4. flavonoid
TRANSCRIPT
FLAVONOID I. PENDAHULUAN
Senyawa fenol alam
2% Karbon tumbuhan diubah jadi flavonoid atau 1 milyar ton pertahun
Warna bunga dan buah, flavin (kuning, jingga), antosian (merah, biru, ungu)
Tumbuhan: pigmen, pertumbuh-an, pertahanan, tabir surya, berkomunikasi
Manusia :antioksidan, antiinflamasi, immunostimulan, antikanker, antivirus dan antimikroba.
Kerangka dasar
Kerangka dasar 15 atom C, dua cincin benzen,
terikat pada rantai propana, susunan C6–C3–C6
susunan yaitu : 1,3–diarilpropana (flavonoid)
1,2–diarilpropana (isoflavonoid) dan 1,1 – diaril
propana (neoflavonoid)
C1
C2
C3 C1
C2
C3
C1
C2
C3
FLAVONOID ISOFLAVONOID NEOFLAVONOID
contoh O
O
O
O
OH
OHHO
OH
O
OOCH3
O
FLAVON KUERSETIN KRANJIN
1. Flavonoid
O
OOH
HO
HO OCH3
O
OH
H3CO
OO
CH2
O
O
O
OO
OCH3
OCH3
FEREIRIN
PTEROKARPIN ROTENON
2. Isoflavonoid
O
HO
H3CO O O O
OH
OH3CO O
O
O
DALBERGIN BRAZILIN KALOFILOID
3. Neoflavonoid
Cincin benzen dihubungkan satuan tiga
karbon dapat atau tidak dapat membentuk
cincin ketiga. Untuk memudahkan maka
cincin pertama benzen diberi indeks A,
cincin benzen kedua indeks B dan cincin
yang dapat terbentuk cincin C
O
O
A
B
C
12
3
4105
6
7
89
1'
2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
A
B
6'
5'
4'
3' 2'
2
3
4
5HO
OH
1
6
Asal usul Biogenetik Awal Robinson (1936): kerangka C6 – C3 – C6.
dari kerangka C6 – C3 fenilpropana mempunyai gugus fungsi oksigen pada para, para dan meta atau dua meta dan satu para pada cincin aromatik. Senyawa fenilpropana, seperti asam amino fenilalanin dan tirosin, bukan menurunkan flavonoid, hanya senyawa yang bertalian.
Dilanjutkan Birch: tahap pertama biosintesis flavonoid, dari unit C6 – C3 berkombinasi dengan 3 unit C2 menghasilkan unit C6 – C3 – (C2+C2+C2), maka biosintesis dari flavonoid melalui 2 jalur bisosintesis yaitu poliketida (asam asetat atau mevalonat) membentuk cincin A dari kondensasi 3 molekul unit asetat, sedang cincin B dan tiga atom karbon dari rantai propana berasal dari jalur fenilpropana (shikimat).
What’s a phenolic compound? A secondary product that contains a phenol group - a hydroxyl functional group on an aromatic ring.
OH
Phenolics are a chemically diverse group: many different properties and functions.
Biosynthesis of phenolics Shikimic acid pathway is most common in plants. Converts simple carbohydrates into aromatic amino acids. Not present in animals.
Most plant phenolics are derived from cinnamic acid formed from phenylalanine by phenylalanine ammonia lyase (PAL)
enzyme.
PAL
PAL activity is inducible: fungal infection, low nutrient levels, high light
OH
O
HO
OH
O
O
HO
OH
FLAVANON KHALKON
Pokok-pokok Biosintesis Flavonoid
Hubungan Biogenetik Berbagai jenis Flavonoid (Grisebach)
O
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
O
O
OH
OH
HO
O
O
H
[O]
O
OH
OH
HO
O
OH
O a
OH
OH
HO
O
H
+OH-
H
b
a
+
Flavanon Khalkon
Flavanonol
O
OH
OH
HO
O
O
OH
OH
HO
O
OH
OH
HO
a-H+
-H+H
[O]
b
Flavon Auron Flavonol
O
OH
HO
O
H
H
O
O
OH
HO
OOH
Isoflavon
Katekin Antosianidin
O
O
CH OH
Biosintesis Antosianidin dan Katekin (Haslam)
O
OOH
HO
OH
OH
OHO
OHOH
HO
O
OH
OH
O
OH
O
O
OH
OH
O
OH
O
O
OH
OH
H+
O
OH
OH
OH
OH
Flavanonol
-H2O
H+
OO
OH
OH
OH
H+
+
HO
H+H+
OHO
OH
O
OH
H+
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
+OHO
OH
OH
OH
OH
Katekin Antosianidin
2[H]
Fungsi flavonoid pada tumbuhan Fungsi penyerbukan:pigmen tumbuhan, warna jingga, merah, biru dan ungu pada bunga dan buah. faktor penarik lebah, kupu-kupu, burung dan hewan lainnya, terjadi penyerbukan. Burung suka merah, lebah biru. Fungsi pengatur tumbuh. tidak langsung sebagai zat pengatur tumbuh melalui sistem IAA (Indole Acetic Acid) – IAA Oxidase. Secara in vitro, flavonoid (kuersetin ) dapat menghambat enzim IAA – Oxidae, berarti kuersetin secara tidak langsung meningkatkan pertumbuhan. Sebagai ”feeding deterrent” maupun ”feeding stimulant”. Kadar tanin yang tinggi pada buah muda merupakan ”feeding deterrent” kera maupun manusia tidak bernafsu untuk memakan sebelum masak. Senyawa morin dan isokuersetrin dalam daun murbei (Morus alba L), merupakan ”feeding stimulant” bagi ulat sutera (Bombyx mori). Zat alelopati. Untuk berinteraksi dengan lingkungan, tumbuhan menggunakan sinyal berupa senyawa kimia.Pada tahun 1986, secara hampir bersamaan, para ahli dari berbagai laboratorium di dunia melaporkan bahwa simbiosis antara tumbuhan polong-polongan dengan bakteri marga Rhizobium dipicu oleh sinyal kimia berupa senyawa flavonoid dari akar tumbuhan. Sejak tahun 1982, ahli ekologi mengetahui tumbuhan “Spotted knapweeds” (Centaurea maculosa Lam.) mengeluarkan senyawa alelopati yang menghambat pertumbuhan tumbuhan lain di sekitarnya, tahun 2001 diketahui adalah (-) – katekin (golongan flavan), sekarang diteliti untuk herbisida alam. Tabir surya. Rusaknya ozon di lapisan stratosfir, terutama di daerah dekat Kutub Selatan, tumbuhan mengalami cekaman sinar ultraviolet B (UVB). Sejenis semanggi di Selandia Baru mempunyai toleransi yang tinggi terhadap sinar UVB, adaptasi ini karena kadar flavonoid meningkat.
II. Ekstraksi dan Isolasi 1.Ekstraksi Aglikon adalah polifenol maka bersifat fenol, agak asam,
larut dalam basa. Senyawa polar, kepolaran berbeda-beda. Umumnya larut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetil sulfoksida, dimetilformamida, air. Bentuk glikosida karena ada gula mudah larut dalam air, campuran pelarut diatas dengan air merupakan pelarut yang baik untuk glikosida. Sebalik, aglikon kurang polar seperti isoflavon, flavanon dan flavon serta flavonol termodifikasi, cenderung larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform.
Bahan segar bahan ideal untuk analisis flavonoid, kering dan lama masih tetap memberi hasil baik. Bila bahan segar, sisa cuplikan yang dianalisis segara keringkan mencegah kerja enzim. Ekstraksi baik dua tahap; pertama metanol-air (9 : 1) dan kedua metanol-air (1 : 1). Ekstrak dicampur dan diuapkan hingga sepertiga , atau hampir semua metanol menguap. Ekstrak dapat dibebaskan dari senyawa kepolarannya rendah seperti lemak, terpena, klorofil, xantofil dengan ekstraksi (dalam corong pisah) menggunakan pelarut heksan atau kloroform. Ekstraksi dilakukan beberapa kali, lapisan air mengandung sebagian besar flavonoid, dirotapavor.
Lanjutan Pemilihan pelarut tidak hanya tergantung pada kepolaran, tetapi juga tempat substansi berada. Bila pada vakuola sel, bersifat hidrofilik, penyarian dengan air atau pelarut alkoholik. Jika dalam kloroplas pelarut nonpolar sebelum alkoholik.
Ekstraksi flavonoid tidak cocok untuk antosianin atau flavonoid kepolaran rendah. Antosian, daun segar atau bunga segera digerus dengan NaOH yang mengandung 1% HCl pekat. Ekstraksi terjadi ditandai adanya perubahan warna larutan, kromatografi atau analisis spektroskopi ekstrak segera dilakukan untuk mencegah hidrolsisi glikosida. Untuk simplisia yang mengandung flavonoid dengan kepolaran yang lebih rendah lagi langsung diisolasi dengan heksana atau eter beberapa menit, ingat ekstrak yang diperoleh mengandung lemak dan lilin.
2 Isolasi Metode terbaik isolasi campuran flavonoid a.l kromatografi kertas (KKt) dan kromatografi lapis tipis (KLT). Metode KKt, kertas disarankan kertas Whatman 3MM (46 x 57 cm) atau setara. Ekstrak ditotolkan 8 cm dari tepi lipatan pertama dan 3 cm dari lipatan kedua dengan garis tengah 3 mm berpusat pada satu titik, keringkan bercak dengan pengering rambut. Ekstrak yang ditotolkan secara umum yaitu dari sejumlah ekstrak yang diperoleh dari 50 – 100 mg bahan tumbuhan kering. Elusi pertama dapat BAA (n-Butanol, Asam asetat, Air = BAW) 4:1:5 atau TBA (t-BuOH:HOAc:H2o) 3:1:1. Kertas diangkat, keringkan di lemari asam, bagian kromatogram yang dilipat (a) digunting. Eluen kedua menggunakan biasanya berupa larutan dalam air seperti asam asetat 15%. Untuk antosianin disarankan pengembang setara , biasanya BAA atau Bu/HCl dan kedua HCl 1%.
Flavonoid tidak nampak, kecuali antosian (bercak jingga sampai lembayung yang biru dengan uap ammonia), khalkon, auron dan 6-hidroksi flavanol kuning). Karena alasan tersebut, untuk mendeteksi bercak, kromatogram diperiksa dengan sinar UV (366 nm dan 254 nm) diperjelas dengan uap ammonia.
Lanjutan Untuk isolasi flavonoid skala besar dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoid (berupa larutan) di atas kolom berisi serbuk penjerap (seperti selulosa, silika, atau poliamida), lanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang sesuai. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujungnya dengan ukuran garis tengah berbanding panjang kolom 1:10 atau 1:30.
Mengemas kolom dengan hati-hati agar kolom homogen, Jika tidak ada kaca masir, dapat kaca wol atau kapas, sumbat ini direndam pengelusi tingginya ± 10 cm. Kemasan kolom dibuat bubur dengan pelarut sama, lalu dituang ke dalam kolom tanpa putus agar tidak terbentuk lapisan. Kemasan dibiarkan turun dan kelebihan pelarut dibiarkan turun. Jika fase diam poliamida yang digunakan maka dianjurkan untuk mengembangkan dulu satu jam.
Selanjutnya larutan cuplikan ditempat di atas kemasan sedemikian rupa sehingga berupa satu pita, menggunakan pelarut sesedikit mungkin untuk hasil yang baik. Biarkan larutan cuplikan meresap ke dalam kemasan dengan membuka sedikit keran, tutup dan tambah perlahan-lahan cairan pengelusi dan dibiarkan kembali meresap ke dalam kemasan.
Memilih kemasan kolom disesuaikan dengan
flavonoid yang diisolasi; 1. Selulosa. Ideal untuk pemisahan antara glikosida atau glikosida dengan aglikon dan aglikon yang kurang polar 2. Silika. Baik untuk aglikon yang kurang polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon dan falavonol 3. Poliamida. Cocok untuk memisahkan flavonoid dan glikosida. 4. Gel sephadex (deret G). Digunakan memisahkan campuran, terutama berdasarkan atas ukuran molekul 5. Gel sephadex (LH-20). Dirancang untuk menggunakan pelarut organik, dan dapat digunakan dua cara.
3 cm
8 cm
arah aliran pengembangpertama
arah aliran pengembangpertama
biarkan 5 cm
(a) (b)
(c) (d)
Karakterisasi dan Identifikasi Secara umum ditentukan dengan uji warna, kelarutan, bilangan Rf dan ciri spektrum ultraviolet.
Jika tidak tercampur, dengan uap ammonia berwarna spesifik masing golongan. Falavon & flavonol kuning-kuning kemerahan. Antosianin merah biru, flavononol orange atau coklat. Warna merah & lembayung terjadi mendadak dalam suasana asam, khalkon atau auron.
Flavonoid kuning terang atau jingga dalam larutan basa, jika bagian tumbuhan tanwarna diuapi amonia, terbentuk garam karena struktur kuinoid pada cincin B seperti berikut :
O
O
OH
O
O
O-
O
O-
O
OH-
Pembentukan struktur kuinoid dari flavonoid dengan basa
O
O
OH
HO
OH
O
O
HO
O
BOOH
HO
NaOAc, H3BO3
OH-
Kompleks flavonoid dengan asam borat dan natrium asetat
Adanya gugus fenol memberikan reaksi positif dengan pereaksi fenol, misalnya besi (III) klorida dan pereaksi asam sulfat memberi warna spesifik. Reaksi ini tidak spesifik, tidak dapat digunakan membedakan golongan dan harus diikuti oleh uji warna lainnya.
Flavonoid dengan gugus hidroksil kedudukan orto berwarna kuning intensif jika bereaksi dengan asam borat dan larutan natrium asetat, seperti rekasi berikut:
Selain pada kedudukan orto, gugus hidroksil dengan kedudukan lain diduga dapat membentuk ikatan dengan campuran asam sitrat dan asam borat, pada pemanasan, pereaksi sitroborat, mekanisme reaksi yang terjadi belum dapat diketahui secara pasti. Warna fluoresensi yang terbentuk adalah kuning,kuning kehijauan dengan sinar UV 366 nm.
Pereaksi AlCl3 membentuk kompleks dengan
flavonoid (gugus hidroksil berkedudukan orto) menimbulkan warna kuning, ini tidak stabil dengan HCl dan terurai kembali, jika gugus hidroksil yang berkedudukan dekat gugus karbonil akan stabil dengan penambahan HCl.
O
O
OH
HO
OH
O
O
HO
O
AlO
AlCl3
HCl
O
O
OH
HO
OH
OHO
OH
OH
OHO
AlO
Cl Cl
OHO
O
AlO
OAl
O
Cl Cl
AlCl3 HCl
Cl
Cl
Kompleks flavonoid dengan AlCl3 lewat gugus hidroksil yang berkedudukan orto dan yang berkedudukan dekat gugus karbonil, digunakan dasar penetapan adanya gugus hidroksil pada kedudukan tertentu dalam molekul flavonoid.
Lazim identifikasi flavonoid diawali dengan
reaksi warna menggunakan pereaksi-pereaksi, seperti natrium hidroksida, asam sulfat, besi (III) klorida, logam magnesium dan asam klorida. Kelarutan dari flavonoid menjadi dasar dalam ekstraksi dan pemisahan secara kromatografi, sifat-sifatnya dengan pereaksi-pereaksi tertentu menjadi dasar analisis spektrofotometri UV-tampak.
Hidrolisis Flavonoid terdapat pada semua bagian tumbuhan tinggi, seperti bunga, daun, ranting, buah, kayu, kulit, kayu dan akar. Flavanoid tertentu bisa terkonsentrasi pada satu jaringan, misal antosianidin zat warna bunga, buah dan daun.
Sebagian besar flavonoid alam dalam bentuk glikosida, adalah kombinasi antara gula dan alkohol saling berikatan melalui ikatan glikosida. Prinsip ikatan glikosida, gugus hidoksil dari alkohol beradisi ke gugus karbonil dari gula, sama seperti adisi alkohol ke aldehida yang dikatalis oleh adanya asam menghasilkan asetal.
C
R
R
+ R'OH C
R
OHH
OR'
C
R
OR'H
OR'+
+ H2O
Aldehida Alkohol Hemiasetal Asetal
R'-OH
H+
C
OH
OH
OH
OH
CH2OH
O
OH
OH
OH
CH2OH
H
OOH O
OH
OH
OH
CH2OH
OR'
Glukosa Glukosa Glukosida(rantai terbuka) (siklik hemiasetal)
R'OH
H+
Pada hidrolisis, glikosida terurai kembali atas komponennya menghasilkan gula dan alkohol, alkohol disebut aglikon. Biasanya, sisa gula dari glikosida flavonoid alam adalah glukosa, rhamnosa, galaktosa dan gentiobiosa, sehingga glikosida tersebut masing-masing disebut glukosida, rhamnosida, galaktosida dan gentiobiosida.
Flavonoid dapat ditemukan sebagai mono, di atau tri-glikosida, dimana satu, dua atau tiga gugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan hanya sedikit larut dalam pelarut organik seperti eter, benzen, kloroform dan aseton.
Untuk membedakan aglikon dan gula yang terikat sebagai glikosida, perlu dilakukan hidrolisis dapat dengan asam, enzim atau basa.
Hidrolisis dengan asam Biasanya dengan HCl, ikatan O-glikosida atau C-glikosida. C-glikosida, sangat tahan asam, dibedakan waktu atau lama hidrolsis. Juga dipengaruhi posisi ikatan gula pada flavonoid. Gula posisi 3 lebih mudah dihidrolisis dibanding posisi 7, paling mudah posisi 5. Flavonol 3-rhamnofuranosida kurang stabil sehingga hidrolsis lebih cepat dibanding flavonol 3-rhamnopiranosida relatif lebih stabil. Cara baku hidrolisis O-glikosida: Larutan glikosida (1mg) hidrolisis 5 ml HCl 2N : MeOH (1:1) dalam labu alas bulat 25 ml, refluks 60 menit. Rotavapour, sisa larutkan dengan MeOH : H2O (1:1) sesedikit mungkin. KKt atau KLT-selulosa, 15% asam asetat, hasil : - jika terjadi hidrolsisi, Rf akan lebih kecil, suatu O-glikosida, kemungkinan kecil bisulfat atau C-glikosida ter-O-glikosida. - Jika tidak terjadi hidrolisis, adalah C-glikosida atau glukoronida - Jika hidrolisis sebagian, mungkin glukuronida
Hidrolsis dengan enzim Berguna menentukan sifat ikatan antara gula dan flavonoid (yaitu α atau β), khas hanya memutuskan monosakarida flavonoid O-glikosida. Selanjutnya dianalisis dengan KLT, atau KGC untuk mengetahui hasil hidrolosis, - β-glukosidase (emulsin), menghidrolsisi β-D-gluksoda dan xilosida, tidak menghidrolsisi antosianidin glikosida. - β-galaktosidase, menghidrolsisi β-D-galaktosida - β-glikuronidase, menghidrolsisi β-D-glukuronidase - Pektinase, menghidrolsis α-D-poligalakturonida dan α-L-rhamnosida - Antosianase, menghidrolsis sebagian besar antosiani din glikosida - Rhamnodiastase, memutuskan sebagian besar oligo sakarida secara utuh dari glikosida dalam Rhamnus frangula - Takadiastase, menghidrolsisi naringenin 7-O-neo hesperidosida.
HIDROLISIS DENGAN BASA Jarang digunakan hidrolisis gliksodia flavonoid, digunakan untuk memutuskan gula secara selektif dari posisi 7, 4’, 3-hidroksil. Keselektifan ini kebalikan dari hidrolisis asam.
Hidrolsis basa melepaskan disakarida dari 7 – hidroksil asal ikatan antara glukosida bukan (1----2). Rutinosida terhidrolisis, tetapi 7-O-apiol (1----2) glukosida dan 7-O-neohesperidosida tidak hidrolsis. Jaga tidak ada kontak udara, sebab flavonoid terurai suasana basa jika ada oksigen. Kebanyakan 7 – dan 4’ – O – gliksida pecah waktu 30 menit, beberapa glikosida perlukan waktu dua jam.Pemutusan gula yang terikat posisi 4’ secara selektif tanpa ganggu gula posisi 7. Cara: Larutan glikosida (10 – 30 mg) dalam 10 ml KOH 0,5% refluks dengan tangas air 30 menit lingkungan N2. Netralkan dengan HCl 2N, dikromatografi kertas eluen HOAc 15% untuk isolasi flavonoid