWAY et al., 2008).

Modelos farmacológicos que nos permitem mimetizar situações

comportamentais e fisiológicas que ocorrem em pacientes com DA são essenciais

para o estudo de substâncias com efeitos sobre esta patologia (WEI et al., 2005).

Um dos modelos descritos com uma metodologia apropriada contempla a indução

da DA através da administração intracerebroventricular (I.C.V) de estreptozotocina

20

(STZ), uma vez que, esta droga induz a processos bioquímicos similares aqueles

encontrados em pacientes com DA, como, anormalidades no metabolismo da

glicose, deficiência do sistema colinérgico, hiperfosforilação da proteína TAU e

injúria oxidativa (GEROZISSIS, 2008; PINTON et al., 2010).

A importância da associação entre o estresse oxidativo e o envelhecimento

está relacionada com a constante produção de radicais livres por organismos vivos,

a qual é controlada através da produção endógena de enzimas antioxidantes e, pelo

consumo de antioxidantes exógenos não enzimáticos como os flavonoides e as

vitaminas C, E (SALLOWAY et al., 2008). Dentre as enzimas que têm papel

antioxidante destacam-se a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a

glutationa peroxidase (GPx), que se apresentam diminuídas no Sistema Nervoso

Central (SNC) durante o processo de envelhecimento (FURIAN, 2009).

No entanto, o uso de antioxidantes não é reconhecido como alternativa

terapêutica, pois faltam dados científicos que demonstrem efetivamente que o

emprego de tais substâncias é seguro e eficiente (WOLFE, 2006). Uma vez que os

flavonoides são encontrados em muitos alimentos de origem vegetal, fazendo

inclusive parte da dieta humana e, são potentes antioxidantes, torna-se interessante

a investigação dos efeitos desses compostos polifenólicos, na prevenção e

tratamento de diversas doenças relacionadas ao envelhecimento. Ao longo dos

anos, os flavonoides vêm merecendo a atenção dos pesquisadores como potenciais

candidatos a medicamentos de várias patologias do SNC cuja terapêutica ainda é

ineficiente, destacando-se nesse contexto a DA (LOPEZ et al., 2006).

Dentro da classe dos flavonoides destaca-se a morina (2’,3,4’,5,7-

pentahidroxiflavona), composto com atividade biológica antioxidante já comprovada

(ZHANG et al., 2009). Estudos anteriores realizados em nossos laboratórios

demonstraram que o composto exerce significativos efeitos sobre a memória de

animais normais e com DA induzida por diferentes mecanismos (SERRÃO et al.,

2011).

Diante do exposto anteriormente, a proposta do presente estudo foi

aprofundar a investigação sobre os efeitos da morina, avaliando seus efeitos sobre o

sistema de oxidação cerebral dos animais que foram submetidos aos modelos

comportamentais de memória, procurando relacionar dessa forma, os efeitos

facilitatórios sobre a memória dos animais com a propriedade antioxidante.

21

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Estudar o efeito do flavonoide morina sobre o processo de estresse oxidativo

causado pela Doença de Alzheimer, induzida quimicamente em camundongos.

2.2 Objetivos específicos

- Avaliar o efeito agudo da morina sobre atividade de enzimas antioxidantes

(superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase) e

níveis de peroxidação lipídica em tecido cerebral de animais normais;

- Avaliar o efeito subcrônico da morina sobre atividade de enzimas antioxidantes

(superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase) e

níveis de peroxidação lipídica em tecido cerebral de animais com doença de

Alzheimer induzido por Estreptozotocina;

- Estabelecer a relação entre os efeitos nootrópicos da morina (facilitador da

memória em testes comportamentais anteriores) com a sua capacidade de

aumentar a atividade do sistema antioxidante cerebral e diminuição da

peroxidação lipídica.

22

23

3 EMBASAMENTO TEÓRICO

3.1 Doença de Alzheimer

3.1.1 Caracterização e sintomas da doença

A DA foi descrita inicialmente pelo neuropatologista alemão Alois Alzheimer

em 1907. Alzheimer descreveu a doença como uma patologia neurodegenerativa

frequentemente associada à idade, apresentando manifestações cognitivas e

neuropsiquiátricas, alterações de comportamento e incapacidade de atividades

rotineiras (HEBERT et al., 2010).

Trata-se de uma doença progressiva caracterizada por início insidioso com

deterioração da memória, deterioração cognitiva progressiva, surgimento de

sintomas neuropsiquiátricos e distúrbios comportamentais. Além disso, no paciente

com Alzheimer há comprometimento das atividades da vida diária, e perda da função

independente (SALLOWAY et al. ,2008).

O processo degenerativo progressivo das funções psicomotoras e cognitivas,

dura entre 8,5-10 anos, desde o aparecimento dos primeiros sintomas clínicos até a

morte. As regiões cerebrais associadas às funções mentais superiores,

particularmente o córtex frontal e o hipocampo, são aquelas mais comprometidas

pelas alterações bioquímicas decorrentes de DA (MACHADO et al., 2009). A doença

é marcada por uma perda de neurônios colinérgicos inicialmente na região do

hipocampo, bem como diminuição da memória, até a progressão para a completa

demência (AKAISHI et al., 2008).

A fase inicial da DA é descrita por muitos pesquisadores como uma

diminuição suave da cognição. Esta fase é intermediária entre o estado normal do

indivíduo e a etapa avançada da DA. Pacientes neste estado inicial apresentam um

declínio na cognição, porém, nenhum sinal de demência. As atividades de vivência

diárias não são afetadas, entretanto ocorrem brandas perdas de memória (MORRIS,

2005; CADDELL; CLARE, 2010).

A progressão da doença acarreta em tornar o paciente completamente

dependente de cuidadores. A linguagem fica reduzida a simples falas ou palavras.

As tarefas diárias são comprometidas devido à apatia, cansaço e depressão, o que

24

leva à perda da mobilidade e até mesmo da capacidade de se alimentarem sozinhos

(MORRIS, 2005). Devido a diversas complicações, inúmeras patologias oportunistas

acabam por levar o paciente a óbito (FORLENZA, 2005).

Evidências epidemiológica e ciência básica sugerem uma possível

fisiopatologia compartilhada entre diabetes mellitus tipo 2 e doença de Alzheimer.

Essa hipótese tem sido descrita como o diabetes tipo 3 (AKTER ET al., 2011).

Pesquisadores reconheceram uma alteração na função do receptor de insulina, o

qual induz um estado de estresse oxidativo, podendo ser relacionado com a

patogênese da DA. (DE LA MONTE; WANDS, 2006).

Estudos utilizando a tomografia por emissão de pósitrons têm consistentemente

documentado diminuição do metabolismo da glicose cerebral em pacientes

moderadamente e severamente dementes quando comparados com indivíduos

normais pareados por idade, e estudos recentes têm mostrado a utilização da

glicose prejudicada em áreas de associação neocorticais do cérebro de pacientes

com leve déficit cognitivo, um precursor para a DA (MARTINS et al., 2008).

Outros estudos ainda, demonstraram que pacientes com DA exibiram um

maior aumento nos níveis de glicose no sangue após a administração periférica de

glicose do que os controles, apoiando a hipótese de uma disfunção sistêmica na

regulação da glicose na DA (VOSS; PALLER, 2008). Os déficits no metabolismo da

glicose pode também potencializar a morte das células neuronais produzidos por

outros processos patológicos como, por exemplo, níveis elevados de agregados do

peptídeo β-amiloide, resultante do metabolismo anormal da proteína precursora do

amiloide (APP), processo comum em pacientes com DA, que por sua vez pode ser

influenciado pela predisposição genética (AKTER ET al., 2011).

Todas essas manifestações são temporais e ocorrem com a progressão da

doença resultando na neurodegeneração progressiva do sistema nervoso central.

3.1.2 Epidemiologia

A DA constitui aproximadamente 70% de todos os casos de demência. A

prevalência também aumenta exponencialmente com a idade. Para pessoas entre

as idades de 65 e 69, 70 e 74, 75 e 79, 80 e 84, 85 e mais velhas a incidência da

25

doença de Alzheimer tem sido estimada em 0,6%, 1,0%, 2,0%, 3,3% e 8,4%,

respectivamente (CASTELLANI; ROLSTON; SMITH, 2010).

A doença afeta cerca de 25 milhões de pessoas em todo o mundo. Nos EUA,

a prevalência foi estimada em 5 milhões em 2007 e, em 2050, está projetada para

13 milhões só nos EUA (SERENIKI; VITAL, 2008). Estima-se que mais de 1 milhão

de pessoas são afetadas pela doença no Brasil (TATSCH et al., 2006). Cerca de 7%

da população brasileira com mais de 65 anos são acometidos pela DA. O ministério

da Saúde aponta que os gastos com esta patologia chegam a R$ 129 milhões

apenas em medicamentos (BRASIL, 2010).

Globalmente, o número de adultos mais velhos está projetado para aumentar

ainda mais dramaticamente, mais do que dobrando a soma de 420 milhões em 2000

para 973 milhões em 2030. Levando-se em consideração o fato de que a idade

avançada é o principal fator de risco para a DA, não se pode subestimar o problema.

Esta doença representará muito em termos de custo financeiro e humano. Com

efeito, o custo de vida útil prevista de pessoas com DA foi estimado em US $

174.000. Em 2005, o Medicare (sistema de seguros de saúde gerido pelo governo

dos Estados Unidos da América e destinado às pessoas de idade igual ou maior que

65 anos ou que verifiquem certos critérios de rendimento) gastou 91 bilhões de

dólares americanos para cuidados de saúde para pessoas com DA, sendo 21

bilhões dólares associados aos serviços de cuidados de longa duração. Os encargos

em planos de saúde de pessoas com DA foi estimado em mais de US $ 4000 por

pessoa por ano (CASTELLANI; ROLSTON; SMITH, 2010).

3.1.3 Achados patológicos do Alzheimer

Muitas hipóteses têm sido propostas na tentativa de explicar a patologia da

DA, incluindo o depósito dos peptídeos β-amiloide, hiperfosforilação da proteína

TAU, deficiência da acetilcolina, inflamação e estresse oxidativo (HARDY; SELKOE,

2002).

As características histopatológicas presentes no parênquima cerebral de

pacientes portadores da DA incluem depósitos fibrilares amiloidais localizados nas

paredes dos vasos sangüíneos, associados a uma variedade de diferentes tipos de

placas senis também denominadas de placas neuríticas, assim como, acúmulo de

26

filamentos anormais da proteína TAU. Consequente a isso há a formação de novelos

neurofibrilares (NFT), perda neuronal e sináptica, ativação da glia e inflamação

(SERENIKI; VITAL, 2008).

Nos achados histopatológicos, a placa neurítica (Fig. 01) em particular, têm

sido apontados como o mais relevante, e, muitas vezes em destaque (CASTELLANI;

ROLSTON; SMITH, 2010).

Figura 01: Placa neurítica formada pelo depósito do peptídeo β-amiloide.

Fonte: Castellani; Rolston; Smith, 2010.

As placas neuríticas são acúmulos extracelulares com cerca de 2mm de

diâmetro, resultantes do metabolismo anormal da proteína precursora do amiloide

(APP), levando à formação de agregados do peptídeo β-amiloide 1-40 e 1-42. Outro

achado histopatológico, os emaranhados neurofibrilares (fig. 02) são inclusões

intracelulares filamentosas encontradas no córtex cerebral e estruturas do lobo

temporal como o hipocampo e amígdala. São constituídos pela deposição de uma

forma insolúvel de uma proteína normalmente solúvel (TAU), formando-se a partir do

27

colapso do citoesqueleto neuronal, decorrente da hiperfosforilação desta proteína

(FORLENZA, 2005; NIZZARI et al., 2012). A TAU é uma fosfoproteína constituinte

da família das proteínas associadas à microtúbulos, estando altamente expressa no

cérebro, essencialmente em neurônios (PARIHAR; HEMNANI, 2004).

Figura 02: Emaranhados neurofibrilares decorrentes do depósito da TAU hiperfosforilada.

Fonte: Castellani; Rolston; Smith, 2010.

Baseadas nesses marcadores neuropatológicos, duas hipóteses principais

foram propostas, a fim de explicar a etiologia da doença. De acordo com a hipótese

da cascata amiloidal, a neurodegeneração da DA inicia-se com a clivagem

proteolítica da proteína precursora amiloide (APP) e resulta na produção, agregação

e deposição da substância β- amiloide (Aβ) e placas senis. De acordo com a

hipótese colinérgica, a disfunção do sistema colinérgico é suficiente para produzir

uma deficiência de memória em modelos animais, a qual é semelhante à DA.

Cérebros de pacientes portadores da DA mostraram degeneração dos neurônios

colinérgicos, ocorrendo também uma redução dos marcadores colinérgicos e uma

28

diminuição da colina acetiltransferase e da acetilcolinesterase (SERENIKI; VITAL,

2008).

3.1.4 Tratamento atual da doença de Alzheimer

Grandes esforços têm sido realizados para a compreensão e tratamento da

DA, entretanto, a terapia atual está longe de ser satisfatória. De fato, embora o

tratamento realizado através da administração de inibidores da enzima AChE tenha

consistentemente demonstrado eficácia sintomática e redução na progressão da

patologia, esses medicamentos produziram algum tipo de melhora em

aproximadamente 30-40% dos pacientes portadores da DA leve a moderada

(GRANIC et al., 2010).

Os inibidores da AChE (tacrina, rivastigmina, donepezil, galantamina) alteram

a função colinérgica central ao inibir as enzimas que degradam a acetilcolina (AChE

e BuChE), aumentando, assim, a capacidade da acetilcolina de estimular os

receptores nicotínicos e muscarínicos cerebrais. Desde a introdução desses

medicamentos na prática clínica, os inibidores da AChE constituem o tratamento

sintomático de escolha para a DA (SERENIKI; VITAL, 2008). Estes fármacos

apresentam uma terapêutica paliativa e limitada, porque apenas melhoram os

déficits de memória no estágio inicial da doença, uma vez que não interrompem o

processo neurodegenerativo (EPIS et al., 2010).

Determinadas pesquisas levaram a constatação de que uma alta estimulação

glutamatérgica causava danos cerebrais aos pacientes comprometidos pela DA. Em

virtude disso, o FDA aprovou a utilização da memantina (Ebix®, Heimer®, Akatinol®)

em 2003 (ARRIETA, 2006). O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório

do cérebro. Uma alta estimulação glutaminérgica pode resultar em prejuízo neuronal,

fenômeno que tem sido denominado excitotoxicidade. A memantina é a primeira de

uma nova classe de fármacos para os estágios moderado a grave da DA. É um

fármaco antagonista, não-competitivo, voltagem-dependente do receptor N-metil-D-

aspartato (NMDA), que bloqueia os efeitos patológicos decorrentes dos níveis

elevados de glutamato (ARAÚJO; PONDE, 2006).

29

Diversos distúrbios neuropsiquiátricos são observados concomitantemente ao

quadro, se fazendo necessário o uso de ansiolíticos e antidepressivos com o

objetivo de melhora do quadro geral do doente (EPIS et al., 2010).

Estudos farmacológicos visando à investigação de substâncias com potencial

sobre a DA, necessitam de modelos que possam induzir modificações neurológicas

semelhantes as que ocorrem na patologia (ANNAHÁZI et al., 2007). Dessa forma

estudos continuam sendo realizados no sentido de buscar novos compostos com

mais efetividade do que os existentes e/ou apresentando menos efeitos colaterais

(MORRIS, 2005).

3.2 A administração I.C.V de estreptozotocina como modelo animal

Muitos modelos animais foram desenvolvidos ao longo dos anos para o

estudo da DA. A DA é uma patologia que apresenta anormalidades no metabolismo

da glicose, onde ocorre uma redução de sua utilização, bem como alterações na

metabolização do fosfato energético adenosina trifosfato (ATP). Em adição, os

distúrbios no metabolismo energético estão intrinsecamente associados a um

aumento de estresse oxidativo, o qual pode ser resultado de oxidação de

biomoléculas, e início de excitotoxicitade neuronal culminando em apoptose e

necrose (TOTA et al., 2010).

Um modelo de demência esporádica do tipo Alzheimer foi estabelecido por

Sharma e Gupta em 2003 com uma injeção I.C.V bilateral de STZ. A STZ é uma

substância diabetogénica que disturbios prolongados da memória e do metabolismo

cerebral, se injectada no SNC em uma dose sub-diabetogénica. Como modelo

farmacológico, a administração I.C.V. de STZ tem sido descrito como uma

metodologia apropriada para causar DA, uma vez que proporciona uma progressiva

deterioração da memória e redução da glicose e metabolismo energético cerebral,

os quais são característicos na doença (AWASTHI et al., 2010).

Os danos relacionados à STZ abrangem a inibição da síntese de ATP e

acetilcoezima A (acetil-CoA), que resulta numa deficiência do sistema colinérgico.

Associado a estas ações verifica-se também uma redução da atividade das

acetiltransferases (AChT) no hipocampo e um aumento na ação das AChE no

cérebro de ratos (GEROZISSIS, 2008). Recentemente, foi demonstrado que STZ

30

também aumenta a produção e atividade de citocinas inflamatórias, tais como

interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1 (IL-1). Estas citocinas inflamatórias e o estresse

oxidativo grave decorrente da disfunção mitocondrial e aumenta o risco de apoptose

de células no cérebro, particularmente no hipocampo (JAVED et al, 2012).

A administração da STZ possibilita uma dessensibilização dos receptores

neuronais da insulina e redução da atividade das enzimas glicolíticas, causando

redução da energia cerebral, e, levando a uma disfunção cognitiva pela inibição da

síntese de ATP. Além disso, a redução da glicose cerebral a níveis críticos, afeta o

sistema colinérgico, pois ocorre um decréscimo na síntese de acetilcolina, devido à

diminuição da concentração de acetil-CoA, que é um derivado de glicose (SHARMA;

SINGH; SINGH, 2008; SHOHAM et al., 2007). A glicose é metabolizada em produtos

energéticos, e, é transformada em fonte de energia para o cérebro. Por este motivo,

interrupções no metabolismo energético afetam criticamente as funções cerebrais,

além de síntese proteica e processos celulares e moleculares básicos (SPITALER;

GRAIER, 2002).

Ishrat e colaboradores (2006) demonstraram ainda, que a administração

I.C.V. de STZ reduz a atividade da acetiltransferase (ChAT) no hipocampo, fator que

acarreta em uma deficiência de transmissão colinérgica, a qual é determinante na

redução da memória dos animais.

3.3 Relação estresse oxidativo e a doença de Alzheimer

A relação entre estresse oxidativo e doenças neurodegenerativas tem sido

profundamente questionada e estudada nos últimos anos (JOVANOVIĆ, 2012).

Atualmente, devido ao aumento da expectativa de vida da população, existe um

crescente interesse no estudo de doenças neurodegenerativas como a DA. Uma

vertente destes estudos demonstram que o estresse oxidativo possui um papel

importante e pode até mesmo desencadear o processo de neurodegeneração.

(BARBOSA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2006). Ele tem sido avaliado como uma das

vias cruciais na patogênese de diversas doenças, incluindo desordens

neurodegenerativas, câncer e isquemia (LI; MA; LIU, 2007). Uma vez que, os

neurônios são particularmente susceptíveis a EROS, o estresse oxidativo é

31

apontado como uma das fontes das várias alterações patológicas que ocorrem na

DA (GLADE, 2010).

O estresse oxidativo é definido como a situação na qual a formação de

espécies reativas de oxigênio (EROS) excede significativamente a capacidade de

defesa antioxidante e de reparo do organismo, tendo como consequência o aumento

de danos a biomoléculas (DNA, lipídios, proteínas) (WANG et al., 2006).

Quando a taxa de entrada de elétrons na cadeia respiratória excede a

capacidade limite, podem ocorrer reações que sobrecarregam a capacidade de

extinção dos radicais livres, servindo de gatilho para uma produção exacerbada de

EROS (KING; SHARPLEU; HIRST, 2009). Diversos estudos demostram que déficits

de memória são consequência de desequilíbrios entre EROS e a capacidade

antioxidante disponível no cérebro. Sendo os neurônios extremamente suscetíveis a

EROS, o estresse oxidativo é apontado como uma das fontes das várias alterações

patológicas que ocorrem na DA, pois oxidam macromoléculas biológicas levando a

distúrbios homeostásicos que podem resultar na morte celular (ANNAHÁZI et al.,

2007). Além disso, o acúmulo de proteínas oxidadas no cérebro potencializa a

neurodegeneração e diminui as funções cognitivas (AMES, 2006; CORBETTA;

PATEL; SHULMAN, 2008; LI et al., 2007).

Considera-se que o SNC é mais susceptível as EROS devido a inúmeros

fatores. O principal fator é seu alto consumo de O2, sendo responsável por 20% do

consumo total de O2 corporal, apesar de seu peso corresponder a 2% do peso

corporal. Além disso, outros fatores contribuem para tornar o cérebro mais

vulnerável às reações de oxidação, tais como as altas concentrações de lipídeos

poli-insaturados, deficiência de mecanismos protetores antioxidantes, baixa atividade

de enzimas antioxidantes e sua localização nas células gliais fazem com que os

neurônios fiquem menos protegidos contra as espécies reativas geradas no cérebro

(FURIAN, 2009).

As EROS são necessárias pra o funcionamento normal do organismo e são

continuamente produzidas e neutralizadas pelo sistema de defesa antioxidante.

Entretanto quando as EROS são produzidas em altas concentrações, ou quando as

defesas antioxidantes são deficientes, elas podem causar prejuízo na função celular,

apoptose e necrose caracterizando o estresse oxidativo (FURIAN, 2009). Esse

desequilíbrio entre a produção celular de espécies reativas e as defesas

32

antioxidantes pode representar um mecanismo fundamental para o desenvolvimento

de algumas patologias, principalmente no SNC (ANSARI; SCHEFF, 2010).

Marcadores de estresse oxidativo são detectados em concentrações

aumentadas em tecidos de pacientes e em animais com modelo de DA, além de

apresentarem níveis alterados da expressão de enzimas antioxidantes

(RAMASSAMY, 2006).

Por este motivo, existem diversas linhas de pesquisa que buscam aumentar o

artesanal antioxidante a nível cerebral, visando uma longevidade cognitiva,

impedindo que patologias neurodegenerativas como a DA venham a afetar cérebros

mais susceptíveis, como é o caso dos idosos (GLADE, 2010).

Sendo assim, a descoberta de novas substâncias com ação antioxidante tem

despertado interesse na pesquisa para o tratamento de patologias relacionadas à

formação de radicais livres.

3.4 Flavonoides

A investigação dos flavonóides (fig. 03), compostos polifenólicos considerados

antioxidantes, para prevenção e tratamento de doenças neurodegenerativas tem

sido realizada de forma constante (KUMAR, KHANUM, 2012). Estes compostos são

encontrados em quase todos os alimentos vegetais e é uma das principais fontes de

compostos bioativos da dieta humana. Mais de 8.000 polifenóis são conhecidos e

mais de 2.000 são encontrados em plantas, pois são essenciais para a sua

pigmentação, crescimento, reprodução e resistência a patógenos (MARQUES,

2004).

Os flavonoides (descobertos pelo bioquímico Alberto Gyorgi) possuem

propriedades antioxidantes (ALVES et al., 2007) e antiinflamatórias (COUTINHO;

MUZITANO; COSTA, 2009), podendo atuar de diferentes formas para a contribuição

da integridade do tecido neuronal: inibindo a atividade de enzimas como a

monoamina-oxidase, que contribuem para a geração de radicais livres no cérebro e

no corpo (CORREIA DA SILVA; SOUZA; PINTO, 2013; DAVID; BARREIROS;

ANDRE; 2006).

A atividade antioxidante dos flavonoides é conhecida e estudada por diversos

grupos de pesquisa (AGATI et al., 2012). Esta atividade está relacionada à

33

quantidade de grupamentos hidroxila que os compostos possuem. Flavonoides com

3 a 6 hidroxilas possuem os efeitos mais evidenciados, sendo a posição C3

responsável pela potência da ação antioxidante (WANG et al., 2006). De modo geral,

quanto maior o número de hidroxilas, maior a atividade como agente doador de H e

elétrons. Flavonoides monoidroxilados apresentam atividade muito baixa, por

exemplo, a 5-hidroxiflavona tem atividade não-detectável. Entre os flavonoides

diidroxilados, destacam-se aqueles que possuem o sistema catecol (3’,4’-diidroxi) no

anel B. Os flavonoides com múltiplas hidroxilas como a quercetina, miricetina,

luteolina e morina possuem forte atividade antioxidante quando comparados ao α-

tocoferol, ácido ascórbico, β-caroteno (CORREIA DA SILVA, SOUZA, PINTO, 2013;

YANG et al., 2001).

Figura 03: Estrutura básica dos flavonoides e sistema de numeração.

O

A

B

C2

35

7

1'

3'

5'

Fonte: Trueba, 2003.

Diversos estudos (MARQUES, 2004; FURIAN, 2009; ANSARI; SCHEFF,

2010; WILLIAMS, SPENCER 2012) comprovam que os flavonoides têm

demonstrado efeitos promissores no tratamento de patologias neurodegenerativas,

como as doenças de Parkinson e Alzheimer. Vários trabalhos relatam que os

compostos polifenólicos podem proteger os neurônios de substâncias tóxicas,

exercendo efeitos benéficos às células devido ao seu potencial antioxidante, além da

modulação de diferentes vias como as cascatas de sinais intracelulares, processos

antiapoptóticos, ou, síntese e degradação dos peptídeos amilóides (RAMASSAMY,

2006; ZHONG et al.,2011). Indicam ainda, a capacidade dos flavonoides em facilitar

34

a modulação intracelular da cascata bioquímica das proteínas que, além de estar

envolvida no processo de formação da memória, são responsáveis pela

sobrevivência e morte neuronal durante o desenvolvimento e envelhecimento do

sistema nervoso central, bem como por doenças neurodegenerativas (VIEGAS et al.,

2004).

3.5 Do flavonoide em estudo: Morina

A morina (2’,3,4’,5,7-pentahidroxiflavona) (fig. 04) é um flavonoide encontrado

em várias espécies vegetais de uso medicinal ou não, como por exemplo na

Chlorophora tinctoria, Prunus dulcis Raphanus sativus L., Lepidium sativum L.,

Caylusea abyssinica além de outras espécies de plantas da família moraceae (XIE et

al., 2006; DE MARTINO et al., 2012; TAMIRU; ENGIDAWORK; ASRES, 2012).

Figura 04: Estrutura do flavonoide morina.

OOH

OH O

OHOH

OH

Fonte: Marques, 2004.

Este flavonoide tem sido amplamente estudado, pois parece ter efeito ativo no

metabolismo fisiológico e bioquímico tendo principalmente ação protetora no sistema

cardiovascular (MARQUES, 2004), antiinflamatória (WANG et al., 2006),

hipouricemica (MO et al., 2007), atividade antialérgica (KIM et al., 2009), inibição da

oxidação de LDL (LIAN et al., 2008), além do efeito antioxidante (ZHANG et al.,

2009). A morina (devido a sua estrutura molecular) apresenta um grande potencial

35

antioxidante por ser um composto com múltiplas hidroxilas, sobretudo na posição

C3, responsável pela potência da ação antioxidante. O composto também possui

efeito inibitório sobre a enzima β-secretase in vitro, impedindo a formação da

proteína β-amiloide, presentes na DA (SHIMMYO et al., 2008).

Uma vez que na DA, a sua terapêutica atual é paliativa e limitada, e os agentes

anticolinesterásicos (única linha de tratamento) promoverem efeitos colaterais

significativos, muitas são as apostas em moléculas para futuros medicamentos anti-

DA. Os flavonoides por sua vez, exercem uma série de propriedades, principalmente

a atividade antioxidante, uma característica que os fazem alvos de pesquisa para a

busca de um composto com mais efetividade ou de melhor adaptação ao paciente

dos que já existentes no mercado.

36

37

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Materiais

4.1.1 Reagentes

Para os ensaios bioquímicos foram necessários os seguintes reagentes:

Ácido tiobarbitúrico 0,67%

Água destilada

Agua Mili-Q

Azida sódica 100mM

Azul de Comassie G

BHT

EDTA 5mM e 1.5mM

Epinefrina 60mM

Glutationa oxidada

Glutationa peroxidase

Glutationa redutase

Glutationa reduzida

Inibidor de protease 1%

Morina (SIGMA, USA)

NADPH 0,15 mM

Peróxido de hidrogênio 30mM

Tampão fosfato de potássio monobásico 50mM e 150mM, pH 7,0

Tampão glicina 50mM

4.1.2 Equipamentos

Utilizou-se nos ensaios bioquímicos os seguintes equipamentos:

Alicate bico chato n. 6

Balança analítica (Bioprecisa®)

Bisturi

38

Centrífuga (CENTRIFUGER® 5418R)

Espátulas

Espectrofotômetro (SHIMADZU®- UV/Vis 1620)

Guilhotina (INSIGHT ®)

Homogeinizador de tecidos tipo potter (MARCONI-5421)

Micropipetas (TRAUSFEIPETTE®)

pHmetro (MARCONI ®)

Sonicador (BRONSON®)

Material cirúrgico

4.2 Animais

Para os ensaios foram utilizados camundongos fêmeos obtidos no Biotério

Central da UNIVALI, os quais foram mantidos a 22-27C com livre acesso a água e

comida, em ciclo claro/escuro 12/12 horas. Os ensaios foram realizados segundo os

princípios éticos de Boas Normas de Experimentação, após o projeto ser analisado e

aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa (CEP) da instituição com o parecer

339/09. Foram utilizados os cérebros de animais normais e com DA induzida por

STZ, oriundos de experimentos comportamentais e de memória.

4.3 Ensaios bioquímicos: “Testes in vitro”

4.3.1 Preparo dos animais para os testes “in vitro”

No primeiro momento, foram feitos dois experimentos in vivo. Animais

normais (sem indução de DA) e animais com DA induzida, foram separados em

grupos distintos (n=10). O primeiro grupo, os animais normais, foi tratado com

morina (nas doses de 25, 50 e 100mg/kg) e veículo de forma aguda, v.o, sendo

posteriormente submetidos aos ensaios comportamentais e de memória.

39

As doses foram escolhidas de acordo com ensaios farmacológicos realizados

com o composto avaliando a atividade antinociceptiva e com dados da literatura

(HOLZEMANN , 2012- dados não publicados).

O segundo experimento foi realizado com animais com DA induzida pela

administração I.C.V da STZ em doses subdiabetogênicas (duas infusões de

2,5mg/ml - 2µl em um intervalo de 48h). Os grupos (n=10) receberam uma solução

de morina por v.o (uma vez ao dia) nas doses de 25, 50 e 100mg/kg por vinte e um

dias e veículo (salina). Após a indução da DA e a realização dos ensaios

farmacológicos comportamentais que foram conduzidos pelas acadêmicas Stefany

Andrade Serrão e Carla Jane Weber, os animais foram sacrificados e os tecidos

cerebrais foram imediatamente estocados a -20 C para uso posterior (LU et al.,

2007).

4.3.2 Preparo das amostras de tecido cerebral

Para os estudos bioquímicos, animais foram sacrificados por decapitação,

utilizando guilhotina. Os cérebros foram dissecados e perfundidos com tampão

fosfato de potássio 50mM (pH 7,0) em baixa temperatura. Os cérebros foram

homogeneizados em tampão fosfato de potássio 50mM (pH 7,0) contendo uma

mistura de inibidor de protease a 1%, utilizando-se um homogenizador de tecidos do

tipo Potter em 1200rpm. Após, os homogenatos foram submetidos a sonicagem em

4 tempos de 30 segundos com intervalos de 30 segundos utilizando sonicador

Bronson (em banho de gelo). As amostras dos tecidos cerebrais foram aliquotadas

em eppendorfs e centrifugadas à 12.000g por 10min em temperatura de 4ºC. O

sobrenadante foi coletado e estocado em temperatura de -20C para determinação

da atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) catalase (CAT), glutationa

peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) além do malondialdeído (MDA) e

proteínas totais (LU et al., 2007).

40

4.3.3 Medida de sistemas e produtos oxidativos

4.3.3.1 Determinação da atividade da Superóxido Dismutase (SOD)

A atividade da SOD foi medida de acordo com o método proposto por McCord

e Fridowich (1969). Em uma cubeta foi pipetado 1mL de tampão glicina com 40µL de

amostra e zerado o equipamento. Em seguida foi adicionado 17µL de epinefrina e

sua absorbância foi lida em espectrofotômetro em um comprimento de onda de

480nm. A atividade da SOD foi calculada usando o coeficiente de extinção molar de

40mM-1cm-1 (MCCORD; FRIDOWICG, 1969 apud LU et al., 2007)

4.3.3.2 Determinação da atividade da Catalase (CAT)

A atividade da CAT foi verificada através do método de Aebi (1984). O meio

de reação consistiu em 0,65 mL de tampão fosfato (50 mM, pH 7,0) e 50L de

amostra. A reação foi iniciada pela adição de 0,3mL peróxido de hidrogênio 30mM. A

decomposição de peróxido de hidrogênio foi monitorada em espectrofotômetro em

um comprimento de onda de 240nm a 25ºC. A atividade da CAT foi calculada

usando o coeficiente de extinção molar de 0,04mM-1cm-1 (AEBI, 1984 apud LU et al.,

2007).

4.3.3.3 Determinação da atividade da Glutationa Redutase (GR)

A atividade da GR foi realizada através do método de Misono e Ohta (1986),

modificado por Lu e colaboradores (2007) onde se verifica a diminuição na

absorbância em 340nm do NADPH. Em uma cubeta foi pipetado 750L do sistema

(tampão fosfato de potássio monobásico 150mM pH 7,0, EDTA 1,5mM e NADPH

0,15mM), 100L de água destilada com 50L de amostra e lido em

espectrofotômetro durante 2 minutos em um comprimento de onda de 340nm.

Obtendo dessa forma o D1. Na mesma cubeta foi adicionado 50L do substrato

(glutationa oxidada 20mM) e lido durante 2 minutos em 340nm. Obtendo-se assim o

41

D2. A atividade da GR foi calculada (D2-D1=D) onde o valor de D foi utilizado no

cálculo em que o coeficiente de extinção molar utilizado foi 0,04mM-1cm-1 (MISONO;

OHTA, 1986 apud LU et al., 2007).

4.3.3.4 Determinação da atividade da Glutationa Peroxidase (GPx)

A atividade da GPx foi determinada pelo método de Paglia e Valentine (1967).

A azida sódica foi usada como substrato. O ensaio da redução enzimática do

peróxido de hidrogênio por GPx consiste no consumo da glutationa reduzida (GSH)

em que é restaurada para glutationa oxidada GSSG em uma reação enzimática

acoplada por GR. GR reduz GSSG para GSH usando NADPH como agente redutor.

A diminuição da absorbância em 340nm é devido ao consumo de NADPH. A

atividade da GPx foi calculada usando o coeficiente de extinção molar de 6.22mM-

1cm-1. Uma unidade de GPX foi definida como a quantidade de enzima que catalisou

a oxidação de 1.0 M de NADPH para NADP+ por minuto a 25ºC (PAGLIA;

VALENTINE, 1967 apud LU et al., 2007).

4.3.3.5 Determinação dos níveis de Malondialdeído (MDA)

A concentração de MDA foi determinada pelo método de Uchiyama e Mihara

(1978) conforme descrito por Lu et al., (2007). 1000L de amostra foram misturados

com 300L de ácido tiobarbitúrico (0,67%) seguido pela adição de 4L de BHT (di-

terc-butil metil fenol). A mistura foi incubada em banho-maria a 95ºC durante 15

minutos e em seguida colocadas em banho de gelo por 5 minutos. Após, as

amostras foram passadas para eppendorfs e centrifugadas a 1000g por 10 minutos.

A absorção do complexo colorido foi lida em 530nm (UCHIYAMA; MIHARA, 1978

apud LU et al., 2007;).

42

4.3.3.6 Determinação de proteínas (Método de Bradford)

A quantificação de proteínas totais em homogeneizado de cérebros de

camundongos foi determinada utilizando-se o método de Bradford (1976). A partir da

diluição das amostras (1:15) foi preparado sistema (50L de amostra diluída, 950L

de água destilada e 2,5mL de azul de comassie G). Foi deixado o sistema em

repouso durante 10 minutos. Na sequência foi lido em espectrofotômetro em um

comprimento de onda de 595nm. O branco foi realizado com 1000L de água

destilada e 2,5mL do azul de comassie G (BRADFORD, 1976).

O resultado deste método, de quantificação de proteínas totais, é utilizado

apenas no cálculo para obtenção dos resultados numéricos das atividades

enzimáticas, não sendo desta forma, reportado como um resultado isolado.

43

5 RESULTADOS

5.1 Medidas de sistemas e produtos oxidativos

5.1.1 Tratamento agudo com o flavonoide morina em animais normais

5.1.1.1 Efeito da morina sobre a atividade da enzima superóxido dismutase

(SOD)

A atividade da SOD está representada na Figura 05 e os resultados nos

permitem verificar que o tratamento com a morina na dose de 100mg/Kg foi capaz

de aumentar de modo significativo a sua ação enzimática. O aumento observado foi

de 166,11% em relação ao grupo controle.

Apesar de as doses de 25 e 50mg/kg terem induzido um aumento expressivo

de 57,95% e 128,52% respectivamente, as análises estatísticas mostraram que não

houve diferença em relação ao grupo controle.

Figura 05: Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima SOD presente no tecido cerebral dos camundongos normais .

C 25 50 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6**Controle

Morina

Tratamento (mg/kg)

SO

D

( M

O2

-./h

/mg

pro

teín

a)

Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.

44

5.1.1.2 Efeito da morina sobre a atividade da enzima glutationa redutase (GR)

A figura 06 demonstra que o tratamento agudo com a morina (em nenhuma

das doses utilizadas) não foi capaz de modificar a atividade da enzima GR em tecido

cerebral de animais normais quando comparado com o controle.

Figura 06: Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o.) sobre a enzima GR presente no tecido cerebral dos camundongos normais.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Controle Morina

Tratamentos (mg/kg)

C 25 50 100

GR

( m

ol

NA

DP

H/

h/m

g p

rote

ína)

Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.

5.1.1.3 Efeito da morina sobre a atividade da enzima glutationa peroxidase

(GPx)

Um perfil farmacológico semelhante ao anterior foi obtido com relação à

atividade da GPx (fig. 07). O tratamento agudo com a morina (em nenhuma das

doses utilizadas) modificou a atividade da enzima, uma vez que os valores de

atividade enzimática encontraram-se significativamente equivalentes aos animais

controles.

45

Figura 07: Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a enzima GPx presente no tecido cerebral dos camundongos normais.

Controle 25 50 1000

10

20

30

40 Veículo Morina

Tratamento (mg/kg, v.o.)

GP

x

(U/m

gN

AD

+p

rote

ína)

Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.

5.1.1.4 Efeito da morina sobre a atividade da enzima catalase (CAT)

A figura 08 demonstra que o tratamento agudo com a morina promoveu uma

diminuição significativa da atividade da CAT. Esta redução foi de 40,76% para a

dose de 25mg/kg em relação ao grupo controle. Para a dose de 50mg/kg a redução

foi de 33,53% e para dose de 100mg/kg a atividade foi reduzida em 29,02%.

46

Figura 08: Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a enzima CAT presente em tecido cerebral de camundongos normais.

Controle 25 50 1000

250

500 Veículo Morina

* ** **

Tratamento (mg/kg, v.o.)

Cata

lase

(um

olH

20

2/h

/mg

pro

teín

a)

Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05), ** (p<0,01). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.

5.1.1.5 Efeito da morina sobre os níveis de Malondealdeido (MDA)

Na figura 09 é possível observar que os normais que receberam a morina v.o

houve uma diminuição significativa dos níveis de peroxidação em 23,46% e 32,77%

respectivamente, o que indica que a morina nas doses administradas (50 e

100mg/kg) foi capaz de reduzir o grau de peroxidação lipídica, sendo efetiva na

proteção do tecido cerebral em relação ao grupo controle.

47

Figura 09: Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre os níveis de TBARS em tecido cerebral de camundongos normais.

Controle 25 50 1000.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Veículo Morina

* ** **

**

Tratamento (mg/kg, v.o.)

TB

AR

S (

um

ol)

Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.

5.1.2 Tratamento subcrônico com o flavonoide morina em animais DA induzida

por estreptozotocina

5.1.2.1 Efeito da morina sobre a atividade da enzima superóxido dismutase

(SOD)

A figura 10 demonstra que o tratamento subcrônico dos animais com a morina

aumentou a atividade da SOD. Verifica-se que esse efeito foi obtido em todas as

doses utilizadas no tratamento. É possível verificar que das doses de 25, 50 e

100mg/Kg houve um aumento na atividade da enzima de 30%, 60% e 90%

respectivamente quando comparados com os animais controle, tratados apenas com

salina.

48

Figura 10: Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima SOD presente em tecido cerebral dos camundongos DA induzida por STZ.

Controle 25 50 1000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

******

***

Tratamento (mg/kg, v.o.)

SO

D

µM

ol O

2-

/ h

/mg

pro

teín

a

Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.

5.1.2.2 Efeito da morina sobre a atividade da enzima glutationa redutase (GR)

A atividade da GR está representada na figura 11, onde é possível verificar

que o tratamento com a morina nos animais DA induzida por STZ promoveu

aumento da atividade da enzima de modo bastante pronunciado.

Os animais que receberam tratamento com o flavonoide administrado nas

doses de 50 e 100mg/Kg tiveram aumento significativo ação da enzima GR em 3,6%

e 24,7% respectivamente.

49

Figura 11: Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima GR presente em cerebral dos camundongos DA induzida por STZ.

Controle 25 50 1000

6

12

Veiculo Morina

**

***

Tratamento (mg/kg, v.o.)

GR µ

Mo

l N

AD

PH

/ h

/m

g p

rote

ína

Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01), *** (p<0,001). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.

5.1.2.3 Efeito da morina sobre a atividade da enzima glutationa peroxidase

(GPx)

Com relação aos efeitos da morina sobre a GPx, observou-se que o

tratamento subcrônico com a morina em animais com DA induzida por STZ também

promoveu aumento estatístico da atividade da enzima nas doses de 50 e 100mg/Kg

podendo ser observado na figura 12. As percentagens de aumento da atividade

enzimática foram calculadas em 28,91% e 34,63%.

50

Figura 12: Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima GPx presente em tecido cerebral dos camundongos DA induzida por STZ.

Controle 25 50 1000

10

20

30

40 Veiculo Morina

*** ***

Tratamento (mg/kg, v.o.)

GP

x

µM

ol N

AD

+/

h

/m

g p

rote

ína

Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.

5.1.2.4 Efeito da morina sobre a atividade da enzima catalase (CAT)

Analisando o efeito do composto em estudo sobre a atividade da enzima CAT

(fig. 13), observou-se que o tratamento crônico com a morina promoveu uma

diminuição da atividade da enzima nas doses de 25, 50 e 100mg/kg, com

percentagens de atividade calculadas em 15,55%, 34,22% e 46,56%

respectivamente.

51

Figura 13: Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima CAT presente em tecido cerebral dos camundongos DA induzida por STZ.

Controle 25 50 1000

200

400

600

800

Veiculo Morina

***

******

Tratamento (mg/kg, v.o.)

CA

T µ

Mo

l H

2O

2 /

h

/mg

pro

teín

a

Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.

5.1.2.5 Efeito da morina sobre os níveis de Malondealdeido (MDA)

Finalmente ao analisarmos o efeito do tratamento subcrônico da morina sobre

os níveis de peroxidação lipídica no cérebro dos animais com DA induzida por STZ

(fig. 18), verificou-se e que nas três doses testadas (25, 50 e 100mg/kg) houve uma

diminuição significativa dos níveis de peroxidação lipídica com percentagens de em

17,33%, 53,71% e 69, 85% respectivamente em relação ao grupo controle.

52

Figura 14: Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre os níveis de TBARS em tecido cerebral de camundongos DA induzida por STZ.

Controle 25 50 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Veiculo Morina

***

***

***

Tratamento (mg/kg, v.o.)

TE

BA

RS

Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.

53

5 DISCUSSÃO

Os Produtos naturais estão ganhando popularidade como potenciais agentes

terapêutico, e, as plantas como representantes desse grupo, vem sendo testadas

para diferentes atividades biológicas, segundo dados etnofarmacológicos (YANG et

al., 2012). Os compostos fenólicos, resultantes do metabolismo secundário das

plantas têm sido apontados como eliminadores de radicais livres, agentes redutores,

e supressores da formação de oxigénio-singuleto (CORREIA DA SILVA, SOUZA,

PINTO, 2013). Fenóis e flavonóides são os principais componentes fitoquímico que

contribuem para a atividade antioxidante de plantas. Estes compostos são altamente

eficazes como sequestradores de radicais livres e parecem exercer menos efeitos

adversos em comparação com antioxidantes sintéticos (AGATI et al., 2012). Como

reportado anteriormente, a presença do grupo OH livre dos compostos fenólicos é

responsável principalmente pela atividade antioxidante dos mesmos (YANG et al.,

2001).

A morina (2’,3,4’,5,7-pentahidroxiflavona), é um composto fenólico com

atividade biológica antioxidante já comprovada em ensaios in vitro (ZHANG et al.,

2009). Estudos anteriores realizados em nossos laboratórios demonstraram que o

composto exerce significativos efeitos sobre a memória de animais normais e com

DA induzida por diferentes mecanismos (SERRÃO et al., 2011). Além disso,

estudos desenvolvidos em nossos laboratórios demonstraram que o composto

exerce pronunciado efeito antinociceptivo em modelos de dor aguda e inflamatória

(GONÇALVES, 2011- dados não publicados). Somam-se também como

propriedades farmacológica desse composto, a atividade antiinflamatória (CHEN et

al., 2012; LIU; LIN; 2013), cardioprotetora (POGULA et al., 2012), hepatoprotetora

(SHANKARI et al., 2010) dentre outras. Com relação a efeitos centrais da morina e

um possível efeito neuroprotetor em processos neurodegenerativos, foi verificado

recentemente, que o composto inibe a fosforilação da proteína TAU (GONG et al.,

2011) e tem efeito antiamiloidogenico (ONO et al., 2012), sendo então uma

molécula interessante com potencial anti-Alzheimer. Além disso, Zhang e

colaboradores (2010) verificaram que o composto exerce efeito neuroprotetor em

modelos in vivo e in vitro da doença de Parkinson. Considerando os resultados

nootrópicos do composto e seus efeitos como antiinflamatório e antioxidante em

54

tecidos periféricos, o presente estudo, investigou os efeitos antioxidantes do

composto em tecido cerebral de animais com DA induzida quimicamente (POGULA

et al., 2012),

Como relatado anteriormente, a DA é atualmente a desordem

neurodegenerativa com maior numero de casos diagnosticados no mundo (RAFII;

AUSEN, 2009). Considerando que a DA apresenta disfunções oxidativas importantes

já relatadas na literatura (AGOSTINHO; CUNHA; OLIVEIRA, 2010), foi escolhido o

modelo da STZ, o qual possibilita a indução de dano oxidativo nos animais, para a

avaliação da atividade da morina, Esse modelo tem sido bem aceito pela

comunidade científica devido à mimetização de vários aspectos patológicos da DA,

como, progressiva deterioração da memória, redução do metabolismo da glicose e

energia cerebral, indução de estresse oxidativo e promoção de disfunção colinérgica

(AWASTHI, 2010; PINTON et al., 2010). A diminuição da utilização cerebral da

glicose, e, os déficits no metabolismo energético representam anormalidades

encontradas em estágios iniciais de deficiência cognitiva, como é apontado em

diversos casos de DA (JEE et al., 2008).

No estudo realizado anteriormente por Serrão e colaboradores (2011), a

indução de DA foi realizada com a STZ, causando nos animais um visível déficit de

memória no teste da esquiva inibitória. Entretanto, o déficit cognitivo causado pela

infusão I.C.V de STZ foi revertido pela administração da Morina, sendo o efeito da

dose máxima do composto utilizada durante os experimentos (100 mg/kg), superior

ao fármaco de referência Galantamina.

No presente estudo foi verificada a hipótese de que a melhora no

desempenho dos animais nos testes de memória referenciados por Serrão e

colaboradores (2011), pode ter relação com um aumento nas defesas antioxidantes

do organismo dos mesmos submetidos ao tratamento com a morina. Para

verificação dessa hipótese, realizou-se a mensuração da atividade das enzimas

antioxidantes SOD, CAT, GPx e GR no tecido cerebral desses animais. Além da

verificação do nível de peroxidação lipídica através do teste do malondialdeído

(MDA).

Em processos oxidativos, a SOD é uma enzima que catalisa a dismutação do

superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio. Assim sendo, constitui uma

importante defesa antioxidante em quase todas as células do organismo expostas

ao oxigênio. A função da SOD é impedir reações prejudiciais do superóxido aos

55

tecidos do organismo. O superóxido, formado quando o oxigênio é reduzido por um

elétron e é uma das principais espécies reativas de oxigênio, pois tem a capacidade

de reagir com alvos celulares sensíveis e críticos (TORSDOTTIR et al., 2010). Além

disso, o peróxido de hidrogênio formado pela ação da SOD é uma espécie oxidativa

altamente nociva para o organismo. Nossos resultados demonstraram que a Morina

produziu aumento da atividade da SOD tanto em animais normais quanto em

animais com DA induzida, sugerindo que o composto exibe capacidade de impedir a

formação de superóxido de hidrogênio e suas ações deletérias sobre o tecido

nervoso.

Outra enzima deste sistema, a CAT, é responsável pela conversão do

peróxido de hidrogênio em produtos menos reativos para o organismo. A CAT

rapidamente catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio

(VLASITS et al., 2010). Entretanto, a ineficiência na degradação deste composto,

provoca a criação de outros radicais livres.

O peróxido de hidrogênio tem a capacidade de produzir um radical livre

extremamente poderoso e tóxico através da reação de Fenton. Ao reagir-se peróxido

de hidrogênio com o íon Ferro (Fe2+) ocorre a produção do radical livre hidroxila

(OH•), o qual tem uma alta capacidade oxidativa e não possui sistema enzimático

para sua eliminação (MORIWAKI; OSBORNE; PHILLIP, 2008). Em nosso estudo, ao

contrário do esperado, o tratamento dos animais normais e com DA induzida com a

morina, produziu diminuição da atividade da CAT de forma dose-dependente. Num

primeiro momento, pensou-se em erro experimental. Entretanto a hipótese foi

descartada, uma vez que os grupos experimentais são bastante homogêneos e o

procedimento foi repetido com outros tratamentos havendo semelhança de

resultados no sentido de diminuição da atividade enzimática. Resultados

semelhantes foram obtidos por Justino e colaboradores (2010) avaliando os efeitos

da quercetina sobre o sistema de oxidação em cérebro de animais com DA induzida

pela D-galactose. Os autores sugerem que a conversão do peróxido de hidrogênio

em produtos menos reativos para o organismo deve ter ocorrido por vias alternativas

as quais ainda são desconhecidas.

A eliminação de todo o peróxido de hidrogênio formado durante o estresse

oxidativo é extremamente importante. Para isso, existe outro sistema enzimático que

constitui defesa antioxidante em nosso organismo. Este sistema é constituído pelas

enzimas GPx e GR. A GPx utiliza a glutationa reduzida, que deve ser oxidada para o

56

reduzir o peróxido de hidrogênio. A GR tem por objetivo final a restauração da

glutationa reduzida com auxílio do NADPH, fornecendo este produto para o

funcionamento da GPx (SHANMUGAM et al., 2011). Com relação a esses sistema,

foi observado em nossos experimentos que a morina não foi capaz de promover o

aumento da atividade tanto da GPx quanto da GR em animais normais, porém esse

efeito foi observado de forma dose-dependente em animais com DA induzida por

STZ, sugerindo que o estresse oxidativo provocado pela STZ, pode ser revertido

após o tratamento com o composto.

Outro fator mensurável relacionado a danos oxidativos pode ser investigado

analisando-se o grau de oxidação de lipídios. Este processo, denominado

peroxidação lipídica, ocorre quando radicais livres retiram elétrons dos lipídios das

membranas celulares, desestabilizando-as. A avaliação deste processo pode ser

realizada através da quantificação do produto final desta peroxidação, o MDA. Esta

determinação ocorre através da quantificação de MDA que reage com o ácido

tiobarbitúrico (TBARS). Quanto maior a concentração de TBARS, maior o grau de

destruição de membranas (CATALÁ, 2006). No presente estudo, o tratamento dos

animais normais com o composto produziu diminuição da concentração de TBARS

de forma significativa. Entretanto, um efeito muito mais significativo e dose-

dependente foi observado em animais com DA induzida por STZ, sugerindo o efeitos

preventivo do composto com relação a diminuição da peroxidação lipídica.

A administração da STZ nos animais causou alterações na capacidade

cognitiva e antioxidante como avaliado nos resultados atuais e nos resultados de

Costa e colaboradores (2010). Os danos oxidativos neuronais, em animais com DA

induzida por STZ, são consistentes com trabalhos anteriores que utilizaram a mesma

metodologia (ISHRAT et al., 2009a; ISHRAT et al., 2009b; TAHIROVIC et al., 2007).

Ishrat e colaboradores (2009a) realizaram tratamento com Selênio, em

animais que apresentavam DA induzida por STZ, e, verificaram uma melhora na

memória dos mesmos, além de um aumento na atividade antioxidante. Ishrat e

colaboradores (2009 b), também investigaram a ação da Curcumina sobre os déficits

de memoria induzidas pela DA, e, ressaltaram que o mecanismo de ação deste

composto estaria relacionado com sua capacidade de inibir o estresse oxidativo.

Hong e colaboradores (2004) avaliaram a atividade do tocoferol em animais

com DA induzida por STZ, demonstrando que o composto promove um aumento na

atividade das enzimas antioxidantes SOD e GPx nesses animais.

57

Os resultados deste estudo condizem com aqueles reportados por Awasthi e

colaboradores (2010) e Tota e colaboradores (2010), os quais respectivamente

investigaram a ação neuroprotetora da curcumina e quercetina. Esses e outros

autores enfatizam a capacidade antioxidante dos flavonoides, como o principal fator

de neuroproteção. Ambos os grupos avaliaram o efeito desses flavonoides

utilizando o mesmo modelo de indução de DA, por nós utilizado. Nestes estudos,

animais tratados com tais compostos, tiveram efeito antioxidante aumentando devido

ao aumento da expressão da atividade das enzimas pertencentes ao sistema de

oxidação, bem como, tiveram uma redução no nível de TBARS da mesma forma que

os animais tratados com a morina, demonstrando a proteção que estes compostos

realizam sobre o SNC. Além disso, em todos os trabalhos onde foi verificado o efeito

neuroprotetor, os compostos produziram também efeito nootrópico revertendo os

déficits cognitivos oriundos dos agentes causadores da DA nos animais. De uma

forma geral, nossos resultados corroboram com os demais da literatura no que tange

ao potencial dos flavonoides como agentes com potencial terapêutico em processo

neurodegenerativos, tanto centrais como periféricos.

58

59

6 CONCLUSÃO

Os resultados obtidos permitem sugerir que a morina possui atividade

protetora contra o estresse oxidativo gerado em tecido cerebral, principalmente no

cérebro de animais com DA induzida pela STZ;

Os resultados indicam que a morina aparenta exibir efeito indutor positivo

sobre as enzimas de defesa antioxidantes testadas em animas normais e DA

induzida pela STZ, principalmente sobre a SOD;

Os resultados sugerem ser esse um dos mecanismos pelos quais a

morina reverteu o déficit cognitivo observado nesses animais quando avaliados no

teste da esquiva inibitória.

Os animais tratados com a morina v.o, tanto os normais quanto os com

DA induzida, apresentaram diminuição do valor de TBARS, o que sugere um efeito

protetor devido à redução do nível de lipoperoxidação.

Outros experimentos são necessários para investigar os mecanismos pelos

quais a morina promove o efeito protetor do SNC, a fim de apontá-lo como suposto

candidato ao tratamento alternativo da doença em questão.

60

61

REFERÊNCIAS

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ANEXO A – Parecer comitê de ética