1

Doktorski studij: BIOLOGIJA NOVOTVORINA Medicinski fakultet u Splitu

FITOTERAPEUTSKI PRIPRAVCI I SPOJEVI

S PROTUTUMORSKIM DJELOVANJEM

- nastavni materijal

Dr. sc. Igor Jerković, docent

Kemijsko-tehnološki fakultet u Splitu, Zavod za organsku kemiju

e-mail: igor@ktf-split.hr

Split, lipanj 2008.

2

1. Farmakognozija i fitoterapija

Farmakognozija je znanost o ljekovitim tvarima biljnog, životinjskog i

mineralnog porijekla (suvremena farmakognozija obuhvaća i

mikroorganizme). Riječ "farmakognozija" izvedenica je grčkih riječi

pharmakon (droga) i gnosis (znanje). Prema "The American Society of

Pharmacognosy" definira se kao "the study of the physical, chemical,

biochemical and biological properties of drugs, drug substances or potential

drugs or drug substances of natural origin as well as the search for new

drugs from natural sources". Farmakognozija je interdisciplinarna znanost

koja povezuje različita znanstvena područja: botaniku, biologiju,

mikrobiologiju, kemiju, farmakologiju i dr. Suvremena istraživanja

farmakognozije se dijele na:

• medicinsku etnobotaniku (izvedenica ethno - istraživanje kulture i

botany - istraživanje biljaka) - znanstvena istraživanja tradicionalne

uporabe biljaka u medicinske svrhe, odnos ljudi - biljke (Journal of

Ethnobiology and Ethnomedicine);

• etnofarmakologiju (združivanje socijalne znanosti - etnologije i

medicinske znanosti - farmakologije) - znanstvena istraživanja

farmakološke kvalitete tradicionalnih ljekovitih tvari koja dovode u

korelaciju etničke grupe, njihovo zdravlje i kako se to odnosi na

njihove navike i korištenje prirodnih ljekovitih tvari

(Ethnopharmacology);

• fitoterapiju - medicinska uporaba biljaka, dijelova biljaka i biljnih

pripravaka (Phytotherapy Research);

3

• fitokemiju - istraživanje prirodnih spojeva iz biljaka (najčešće

sekundarnih metabolita), uključujući i identifikaciju novih ljekovitih

spojeva iz biljnih izvora (Phytochemistry).

Fitoterapija je poveznica farmakologije i komplementarne medicine

u tretiranju i prevenciji bolesti, a podrazumijeva liječenje, ublažavanje i

prevenciju bolesti primjenom ljekovitih biljaka, njihovih dijelova i biljnih

pripravaka (npr. ekstrakti, tinkture). To je prvi oblik medicine koji je čovjek

poznavao, stoljećima jedini oblik liječenja i ublažavanja boli. Biološki

aktivne tvari, odgovorne za terapijski učinak, obično su koncentrirane su u

pojedinim biljnim organima (list, cvijet, plod, korijen) ili ekskretima (npr.

eterično ulje). U praksi se koriste dijelovi biljke bogati ljekovitim tvarima i

nazivaju se ljekovitim drogama ili samo drogama. Ljekovite biljke se koriste

od antičkih vremena za tretiranje različitih oboljenja. Unatoč znatnom

napredku moderne medicine, posljednjih desetljeća ljekovite biljke i dalje

znatano doprinose zdravstvu (prevencija i tretiranje oboljenja). U

posljednijm desetljećima porastao je broj ljekovitih tvari dobivenih iz viših

biljaka, osobito fitofarmaceutika. Procjenjuje se da je cca. 25% svih

modernih ljekova izravno ili neizravno izvedeno iz viših biljaka. U

posebnim slučajevima, kao što su antitumorski i antimikrobni ljekovi, cca.

60% ljekova trenutno dostupnih na tržištu, kao i onih u posljednjim fazama

kliničkih ispitivanja, izvedeno je iz prirodnih spojeva (uglavnom iz viših

biljaka).

Prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji (WHO, "World Health

Organization"), zbog siromaštva i nedostupnosti moderne medicine, oko 65-

80% svjetske populacije koja živi u zemljama u razvoju ovisi prvenstveno o

ljekovitim biljkama za primarnu zdravstvenu zaštitu. Velike svjetske

4

farmaceutske kompanije pokazuju obnovljeni interes za više biljke kao

izvore novih vodećih biološko-aktivnih spojeva (struktura), kao i za razvoj

standardiziranih fitoterapeutskih pripravaka s dokazanom učinkovitosti,

sigurnosti i kvalitetom. Biljni ljekoviti pripravci su veoma popularni u

zemljama u razvoju, ali i u razvijenim zemljama. Svjetsko tržište

fitofarmaceutskih pripravaka raste od 1985. god. za cca. 5-18% godišnje.

Nekoliko važnih čimbenika je doprinjelo ovakovom rastu:

• sklonost prirodnim terapijama,

• zabrinutost zbog nepoželjnih popratnih učinaka modernih ljekova i

uvjerenja da su biljni pripravci osloboñeni tih učinaka (budući milijuni

ljudi širom svjeta koriste ljekovite biljke tisućama godina),

• vjerovanje da ljekovite biljke mogu biti korisne u tretiranju odreñenih

bolesti kada se konvencionalne terapije pokažu neučinkovitima,

• poboljšanje kvalitete i dokaza učinkovitosti i sigurnosti ljekovitih biljaka,

• visoka cijena sintetskih ljekova i dr.

Fitoterapeutici ili fitofarmaceutici prema definiciji (ESCOP - "Europe

Scientific Corporative of Phytotherapy") kao aktivne sastojke sadrže biljke,

biljne dijelove i njihove pripravke, a podrazumijevaju standardizirane biljne

droge sa strogo definiranim sadržajem i sastavom terapijski aktivnih tvari,

čija je učinkovitost potvrñena farmakološkim i kliničkim istraživanjima, uz

naznaku mogućih nuspojava i interakcija s drugim lijekovima.

Fitoterapeutici ne uključuju kemijski definirane izolirane tvari, bilo

pojedinačne ili u kombinaciji s biljnim materijalima. Izolirana pojedinačna

aktivna biljna tvar predstavlja granicu fitoterapije i farmakoterapije!!

Učinci fitofarmaceutika se temelje, kao i u slučaju sintetskih tvari, na

5

farmakološkim zakonima. Naravno, modeli aktivne tvari u farmakologiji se

temelje na jakom učinku pojedinačne tvari i često ne mogu zadovoljiti

smjesu tvari sa širim područjem djelovanja. Stoga se moraju razvijati

kompleksniji modeli za objašnjavanje učinaka fitoterapeutika, te bi se

znanstvena fitoterapija mogla smatrati integralnim dijelom farmakologije.

Meñutim, ispravna upotreba fitofarmaceutika zahtijeva posebne procedure i

načine razmišljanja, pa fitoterapija ipak predstavlja posebno područje

istraživanja.

Osnovna karakteristika fitofarmaceutika/fitoterapeutika je postojanje

smjesa prirodnih tvari, a ponekad se procesuira i nekoliko biljaka (dijelova)

u jedan pripravak. Njihove komponente se dijele na aktivne i prateće tvari u

skladu s njihovim udjelom na kumulativni učinak. Općenito, količina

djelatne (aktivne) tvari prisutne u biljnoj drogi ovisi o:

• uvjetima rasta biljke (tlo, temperatura, vlažnost, godišnje doba),

• stupnju zrelosti biljke u trenutku sabiranja,

• procesu sušenja,

• načinu i vremenu skladištenja.

Prateće tvari takoñer mogu doprinijeti učinku fitofarmaceutskog

pripravka preko interakcije s aktivnim tvarima. Dakle, često cijeli niz u biljci

prisutnih tvari pridonosi postizanju željenog učinka (npr. sinergističko

djelovanje). U tom slučaju iz ljekovite biljke treba izvući sve te tvari

istodobno, zadržavajući njihov meñusobni odnos. Tako se dobiva

standardizirani ekstrakt. Pri kontroliranoj preradi (dobivanju

standardiziranog ekstrakta) gore spomenute varijable se kontroliraju u

procesu proizvodnje sa standardiziranjem koncentracije aktivnih tvari. Uz

aktivnu tvar, biljni ekstrakt sadrži i "druge komponente" prisutne u biljci,

6

kemijski vrlo raznolike, koje zajedno s djelatnim tvarima čine fitokompleks.

Važnost "ostalih komponenti" je u tome što moduliraju djelovanje aktivnih

tvari i pospješuju njihovu apsorpciju. Kao rezultat korištenja fitokompleksa

u odnosu na pojedinačnu djelatnu tvar, uočeno je smanjenje toksičnosti,

neželjenog djelovanja te cjelovitiji i uravnoteženiji učinak na cijeli

organizam. Farmakološka djelotvornost biljne droge je rezultat kombinacije

svih prisutnih tvari u proporcionalnoj ravnoteži u fitokompleksu. Općenite

karakteristike fitofarmaceutika su:

• Blago djelovanje - Aktivne tvari u fitofarmacima obično su razrijeñene

pratećim tvarima (biološki neaktivnim), a i same po sebi imaju blago

djelovanje. Fitofarmaceutici su manje specifični od sintetskih lijekova i

obično imaju širi spektar djelovanja.

• Manje neželjenih djelovanja - Aktivne tvari fitofarmaka brže se

metaboliziraju i izlučuju iz organizma pa rjeñe dolazi do nakupljanja u

organizmu i mogućeg štetnog djelovanja.

• Tijekom terapije više je izražena psihosomatska komponenta –

Pacijenti često bolje prihvaćaju fitofarmaceutike nego sintetske lijekove.

• Djelovanje je sporo - Često je potrebno dugotrajno liječenje.

• Moguće opasnosti - Nijedna farmakološki aktivna tvar nije samo

ljekovita, već istodobno ima i odreñenu štetnost. Budući da sve tvari

prisutne u biljnoj drogi nisu uvijek poznate, nije poznato ni da li i u kojoj

mjeri mogu u odreñenim situacijama biti štetne (rizik je veći u složenijim

situacijama liječenja). Kod samoniklih biljaka, ali i tijekom pripreme

moguća je kontaminacija biljne droge gljivicama, bakterijama, insektima,

teškim metalima, čime se smanjuje koncentracija aktivne tvari i povećava

opasnost od trovanja.

7

Fitoterapija prestaje upravo u trenutku kada se metodama izolacije i

obradom izolata dobije aktivna čista tvar. Dobivena čista tvar, za koju je

utvrñena farmakološka djelotvornost, postaje tada sastavni dio liječenja u

tradicionalnoj medicini. Npr. salicilna kiselina, praotac Aspirina®, a time i

svih protuupalnih nesteroidnih lijekova (najviše korištenih lijekova protiv

bolova), potječe od kore vrbe od koje se mljevenjem dobivao prašak koji se

koristio kao fitofarmaceutik: analgetik (sredstvo za umanjivanje boli koje ne

izaziva gubitak svjesti) i antipiretik (sredstvo za snižavanje povišene tjelesne

temperature). Gotovo istodobno s ovim otkrićem, uočena je i njeno štetno

djelovanje na želučanu sluznicu. Zahvaljujući radu kemičara, salicilna

kiselina se acetiliranjem prevodi u acetilsalicilnu kiselinu (aspirin), čime se

smanjuje nepoželjno djelovanje i time je dobiven lijek - aspirin.

1.1. Jednostavni fitoterapeutski pripravci

Jednostavni fitoterapeutski pripravci se mogu lako pripraviti ekstrakcijom

biljne droge s vodom i/ili alkoholom (etanolom), a meñusobno se razlikuju

po načinu provoñenja ekstrakcije, te se mogu podijeliti na:

• Rinfuz - Propisana količina biljne droge (oko 2-5 g) prelije se

kipućom vodom (150-250 mL), ostavi da stoji poklopljena 5-10 min

O

HO

HO

OH

O

OH

CH2OH

HIDROLIZA salicin 2-hidroksibenzil

-alkohol aspirin

CH2OH

HO

Felix Hoffman 1890-tih (Bayer)

COOH

AcO

u kori vrbe

8

uz povremeno miješanje te se procijedi. Rinfuz je prikladan za većinu

lišća, cvjetnih droga, mekog korijenja i pravilno usitnjenih kora.

• Uvarak - Propisana količina biljne droge stavlja se u hladnu vodu,

zagrijava do vrenja, kuha nekoliko minuta (obično 5-10 min. ili 15-30

min.), ostavi stajati poklopljeno 10-20 min. uz povremeno miješanje,

te se procijedi. Ovaj postupak prikladan je za čvrste biljne droge:

drvo, korijenje, koru.

• Macerat - Biljna droga prelije se propisanom količinom hladne vode,

ostavi nekoliko sati na sobnoj temperaturi i zatim procijedi. Ovaj

način pripreme prikladan je za biljne droge koje sadrže sluzi, budući

da se biljna sluz kuhanjem uništava. Kod nekih biljnih droga ovaj se

postupak može koristiti kako bi se spriječila ekstrakcija nekih

neželjenih tvari npr. treslovine.

Prednost uporabe vrele vode u izradi pripravka je uništenje bakterija u

biljnoj drogi. Zbog opasnosti od razvoja bakterija, rinfuz se može čuvati

24h, a macerat samo 4h.

1.2. Oblikovani fitoterapeutski pripravci

Osim jednostavnih fitoterapeutskih pripravaka, postoje i tzv. oblikovani

pripravci koji zahtijevaju duže vrijeme pripremanja, pa su obično već

pripravljeni za konzumiranje ili je olakšano doziranje preko filter vrećica.

Prednosti filter vrećica su praktičnost primjene, unaprijed odreñena doza za

uporabu, te visoki stupanj usitnjenosti biljne droge koji omogućava

kompletnije iskorištavanje djelatne tvari iz biljke. Meñutim, zbog

9

usitnjenosti, u biljnim drogama koje sadrže eterična ulja djelatna isparljiva

tvar gotovo potpuno ishlapi. Prednost ovakovih pripravaka je i njihova veća

trajnost u odnosu na jednostavne pripravke. Oblikovani fitoterapeutski

pripravci mogu se podijeliti na:

• Biljni prah - Dobiva se usitnjavanjem suhe biljne droge. Najčešće se

dozira u kapsulama.

• Tekući ekstrakt - Dobiva se maceracijom sušene biljne droge u

otapalu (najčešće smjesa voda-alkohol). Vrijeme maceracije je cca. 21

dan). Tako dobivene biljne tinkture sadrže 60-70% alkohola.

• Suhi ekstrakt - Dobiva se ekstrakcijom djelatnih tvari uz pomoć

odgovarajućeg otapala (voda-alkohol), nakon čega se otapalo odstrani.

Tako dobivena kruta tvar lako je topljiva u vodi s velikim postotkom

aktivne tvari.

• Majka tinktura - Dobiva se maceracijom svježe ubrane biljne droge

u vodeno-alkoholnom otapalu (45-50% alkohola). Prisutnost alkohola

sprIječava razvoj mikroorganizama.

• Glicerinski macerat - Dobiva se maceracijom svježe ubranih, mladih

dijelova biljke u mješavini vode, alkohola i glicerina.

• Liofilizirani ekstrakt - Dobiva se složenim, skupim tehnološkim

postupkom kojim se dobiva optimana koncentracija aktivne tvari te

najbolja sačuvanost cjelovitosti fitokompleksa u pripravku.

Liofilizacija je postupak sušenja u smrznutom stanju gdje se uklanja

voda sublimacijom leda u vakuumu.

Suhi ekstrakti i liofilizirani ekstrakti predstavljaju najidealniji oblik, s

obzirom na koncentraciju djelatne tvari i bioraspoloživost, a prikladni su i za

dobivanje gotovih farmaceutskih pripravaka (sirupa, oralnih ampula,

10

tableta...). Tako dobiveni gotovi fitofarmaceutski pripravci ne utječu na

prirodnost proizvoda već doprinose boljoj iskorištenosti ljekovitih tvari iz

biljaka. Specifikacija pripravaka biljnih droga uključuje:

• kvalitetu biljne droge

• stabilnost konstituenata (mikrobiološka stabilnost, količina prisutnih

mikroorganizama, ostatna otapala u ekstraktima, sadržaj vode, teških

metala, pesticida i dr.)

• definirane uvjete sušenja

• sigurnosna i efikasna predklinička i klinička testiranja

• definiranje metode izolacije iz biljke

• odreñivanje fitokemijskih karakteristika (kemijski profili: HPLC/UV,

HPLC/MS, GC/MS, TLC-denzitometrija i dr.)

Mnogi čimbenici otežavaju klinička istraživanja s biljnim preparatima:

• nedostatak standardizacije i kontrole kvalitete biljnih preparata

• korištenje različitih količina preparata

• neadekvatan odabir pacijenata

• mali broj pacijenata za statističke značajke

• poteškoće u uspostavljanju prikladnih placeba zbog okusa, arome i dr.

• velike varijacije u trajanju tretmana i dr.

Općenita ideja o veoma sigurnim biljni preparatima osloboñenih

sporednih učinaka nije točna!! Biljke sadrže stotine konstituenata i neke su

veoma toksične kao što je većina citotoksičnih i antitumorskih biljnih droga.

Meñutim, nepovoljan učinak većine biljnih droga je općenito manje učestao

kada se droge upotrebljavaju ispravno u usporedbi sa sintetskim ljekovima.

Dvije vrste popratnih učinaka su uočeni kod biljnih preparata. Prvi

11

(intrinsični) se odnosi na predvidljivu toksičnost, predoziranje i interakciju s

konvencionalnim ljekovima (mnoge alergijske reakcije). S druge strane

većina poznatih popratnih učinaka (ekstrinsični) odnose se na pripremu npr.

pogrešnu identifikaciju biljaka, nedostatak standardizacije, kontaminacija

(npr. teški metali, pesticidi) i dr.

Pravni propisi za legalizaciju biljnih preparata (droga) mijenjaju se od

zemlje do zemlje. WHO je objavio opće vodilje s namjerom definiranja

temeljnih kriterija za evaluaciju kvalitete, sigurnosti i učinkovitosti biljnih

preparata s ciljem pomoći nacionalim zakonodavstvima, znanstvenim

organizacijama i proizvoñačima. Nadalje, WHO je pripremio farmakopejske

monografije o biljnim preparatima i osnovne vodilje za procjenu biljnih

droga. Standardizacija biljnih droga obuhvaća:

• botaničku autentifikaciju droge

• odreñivanje strane tvari

• organoleptičku procjenu

• makroskopsku i mikroskopsku analizu

• sadržaj i sastav isparljivih tvari

• udio pepela

• ekstraktivnu vrijednost

• kromatografski profil

• prisustvo marker komoponente(i)

• ostatak pesticida

• mikrobiološku analizu

• prisustvo radioaktivnih kontaminanata i dr.

12

Općeniti protokol za standardiziranu proizvodnju biljnih droga:

Analiza SIROVI BILJNI

MATERIJAL Izvor;

Identifikacija

Analiza u vrijeme primjene

SKLADIŠTENJE

Odgovarajući skladišni

uvjeti

Analiza tijekom procesa

PROIZVODNJA

Dobro definirani

proces

Analiza

PROCESUIRANI

MATERIJAL

Prikladno skladištenje

prije pakiranja

Studije stabilnosti

GOTOVI

PROIZVOD

Odgovarajuća ambalaža i

etiketa

Kada se sakupljaju različiti biljni dijelovi?

• Listovi – kada se cvatovi počimaju otvarati

• Cvatovi – neposredno prije negoli se potpuno otvore

• Korijenje – kada odumre nadzemni dio biljke

• Kora – nakon perioda vlažnog vremena

• Plodovi – potpuno zreli

• Smole – za vrijeme suhog vremena

13

2. Biljke kao izvor spojeva s protutomorskim djelovanjem

Biljke imaju dugu tradiciju uporabe u tretiranju tumora. Hartwell u

revijalnom pregledu biljaka koje se koriste protiv tumora spominje više od

njih 3000. Meñutim, u mnogim slučajevima pojam «tumor» nije definiran ili

se odnosi na različita stanja bolesnika, npr. pojačano znojenje i sl. Mnoge

tvrdnje o «učinkovitosti» u tretmanu tumora trebaju se revidirati sa više

skepticizma budući se tumor, kao specifična bolest, vjerojatno slabo definira

u tradicionalnoj medicini. Ovo je u suprotnosti u odnosu na druge terapije

ljekovitim biljem koje se koriste u tradicionalnoj medicini za tretiranje

drugih oboljenja kao što su malarija ili razne vrste boli, koji se mnogo lakše

definiraju i gdje su oboljenja često prevladavajuća u područjima gdje se

ekstenzivno koristi tradicionalna medicina.

Meñutim, preko 60% trenutačno korištenih protutumorskih sredstava

izvedeno je na ovaj ili onaj način iz prirodnih izvora, uključujući biljke,

morske organizme i mikroorganizme. Takoñer prirodni spojevi imaju i danas

dominantnu ulogu u otkriću vodećih struktura za razvoj konvencionalnih

ljekova za tretiranje većine oboljenja kod ljudi.

Istraživanje protutumorskih tvari iz biljaka počelo je 1950-tih sa

otkrićem i razvojem vinca alkaloida, vinblastina i vinkristina, te izolacijom

podofilotoksina. Ova otkrića su potakla United States National Cancer

Institute (NCI) na početak ekstenzivnog sakupljanja biljaka u 1960-tim,

fokusiranim uglavnom na umjerena klimatska podneblja. To je dovelo do

otkrića mnogih novih kemotipova biljaka sa spektrom citotoksičnog

djelovanja uključujući i taksane i kamptotecine, ali se njihov razvoj u

klinički aktivne tvari proširio na period od 30 godina (od ranih 1960-tih do

1990-tih). Ovaj program sakupljanja biljaka je završen 1982. god., ali sa

14

razvojem novih tehnologija za testiranje «screening» NCI je napravio

reviziju sakupljanja biljaka i organizama 1986. god. Ovaj put fokus je na

tropskim i subtropskim podnebljima, ali novo klinički testirano

protutomorsko sredstvo biljnog izvora još nije došlo u fazu opće upotrebe.

Meñutim, neka sredstva su u predkliničkom razvoju.

U daljnjem tekstu spomenute su odabrane biljake koje su poslužile

kao izvor prirodnih spojeva ili njihovih derivata s protutumorskim

djelovanjem u kliničkim ili predkliničkim istraživanjima.

2.1. Catharanthus roseus G. Don - Catharanthus roseus G. Don.

(Apocynaceae), je vrsta Catharanthus endenmska u Madagaskaru. Sinonimi

su Vinca rosea, Ammocallis rosea i Lochnera rosea; ostala engleska imena

koja se povremeno koriste su Cape Periwinkle, Rose Periwinkle i dr. To je

zimzelen grm do 1m visine. Listovi su ovalni 2,5-9 cm dugi i 1-3 cm široki,

bez dlaka. Cvatovi su bijeli do tamno rozi, sa tamnijim crvenim centrom.

Catharanthus roseus G. Don.

Samonikla je veoma ugrožena vrsta iako se široko kultvira i

naturalizirana je u tropskim i subtropskim područjima diljem svijeta kao

ukrasna biljka, ali i kao ljekovita biljka. U tradicionalnoj kineskoj medicini

njeni ekstrakti su korišteni za tretiranje različitih oboljenja uključujući

15

diabetes, malariju, Hodgkinsovu bolest. Može biti opasna ako se konzumira

oralno, kao i halucinogena. Tvari vinblastin (VLB) i vinkristin (VRC)

ekstrahirani iz biljke se koriste za tretiranje leukemije. Otkriveni su za

vrijeme istraživanja biljke kao potencijalnog oralnog hipoglikemičnog

sredstva. Nije potvrñena ova aktivnost, ali je otkriveno da ekstrakti biljke

reduciraju broj bijelih krvnih zrnaca, a zatim je otkriveno da tretiranje

miševa s transplantatom leukemije uzrokuje značajno produljenje života

miševa, što je kasnije dovelo do izolacije VLB i VLC kao aktivnih tvari.

2.2. Podophyllum peltatum Linnaeus - Podophyllum je rod sa 6 vrsta

(species) porodice Berberidaceae, potječe iz istočne Azije (5 vrsta) i istočne

Sjeverne Amerike (vrsta mayapple, P. peltatum).

Podophyllum peltatum Linneaus (myapple)

Svi biljni djelovi osim plodova su otrovni. Čak i plod može uzrokovati

neugodnosti u probavi. Tvar koju sadrže, podofilotoksin ili podofilin, se

16

koristi kao purgativ i citostatik. Podophyllum vrste (Podophyllaceae), P.

peltatum Linneaus i P. Emodii Wallich iz Indije imaju dugu tradiciju

medicinske uporabe uključujući tretiranje kožnih tumora. P. peltatum je

korišten od nativnih Amerikanaca (područje Maine) za tretiranje «tumora».

Glavni aktivni konstituent, podofilotoksin, prvi put je izoliran 1880. god, ali

je njegova točna struktura objavljena kasnije 1950-tih. Mnogi slični

podofilotoksin-slični ligandi su izolirani za vrijeme ovog perioda, a nekoliko

njih je uvedeno u klinička istraživanja, ali su odbačeni zbog nedostatka

efikasnosti i neprihvatljive toksičnosti.

2.3. Taxus brevifolia Nutt. - Taxus brevifolia (pacifička tisa (pacific yew) ili

zapadna tisa (western Yew)) samonikla je u sjevernoistočnom Pacifiku i u

Sjevernoj Americi. Proteže se od Aljaske do središnje Kalifornije, uglavnom

u pacifičkim priobalnim područjima. To je malo do srednje zimzeleno drvo,

10-15 m visoko promjera do 50 cm. Posjeduje tanku smeñu koru, a listovi su

tamnozeleni, 1-3 cm dugi i 2-3 mm široki.

Taxus brevifolia (kora) Taxus brevifolia (iglice)

17

Paklitaksel (taksol) u početku je izoliran iz kore T. Brevifolia

(Taxaceae), sakupljene u Washingtonu kao dio programa slučajnog

sakupljanja biljaka od strane U. S. Department of Agriculture (USDA) za

NCI. Listovi T. Baccata se koriste u tradicionalnoj Azijsko-Indijskoj

medicini za tretiranje tumora. Kako je postala izuzetno rijetka nakon što je

otkriven njen kemoterapeutski potencijal, T. brevifolia nije nikada sabirana s

njenog staništa u velikoj mjeri, a široka upotreba paklitaksela je omogućena

kada je razvijen polusintetski put.

2.4. Camptotheca acuminata Decne - Camptotheca acuminata Decne

(Nyssaceae), sinonim sretno drvo (happy tree) je drvo srednje veličine do 20

m visine, potječe iz središnje Kine. Naziv happy tree je izravan prijevod

kineskog imena xi shu.

Camptotheca acuminata Decne

Ekstrakt drveta se koristu u tretiranju tumora. Kamptotecin je otkriven iz

ekstrakta biljke izvorno sakupljene od U. S. Department of Agriculture kao

potencijalni izvor steroidnih prekursora za proizvodnju kortizona. Ekstrakt

C. acuminata je bio jedini od 1000 ekstrakata koji je testiran na

antitumorsku aktivnost, a pokazao je učinkovitost, a kampotecin je izoliran

18

kao aktivni konstituent ekstrakta. Kamptotecin (kao natrijeva sol) je korišten

u kliničkim istraživanjima od strane NCI u 1970-tim, ali je odbačen zbog

opasne toksičnosti za mjehur. Meñutim, intenzivna istraživanja su

nastavljena od nekoliko farmaceutskih tvrtki u potrazi za mnogo

učinkovitijim kamptotecin derivatima.

2.5. Betula spp. - Breza, Betula spp. (Betulaceae) se sastoji od 30-50 vrsta

koje rastu u Aziji, Sjevernoj Americi i Europi. Riječ betula je klasično

latinsko ime za brezu. Neke vrste su žuta breza (Betula alleghaniensis),

slatka breza (B. lenta), papirnata breza (B. papyrifera), riječna breza (B.

nigra), siva breza (B. populifolia) i zapadna papirnata breza (B. papyrifera

var. commutata).

šuma breza

19

Betulinska kiselina je izolirana iz mnogih taksonomski različitih

biljnih rodova. Glavni izvor je drvo breze, Betula spp., koja je primarni izvor

C28-alkoholnog prekursora, betulina. Izolacija betulina je prvi put objavljena

1788. god. Betulinska kiselina je povezana sa mnogim biološkim

aktivnostima uključujući antibakterijsko, antiupalno i antimalarijsko

djelovanje, ali najvažnije aktivnosti su citotoksična aktivnost protiv različitih

tumora. Značajna in vivo aktivnost je uočena kod životinjskih modela sa

ljudskim melanomom, a NCI pomoaže u razvoju ovog sredstva za uporabu u

kliničkim testiranjima.

3. Od ljekovitih biljaka do fitoterapeutskih pripra vaka i pojedinačnih

ljekovitih tvari - metode izolacije i pročišćavanja

Osim jednostavnih i oblikovanih fitoterapeutskih pripravaka kao smjese

aktivnih tvari, današnja istraživanja usmjerena su na izolaciju pojedinačnih

aktivnih tvari (ili smjesa manjeg broja tvari) iz biljaka ili pripravaka u cilju

odreñivanja kemijske strukture djelatne tvari, te korelacije biološke

aktivnosti s kemijskom strukturom. Naime, mješavine s velikim brojem

komponenata su neracionalne, te je moguće da djelatna komponenta nije

prisutna u dovoljnoj količini pa izostaje učinak. Izolacija pojedinačnih

biološki aktivnih tvari može predstavljati više ili manje složen problem,

ovisno o koncentraciji tvari i složenosti pratećih tvari. Prirodni spojevi mogu

doprinjeti istraživanju novih ljekova na različite načine:

• djelujući kao novi ljekovi koji se mogu koristiti u nepromijenjenom

stanju (npr. vinkristin iz Catharanthus roseus),

20

• osiguravajući kemijske «grañevne elemente» (eng. bilding blocks) za

sintezu više kompleksnih molekula,

• indicirajući nove načine farmakološkog djelovanja koji omogućavaju

potpunu sintezu novih kemijskih analoga.

Prirodni spojevi će se nastaviti smatrati glavnim izvorom novih droga u

nadolazećim godinama zbog toga što:

• pružaju neusporedljivu strukturnu različitost

• mnogi od njih su relativno mali (<2000 Da)

• imaju svojstva slična ljekovima (npr. mogu se absorbirati i

metabolizirati)

Samo mali dio svjetske bioraznolikosti je istražen na biološku aktivnost.

Tako postoji više od 250 000 vrsta viših biljaka, ali je do sada istraženo

jedva 5-10%. Nadalje, ponovno istraživanje predhodno studiranih biljaka

daje nove biološko aktivne spojeve. Razvoj i uvoñenje novih visoko

specifičnih tehnika, kromatografskih metoda i spektroskopskih tehnika

omogućilo je lakše, brže i preciznije testiranje, izoliranje i identificiranje

vodećih kemijskih struktura za ljekove. Strategije istraživanja prirodnih

spojeva su evoluirale značajno zadnjih desetljeća i mogu se podijeliti na:

1. Starije strategije:

• fokusirane na kemiju spojeva iz prirode, ali ne i na njihovu aktivnost,

• jednoznačna izolacija i identifikacija spojeva iz prirodnih izvora, a

zatim testovi biološke aktivnosti (in vivo),

• selekcija biljaka i organizama prema etnofarmakološkim

informacijama i tradiciji.

21

2. Suvremene strategije:

• izolacija i identifikacija vodećih aktivnih komponenti iz prirodnih

izvora koja je voñena prema biološkim probama (engl. bioassay-

guided), uglavnom in vitro,

• više su fokusirane na biološku aktivnost,

• odabir biljaka i organizama na temelju etnofarmakoloških informacija,

tradicije, ali i slučajni odabir.

3.1. Inicijalna izolacija tvari iz biljnog materija la

Odabir procudure izolacije ovisi o prirodi biljnog materijala i spojeva koji se

izoliraju. Prije odabira metode, potrebno je utvrditi cilj izolacije, koji može

biti:

• nepoznata bioaktivna komponenta

• poznata komponenta

• skupina spojeva koji su strukturno slični

• svi sekundarni metaboliti prisutni u biljci

Takoñer je potrebno potražiti odgovore koji se odnose na očekivane reultate

izolacije:

• Da li je izolacija spoja za karakterizaciju parcijalna ili potpuna? Koji

je potreban stupanj čistoće?

• Da li je izolacija provedena s ciljem dobivanje dovoljne količine za

potvrdu ili nepotvrdu predložene strukture prethodno izoliranog

spoja? – potrebne manje količine!

22

• Da li se izolacija provodi za dobivanje dovoljnih količina za daljne

studije, npr. za klinička ispitivanja? – potrebne veće količine!

Tipični inicijalni izolacijski proces za biljne materijale uključuje sljedeće

korake:

• sušenje i usitnjavanje biljnog materijala (homogenizacija)

• odabir i primjena prikladne metode izolacije: ekstrakcija, destilacija

ili tiještenje

• pročišćavanje ekstrakta (dekantiranje, centrifugiranje, filtriranje)

• koncentriranje (npr. uparavanjem) i sušenje ekstrakata

3.1.1. Metode ekstrakcije - Ekstrakcija je proces odjeljivanja sastavnica iz

biljnih droga na temelju različite topljivosti u otapalu kojim se vrši

ekstrakcija. Ekstrakcija uključuje nekoliko istovremenih procesa:

• difuzija otapala u stanice biljnog materijala

• otapanje metabolita u otapalu

• difuzija otapala s otopljenim tvarima izvan stanica

• ispiranje

23

Ekstrakcija se može olakšati usitnjavanjem (tada ekstrakcijski proces ovisi

isključivo o topljivosti) i povećanjem temperature (pogoduje topljivosti).

Uparavanje otapala daje suhi kruti ekstrakt.

Ekstrakti (iscrpine) su koncentrirani pripravci tekuće, krute ili guste

konzistencije; dobivaju se maceracijom, perkolacijom ili drugim pogodnim

validiranim metodama koristeći etanol ili drugo prikladno otapalo (prema

Europskoj farmakopeji, engl. European Pharmacopeia). Vrste ekstrakata su:

Extracta fluida - tekući ekstrakti (odnos droge i

otapala 1:1)

Extracta sicca - suhi ekstrakti (suhi dio

najmanje 95%)

Extracta spissa – gusti ekstrakti (suhi dio

najmanje 70%)

Čimbenici koji utječu na ekstrakciju su temperatura, veličina čestica,

gibanje otapala i pH-vrijednost. Poželjna svojstva otapala za ekstrakciju:

selektivnost za spojeve koje se žele ekstrahirati, veliki ekstrakcijski

kapacitet, nereaktivnost s biljnim sastavnicama, neškodljivost za ljude i

opremu, potpuna hlapljivost i niska cijena. Česte metode esktrakcije s

otapalima se dijele na kontinuirane i nekontinuirane postupke:

24

• maceracija (engl. maceration) – usitnjeni biljni materijal u

pogodnom otapalu u zatvorenoj posudi se ekstrahira na sobnoj

temperaturi. Povremeno ili konstantno miješanje može povećati

brzinu ekstrakcije (maceracija uz miješanje ili vrtložna

maceracija). Nakon ekstrakcije biljni materijal se odvaja

dekantiranjem uz filitriranje. Kako bi se osigurala iscrpna ekstrakcija,

nakon dekantiranja, može se dodati svježe otapalo (remacerizacija –

obično se provodi dva puta zastopno). Stupnjevita maceracija

podrazumijeva proces u kojem se pojedine sastavnice (otapala)

sredstva za ekstrakciju dodaju postepeno. Digestija je jednokratna

maceracija uz povišenu temperaturu.

• ultrazvučno potpomognuta ekstrakcija (engl. ultrasound assisted

extraction, USE) – ovo je modificirana maceracija, gdje je ekstrakcija

olakšana upotrebom ultrazvuka (visoko-frekventni pulsevi, 20 kHz).

25

A

B

C

Aparatura za ultrazvučnu ekstrakciju

s organskim otapalom: A –

ultrazvučna kupelj s vodom, B-

Erlenmayerova tikvica s uzorkom i

organskim otapalom, C - povratno

hladilo

Biljni materijal se postavlja u posudu koja se postavlja u ultrazvučnu

kupelj. Ultrazvuk se koristi za mehanički stres na stanice stvarajući

kavitacije u uzorku. Raspadanje stanica povećava topljivost

metabolita u otapalu i poboljšava ekstrakciju.

• perkolacija (engl. percolation) – usitnjeni biljni materijal se postavlja

u perkolator (cilindrični ili konični kontejner s pipcem na dnu) i

namače u otapalu. Dodatno otapalo se zatim dodaje na vrh biljnog

materijala i pušta da «perkolira» polako (kapajuće) sa dna perkolatora.

Fino sprašeni biljni materijal može biti zapreka za perkolaciju.

Nadalje, ako materijal nije homogeno distribuiran u kontejneru (ili

ako je pakiran suviše gusto) otapalo ne može doći do cijele površine

materijala i ekstrakcija će biti nepotpuna. Reperkolacija podrazumije

perkolaciju u kojoj je više ekstraktora spojeno u nizu. Evakolacija je

26

kontinuirana ekstrakcija uz primjenu vakuuma, a diakolacija je

kontinuirana ekstrakcija uz povišen tlak.

Perkolator

• ekstrakcija u Soxhletu (engl. Soxhlet extraction, SE) – usitnjeni

biljni materijal se postavlja u celulozni cilindar u ekstrakcijskoj

komori koji se postavlja iznad posude za sakupljanje, a ispod

refluksirajućeg hladila. Pogodno otapalo se stavi u posudu, te se

zagrijava i refluksira. Kada se odreñeni volumen otapala sakupi u

ekestrakcijskoj komori, sustavom sifona odlazi u posudu. Glavna

prednost Soxhleta je kontinuirana ekstrakcija u kojem se otapalo s

ekstrahiranim tvarima isprazni u posudu, svježe otapalo se kondenzira

i ekstrahira biljni materijal kontinuirano, što čini ovaj proces kraćim

uz upotrebu manjeg volumena otapala. Mana je u tome što se ekstrakt

kontinuirano zagrijava na temperaturu vrenja otapala, što može

dovesti do nastanka termičkih artefakata.

27

Soxhletov ekstraktor

• Ekstrakcija s otapalom pod tlakom (engl. pressurized solvent

extraction) – ili tzv. «ubrzana ekstrakcija s otapalom» zahtjeva više

temperature u odnosu na druge ekstrakcijske metode i visoke tlakove

kako bi se otapalo zadržalo u tekućem stanju pri visokim

temperaturama. Usitnjeni biljni materijal se postavi u posudu koja se

postavlja u peć. Otapalo se dovodi iz rezervoara tako da ispunjava

posudu koja se zagrijava i tlači programirano zadano vrijeme. Posuda

se zatim ispire s plinom dušikom, a dobiveni ekstrakt koji se

automatski filtrira se sakuplja. Svježe otapalo se koristi za otapanje

preostale količine spojeva. Konačno čišćenje s dušikom se provodi do

sušenja biljnog materijala. Visoke temperature i tlakovi povećavaju

prodiranje otapala u materijal i povećavaju topljivost metabolita,

mjesto za celulozni cilindar s uzorkom

28

ubrzavajući ekstrakciji proces i prinos. Budući je nakon ekstrakcije

materijal osušen, moguće je vršiti ponovljene ekstrakcije s istim

otapalom ili sukcesivne ekstrakcije koristeći otapala s rastućom

polarnosti.

• ekstrakcija pod refluksom (engl. extraction under reflux)– kod ove

ekstrakcije biljni materijal se uranja u otapalo u okrugloj tikvici koja

je spojena na kondenzator. Otapalo se zagrijava do vrenja. Kako se

otapalo kondenzira, otapalo se reciklira u tikvicu.

• ekstrakcija superkriti čnim fluidima (engl. supercritical fluid

extraction, SFE) – superkritični fluidi (SCFs) zamjenjuju organska

otapala. Kriti čna točka čiste tvari se definira kao najviša temperature i

tlak na kojima tvar može postojati u parno-tekućoj ravnoteži. Na

temperaturama i tlakovima iznad ove točke nastaje jedan homogen

fluid, poznat kao superkritični fluid (engl. supercritical fluid, SCF).

Fazni dijagram za CO2

29

SCF je težak kao tekućina ali ima svojstvo prodiranja kao plin, što mu

daje učinkovitost i selektivnost za ekstrakciju. SCF nastaju

zagrijavanjem plinova iznad kritične temperature ili komprimiranjem

tekućina iznad kritičnog tlaka. Promjenom tlaka i temperature mijenja

se sposobnost otapanja superkritičnog CO2 (visokokomprimirani CO2

(t > tk i p > pk)), bez mijenjanja sastava otapala. Ekstrakcija se obično

vrši na 40-50 oC i tlaku 200-300 bara.

3.1.2. Metode detilacije - Organske tvari, koje se s vodom ne miješaju

(većina komponenti eteričnih ulja), imaju svojstvo isparavanja zajedno s

vodenom parom, na temperaturi nižoj od njihova vrelišta, odnosno nižoj od

100 °C. Tu činjenicu objašnjava Daltonov zakon parcijalnih tlakova: tlak

para iznad heterogene smjese (smjese dviju ili više tekućina koje se ne

miješaju) jednak je zbroju parcijalnih tlakova pojedinih komponenti za datu

temperaturu, bez obzira na sastav smjese. Dakle, svaka komponenta u takvoj

smjesi se ponaša kao čista tekućina. Kako je tlak para iznad takve smjese

veći od parcijalnih tlakova pojednih komponenata, on će se izjednačiti s

vanjskim tlakom pri nižoj temperaturi, odnosno vrelište heterogne smjese bit

će niže od vrelišta bilo koje od komponentI. Vrste destilacija su:

- destilacije vodenom parom,

- vodene destilacije (hidrodestilacije),

- vodeno-parne destilacije.

Sve tri metode se zasnivaju na istim teorijskim principima destilacije, a

razlika je u primarnom kontaktu biljnog materijala i vode, tj. vodene pare.

30

3.1.2.1. Vodena destilacija (hidrodestilacija) - Ova metoda se najčešće

koristi za izolaciju eteričnih ulja, a podrazumijeva postavljanje usitnjenog

biljnog materijala u vodu uz zagrijavanje do ključanja, najčešće na

atmosferskom tlaku. Pare eteričnog ulja i vode se kondenziraju u hladilu i

sakupljaju. Postoje različite izvedbe aparatura, a meñu ostalima se mogu

razlikovati ovisno da li se koriste za izolaciju eteričnih ulja lakših ili težih od

vode.

Standardne laboratorijske aparature za

izolaciju eteričnih ulja vodenom

destilacijom su: aparatura po Ungeru

(1), aparatura prema europskoj

farmakopeji (engl. “European

Pharmacopoeia”), aparatura po

Clevengeru. Kod aparature po Ungeru

biljni materijal se nalazi u vodi u

tikvici, eterično ulje destilira zajedno

s vodom, te se pare kondenziraju u

hladilu, a eterično ulje se sakuplja u

središnjoj cijevi aparature.

Aparatura prema europskoj farmakopeji (C) je slična aparaturi po Ungeru,

samo što je odušak smješten na drugom mjestu aparature.

1

31

Nastavak po Clevengeru za destilaciju

eteričnih ulja: A – za ulja manje

gustoće od vode, B – za ulja veće

gustoće od vode. Na vrh nastavka

stavlja se hladilo, a na bočnu cijev

tikvica s biljnim materijalom i vodom.

3.1.2.2. Vodeno-parna destilacija - Biljni materijal je postavljen na

perforiranoj podlozi na odreñenoj udaljenosti od dna posude koja je

ispunjena vodom (biljni materijal se nalazi neposredno iznad vode). Voda se

grije kao i kod vodene destilacije. Zasićena, u ovom slučaju vlažna para

podiže se kroz biljni materijal. Biljni materijal je u kontaktu samo sa parom,

C

32

a ne sa kipućom vodom. Ova metoda se pretežito koristi u industriji, a rjeñe

u laboratoriju.

3.1.2.3. Parna destilacija - Vodena para iz generatora pare se uvodi sa dna,

a biljni materijal je postavljen na rešetku i nije u kontaktu s vodom. Koristi

se zasićena ili pregrijana para, najčešće kod povišenih tlakova. Vodena para

iznosi eterično ulje iz biljnog materijala u kondenzator gdje se pare

kondenziraju, a potom se ulje odjeljuje od vode u separatoru i sakuplja:

Mana ove metode je povećana mogućnost stvaranja artefakata-spojeva koji

nisu izvorno prisutni u biljci a nastali su zbog termičkih degradacijskih

reakcija, osobito hidrolize.

3.1.3. Simultana destilacija-ekstrakcija - Likens i Nickerson su 1964. god.

su dizajnirali originalnu aparaturu za simultanu destilaciju-ekstrakciju

hlapljivih spojeva (engl. «simultaneous distillation-extraction», SDE).

Uzorak destilira u tikvici na lijevom ogranku aparature. Hlapljivi spojevi

33

destiliraju kroz lijevi ogranak i simultano (istovremeno) pare otapala

destiliraju kroz desni ogranak. Pare se kondenziraju u hladilu tzv. «cold

finger» i ekstrakcijski proces počinje izmeñu oba tekuća filma na

kondenzirajućoj površini. Voda i otapalo se sakupljaju i odvajaju u

separatoru, te vraćaju u odgovarajuće posude. Ova izolacija-koncentracija

hlapljivih spojeva omogućuje značajnu uštedu vremena u separacijskom

koraku, a zbog kontinuiranog recikliranja omogućuje i uštedu volumena

korištenog otapala.

Aparatura za simultanu destilaciju-ekstrakciju (Likens-Nickerson).

Danas postoje mnoge modifikacije ove originalne metode koje mogućavaju

preparativnu izolaciju ili izolaciju na sobnoj temperaturi uz smanjenu

mogućnost nastanka artefakata.

«cold finger»

34

3.2. Osnove frakcioniranja ekstrakata - Kruti ekstrakt je smjesa prirodnih

spojeva. Mnogi od njih imaju iste molekulske formule, a različite strukture.

Stoga je teško primijeniti jednu separacijsku tehniku za izolaciju

individualnih spojeva iz smjese. Ekstrakt se obično inicijalno odjeljuje u

različite frakcije spojeva sa sličnom polarnosti ili molekulskom veličinom.

Za početno frakcioniranje ekstrakta nije preporučljivo napraviti veliki broj

frakcija budući to može dispergrirati ciljanu komponentu u velikom broju

frakcija. Mnogo bolje je sakupiti nekoliko većih frakcija i koncentrirati se na

one koje sadrže komponentu od interesa.

3.3. Izolacija čistih tvari - Najvažniji čimbenik koji se mora razmotriti prije

dizajniranja izolacijskog protokola je priroda ciljane komponente u ekstraktu

ili frakciji . Općenita svojstva molekula koja pomažu izolacijskom procesu su

topljivost (hidrofilnost ili hidrofobnost), kiselo-bazna svojstva, naboj,

stabilnost i molekulska veličina. Ako se izolira poznata komponenta iz istog

ili novog prirodnog izvora potrebno je sakupiti literaturne informacije i

odabrati najprikladniju metodu. Mnogo je teže dizajnirati izolacijski

protokol za kruti ekstrakt koji sadrži potpuno nepoznate spojeve. U ovom

slučaju poželjno je napraviti kvalitativni test na prisustvo različitih grupa

organskih spojeva npr. fenole, steroide, alkaloide, flavonoide i dr. Priroda

ekstrakta takoñer može pomoći u odabiru ispravnog izolacijskog protokola.

Različita fizikalna svojstva ekstrakata mogu se odrediti koristeći male

porcije krutog ekstrakta u seriji eksperimenata.

35

3.3.1. Kromatografske metode odjeljivanja smjesa

Tvari koje se nalaze u prirodi najčešće se javljaju u kompleksnim smjesama.

Klasične metode odjeljivanja (kristalizacija, sublimacija, ekstrakcija,

destilacija) samo donekle mogu riješiti problem odjeljivanja individualnih

komponenti iz smjese. Većina smjesa organskih spojeva je složena zbog

velikog broja spojeva koji često imaju slična fizikalno-kemijska svojstva ili

čak iste molekulske formule, a različite strukture (izomeri). Zbog

navedenog, odjeljivanje komponenti iz smjese može predstavljati ozbiljan

problem.

Naziv kromatografija potječe od ruskog kemičara Tswett-a koji je

1906. god. uveo ovu tehniku za odjeljivanje biljnih boja. Kasnije se ime

prenijelo na sve postupke odjeljivanja kod kojih se komponente smjese

razdjeljuju izmeñu stacionarne i mobilne faze. Keulemans je dao općenitu

definiciju za ovu tehniku:

“Kromatografija je fizikalna metoda odjeljivanja ko jom se komponente

razdjeljuju izmeñu dvaju faza; jedna je stacionarna s velikom

površinom, a druga je mobilna.”

Stacionarna faza može biti krutina ili kapljevina, a mobilna kapljevina

ili plin. Mobilna faza putuje preko ili uzduž stacionarne faze utjecajem

kapilarnih sila, sile teže, razlike tlakova i sl. Kromatografski proces se

temelji na uspostavljanju dinamičke ravnoteže nekog spoja izmeñu

stacionarne i mobilne faze: u stacionarnoj fazi nalazi se dio tvari koji je u

ravnoteži s dijelom u mobilnoj fazi. Zbog gibanja mobilne faze narušava se

ravnoteža i molekule putuju u smjeru gibanja mobilne faze. Zbog specifične

interakcije različitih spojeva sa stacionarnom i mobilnom fazom, različiti

spojevi putuju različitim brzinama i tako se odjeljuju. Sam proces

36

odjeljivanja zasniva se na slijedećim načelima: adsorpciji, razdjeljenju,

difuziji, ionskoj izmjeni i dr. Velika moć razlučivanja kromatografskim

metodama zasniva se na pojavi uzastopnog ponavljanja primarnog postupka

razdjeljivanja neke tvari izmeñu mobilne i stacionarne faze. Budući se

uspostavljanje ravnoteže neprestano ponavlja, to i male razlike u

razdjeljivanju izmeñu stacionarne i mobilne faze dovode do dobrog

odjeljivanja tvari.

Prema agregatnom stanju stacionarne i mobilne faze, načinu izvedbe,

kao i prema fizikalno-kemijskim procesima tijekom razdvajanja razlikujemo

slijedeće vrste kromatografije:

• adsorpcijska kromatografija - stacionarna faza je kruti adsorbens,

a mobilna faza može biti kapljevina ili plin (tekućinska adsorpcijska

kromatografija (LSC, engl. Liquid Solid Chromatography) i plinska

adsorpcijska kromatografija (GSC, engl. Gas Solid

Chromatography))

• razdjelna kromatografija - stacionarna faza je kapljevina vezana za

sorbens ili fino zrnatu inertnu krutinu, a mobilna kapljevina ili inertni

plin (tekućinska razdjelna kromatografija (LLC, engl. Liquid Liquid

Chromatography) i plinska razdjelna kromatografija (GLC, engl.

Gas Liquid Chromatography)

adsorpcija razdjeljivanje

37

plin GC plinska

kromatografija

Mobilna

faza kapljevina LC tekućinska

kromatografija

Stacionarna krutina

faza GSC LSC adsorpcijska

kromatografija

kapljevina

GLC LLC razdjelna

kromatografija

Različite vrste adsorpcijske i razdjelne kromatografije

Shematski prikaz tekućinske adsorpcijske kromatografije (LSC)

38

• ionsko-izmjenjivačka kromatografija - temelji se na interakciji

naboja izmeñu molekula uzorka i naboja stacionarne faze. Ionsko-

izmjenjivačka smola je stacionarna faza (npr. smola koja sadrži

benzensulfonske grupe može na sebe vezati proteine sa suprotnim

nabojem od naboja funkcijske skupine na smoli). Eluiranje se postiže

poništavanjem ionskih interakcija promjenom ionske jakosti ili

promjenom pH proteina.

• afinitetna kromatografija - se zasniva na sposobnosti proteina da

vežu odreñene male molekule supstrata (liganda).

39

Molekula supstrata (liganda) odabranog enzima se veže kovalentno za

odreñeni nosač (stacionarna faza), koji se stavi u kolonu. Tako se iz

proteinske otopine koja se propušta kroz kolonu na ligand na stacionarnoj

fazi veže željeni protein (crveni na slici). Dodavanjem otopine liganda

(plavo na slici) protein (crveni) se veže na slobodni ligand i odlazi iz

kolone.

• kromatografija isklju čenjem - stacionarna faza je polisaharidni gel

koji djeluje kao molekulsko sito. Unutar čestica gela nalaze se

vodom ispunjene šupljine u koje mogu prodrijeti samo male

molekule i one srednje veličine, a velike su isključene. Kada se gel

ispire otapalima, molekule koje su prodrle u šupljine difuzijom opet

mogu izaći., ali sporije od ostalih molekula.

40

4. SPOJEVI S PROTUTUMORSKIM DJELOVANJEM IZ BILJNIH

IZVORA I NJIHOVI DERIVATI U PREDKLINI ČKIM I KLINI ČKIM

ISTRAŽIVANJIMA

Prije upoznavanja kemijskih struktura prirodnih spojeva (i njihovih

derivata) s protutumorskim djelovanjem, potrebno se osvrnuti na osnovne

stereokemijske karakteristike organskih spojeva iz kojih često proizlazi

njihovo biološko djelovanje. Takoñer treba se prisjetiti da različiti organski

spojevi istih molekulskih formula - izomeri se dijele na strukturne

(konstitucijske) izomere i stereoizomere, što može predstavljati problem za

potpunu identifikaciju nekog spoja.

41

4.1. Optička aktivnost i kiralnost organskih spojeva - Optička aktivnost

je sposobnost zakretanja ravnine polariziranog svjetla organskih spojeva u

otopini (J.-B. Biott, 1815. god.)

Za objašnjenje kiralnosti potrebni je proučiti simetriju molekule.

Simetrija objekta i molekule se opisuje elementima simetrije (zrcalne osi,

središte i ravnine simetrije) koji povezuju ekvivalentne dijelove, a s obzirom

na elemente simetrije razlikuju se slijedeći pojmovi:

• kiralno - (grč. cheir = ruka) geometrijsko svojstvo nemogućnosti

preklapanja sa svojom zrcalnom slikom zbog asimetrije - odsutnosti

elemenata simetrije (L. Kelvin i W. H. Thompson, 1883. god.);

kiralne molekule - optički aktivne (kiralnost nužan ali ne i dostatan

uvijet za optičku aktivnost spoja!)

• akiralno - (odsustvo kiralnosti) posjeduje najmanje jedan element

simetrije; akiralne molekule - optički neaktivne

42

Postojanje “kiralnog središta” (središta asimetrije) je uvjet za

optičku aktivnost molekule; najčešće je to asimetričan ugljikov atom

“kiralni ugljik” (ugljik povezan sa četiri razli čita atoma ili skupine).

Sedište kiralnosti osim atoma može biti molekulska podstruktura (npr.

prsten) ili pak čitava molekula (npr. lijeva i desna DNA uzvojnica).

Apsolutna konfiguracija kiralnog središta predstavlja prostorni raspored

četiri skupine vezane za kiralno središte, a odreñuje se prema CIP (Cahn-

Ingold-Prelog) - sustavu tj. pravilu sekvence:

1. skupine vezane za kiralno središte označavaju se 1-4, gdje je skupina

1 najvišeg, a 4 najnižeg prioriteta (skupina je prioritetnija što je masa

atoma neposredno vezanog za kiralno središte veća)

2. molekula se zatim promatra u smjeru kiralno središte → 4 (suprotna

strana od skupine najnižeg prioriteta)

3. ako su preostali supstituenti 1-3 smješteni u smjeru kazaljke na satu

tada je to R-konfiguracija, a kada se radi o suprotnom smjeru od

kazaljke na satu riječ je o S-konfiguraciji.

(R)-butan-2-ol (S)-butan-2-ol

Iz razlike u konfiguraciji molekule proizlazi zrcalnosimetričan odnos (kao

predmet i slika u zrcalu) kod enantiomera (vrsta stereoizomera – spojevi iste

molekularne formule, a različitog prostornog rasporeda atoma u molekuli).

C

OH

H CH3

C2H5C

OH

HH3CC2H5

1

2

3

4

1

2

34

43

Enantiomeri su kiralne molekule u zrcalnom odnosu, a koje se

uzajamno ne mogu preklopiti - članovi enantiomernog para zakreću ravninu

polariziranog svjetla za jednaki kut, ali u suprotnim smjerovima (označavaju

se sa (+) i (-)). Enantiomeri s više središta kiralnosti se razlikuju po

apsolutnoj konfiguraciji svih središta kiralnosti. Fizička svojstva su im

obično identična (Tt, Tv, gustoća) osim kuta zakretanja polariziranog svjetla.

Mogu se razlikovati po biološkoj aktivnosti ili mirisu.

Dijastereomeri su stereoizomeri koji koji se ne odnose kao predmet i

njegova zrcalna slika. Dijastereomeri s više središta kiralnosti se razlikuju u

konfiguraciji jednog ili više, ali ne i svih središta kiralnosti (nisu u zrcalnom

odnosu), imaju različita fizikalna i kemijska svojstva (mogu se meñusobno

odijeliti separacijskim tehnikama).

Racemat je smjesa jednakih količina dva enantiomera (npr. (+)-

butan-2-ol i (-)-butan-2-ol) koja ne pokazuje optičku aktivnost, budući da

svaki enantiomer zakreće ravninu polariziranog svjetla za isti iznos, ali u

suprotnim smjerovima; označava se (±); npr. (±)-butan-2-ol.

Prirodni spojevi koji se upotrebljavaju kao ljekovite tvari dolaze

najčešće u obliku samog jednog enantiomera. Djelovanje drugog

enantiomera najčešće nije istraženo, pa se nezna da li je ono bolje ili slabije

od prirodnog enantiomera. Tijekom izolacije prirodnih spojeva može doći do

racemizacije (oprez!)

Općenito se smatra da racemični i enantiomerno čisti spojevi u prirodi

nastaju reakcijama koje kataliziraju enantioselektivni katalizatori (enzimi).

Porijeklo kiralnih biokatalizatora i njihovih grañevnih podjedinica (kiralnih

aminokiselina) do danas nije razjašnjeno.

44

4.2. Stereokemijske osnove djelovanja fitospojeva - Stereokemija je grana

kemije koja se bavi prostornom grañom molekula (statička stereokemija) i

prostornim odvijanjem kemijskih reakcija (dinamička stereokemija) koje su

neobično važne kod djelovanja lijekova. Enantiomeri kiralnog ljeka mogu se

znatno razlikovati po svojim farmakodinamičkim i farmakokinetičkim

svojstvima. Te se pojave mogu pripisati kiralnosti receptora. E. J. Ariëns je

podijelio enantiomere prema njihovom farmakološkom djelovanju na:

• eutomer (grč. eú - dobro) - enantiomer s većim afinitetom prema

receptoru, bolje farmakološko djelovanje

• distomer (grč. dys - loše) - enantiomer s manjim afinitetom prema

receptoru, tj. sa slabijim farmakološkim djelovanjem

Uzajamno djelovanje lijeka i receptora temelji se na slijedećim

interakcijama:

• elektrostatskim interakcijama - privlačenje ili odbijanje pozitivnih i

negativnih naboja na molekulama (npr. vodikova veza)

• steričkim (prostornim) Van der Waalsovim interakcijama, a interakcija

lijeka i receptora je najčešće stereoselektivna!!

• hidrofobnim djelovanjima - interakcija s otapalom.

Enantiomeri kiralnih ljekovitih tvari ne razlikuju se po kemijskim i

fizikalnim svojstvima u akiralnom mediju, ali se često razlikuju u

farmakodinamičkim i farmakokinetičkim svojstvima jer su molekule s

kojima dolaze u interakciju i same kiralne. Kiralnost lijeka utječe na sve faze

njegovog djelovanja:

45

1. izlaganje (ekspozicija) - utjecaj afiniteta lijeka za receptore,

djelotvornost metabolita, specifičnost tkiva

2. farmakokinetička faza - obuhvaća apsorpciju, distribuciju,

metabolizam i izlučivanje lijeka iz organizma. Ti su fiziološki procesi

stereoselektivni, a enantiomeri se mogu razlikovati po jačini

djelovanja, farmakokinetičkom profilu i dr.

3. farmakodinamička faza - interakcija bioaktivne tvari i specifičnog

receptora u ciljnom tkivu što uzrokuje krajnji farmakološki učinak

Kiralni lijekovi se prema djelovanju svojih enantiomera (koje uključuje tri

spomenute faze) mogu podijeliti na:

• ukupna farmakološka aktivnost lijeka proizlazi iz djelovanja samo

jednog enantiomera – NAJČEŠĆE!!

• enantiomeri lijekova djeluju podjednako (kvalitativno i kvantitativno)

• farmakološko djelovanje enantiomera slično je u kvalitativnom

smislu, ali kvantitativno različito

Učinkovito i prihvatljivo preventivno ili antikancerogeno sredstvo mora

imati slijedeća svojstva: bez toksičnog učinka na zdrave stanice, visoku

učinkovitost protiv više tumora, mogućnost oralnog uzimanja, poznat

mehanizam djelovanja i malu cijenu. Klini čka procjena učinkovitosti

antikancerogenog spoja uključuje višestupanjski proces:

• faza I: identifikacija optimalnog antikancerogenog spoja,

• faza II: demonstracija učinkovitosti na ljudima preko modulacije

tkiva, biokemijskih i molekulskih surogata,

• faza III: smanjenje rizika tumora na velikim skupinama ljudi.

Odabrani antikancerogeni lijekovi biljnog porijekla u kliničkoj uporabi su:

46

Aktivna tvar i naziv lijeka Porijeklo Terapeutska

uporaba Mehanizam djelovanja

Kamptotecin (engl.

Camptothecine)

Camptotheca acuminata

klinički se koristi u Kini za

gastrointestinalne tumore

poboljšava vezivanje

topoizomeraze I na DNA i tako promovira

cijepanje sastavnih dijelova

Docetaksel (engl. Docetaxel)

Taxotere® Taxus baccata

za tretiranje tumora dojke,

debelog crijeva i bronhija

vezanje za tubulin podjedinicu i stabilizacija mikrotubula

Etopozid

(engl. Etoposide) Eposin®

Etopofos® Exitop® Vepesid®

polusintetski derivat

podofilotoksina iz Podophyllum

sp.

leukemija, Hodgkinova

bolest, i tumor testisa

inhibitor DNA topoizomeraze II

Irinotekan Campto®

polusintetski derivat

kamptotecina

colorectal karcinom

inhibitor DNA topoizomeraze I

Krizantaspas (engl.

Krisantaspas) Erwinase®

Erwinia chrysanthemi

Sve inhibicija malignih asparagin-ovisnih

stanica

Paklitaksel (engl. Paclitaxel)

Taxol®

Taxus brevifolia i T. cuspidata

karcinom dojke i metastazni NSCLC

vezanje za tubulin podjedinicu i stabilizacija mikrotubula

Tenipozid

(engl. Teniposide) Vumon®

sličan etopozidu koristi se u

kombiniranoj terapiji

inhibitor DNA topoizomeraze II

Topotekan (engl. Topotecan)

Hycamtin®

derivat kamptotecina s poboljšanom

vodotopljivost

karcinom debelog crijeva

inhibitor DNA topoizomeraze I

47

Vinblastin (engl.

Vinblastine) Velbe®

alakloid iz Vinca rosea

Hodgkinova bolest i karcinom

antimitotik - inhibicija stanične

mitoze

Vinkristin (engl. Vincristine)

Oncovin® Vincristine®

alakloid iz Vinca rosea

leukemija, SCLC i maligni limfoni

antimitotik

Vinorelbin (engl.

Vinorelbine) Navelbine®

polusintetski derivat

vinblastina

NSCLC i karcinom dojke

antimitotik - inhibicija

polimerizacije tubulina

4.3. Odabrane stukture protutumorskih fitospojeva i derivata

4.3.1. Kamptotecin i sintetski derivati - Otkriće kamptotecina, engl.

camptothecin (CPT), kao antikancerogenog spoja (1960. – tih) sa

jedinstvenim načinom djelovanja (inhibicija DNA topoizomeraze I) dalo je

novu smjernicu u kemoterapiji. Ovaj prirodni alkaloid prvo je ekstrahiran iz

različitih biljnih dijelova kineskog drva Camptotheca acuminate, a kasnije i

iz Ophiorrhiza pumila te Mapia foetida. Pokazuje antikancerogenu aktivnost

na tumor debelog crijeva i pankreasa, te je odobren od US Food and Drug

Administration 1970-tih god. za tretiranje tumora debelog crijeva, te za

daljnja istraživanja na drugim ljudskim tumorima. Iako CPT pokazuje

snažnu antitumorsku aktivnost, takoñer je uzrokovao nepredviñene i ozbiljne

popratne učinke kao što su povraćanje, proljev, krvarenje i upalu mjehura i

dr., što je prouzrokovalo obustavom istraživanja. 1972. god.

Meñutim, istraživanja sintetskih derivata CTP-a su se nastavila, tako

se trenutačno prva generacija CPT derivata (topotekan, engl. topotecan i

irinotekan, engl. irinotecan) koristi za tretiranje tumora debelog crijeva, a

48

drugi derivati pokazuju antikancerogenu aktivnost u jetri, prostati, dojkama i

dr.

N

N

O

O

OOH

A B C

D

E

20

Odnosi strukture i aktivnosti: Prstenovi A-D su osnovni za in vitro i

in vivo antitumorsku aktivnost, kao i α-hidroksi laktonski prsten E.

Konformacija C-20 je presudna za bolju aktivnost, budući je 20 (S) izomer

10-100 puta aktivniji od 20 (R) izomera. Modifikacije prstena A i B mogu

rezultirati još boljom aktivnosti CPT-a. Jedan od nedostataka CPT analoga u

kliničkim istraživanjima je i gubitak terapeutske aktivnosti zbog brze

hidrolize laktonskog prstena u organizmu.

Mehanizam djelovanja: Ranih 1970-tih god. početne studije

djelovanja CPT-a sugerirale su kako citotoksičnost može biti posljedica

inhibicije DNA topoizomeraze I. Takoñer, ova istraživanja su sugerirala da

je CPT selektivno citotoksičan na S-fazu stanica, zaustavlja stanice u G-2

fazi, te uzrokuje fragmentaciju kromosomske DNA.

Sintetski derivati CTP-a - Zbog toksičnosti CPT-a pripravljaju se derivati

sa slijedećim modifikacijama:

• Modifikacije A i B prstena – najuspješniji derivati CTP-a. Tako su

vodotopljivi derivati topotekan (engl. topotecan) i irinotekan (engl.

irinotecan) jedini odobreni derivati CTP-a za kliničku uporabu.

49

Pripravljeni derivati su inhibirali DNA topoizomerazu I sa sličnom ili

boljom aktivnosti od CTP-a.

N

N

O

O

OOH

HO

CH2N

topotekan

N

N

O

O

OOH

C2H5

N C

O

N O

irinotekan

• Modifikacije C i D prstena – uglavnom su vodile gubitku

citotoksičnosti.

• Modifikacije E prstena – obično reduciraju ili poništavaju aktivnost

CTP-a.

Derivati CTP ostaju i dalje predmet organskih sinteza, kao i studije

interakcija CTP-DNA-topoizomeraza I, koje mogu dati smjernice za sintezu

novih CTP derivata.

50

4.3.2. Vinca alkaloidi - Vinblastin (engl. vinblastine) i vinkristin (engl.

vincristine) su alkaloidi pronañeni u Catharanthus roseus (prijašnja

klasifikacija Vinca rosea). Zajedno sa polusintetskim derivatima vindezinom

i vinorelbinom djeluju kao inhibirori mitoze (diobe stanice) u metafazi.

Popratni učinci uključuju gubitak kose, proljev, sniženje broja krvnih

stanica, glavabolju i dr.

Vinblastin se uglavnom koristi za

tretiranje Hodgkinsove bolesti,

uznapredovalog tumora testisa i

dojki, Kaposi sarkoma i dr.

Takoñer, izgleda da djeluje na

tumore interferirajući sa

metabolizmom glutaminske kiseline (specifično, putova koji vode iz

glutaminske kiseline do Krebsovog ciklusa i nastanka uree).

Vinkristin se koristi za tretiranje

leukemije, Hodgkinsove bolesti i dr.

Vindezin se koristi za tretiranje

melanoma i tumora pluća i dr.

51

Vinorelbin je trenutno u fazi II kliničkih istraživanja za tretiranje tumora

debelog crijeva. Za sada vinorelbin izgleda da pokazuje široki spektar

antitumorske aktivnosti u odnosu na druge vinca alkaloide.

Mehanizam djelovanja: Vinblastin i njegovi polusintetski derivati vindezin

i vinorelbin djeluju tako da inhibiraju mitozu (podjelu stanica) u metafazi.

Ovi alkaloidi se vežu za tubulin i tako spriječavaju stvaranje niti diobenog

vretena koje su potrebne za diobu stanice (slično djelovanju colchicina, ali

različito od djelovanja paklitaksela, koji interferira sa diobom stanica tako

što održava niti diobenog vretena od cijepanja). Ovi alkaloidi takoñer

izgleda da interferiraju sa sposobnošću sinteze DNA i RNA.

4.3.3. Taksol i sintetski derivati - Taksol je kompleksni terpen izoliran iz

Taxus brevifolia kasnih 1960-tih god. Kasnije je izoliran i iz drugih Taxus

vrsta u kojima je pronañeno više od 300 različitih taksoida. Odobren je

1992. god. od US Food and Drug Administration za tretiranje tumora

debelog crijeva, metastatičnih tumora dojki i pluća, te Kaposi sarkoma.

Glavni nedostatak taksola je slaba bioraspoloživost, zbog slabe

vodotopljivosti. Taksol se tolerira na receptorima bolje od bilo kojeg

52

antikancerogenog spoja, ali pokazuje i prateće učinke (smanjenje bijelih

krvnih zrnaca). Danas je poznat taksoter, engl. taxotere, kao polusintetski

derivat taksola sa boljim antitumorskim djelovanjem.

O

AcO

OH

HO

O

H

AcO

O

O

Ph

OH

NHPh

O

A B C

D

1'2'3'

7

taksol

Odnosi strukture i aktivnosti: C-13 bočni lanac je nužno potreban za

antitumorsku aktivnost taksola, kao i C-2' hidroksil (kada se zaštiti aktivnost

se reducira). C-3' arilna skupina je kritična (Ph = benzen) Zamjena C-3'

vezanog dušika s kisikom je prihvatljiva bez značajnijeg gubitka aktivnosti.

Apsolutna konfiguracija na C-2' i C-3' ima dramatičan utjecaj na aktivnost.

Izomer (2'R,3'S) je značajno manje aktivan od prirodnog (2'R,3'S) izomera,

ali (2'S,3'S) i (2'R,3'R) izomeri pokazuju sličnu aktivnost s prirodnim

izomerom. C-13 bočni lanac taksola se vjerojatno orijentira pomoću

vodikovih veza, te može pristati na hidrofobno mjesto vezanja taksola, što

stabilizira interakcije s tubulinom.

Mehanizam djelovanja: Taksol posjeduje jedinstven mehanizam

djelovanja. Djeluje kao mikrotubulin stabilizator, dok drugi antitumorski

spojevi destabiliziraju ovaj proces.

C-13

C-2'

C-3'

53

Sintetski derivati taksola:

• taksoter, engl. taxotere – je strukturni analog taksola, te pokazuje

bolju antitumorsku aktivnost od taksola. Takoñer pokazuje bolja

farmakološka svojstva kao što je poboljšana vodotopljivost.

• vodotopljivi derivati taksola – derivati na C-7, C-2’ ili oba

hidroksila su sintetizirani, uključujući soli i dr. Nedavno je pripravljen

izotaksel, eng. Isotaxel koji je 1800 puta vodotopljiviji od taksola..

pretvara se u aktivnu molekulu – taksol u organizmu.

4.3.4. Podofilotoksin - Podofilotoksin (engl. podophyllotoxin, PDT) je

dobro poznati prirodni lignan koji je pšrvo izoliran iz Podophyllum peltatum

Linnaeus, a ksnije i iz drugih vrsta kao P. emodi Wall i P. pleianthum. Osi

toga, pronañem je i 4-deoksipodofilotoksin (engl. 4-deoxypodophyllotoxin)

u Anthiscus sylvestris i Pulsatilla koreana. PDT je učinkovit u tretmanu

različitih genitalnih tumora, non-Hodgkin tumora, te drugih limfoma i raka

pluća i dr.. Zbog popratnih učinaka kao što su proljev, oštećivanje zdravih

stanica i dr. PDT kao takav se ne koristi kao lijek, već se provode njegove

strukturne modifikacije kako bi se dobili potentiniji i manje toksični

54

antikancerogeni spojevi. Dva polusintetska derivata PDT-a, etopozid (engl.

etoposide) i tenipozid (engl. teniposide) se koriste u kemoterapiji različitih

tumora.

PDT sadrži pet prstena (A-E). Prstenovi A i E su osnovni za aktivnost.

D-prsten u laktonskom obliku je preferiran za bolju aktivnost.

O

O

O

O

OCH3

H3CO OCH3

OH

A B C D

E

O

O

O

O

OCH3

H3CO OCH3

R

podofilotoksin derivat podofilotoksina

Mehanizam djelovanja: PDT djeluje kao inhibitor skupine

mikrotubula i zaustavlja stanični ciklus u metafazi. PDT lignani blokiraju

katalitičku aktivnost DNA topoizomeraze stabiliziranjem cijepanja enzim-

DNA kompleksa u kojem se DNA cijepa i kovalentno veže za enzim.

Kemijske modifikacije PDT-a su dovele do do promjene mehanizma

djelovanja: inhibicija stvaranja mikrotubula ili inhibicija DNA

topoizomeraze II.

Sintetski derivati podofilotoksina - modifikacije prstena C: najčešće

na poziciji C-4, te je uočeno da prisustvo velikih skupina povećava

citotoksičnost te inhibiciju topoizomeraze.