SENYAWA FLAVONOID

OLEH

Burhanuddin Taebe

SENYAWA FENOLIK ALAMSENYAWA FENOLIK ALAM

POLIKETIDAFENILPROPANOID

FLAVONOIDFLAVONOIDI. PENDAHULUANI. PENDAHULUAN

Senyawa fenol alamSenyawa fenol alam

2% Karbon tumbuhan diubah jadi flavo-2% Karbon tumbuhan diubah jadi flavo-noid atau 1 milyar ton pertahunnoid atau 1 milyar ton pertahun

Warna bunga dan buah, flavin (kuning, Warna bunga dan buah, flavin (kuning, jingga), antosian (merah, biru, ungu)jingga), antosian (merah, biru, ungu)

Tumbuhan: pigmen, pertumbuhan, perta-Tumbuhan: pigmen, pertumbuhan, perta-hanan, tabir surya, berkomunikasi hanan, tabir surya, berkomunikasi

Manusia : antioksidan, antiinflamasi, Manusia : antioksidan, antiinflamasi, immunostimulan, antikanker, antivirus immunostimulan, antikanker, antivirus dan antimikroba. dan antimikroba.

Kerangka dasarKerangka dasar

Kerangka dasar 15 atom C, dua cincin Kerangka dasar 15 atom C, dua cincin benzen, terikat pada rantai propana, benzen, terikat pada rantai propana, susunan Csusunan C66–C–C33–C–C66 susunan yaitu : 1,3– susunan yaitu : 1,3–diarilpropana (diarilpropana (flavonoidflavonoid) 1,2–diarilpro-) 1,2–diarilpro-pana (pana (isoflavonoidisoflavonoid) dan 1,1 – diarilpro-) dan 1,1 – diarilpro-pana (pana (neoflavonoidneoflavonoid))

C1

C2

C3 C1

C2

C3

C1

C2

C3

FLAVONOID ISOFLAVONOID NEOFLAVONOID

contohO

O

O

O

OH

OHHO

OH

O

OOCH3

O

FLAVON KUERSETIN KRANJIN

1. Flavonoid

O

OOH

HO

HO OCH3

O

OH

H3CO

OO

CH2

O

O

O

OO

OCH3

OCH3

FEREIRIN

PTEROKARPIN ROTENON

2. Isoflavonoid

O

HO

H3CO O O O

OH

OH3CO O

O

O

DALBERGIN BRAZILIN KALOFILOID

3. Neoflavonoid

Cincin benzen dihubungkan satuan tiga karbon dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga. Untuk memudahkan maka cincin pertama benzen diberi indeks A, cincin benzen kedua indeks B dan cincin yang dapat terbentuk cincin C

O

O

A

B

C

12

3

4105

6

7

89

1'

2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

A

B

6'

5'

4'

3' 2'

2

3

4

5HO

OH

1

6

Asal usul Biogenetik

Awal, Robinson (1936): kerangka C6 – C3 – C6 dari kerangka C6 – C3 fenilpropana mempunyai gugus fungsi oksigen pada para, para dan meta atau dua meta dan satu para pada cincin aromatik. Senyawa fenilpropana, seperti asam amino fenilalanin dan tirosin, bukan menurunkan flavonoid, hanya bertalian.

Dilanjutkan Birch: tahap pertama biosintesis flavonoid, dari unit C6 – C3 berkombinasi dengan 3 unit C2 menghasilkan unit C6 – C3 – (C2+C2+C2), maka biosintesis dari flavonoid melalui 2 jalur bisosintesis yaitu poliketida (asam asetat atau mevalonat) membentuk cincin A dari kondensasi 3 molekul unit asetat, sedang cincin B dan tiga atom karbon dari rantai propana berasal dari jalur fenilpropana (shikimat).

OH

O

HO

OH

O

O

HO

OH

FLAVANON KHALKON

Pokok-pokok Biosintesis Flavonoid

Hubungan Biogenetik Berbagai jenis Flavonoid (Grisebach)

O

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

O

O

OH

OH

HO

O

O

H

[O]

O

OH

OH

HO

O

OH

O a

OH

OH

HO

O

H

+OH-

H

b

a

+

Flavanon Khalkon

Flavanonol

O

OH

OH

HO

O

O

OH

OH

HO

O

OH

OH

HO

a-H+

-H+H

[O]

b

Flavon Auron Flavonol

O

OH

HO

O

H

H

O

O

OH

HO

OOH

Isoflavon

Katekin Antosianidin

O

O

CH OH

Biosintesis Antosianidin dan Katekin (Haslam)Biosintesis Antosianidin dan Katekin (Haslam)

O

OOH

HO

OH

OH

OHO

OHOH

HO

O

OH

OH

O

OH

O

O

OH

OH

O

OH

O

O

OH

OH

H+

O

OH

OH

OH

OH

Flavanonol-H2O

H+

OO

OH

OH

OH

H+

+

HO

H+H+

OHO

OH

O

OH

H+

OH

OHO

OH

OH

OH

OH

+OHO

OH

OH

OH

OH

Katekin Antosianidin

2[H]

Fungsi flavonoid pada tumbuhanFungsi flavonoid pada tumbuhan

Fungsi penyerbukan: Fungsi penyerbukan: pigmen tumbuhan, pigmen tumbuhan, warna jingga, merah, biru dan ungu pada warna jingga, merah, biru dan ungu pada bunga dan buah, faktor penarik lebah, kupu-bunga dan buah, faktor penarik lebah, kupu-kupu, burung dan hewan lainnya, terjadi kupu, burung dan hewan lainnya, terjadi penyerbukan. Burung suka merah, lebah biru.penyerbukan. Burung suka merah, lebah biru.

Fungsi pengatur tumbuh.Fungsi pengatur tumbuh. tidak langsung tidak langsung sebagai zat pengatur tumbuh melalui sistem sebagai zat pengatur tumbuh melalui sistem IAAIAA (Indole Acetic Acid) – (Indole Acetic Acid) – IAA Oxidase. IAA Oxidase. Secara Secara in vitro,in vitro, flavonoid (kuersetin ) dapat flavonoid (kuersetin ) dapat menghambat enzim IAA – Oxidase, berarti menghambat enzim IAA – Oxidase, berarti kuersetin secara tidak langsung meningkatkan kuersetin secara tidak langsung meningkatkan pertumbuhan. pertumbuhan.

Sebagai Sebagai ””feeding deterrentfeeding deterrent”” maupun maupun ”feeding stimulant””feeding stimulant”. Kadar tanin yang . Kadar tanin yang tinggi pada buah muda merupakan tinggi pada buah muda merupakan ””feeding deterrentfeeding deterrent”” kera maupun kera maupun manusia tidak bernafsu untuk memakan manusia tidak bernafsu untuk memakan sebelum masak. Senyawa morin dan sebelum masak. Senyawa morin dan isokuersetrin dalam daun murbei (isokuersetrin dalam daun murbei (Morus Morus alba alba L), merupakan L), merupakan ”feeding ”feeding stimulant”stimulant” bagi ulat sutera ( bagi ulat sutera (Bombyx Bombyx mori)mori)..

Zat alelopatiZat alelopati. . Untuk berinteraksi dengan Untuk berinteraksi dengan lingkungan, tumbuhan menggunakan sinyal lingkungan, tumbuhan menggunakan sinyal berupa senyawa kimia.Pada tahun 1986, secara berupa senyawa kimia.Pada tahun 1986, secara hampir bersamaan, para ahli dari berbagai hampir bersamaan, para ahli dari berbagai laboratorium di dunia melaporkan bahwa laboratorium di dunia melaporkan bahwa simbiosis antara tumbuhan polong-polongan simbiosis antara tumbuhan polong-polongan dengan bakteri marga dengan bakteri marga RhizobiumRhizobium dipicu oleh dipicu oleh sinyal kimia berupa senyawa flavonoid dari sinyal kimia berupa senyawa flavonoid dari akar tumbuhan. Sejak tahun 1982, ahli ekologi akar tumbuhan. Sejak tahun 1982, ahli ekologi mengetahui tumbuhan “mengetahui tumbuhan “Spotted knapweeds”Spotted knapweeds” ((Centaurea maculosa Centaurea maculosa Lam.) mengeluarkan Lam.) mengeluarkan senyawa alelopati yang menghambat senyawa alelopati yang menghambat pertumbuhan tumbuhan lain di sekitarnya, pertumbuhan tumbuhan lain di sekitarnya, tahun 2001 diketahui adalah (-) – katekin tahun 2001 diketahui adalah (-) – katekin (golongan flavan), sekarang diteliti untuk (golongan flavan), sekarang diteliti untuk herbisida alam.herbisida alam.

Tabir suryaTabir surya. . Rusaknya ozon di lapisan Rusaknya ozon di lapisan stratosfir, terutama di daerah dekat Kutub stratosfir, terutama di daerah dekat Kutub Selatan, tumbuhan mengalami cekaman Selatan, tumbuhan mengalami cekaman sinar ultraviolet B (UVB). Sejenis semang-sinar ultraviolet B (UVB). Sejenis semang-gi di Selandia Baru mempunyai toleransi gi di Selandia Baru mempunyai toleransi yang tinggi terhadap sinar UVB, adaptasi yang tinggi terhadap sinar UVB, adaptasi ini karena adanya kadar flavonoid yang ini karena adanya kadar flavonoid yang meningkat.meningkat.

II. Ekstraksi dan IsolasiII. Ekstraksi dan Isolasi

1.Ekstraksi 1.Ekstraksi Aglikon adalah polifenol maka bersifat polar, Aglikon adalah polifenol maka bersifat polar,

agak asam, larut dalam basa. Senyawa polar, agak asam, larut dalam basa. Senyawa polar, kepolaran berbeda-beda. Umumnya pelarut kepolaran berbeda-beda. Umumnya pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetil sulfoksida, dimetilformamida, air. dimetil sulfoksida, dimetilformamida, air. Bentuk glikosida karena ada gula mudah larut Bentuk glikosida karena ada gula mudah larut dalam air, campuran pelarut diatas dengan air dalam air, campuran pelarut diatas dengan air merupakan pelarut yang baik untuk glikosida. merupakan pelarut yang baik untuk glikosida. Sebalik, aglikon kurang polar seperti isoflavon, Sebalik, aglikon kurang polar seperti isoflavon, flavanon dan flavon serta flavonol flavanon dan flavon serta flavonol termodifikasi, cenderung larut dalam pelarut termodifikasi, cenderung larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform. seperti eter dan kloroform.

Analisis flavonoid yang ideal adalah bentuk Analisis flavonoid yang ideal adalah bentuk segar, walaupun kering dan lama masih segar, walaupun kering dan lama masih memberi hasil baik. Bila bahan segar, sisa memberi hasil baik. Bila bahan segar, sisa cuplikan yang dianalisis segara dikeringkan cuplikan yang dianalisis segara dikeringkan mencegah kerja enzim. Ekstraksi baik dua mencegah kerja enzim. Ekstraksi baik dua tahap; pertama metanol-air (9 : 1) dan kedua tahap; pertama metanol-air (9 : 1) dan kedua metanol-air (1 : 1). Ekstrak dicampur dan metanol-air (1 : 1). Ekstrak dicampur dan diuapkan hingga sepertiga , atau hampir semua diuapkan hingga sepertiga , atau hampir semua metanol menguap. Ekstrak dapat dibebaskan metanol menguap. Ekstrak dapat dibebaskan dari senyawa kepolarannya rendah seperti dari senyawa kepolarannya rendah seperti lemak, terpena, klorofil, xantofil dengan lemak, terpena, klorofil, xantofil dengan ekstraksi (dalam corong pisah) menggunakan ekstraksi (dalam corong pisah) menggunakan pelarut heksan atau kloroform. Ekstraksi pelarut heksan atau kloroform. Ekstraksi dilakukan beberapa kali, lapisan air dilakukan beberapa kali, lapisan air mengandung sebagian besar flavonoid, mengandung sebagian besar flavonoid, dirotapavor.dirotapavor.

LanjutanLanjutanPemilihan pelarut tidak hanya tergantung pada Pemilihan pelarut tidak hanya tergantung pada kepolaran, tetapi juga tempat substansi berada. Bila kepolaran, tetapi juga tempat substansi berada. Bila pada vakuola sel, bersifat hidrofilik, penyarian dengan pada vakuola sel, bersifat hidrofilik, penyarian dengan air atau pelarut alkoholik. Jika dalam kloroplas pelarut air atau pelarut alkoholik. Jika dalam kloroplas pelarut nonpolar sebelum alkoholik.nonpolar sebelum alkoholik.Ekstraksi antosianin atau flavonoid kepolaran rendah Ekstraksi antosianin atau flavonoid kepolaran rendah tidak cocok. Antosian, daun segar atau bunga segera tidak cocok. Antosian, daun segar atau bunga segera digerus dengan NaOH yang mengandung 1% HCl digerus dengan NaOH yang mengandung 1% HCl pekat. Ekstraksi terjadi ditandai adanya perubahan pekat. Ekstraksi terjadi ditandai adanya perubahan warna larutan, kromatografi atau analisis spektroskopi warna larutan, kromatografi atau analisis spektroskopi ekstrak segera dilakukan untuk mencegah hidrolsisi ekstrak segera dilakukan untuk mencegah hidrolsisi glikosida. Untuk simplisia yang mengandung glikosida. Untuk simplisia yang mengandung flavonoid dengan kepolaran yang lebih rendah lagi flavonoid dengan kepolaran yang lebih rendah lagi langsung diisolasi dengan heksana atau eter beberapa langsung diisolasi dengan heksana atau eter beberapa menit, ingat ekstrak yang diperoleh mengandung menit, ingat ekstrak yang diperoleh mengandung lemak dan lilin.lemak dan lilin.

2 Isolasi2 Isolasi

Metode terbaik isolasi campuran flavonoid a.l ; KKt Metode terbaik isolasi campuran flavonoid a.l ; KKt dan KLT. Metode KKt, kertas disarankan kertas dan KLT. Metode KKt, kertas disarankan kertas Whatman 3MM (46 x 57 cm) atau setara. Ekstrak Whatman 3MM (46 x 57 cm) atau setara. Ekstrak ditotolkan 8 cm dari tepi lipatan pertama dan 3 cm dari ditotolkan 8 cm dari tepi lipatan pertama dan 3 cm dari lipatan kedua dengan garis tengah 3 mm berpusat lipatan kedua dengan garis tengah 3 mm berpusat pada satu titik, keringkan bercak dengan pengering pada satu titik, keringkan bercak dengan pengering rambut. Ekstrak yang ditotolkan secara umum yaitu rambut. Ekstrak yang ditotolkan secara umum yaitu dari sejumlah ekstrak yang diperoleh dari 50 – 100 mg dari sejumlah ekstrak yang diperoleh dari 50 – 100 mg bahan tumbuhan kering. Elusi pertama dapat BAA (n-bahan tumbuhan kering. Elusi pertama dapat BAA (n-Butanol,Asam asetat,Air = BAW) 4:1:5 atau TBA (t-Butanol,Asam asetat,Air = BAW) 4:1:5 atau TBA (t-BuOH:HOAc:HBuOH:HOAc:H22o) 3:1:1.Kertas diangkat, keringkan di o) 3:1:1.Kertas diangkat, keringkan di lemari asam, bagian kromatogram yang dilipat (a) lemari asam, bagian kromatogram yang dilipat (a) digunting. Eluen kedua menggunakan biasanya digunting. Eluen kedua menggunakan biasanya berupa larutan dalam air seperti asam asetat berupa larutan dalam air seperti asam asetat 15%.Untuk antosianin disarankan pengembang 15%.Untuk antosianin disarankan pengembang setara ,biasanya BAA atau Bu/HCl dan kedua HCl 1%.setara ,biasanya BAA atau Bu/HCl dan kedua HCl 1%.

Flavonoid tidak nampak, kecuali antosian Flavonoid tidak nampak, kecuali antosian (bercak jingga sampai lembayung yang (bercak jingga sampai lembayung yang biru dengan uap ammonia), khalkon, biru dengan uap ammonia), khalkon, auron dan 6-hidroksi flavanol kuning). auron dan 6-hidroksi flavanol kuning). Karena alasan tersebut, untuk Karena alasan tersebut, untuk mendeteksi bercak, kromatogram mendeteksi bercak, kromatogram diperiksa dengan sinar UV (366 nm dan diperiksa dengan sinar UV (366 nm dan 254 nm) diperjelas dengan uap 254 nm) diperjelas dengan uap ammonia.ammonia.

LanjutanLanjutanUntuk isolasi flavonoid skala besar dapat dilakukan dengan Untuk isolasi flavonoid skala besar dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Dasarnya, cara ini meliputi penempatan kromatografi kolom. Dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoid (berupa larutan) di atas kolom berisi serbuk campuran flavonoid (berupa larutan) di atas kolom berisi serbuk penjerap (seperti selulosa, silika, atau poliamida), lanjutkan penjerap (seperti selulosa, silika, atau poliamida), lanjutkan dengan elusi setiap komponen memakai pelarut yang sesuai. dengan elusi setiap komponen memakai pelarut yang sesuai. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujungnya dengan ukuran garis tengah berbanding pada salah satu ujungnya dengan ukuran garis tengah berbanding panjang kolom 1:10 atau 1:30. panjang kolom 1:10 atau 1:30.

Mengemas kolom dengan hati-hati agar kolom homogen, Jika tidak Mengemas kolom dengan hati-hati agar kolom homogen, Jika tidak ada kaca masir, dapat kaca wol atau kapas, sumbat ini direndam ada kaca masir, dapat kaca wol atau kapas, sumbat ini direndam pengelusi tingginya pengelusi tingginya ±± 10 cm. Kemasan kolom dibuat bubur 10 cm. Kemasan kolom dibuat bubur dengan pelarut sama, lalu dituang ke dalam kolom tanpa putus dengan pelarut sama, lalu dituang ke dalam kolom tanpa putus agar tidak terbentuk lapisan. Kemasan dibiarkan turun dan agar tidak terbentuk lapisan. Kemasan dibiarkan turun dan kelebihan pelarut dibiarkan turun. Jika fase diam poliamida yang kelebihan pelarut dibiarkan turun. Jika fase diam poliamida yang digunakan maka dianjurkan untuk mengembangkan dulu satu jam.digunakan maka dianjurkan untuk mengembangkan dulu satu jam.

Selanjutnya larutan cuplikan ditempat di atas kemasan sedemikian Selanjutnya larutan cuplikan ditempat di atas kemasan sedemikian rupa sehingga berupa satu pita, menggunakan pelarut sesedikit rupa sehingga berupa satu pita, menggunakan pelarut sesedikit mungkin untuk hasil yang baik. Biarkan larutan cuplikan meresap mungkin untuk hasil yang baik. Biarkan larutan cuplikan meresap ke dalam kemasan dengan membuka sedikit keran, tutup dan ke dalam kemasan dengan membuka sedikit keran, tutup dan tambah perlahan-lahan cairan pengelusi dan dibiarkan kembali tambah perlahan-lahan cairan pengelusi dan dibiarkan kembali meresap ke dalam kemasanmeresap ke dalam kemasan..

Memilih kemasan kolom disesuaikan dengan Memilih kemasan kolom disesuaikan dengan flavonoid yang diisolasi;flavonoid yang diisolasi;

1.1. Selulosa. Selulosa. Ideal untuk pemisahan antara Ideal untuk pemisahan antara glikosida atau glikosida dengan aglikon dan glikosida atau glikosida dengan aglikon dan aglikon yang kurang polaraglikon yang kurang polar2.2. Silika.Silika. Baik untuk aglikon yang kurang Baik untuk aglikon yang kurang polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon dan falavonoldan falavonol3. Poliamida. 3. Poliamida. Cocok untuk memisahkan Cocok untuk memisahkan flavonoid dan glikosida. flavonoid dan glikosida. 4. Gel sephadex (deret G). 4. Gel sephadex (deret G). Digunakan Digunakan memisahkan campuran, terutama berdasarkan memisahkan campuran, terutama berdasarkan atas ukuran molekulatas ukuran molekul5. Gel sephadex (LH-20). 5. Gel sephadex (LH-20). Dirancang untuk Dirancang untuk menggunakan pelarut organik, dan dapat menggunakan pelarut organik, dan dapat digunakan dua cara. digunakan dua cara.

3 cm

8 cm

arah aliran pengembangpertama

arah aliran pengembangpertama

biarkan 5 cm

(a) (b)

(c) (d)

COLUMN CHROMATOGRAPHYCOLUMN CHROMATOGRAPHY

Karakterisasi dan IdentifikasiKarakterisasi dan Identifikasi Secara umum ditentukan dengan uji warna, Secara umum ditentukan dengan uji warna, kelarutan, bilangan Rf dan ciri spekelarutan, bilangan Rf dan ciri spekktrum trum ultraviolet.ultraviolet.

Jika tidak tercampur, dengan uap ammonia Jika tidak tercampur, dengan uap ammonia berwarna spesifik masing golongan. berwarna spesifik masing golongan. Falavon & Falavon & flavonol kuning-kuning kemerahan. Antosianin flavonol kuning-kuning kemerahan. Antosianin merah biru, flavononol orange atau coklat. merah biru, flavononol orange atau coklat. Warna merah & lembayung terjadi mendadak Warna merah & lembayung terjadi mendadak dalam suasana asam, khalkon atau auron.dalam suasana asam, khalkon atau auron.

Flavonoid kuning terang atau jingga dalam Flavonoid kuning terang atau jingga dalam larutan basa, jika bagian tumbuhan tanwarna larutan basa, jika bagian tumbuhan tanwarna diuapi amonia, terbentuk garam karena diuapi amonia, terbentuk garam karena struktur kuinoid pada cincin B seperti berikut :struktur kuinoid pada cincin B seperti berikut :

Adanya gugus fenol memberikan reaksi Adanya gugus fenol memberikan reaksi positif dengan pereaksi fenol, misalnya positif dengan pereaksi fenol, misalnya besi (III) klorida dan pereaksi asam sulfat besi (III) klorida dan pereaksi asam sulfat memberi warna spesifik. Reaksi ini tidak memberi warna spesifik. Reaksi ini tidak spesifik, tidak dapat digunakan spesifik, tidak dapat digunakan membedakan golongan dan harus diikuti membedakan golongan dan harus diikuti oleh uji warna lainnya.oleh uji warna lainnya.

Flavonoid dengan gugus hidroksil Flavonoid dengan gugus hidroksil kedudukan orto berwarna kuning intensif kedudukan orto berwarna kuning intensif jika bereaksi dengan asam borat dan jika bereaksi dengan asam borat dan larutan natrium asetat, seperti rekasi larutan natrium asetat, seperti rekasi berikut:berikut:

O

O

OH

O

O

O-

O

O-

O

OH-

Pembentukan struktur kuinoid dari flavonoid dengan basa

O

O

OH

HO

OH

O

O

HO

O

BOOH

HO

NaOAc, H3BO3

OH-

Kompleks flavonoid dengan asam borat dan natrium asetat

Selain pada kedudukan orto, gugus hidroksil dengan kedudukan lain diduga dapat membentuk ikatan dengan campuran asam sitrat dan asam borat, pada pemanasan, pereaksi sitroborat, mekanisme reaksi yang terjadi belum dapat diketahui secara pasti. Warna fluoresensi yang terbentuk adalah kuning,kuning kehijauan dengan sinar UV 366 nm.

Pereaksi AlCl3 membentuk kompleks dengan flavonoid (gugus hidroksil berkedudukan orto) menimbulkan warna kuning, ini tidak stabil dengan HCl dan terurai kembali, jika gugus hidroksil yang berkedudukan dekat gugus karbonil akan stabil dengan penambahan HCl.

O

O

OH

HO

OH

O

O

HO

O

AlO

AlCl3

HCl

O

O

OH

HO

OH

OHO

OHOH

OH OAl

O

Cl Cl

OHO

O

AlO

OAl

O

Cl Cl

AlCl3 HCl

Cl

Cl

Kompleks flavonoid dengan AlCl3 lewat gugus hidroksil yang berkedudukan orto dan yang berkedudukan dekat gugus karbonil, digunakan dasar penetapan adanya gugus hidroksil pada kedudukan tertentu dalam molekul flavonoid.

Lazim identifikasi flavonoid diawali dengan reaksi warna menggunakan pereaksi-pereaksi, seperti natrium hidroksida, asam sulfat, besi (III) klorida, logam magnesium dan asam klorida. Kelarutan dari flavonoid menjadi dasar dalam ekstraksi dan pemisahan secara kromatografi, sifat-sifatnya dengan pereaksi-pereaksi tertentu menjadi dasar analisis spektrofotometri UV-tampak.

HidrolisisHidrolisis Flavonoid terdapat pada semua bagian Flavonoid terdapat pada semua bagian tumbuhan tinggi, seperti bunga, daun, ranting, tumbuhan tinggi, seperti bunga, daun, ranting, buah, kayu, kulit, kayu dan akar. Fbuah, kayu, kulit, kayu dan akar. Flavanoid lavanoid tertentu bisa terkonsentrasi pada satu jaringan, tertentu bisa terkonsentrasi pada satu jaringan, misal antosianidin zat warna bunga, buah dan misal antosianidin zat warna bunga, buah dan daun.daun.

Sebagian besar flavonoid alam dalam bentuk Sebagian besar flavonoid alam dalam bentuk glikosida, adalah kombinasi antara gula dan glikosida, adalah kombinasi antara gula dan alkohol saling berikatan melalui ikatan alkohol saling berikatan melalui ikatan glikosida. Prinsip ikatan glikosida, gugus glikosida. Prinsip ikatan glikosida, gugus hidoksil dari alkohol beradisi ke gugus karbonil hidoksil dari alkohol beradisi ke gugus karbonil dari gula, sama seperti adisi alkohol ke aldehida dari gula, sama seperti adisi alkohol ke aldehida yang dikatalis oleh adanya asam menghasilkan yang dikatalis oleh adanya asam menghasilkan asetal.asetal.

C

R

R

+ R'OH C

R

OHH

OR'

C

R

OR'H

OR'+

+ H2O

Aldehida Alkohol Hemiasetal Asetal

R'-OH

H+

C

OH

OH

OH

OH

CH2OH

O

OH

OH

OH

CH2OH

H

OOH O

OH

OH

OH

CH2OH

OR'

Glukosa Glukosa Glukosida(rantai terbuka) (siklik hemiasetal)

R'OH

H+

Pada hidrolisis, glikosida terurai kembali atas Pada hidrolisis, glikosida terurai kembali atas komponennya menghasilkan gula dan alkohol, komponennya menghasilkan gula dan alkohol, alkohol disebut alkohol disebut aglikon. aglikon. Biasanya, sisa gula Biasanya, sisa gula dari glikosida flavonoid alam adalah glukosa, dari glikosida flavonoid alam adalah glukosa, rhamnosa, galaktosa dan gentiobiosarhamnosa, galaktosa dan gentiobiosa

Flavonoid dapat berupa mono, di atau tri-Flavonoid dapat berupa mono, di atau tri-glikosida, dengan cara satu, dua atau tiga glikosida, dengan cara satu, dua atau tiga gugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat gugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan hanya sedikit larut dalam pelarut organik hanya sedikit larut dalam pelarut organik seperti eter, benzen, kloroform dan aseton.seperti eter, benzen, kloroform dan aseton.

Untuk membedakan aglikon dan gula yang Untuk membedakan aglikon dan gula yang terikat sebagai glikosida, dapat dilakukan terikat sebagai glikosida, dapat dilakukan hidrolisis dengan; asam, enzim atau basa. hidrolisis dengan; asam, enzim atau basa.

Hidrolisis dengan asamHidrolisis dengan asam Biasanya dengan HCl, ikatan O-glikosida atau C-glikosida. Biasanya dengan HCl, ikatan O-glikosida atau C-glikosida. C-glikosida, sangat tahan asam, dibedakan waktu atau C-glikosida, sangat tahan asam, dibedakan waktu atau lama hidrolsis.lama hidrolsis.Juga dipengaruhi posisi ikatan gula pada flavonoid. Gula Juga dipengaruhi posisi ikatan gula pada flavonoid. Gula posisi 3 lebih mudah dihidrolisis dibanding posisi 7, paling posisi 3 lebih mudah dihidrolisis dibanding posisi 7, paling mudah posisi 5. Flavonol 3-rhamnofuranosida kurang mudah posisi 5. Flavonol 3-rhamnofuranosida kurang stabil sehingga hidrolsis lebih cepat dibanding flavonol 3-stabil sehingga hidrolsis lebih cepat dibanding flavonol 3-rhamnopiranosida relatif lebih stabil.rhamnopiranosida relatif lebih stabil.Cara baku hidrolisis O-glikosida: Cara baku hidrolisis O-glikosida: Larutan glikosida (1mg) Larutan glikosida (1mg) hidrolisis 5 ml HCl 2N : MeOH (1:1) dalam labu alas bulat hidrolisis 5 ml HCl 2N : MeOH (1:1) dalam labu alas bulat 25 ml, refluks 60 menit. Rotavapour, sisa larutkan 25 ml, refluks 60 menit. Rotavapour, sisa larutkan dengan MeOH : H2O (1:1) sesedikit mungkin. KKt atau KLT-dengan MeOH : H2O (1:1) sesedikit mungkin. KKt atau KLT-selulosa, 15% asam asetat, hasil :selulosa, 15% asam asetat, hasil :- jika terjadi hidrolsisi, Rf akan lebih kecil, suatu O-- jika terjadi hidrolsisi, Rf akan lebih kecil, suatu O-glikosida, kemungkinan kecil bisulfat atau C-glikosida ter-glikosida, kemungkinan kecil bisulfat atau C-glikosida ter-O-glikosida.O-glikosida.- Jika tidak terjadi hidrolisis, adalah C-glikosida atau - Jika tidak terjadi hidrolisis, adalah C-glikosida atau glukoronidaglukoronida- Jika hidrolisis sebagian, mungkin glukuronida- Jika hidrolisis sebagian, mungkin glukuronida

Hidrolsis dengan enzimHidrolsis dengan enzim Berguna menentukan sifat ikatan antara gula dan Berguna menentukan sifat ikatan antara gula dan flavonoid (yaitu α atau β), khas hanya memutuskan flavonoid (yaitu α atau β), khas hanya memutuskan monosakarida flavonoid O-glikosida. Selanjutnya monosakarida flavonoid O-glikosida. Selanjutnya dianalisis dengan KLT, atau KGC untuk mengetahui hasil dianalisis dengan KLT, atau KGC untuk mengetahui hasil hidrolosis,hidrolosis,- β-glukosidase- β-glukosidase (emulsin), menghidrolsisi β-D-gluksoda (emulsin), menghidrolsisi β-D-gluksoda dan xilosida, tidak menghidrolsisi antosianidin glikosida.dan xilosida, tidak menghidrolsisi antosianidin glikosida.- β-galaktosidase, - β-galaktosidase, menghidrolsisi β-D-galaktosida menghidrolsisi β-D-galaktosida - β-glikuronidase, - β-glikuronidase, menghidrolsisi β-D-glukuronidasemenghidrolsisi β-D-glukuronidase- Pektinase, - Pektinase, menghidrolsis α-D-poligalakturonida dan α-menghidrolsis α-D-poligalakturonida dan α-L-rhamnosidaL-rhamnosida- Antosianase, - Antosianase, menghidrolsis sebagian besar antosiani menghidrolsis sebagian besar antosiani din glikosidadin glikosida- Rhamnodiastase, - Rhamnodiastase, memutuskan sebagian besar oligo memutuskan sebagian besar oligo sakarida secara utuh dari glikosida dalam sakarida secara utuh dari glikosida dalam Rhamnus Rhamnus frangula frangula - Takadiastase, - Takadiastase, menghidrolsisi naringenin 7-O-neo menghidrolsisi naringenin 7-O-neo hesperidosida.hesperidosida.

HIDROLISIS DENGAN BASAHIDROLISIS DENGAN BASA Jarang digunakan hidrolisis gliksodia flavonoid, Jarang digunakan hidrolisis gliksodia flavonoid, digunakan untuk memutuskan gula secara selektif dari digunakan untuk memutuskan gula secara selektif dari posisi 7, 4’, 3-hidroksil. Keselektifan ini kebalikan dari posisi 7, 4’, 3-hidroksil. Keselektifan ini kebalikan dari hidrolisis asam.hidrolisis asam.

Melepaskan disakarida dari 7 – hidroksil asal ikatan antara Melepaskan disakarida dari 7 – hidroksil asal ikatan antara glukosida bukan (1----2). Rutinosida terhidrolisis, tetapi 7-glukosida bukan (1----2). Rutinosida terhidrolisis, tetapi 7-O-apiol (1----2) glukosida dan 7-O-neohesperidosida tidak O-apiol (1----2) glukosida dan 7-O-neohesperidosida tidak hidrolsis. Jaga tidak ada kontak udara, sebab flavonoid hidrolsis. Jaga tidak ada kontak udara, sebab flavonoid terurai suasana basa jika ada oksigen. Kebanyakan 7 – dan terurai suasana basa jika ada oksigen. Kebanyakan 7 – dan 4’ – O – gliksida pecah waktu 30 menit, beberapa glikosida 4’ – O – gliksida pecah waktu 30 menit, beberapa glikosida perlukan waktu dua jam.Pemutusan gula yang terikat perlukan waktu dua jam.Pemutusan gula yang terikat posisi 4’ secara selektif tanpa ganggu gula posisi 7.posisi 4’ secara selektif tanpa ganggu gula posisi 7.

Cara:Cara: Larutan glikosida (10 – 30 mg) dalam 10 ml KOH 0,5% Larutan glikosida (10 – 30 mg) dalam 10 ml KOH 0,5% refluks dengan tangas air 30 menit lingkungan N2. refluks dengan tangas air 30 menit lingkungan N2. Netralkan dengan HCl 2N, dikromatografi kertas eluen Netralkan dengan HCl 2N, dikromatografi kertas eluen HOAc 15% untuk isolasi flavonoidHOAc 15% untuk isolasi flavonoid

Spektroskopi Ultraviolet Spektroskopi Ultraviolet FlavonoidFlavonoid

MMempunyai sistem aromatik empunyai sistem aromatik terkonyugasi, sehingga punya pita terkonyugasi, sehingga punya pita serapan di daerah ultraviolet dan serapan di daerah ultraviolet dan ultraviolet tampak (UV-UV Vis). ultraviolet tampak (UV-UV Vis). Spektra flavon dan flavonol Spektra flavon dan flavonol memperlihatkan dua puncak memperlihatkan dua puncak utama pada daerah 240 – 400 nm, utama pada daerah 240 – 400 nm, pita I (300 – 380 nm) absorbsi pita I (300 – 380 nm) absorbsi untuk cincin B sinamoil dan pita II untuk cincin B sinamoil dan pita II (240 – 280 nm) absobsi cincin A (240 – 280 nm) absobsi cincin A benzoilbenzoil..

O

O

A

B

SINAMOILBENZOIL

Isoflavon, falavanon dan dihidroflavonol punya Isoflavon, falavanon dan dihidroflavonol punya spektra UV mirip, disebabkan tidak punya sistem spektra UV mirip, disebabkan tidak punya sistem konyugasi sinamoil cincin B. Larutan isoflavon konyugasi sinamoil cincin B. Larutan isoflavon dalam dalam metanolmetanol memberikan spektra UV puncak II memberikan spektra UV puncak II pada 250 nm – 270 nm, puncak I pada 300 nm – pada 250 nm – 270 nm, puncak I pada 300 nm – 330 nm. F330 nm. Flavanon dan dihidroflavanon puncak II lavanon dan dihidroflavanon puncak II pada 270 nm – 290 nm dan puncak I pada 320 pada 270 nm – 290 nm dan puncak I pada 320 nm – 330 nm.nm – 330 nm.

Peran gugus OH pada cincin A flavon dan flavonol Peran gugus OH pada cincin A flavon dan flavonol memberi pergeseran batokromik nyata pada pita memberi pergeseran batokromik nyata pada pita II dan sedikit pada pita I. II dan sedikit pada pita I.

Metilasi dan Metilasi dan glikosilasi pada flavon dan flavonol glikosilasi pada flavon dan flavonol pada absorpsi. Jika gugus 3, 5, dan 4’ – OH pada pada absorpsi. Jika gugus 3, 5, dan 4’ – OH pada flavon dan flavonol termetilasi dan terglikosilasi flavon dan flavonol termetilasi dan terglikosilasi terjadi pergeseran hipsokromik terutama pita I. terjadi pergeseran hipsokromik terutama pita I. Pergeseran yang terjadi terbesar 12 – 17 nm, bisa Pergeseran yang terjadi terbesar 12 – 17 nm, bisa mencapai 22 – 25 nm pada flavon yang tidak mencapai 22 – 25 nm pada flavon yang tidak mempunyai gugus 5 – OH.mempunyai gugus 5 – OH.

Pita II Pita II ((serapan cincin A bagian benzoilserapan cincin A bagian benzoil)), , pita I pita I ((serapan cincin B bagian sinamoilserapan cincin B bagian sinamoil)). . Intesitas serapan tergantung panjangnya Intesitas serapan tergantung panjangnya sistem konyugasisistem konyugasi,, adanya subtitusi adanya subtitusi terutama pada kedudukan atom Cterutama pada kedudukan atom C33 dan C dan C55. . Sebagai contoh senyawa flavon yang Sebagai contoh senyawa flavon yang mempunyai sistem sinamoil mengandung mempunyai sistem sinamoil mengandung sistem konyugasi lebih panjang daripada sistem konyugasi lebih panjang daripada sistem benzoil, intensitas puncak I lebih sistem benzoil, intensitas puncak I lebih kecil dari intensitas puncak II.kecil dari intensitas puncak II.

Flavon, flavonol tersubtitusi oksigen hanya Flavon, flavonol tersubtitusi oksigen hanya pada cincin Apada cincin A,, dalam metanol cenderung dalam metanol cenderung memberikan spektra nyata pada pita II dan memberikan spektra nyata pada pita II dan lemah pada pita I, tetapi jika cincin B lemah pada pita I, tetapi jika cincin B tersubtitusi oksigen, pita I akan kelihatan tersubtitusi oksigen, pita I akan kelihatan lebih nyata.lebih nyata.

Penambahan pereaksi geser atau pereaksi Penambahan pereaksi geser atau pereaksi diagdiag--nostiknostik dan dan dengan dengan adanyaadanya hidroksilasi, glikolasihidroksilasi, glikolasi metilasi metilasi sertaserta asetilasi dapat mengubah karakasetilasi dapat mengubah karak--ter ter resapan senyawa flavonoidresapan senyawa flavonoid, ini , ini dapat digudapat digu--nakan untuk memperkirakan struktur nakan untuk memperkirakan struktur flavonoidflavonoid tersebut tersebut..

1. Efek hidroksilasi1. Efek hidroksilasi AdanyaAdanya gugus gugus OH OH pada cincin A pada flavon pada cincin A pada flavon oror flavo flavo--

nol nol memberi memberi pergeseran batokromik nyata pada pita I pergeseran batokromik nyata pada pita I oror pita II pita II.. Apabila gugus Apabila gugus OHOH tidak ada pada flavon atau tidak ada pada flavon atau flavonol, flavonol, max max muncul pada muncul pada lebih pendek diban lebih pendek diban--ding ding jika ada gugus 5 – OHjika ada gugus 5 – OH.. SSubtitusi gugus ubtitusi gugus OHOH posisi 3, 5 posisi 3, 5 dan 4dan 4 punya sedikit efek punya sedikit efek oror tidak sama sekali pada tidak sama sekali pada spektra UV. Pita absorpsi I isoflavon punya intensitas spektra UV. Pita absorpsi I isoflavon punya intensitas lemah, pita II intensitas kuat. lemah, pita II intensitas kuat. AAbsbsoorbsi rbsi pita pita II isoflavon II isoflavon biasanya antara 245 – 270 nm dan relatif tidak punya biasanya antara 245 – 270 nm dan relatif tidak punya efek pada cincin B dengan adanya hidroksilasi.efek pada cincin B dengan adanya hidroksilasi.

2. 2. Efek natrium metoksidaEfek natrium metoksida NaNaOCHOCH33 basa kuat dapat mengiionisasi semua gugus basa kuat dapat mengiionisasi semua gugus

dalam flavonoid. Degradasi dalam flavonoid. Degradasi oror pengurangan kekuatan pengurangan kekuatan spektra setelah waktu tertentu merupakan petunjuk spektra setelah waktu tertentu merupakan petunjuk baik akan adanya gugus yang peka terhadap basa.baik akan adanya gugus yang peka terhadap basa.

Spektra isoflavon yang mempunyai gugus Spektra isoflavon yang mempunyai gugus OHOH pada pada cincin A cincin A adaada pergeseran batokromik baik pada pita I pergeseran batokromik baik pada pita I maupun pita II. maupun pita II.

Puncak spektra UV senyawa 3’ – 4’ diPuncak spektra UV senyawa 3’ – 4’ di-OH-OH isoflavon isoflavon akan mengalami penurunan intensitas beberapa menit akan mengalami penurunan intensitas beberapa menit setelah penambahan Nasetelah penambahan NaOCHOCH33. Adanya perbedaan . Adanya perbedaan kecepatan dekomposisi 4’ monokecepatan dekomposisi 4’ mono-OH-OH isoflavon dapat isoflavon dapat digunakan menentukan bahwa dekomposisi yang digunakan menentukan bahwa dekomposisi yang berjalan cepat menunjukkan adanya 3’ – 4’ diberjalan cepat menunjukkan adanya 3’ – 4’ di-OH-OH isoflavon. isoflavon.

Penambahan NaPenambahan NaOCHOCH33 pada flavon dan flavonol dalam pada flavon dan flavonol dalam

metanol umumnya memetanol umumnya memberi mberi pergeseran batokromik pergeseran batokromik semua pita serapan. semua pita serapan. PPergeseran batokromik yang ergeseran batokromik yang besar pada serapabesar pada serapann pita I sekitar 40 – 65 nm tanpa pita I sekitar 40 – 65 nm tanpa penurunan intensitas, menunjukkan adanya gugus 4’ – penurunan intensitas, menunjukkan adanya gugus 4’ – OH bebas. OH bebas. FFlavonol yang tidak punylavonol yang tidak punyaa gugus 4’ – OH gugus 4’ – OH bebas juga memberi pergeseran pada pita serapan I, bebas juga memberi pergeseran pada pita serapan I, dengan penurunan intensitas.dengan penurunan intensitas. P Pergeseran batokromik ergeseran batokromik yang yang disebabkan adanya gugus 3 – OH bebas. Jika disebabkan adanya gugus 3 – OH bebas. Jika suatu flavonol mempunyai 3 dan 4’ – OH bebas, maka suatu flavonol mempunyai 3 dan 4’ – OH bebas, maka spektra dengan Naspektra dengan NaOCHOCH33 akan mengalami dekompo akan mengalami dekompo--

sisi. sisi.

Pengganti NaPengganti NaOCHOCH33 yang baik ialah laruan NaOH 2M yang baik ialah laruan NaOH 2M

dalam air.dalam air.

3. 3. Efek natrium asetatEfek natrium asetat

NaNa-OAc-OAc adalahadalah basa lemah dan hanya akan mengionisasi basa lemah dan hanya akan mengionisasi gugus yang sifat keasamannya tinggi, khususnya untuk gugus yang sifat keasamannya tinggi, khususnya untuk mendeteksi adanya gugus 7 – OH bebas. Namendeteksi adanya gugus 7 – OH bebas. Na-OAc-OAc hanya hanya dapat mengionisasi isoflavon khusus pada gugus 7 – OHdapat mengionisasi isoflavon khusus pada gugus 7 – OH,, ggugus 3’ atau 4’ – OH pada flavonol. Oleh sebab itu ugus 3’ atau 4’ – OH pada flavonol. Oleh sebab itu interpretasi terhadap pergeseran spektra isoflavon untuk interpretasi terhadap pergeseran spektra isoflavon untuk penambahan penambahan NNaa-OAc-OAc menjadi sederha menjadi sederha--na. Adanya 7 – OH na. Adanya 7 – OH isoflavon menyebabkan pergeseran batokisoflavon menyebabkan pergeseran batok--romik 6 – 20 romik 6 – 20 nm pada pita II setelah penambahan nm pada pita II setelah penambahan Na-OAcNa-OAc. .

NNaa-OAc -OAc dan asam borat akan membentuk kompleks dan asam borat akan membentuk kompleks dengan gugus orto dengan gugus orto -OH-OH pa padda cincin B menunjukkan a cincin B menunjukkan pergeseran batokromik pita serapan I sebesar 12 – 30 pergeseran batokromik pita serapan I sebesar 12 – 30 nm. Gugus ortonm. Gugus orto -OH -OH pada cincin A juga pada cincin A juga terterdeteksi dengan deteksi dengan efek efek Na-OAcNa-OAc dan asam borat. Adanya pergesaran dan asam borat. Adanya pergesaran batokromik sebesar 5 – 10 nm pada pita II menunjukkan batokromik sebesar 5 – 10 nm pada pita II menunjukkan adanya gugus orto hidroksi pada posisi C6 dan C7 atau adanya gugus orto hidroksi pada posisi C6 dan C7 atau C7 dan C8.C7 dan C8.

4. 4. Efek aluminium kloridaEfek aluminium klorida

MMembentuk kompleks embentuk kompleks dengan dengan gugus gugus OHOH dan keton ber dan keton ber--tetangga tahan asamtetangga tahan asam,, membentuk kompleks dengan membentuk kompleks dengan gugus orto – gugus orto – OHOH tidak tahan asam. Adanya gugus 3’, 4’ tidak tahan asam. Adanya gugus 3’, 4’ – – OHOH pada isoflavon atau flavanon dan dihidroflavo pada isoflavon atau flavanon dan dihidroflavo--nol nol tidak tidak terterdeteksi dengan AlCldeteksi dengan AlCl33 karena cincin B punya karena cincin B punya sedikit sedikit oror tidak ada konyugasi kromofor utama. Jika tidak ada konyugasi kromofor utama. Jika isoflavon, flavanon (dan mungkin dihidroflavonol) meisoflavon, flavanon (dan mungkin dihidroflavonol) me--ngandung gugus orto – ngandung gugus orto – OHOH pada posisi 6, 7 atau 7, 8 pada posisi 6, 7 atau 7, 8 maka spektra AlCl3 menunjukkanmaka spektra AlCl3 menunjukkan pergeseran batokpergeseran batok--romik (biasanya pada pita I romik (biasanya pada pita I dandan pita II). pita II). SSerapaerapan pitan pita II II spektra UV semua 5 – OH isoflavon spektra UV semua 5 – OH isoflavon terterdeteksi dengan deteksi dengan pepe+a+ann AlCl3AlCl3//HCl, HCl, kecuali 2 – karboksil 5, 7 – dihidroksil kecuali 2 – karboksil 5, 7 – dihidroksil isoflavonisoflavon, , ditandai pergeseran batokromik pita II 10 – ditandai pergeseran batokromik pita II 10 – 14 nm14 nm (relatif terhadap spektra (relatif terhadap spektra CHCH33-OH)-OH). Spektra iso. Spektra iso--flavonflavon tidak punya gugus 5 – OH bebas tidak berefektidak punya gugus 5 – OH bebas tidak berefek setelah pesetelah pe+an +an AlCl3 / HCl.AlCl3 / HCl.

Pada flavon dan flavonol, adanya guPada flavon dan flavonol, adanya gu--gus orto – gus orto – OHOH pada cincin B dike pada cincin B dike--tahui jika petahui jika pe+a+an asam n asam padapada spek spek--tra AlCl3 tra AlCl3 terjaditerjadi pergeseran hipso pergeseran hipso--kromik sebesar 30 – 40 nm pada kromik sebesar 30 – 40 nm pada pita I (atau pita Ia jika terdirpita I (atau pita Ia jika terdirii dari dari dua puncak). dua puncak). AAdanya pergeseran danya pergeseran batokrobatokro--mik pada pita Ia (dalam mik pada pita Ia (dalam AlCl3 / HCl) dibandingkan dengan AlCl3 / HCl) dibandingkan dengan pita I (dalam pita I (dalam CHCH33-OH-OH) sebesar 35 – ) sebesar 35 – 55 nm, menunjukkan adanya 5 – 55 nm, menunjukkan adanya 5 – OH flavon OH flavon oror flavonol 3 – OH flavonol 3 – OH tersubtitusi.tersubtitusi.

PENETAPAN KADAR FLAVONOIDPENETAPAN KADAR FLAVONOID

PRINSIP KERJA : PRINSIP KERJA : ditetapkan kadar flavonoid ditetapkan kadar flavonoid sebagai aglikon, hidrolisis asam dengan sebagai aglikon, hidrolisis asam dengan heksa-metilentetramin, selanjutnya ukur heksa-metilentetramin, selanjutnya ukur spektrofoto-metri dengan pereaksi geser AlClspektrofoto-metri dengan pereaksi geser AlCl33

CARA KERJA : CARA KERJA : ekstrak setara 200 mg ekstrak setara 200 mg simplisia, direfluks dengan 1.0 ml lar. 0,5% b/v simplisia, direfluks dengan 1.0 ml lar. 0,5% b/v heksmetilentetramin, 20.0 ml aseton dan 25 ml heksmetilentetramin, 20.0 ml aseton dan 25 ml HCl 25%, refluks 30 menit. Saring dengan HCl 25%, refluks 30 menit. Saring dengan kapas kedalam labu tentukur 100 ml. Ampas kapas kedalam labu tentukur 100 ml. Ampas cuci dengan aseton 2x20 ml didihkan sebentar, cuci dengan aseton 2x20 ml didihkan sebentar, filtrat campur dengan filtrat pertamafiltrat campur dengan filtrat pertama

Adkan volume dengan aseton, pipet 20 ml Adkan volume dengan aseton, pipet 20 ml dan tambah 20 ml air, kocok. Selanjutnya dan tambah 20 ml air, kocok. Selanjutnya ekstraksi dengan etil asetat 15, 10 dan 10 ml ekstraksi dengan etil asetat 15, 10 dan 10 ml etil asetat.etil asetat.

Lapisan etil asetat dikumpulkan dalam labu Lapisan etil asetat dikumpulkan dalam labu tentuku 50 ml, adkan volume dengan etil tentuku 50 ml, adkan volume dengan etil asetatasetat

SPEKTROMETRI : SPEKTROMETRI : sebanyak 4 ml lartuan etil sebanyak 4 ml lartuan etil asetat dalam labu tentukur 5 ml, tambah 0,2 asetat dalam labu tentukur 5 ml, tambah 0,2 ml AlClml AlCl33 dalam lar asetat asetat glasial 5% dalam lar asetat asetat glasial 5%

dalam MeOH. Diamkan, ukur dalam MeOH. Diamkan, ukur maxmax

PEMBUATAN LARUTAN BAKU :PEMBUATAN LARUTAN BAKU : Rutin ditimbang saksama 0,0113 g, Rutin ditimbang saksama 0,0113 g,

masukkan dalam labu tentukur 10 ml dan masukkan dalam labu tentukur 10 ml dan larutkan dengan Et-OH 96%, ini sebagai larutkan dengan Et-OH 96%, ini sebagai larutan stock yang dibuat dengan berbagai larutan stock yang dibuat dengan berbagai konsentrasikonsentrasi

2ml lar stock diencerkan dalam labutentukur 2ml lar stock diencerkan dalam labutentukur 10 ml dengan 0,2 ml AlCl10 ml dengan 0,2 ml AlCl33 dan asam asetat dan asam asetat

glasial, glasial, hasil 0,0226%hasil 0,0226% 1 ml lar 0,0226% diencerkan dalam 1 ml lar 0,0226% diencerkan dalam

labutentu-kur 5 ml dengan 0,2 ml AlCllabutentu-kur 5 ml dengan 0,2 ml AlCl33 dan dan

asam asetat glasial, asam asetat glasial, hasil 0,00452%hasil 0,00452%

3 ml lar 0,0226% diencerkan dalam labuten-3 ml lar 0,0226% diencerkan dalam labuten-tukur 5 ml dengan 0,2 ml AlCltukur 5 ml dengan 0,2 ml AlCl33 dan asam dan asam

asetat glasial, asetat glasial, hasil 0,00678%hasil 0,00678% 2 ml lar 0,0226% diencerkan dalam 2 ml lar 0,0226% diencerkan dalam

labutentu-kur 5 ml dengan 0,2 ml AlCllabutentu-kur 5 ml dengan 0,2 ml AlCl33 dan dan

asam asetat glasial, asam asetat glasial, hasil 0,00904%hasil 0,00904% 3 ml lar 0,0226% diencerkan dalam 3 ml lar 0,0226% diencerkan dalam

labutentu-kur 5 ml dengan 0,2 ml AlCllabutentu-kur 5 ml dengan 0,2 ml AlCl33 dan dan

asam asetat glasial, asam asetat glasial, hasil 0,01356%hasil 0,01356% Ukur Ukur maxmax masing-masing masing-masing konsentrasikonsentrasi

SKEMA PENETAPAN KADAR FLAVONOIDSKEMA PENETAPAN KADAR FLAVONOID

Sampel ekstrakSampel ekstrak

PROSEDUR KERJA

Setara 200 mg simplisia

+ 1.0 ml lar 0,5% b/v

heksmetilentetramin

+ 20.0 ml aseton

+ 2.0 ml lar HCl 25%

+ Refluks 30’

- Saring kapas

ampasampas Labu ukur 100 mlLabu ukur 100 ml Adkan volume

dengan aseton

+ 2x20 ml aseton

- Didihkan sebentar

ampasampas filtratfiltrat 20 ml filtrat20 ml filtrat

20 ml filtrat20 ml filtrat

- dalam corong pisah

+ 20 ml air, kocok

+ 15 ml, 10 ml, 10 ml etil asetat

Lapisan airLapisan air Filtrat etil asetatFiltrat etil asetat Dalam labu takar 50 ml Adkan volume etil asetat

- Pipet 4ml, encerkan dalam - Pipet 4ml, encerkan dalam tabu takar 5 mltabu takar 5 ml

+ 0,2 ml AlCl+ 0,2 ml AlCl33 dalam asam ase- dalam asam ase-

tat glasial 5% v/vtat glasial 5% v/v

- Ukur - Ukur maxmax

- Kurva baku dibuat dengan - Kurva baku dibuat dengan prosedur samaprosedur sama

Y = b + aXY = b + aX

Konsentrasi Absorbansi0,00225 0,000452 0,2080,00452 0,000904 0,2580,00678 0,001358 0,4080,00904 0,001808 0,530,01356 0,002712 0,7540,0226 0,00452 1,102

KURVA BAKUKURVA BAKU

NomorNomor KonsentrasiKonsentrasi AbsorbansiAbsorbansi

110,000452 % 0,000452 %

b/vb/v 0,208 0,208

220,000904 % 0,000904 %

b/vb/v 0,258 0,258

330,001356 % 0,001356 %

b/vb/v 0,408 0,408

440,001808 % 0,001808 %

b/vb/v 0,53 0,53

550,002712 % 0,002712 %

b/vb/v 0.754 0.754

66 0,00452 % b/v0,00452 % b/v 1,102 1,102

HASIL PENGUKURAN HASIL PENGUKURAN SAMPELSAMPEL

NomorNomor Berat sampelBerat sampel AbsorbansiAbsorbansi

11 101 mg101 mg 0,330 0,330

22 101 mg101 mg 0.308 0.308

33 101 mg101 mg 0.304 0.304

44 50,2 mg50,2 mg 0,375 0,375

55 50,2 mg50,2 mg 0,376 0,376

66 50,2 mg50,2 mg 0,370 0,370

CARA PERHITUNGANCARA PERHITUNGAN Persamaan garis liner dari kurva bakuPersamaan garis liner dari kurva baku

Y = 227,54 X + 0,0976Y = 227,54 X + 0,0976 Y – 0,0976Y – 0,0976 X =X = 227,54227,54Jika absorban 0,330 , maka kadar flavonoid :Jika absorban 0,330 , maka kadar flavonoid :

0,33– 0,09760,33– 0,0976 X = = 0,001021359%X = = 0,001021359% 227,54227,54

Kadar flavonid total dalam 4 ml = 5/4 x Kadar flavonid total dalam 4 ml = 5/4 x 0,001021359% 0,001021359%

= 0,001276699%= 0,001276699% = 0,01276699 = 0,01276699

mg/mlmg/ml

Berat flavonid total dalam 50 ml larutan etil Berat flavonid total dalam 50 ml larutan etil asetat :asetat :

= 50 ml x 0,01021359 mg/ml= 50 ml x 0,01021359 mg/ml

= 0,6383495 mg = 0,6383495 mg ~ 20 ml filtrat ~ 20 ml filtrat asetonaseton

Berat flavonid total dari ekstrak yang dihidrolisis:Berat flavonid total dari ekstrak yang dihidrolisis:

= 100/20 ml x 0,6383495 mg = 100/20 ml x 0,6383495 mg

= 3,1917474 mg= 3,1917474 mg

Jadi kadar flavonoid dalam ekstrak :Jadi kadar flavonoid dalam ekstrak :

= = 3,1917474 mg / 101 mg x 100%3,1917474 mg / 101 mg x 100%

= = 3,16%3,16%

7-Hidroksi Flavon

MeOH 252, 268, 307

AlCl3 249, 307

AlCl3 + HCl 251, 307, 372sh

O

O

HO

OOH

O

OH

3’,4’-Dihidroksi Flavon

MeOH 242, 308sh, 340

AlCl3 248sh, 273, 304, 378, 468sh

AlCl3 + HCl 242, 312sh, 342

O

OOH

HO

HO

Baikalein

MeOH 247, 274, 323

AlCl3 247, 272, 284sh, 375

AlCl3 + HCl 255sh, 282, 292sh, 346

O

OOH

HO

OH

OH

Luteolin

MeOH 242sh, 253, 287, 291sh, 349

AlCl3 274, 300, 328, 426

AlCl3 + HCl 266sh, 275, 294sh, 355, 385