Zeitsehrift fiir Krebsforschung 64, 353--365 (196i)

Aus dem Pathologischen Institut der Universit/~t Miinehen (Direktor: Prof. Dr. W. Bi)NG~LI~t~)

Fermenthistoehemische Untersuchungen zur Biologie yon Ascitestumoren und ihrer Umwandlung

in solide Geschwiilste* Von

M. ED]~I~ und H. WgBA**

Mit 6 Textabbfldungen

(Eingegangen am 19. Juli 1961)

I n einer friiheren Untersuehung stellten wit lest, dab Ascitestumorzellen vet- schiedener Geschwiilste quant i ta t ive fermenthistochemisehe Untersehiede zeigen (EDEn, S C ~ V E ~ und W ~ 1960). Diese Befunde sind inzwischen dureh quanti- ta t ive Auszghlung gesiehert worden. Besonders auffallend war dabei die Beob- aehtung, dag bei den untersuchten Gesehwfilsten lediglich ein Teil der Tumorzellen positive Ferment reakt ionen zeigt, w~hrend die iibrigen Geschwulstzellen ferment- negat iv sind. Desh~db erschien es yon besonderem Interesse, die Frtihphase der Entwieklung solider Gesehw/ilste bei der subeutanen Transplanta t ion verschie- dener Asci tes tumoren morphologisch und fermenthistoehemisch vergleichend zu untersuehen. Uber Teitergebnisse dieser Untersuehungsreihe wurde friiher bereits kurz berichtet (ED~'~, W n ~ , VEnS~O~,D und S c ~ a u ~ 1961).

Methodik

Es wurden untersueht: Der Ehrlich-l~[~use-Ascites-Tumor (institutseigene Linie), der auf H~ndler-M/tuse iibertr.~gen wurde; der WMker-Aseites-Tumor (MI~) sowie der colchicin- resistente Walker-Aseites-Tumor (CI~) und der Yoshida-Aseites-Tumor (RY) (W~BA und I~IFOr~L-G6MEZ 1960a., b), die auf Sprague-Dawley-R~tten iiberimpft wurden.

ZurUntersuehung der Aseites-Tumoren wurde der Aseites in l~inger-LSsung aufgenommen, gewasehen und zentrifugiert; d~naeh wurden die histochemisehen Reaktionen durchgefiihrt, wobei anstelle der Schnigtuntersuchungen jeweils das Zellzentrifuga~ in aufgesehiittelter Suspension verarbeitet wurde. An Kontrollausstrichen mit H.-E.- und Feulgen-F/irbung wurde die Leukoeytenz~hl sowie der Mitoseindex bestimmt. Zur quantitativen Ausz~hlung wurden fiir jede Methode auf drei versehiedenen Ausstriehen in Glyeeringetatine je 1000 Zellen gez~hlt.

l~'fir die Untersuehung der Entwieklung solider Gesehwiilste erhielten t{atten 0,3--0,5 em 3, MiSuse 0,2 em 3 der entnomraenen Aseitesfliissigkeit subeutan injiziert. Die Untersuehung dureh Kryosta, t-Seriensehnitte erfolgte naeh 5, 15, 30 min, 1, 3, 4, 6, 21--24 und 48 Std sowie 3, 5, 7 und 9 Tagen. Neben H.-E.- und Fettf~rbungen (Sudan III) wurden die Fermente DPN- und TPN-Diaphorase, Succino-, Milehs~ure-, Apfels~ure-, M~lat- und ~-Glycerophos- phat-Dehydrase naeh der Methode yon HEss, PEA~SE und SCA~PELLI (S. PEARSE 1960) dargestellt.

A. Ehrlich-Tumor der Maus

Die in Ascitesform vorliegenden Geschwulstzellen zeigen bei den verschiedenen histochemischen Fermentmethoden wechselnde t~efunde. W/~hrend bei dem Naehweis ffir Diaphorasen und Succinodehydrase die Ferment reakt ion in den

* Die Arbeit wurde mit Mitteln der Deutsehen Forschungsgemeinsch~ft durchgeffihrt. ** Unter Mit~rbeit yon A. Sc~Av~ und It. VE~S~mLI).

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354 Mr. EDER und H. WRBA:

versehiedenen Gesehwulstzellen zwisehen stark fermentpositiven und ferment- negativen Zellen eine gleitende Intensit/~tsskala aufweist, zeigen sieh vor allem bei den geaktionen f/Jr Milehsgure- und Xpfels/~ure-Dehydrase (sehw/ieher bei der sr in der t~egel neben stark fermentpositiven nut fermentnegative oder sehwaeh fermentpositive Zellen. Sehwaehe Ferment- reaktionen sind dureh einen zarten deutlieh blauen Farbton z. B. einzelner Granula gekennzeiehnet, blagviolette Misehfarben, wie sie bei den Diaphorasen oder der Sueeinodehydrase auftreten, fehlen hier. Damit ergibt sieh gerade ffir diese Fermente die MSgliehkeit, die fermentpositiven Zellen quantitativ auszuzghlen. Im Durehsehnitt fanden sieh 10--20 % fermentpositive Zellen.

a b e

Abb. l a--e. Vergleieh der Ascites~Tumoren 5 rain nach subcutaner Implantation. Reaktion fiir Milchs~ure-Dehydrase. a Ehrlich-Tumor: Im Unterschied zmn Verhalten im Ascites zeigen alle Ge- schxvulstzellen eine starke Fermentreaktion. b Walker-Ttmlor: Nut einzelne Geschwulstzellen zeigen eine starke Fermentreaktion, etwa dem Verhalten im Aseites entspreehen4, c Yoshida-Sarkom: A]leh hier linden sich nur einzelne Geschwulstzellen mit starker Fermentreaktion, dem Verhalten im

Ascites entsprechen4. Vergr. 100 x

Nach snbeutaner Implantation bei Verwendung der Standardmengen zur Erzeugung solider Gesehwtilste findet sieh die Hauptmasse der iibertragenen Gesehwulstzellen dieht zusammen gelagert als solider Knoten zwisehen Mnsku- latur und I-Ia, ut. Die Ascitesfltissigkeit wird zusammen mit einzelnert Geschwulst- zellen in die Masehen des umgebenden Bindegewebes gedrtiekt, das hierdureh hoehgradig 5demat6s aufgequollen ist. Dies gilt far alle drei Aseites-Tumoren.

In dem ans den zusammenliegenden Gesehwulstzellen bestehenden Knoten beim Ehrlieh-Aseites-Tumor finder sieh naeh 5 min, sp~testens naeh 15--30 min, eine vollkommene Xnderung in der fermenthistoehemisehen Reaktion. In den untersuehten Schnitten zeigen nunmehr alle Geschwulstzellen eine intensive Reaktion ffir Milehsguredehydrase (Abb. 1 a). Aueh die geaktionen ffir ]4pfel- s~ure-, ~-Glyeerophosphat- und Sueeino-Dehydrase sowie DPN-Diaphorase sind in allen Zellen starker positiv. Dabei ist die positive Fermentreaktion in vielen Zellen in Form eines gIeichmgl~igen schmalen Farbringes an der Membran an- geordnet. Im Cytoplasma linden sieh dieht neben der Membran zahlreiehe

Fermenthistoehemische Untersuchungen 355

d

Abb. 2a--d. Ehrlich-Tumor 2I Std nach subeutaner Implantation. a II.-E.-Fhrbung: Deutliche ringf6rmige AuI3enzone. b Milchs~m'edehydrase: Starke ]~eaktionin der ~k'a~enzone, Zen~rl~m negativ. c Succinodehydrase: Sehr schwache Reak t ion in der AuBenzone, Z e n t r u m s ta rk positiv, d ~-Glycero-

phospha tdehydrase : AuBenzone stfirker, Zen t rnm schwach positiv. Vcrgr. c twa 8 •

fermentpositive Granula; haufig is~, insbesondere bei gr6Berem Zelleib, alas Cyto- plasma neben dem meist exzentriseh gelagerten Zellkern in Form einer Siehel oder

356 M. EDEI~ u n d I t . Wt~BA:

eines ttMbmondes intensiv fermentpositiv (Abb. 4 a und f). Zur Frage der Ursaehe dieser pl6tzliehen Reaktions~nderung sind Untersuehungen im Gange.

Im Vordergrund dieser Arbeit stand die Frage, wie sieh in der Folgezeit das subeutane Implantat morphologiseh und histoehemiseh vergndert. Etwa 4--6 Std naeh der Implantation finder sieh das Implantat subeutan inmitten 6demat6s aufgequollenen Bindegewebes, wobei die Gesehwulstzellen dieht zusammengepreBt gelagert sind. Zu diesem Zeitpunkt treten die ersten morphologiseh fagbaren Ver/tnderungen auf. In den l~andabsehnitten finder sieh eine ringf6rmig angeord- mete Zellsehieht mit einer Sehiehtdieke zwisehen 5 und 20 Zellen, die aus groBen

a b c Abb. 3 a - - c . Ausschni t t aus Abb. 2. a H . -E . -Fhrbung : An die Muskula tur (oben) angrenzend f inder sich eine groi3zellige Aul3enzone, das Z e n t r u m bes teh t aus kleinen Geschwulstzellen. b 2r dehydrase : Die Auftenzone zeigt eine s tarke, scharf begrenzte Ferment reak t ion , das Z e n t r u m (unten) ist v611ig negat iv , c Succinodehydrase : Die Augenzone zeigt n u t eine sehr schwache, das Z e n t r u m eine

s tarke Fcrment reak t ion . Vergr. 100 x

Geschwulstzellen mit groBem Zellkern und Zelleib besteht. Der zentrMe Anteil des Implantats zeigt durchwegs kleinere Tumorzellkerne mit dicht gefiirbtem Chromatingerfist und kleinerem Cytop]asmMeib (Abb. 2a und 3a). Sowohl in der Randzone wie im Zentrum linden sich reichlich Mitosen. Parallel mit dieser morphologischen Differenzierung findet sich eine fermenthistochemische Auf- gliederung. Die Randzone zeigt eine intensive ringf6rmige, gegenfiber dem Zen- trum scharf abgesetzte Reaktion der Milchs~ure-, ~pfelsiiure- und cr phosphat-Dehydrase (Abb. 2 b und d, Abb. 3 b). Ebenso angeordnet ist die stark positive DPN-Diaphorase-Reaktion, die jedoch gegenfiber dem zentralen Ge- schwulstabschnitt nicht so scharf abgesetzt ist, sondern langsam abnimmt. Die intracellul~re Fermentanordnung entspricht den Belunden an Asciteszellen.

Im Zentrum des Imp]antats sind diese Fermentreaktionen weitgehend negativ. Dagegen ist die Succinodehydrase-Reaktion in der Randzone nur schwach positiv in Form kleiner intracelluliirer Granula, w~hrend sie in den zentralen Geschwulst- zellen mit einem dichten Farbniederschlag an der Zellmembran oder in Form kleiner Granula entlang der Zellmembran intensiv naehweisbar ist (Abb. 2 c, 3 c,

Fermenthistochemische Untersuchungen 357

4b undc) . Halbmondf6rmige geaktionen im Cytoplasma werden dabei zu- nehmend seltener. Nach 24 Std ist diese 8ehiehtung yell ausgeprggt. Morpho- logisch treten zu diesem Zeitpunkt erstmalig kleine Nekrosen und Leukocyten- ansammlungen, und zwar nur am Rande des zentralen Geschwulstimplantats, d.h. also direkt unter der AuBenzone, auf. Im Bereich dieser Nekrosen fehlen alle Fermentreaktionen. Die Leukocyten zeigen nut schwache Fermentaktivitgten, sie sind in der gegel gut gegen die Geschwulstzellen abgrenzbar.

Naeh 48 Std vergndert sich das morphologische Bild; die Randzone wird nun dutch eine breitere Leukoeytenzone mit Geschwulstzellnekrose yon dem zentralen Gesehwulstzellkern getrennt. Nunmehr ist an dem Implantat eine deutliehe Drei- schichtung erkennbar. Die AuBenzone besteht welter aus groBen Geschwulst- zellen und zeigt ehm starke Mi]ehsgure-, ~pfelsgure-, a-Glycerophosphat-Dehy- drase- und Diaphorase-Reaktion; die Succinodehydrase-Reaktion ist nur schwach nachweisbar. Im Bereich der Leukocyten- und Nekrosezone fehlen die oben- genannten Fermente. Im zentralen Transplantatabschnitt bleibt ein leukocyten- freier Geschwulstanteil aus locker liegenden kleinen Tumorzellen erhalten, die Suecinodehydrase-geaktion ist unvergndert stark positiv.

Nach 3 Tagen h~t sich die urspriingliche AuBenzone durch Wachstum welter vergrOBert, lhr guf~erer Antei! zeigt n~ch wie vor starke geak~ionen fiir Mileh- sgure-, fl~pfelsgure- und ~-Glycerophosphat-Dehydrase, ]edoch treten nunmehr die halbmondfSrmigen starken Cytoplasmareaktionen zurtick. An ihrer Stelle linden sicb im Cytoplasma deutliche fermentpositive Einzelgranula, die Mem- branen selbst sind noch stark fermentpositiv. Diese guBere stark positive Ferment- zone zeigt etwa die urspriingliche Breite. Ihr innerer Anteil weist dagegen in zunehmendem MaBe Vergnderungen auf, wie sie anfangs im Transplantatzentrum zu beobaehten waren, ngmlich morphologisch Verkleinerung der Geschwulst- zellen, Abaahme der Mi]chsguredehydrase-l%aktion und eine stgrkere l~eaktion f/Jr Suceinodehydrase, vor allem im Bereich der Zellmembra,nen. Davon naeh innen zu finder sieh die nun ebenfalls verbreiterte Leukocyten- und Nekrosezone, die in ihrem Fermentverhalten unvergndert bleibL wghrend im Zentrum stark verkleinert immer noch ein Kern aus kleinen, nichtnekrotischen, leukoeyten- freien, succinodehydrasepositiven Geschwulstzellen besteht. Es sind demnach nunmehr vier Schiehten entstanden, und zwar dadurch, dab die ursprfingliche AuBenzone sich verbreitert hat und ihr innerer Antei] Vergnderungen zeigt, wie sie im Anfang im Geschwulstzentrum aufgetreten waren. Etwa zu diesem Zeitpnnkt linden sieh in der AuBenzone Zeichcn soliden Gewebswaehstums der Geschwulst- ze]len, wobei hier eine starke Milchsguredehydrase-Reaktion nachweisbar ist.

Zu den spgteren Zeitpunkten (5.--9. Tag) ist dutch das zunehmeade Ge- schwulstwachstum der schichtenweise Aufbau nur noch teilweise erkennbar, wobei nunmehr unrege]mgfiige, gr6Bere, mit Leukocyten durehsetzte I%kroseteile ira Zentrum vorliegen. In diesen sind immer noch vereinzelt Geschwulstzellen mit einer sehmalen, auf die Membran begrenzten Succinodehydrase-l~eaktion nach- weisbar (Abb. 4e). In den ~uBeren Sehiehten sind gr61~ere Komplexe aus soliden Gesehwulstzellnestern entwiekelt. Mit dem eigentlichen l~bergang in die solide Zellagerung sind in diesen Zellen die l%aktionen ffir Milchsgure-, J~p~elsaure- und ~-Glycerophosphat.Dehydrase insgesamt schwgcher geworden und ebenso wie e]ne sehwgehere Succinodehydrase-l~eaktion in Form einzeln liegender Granu]a

358 M. EDE]a und H. WR~A:

im Cytoplasma sowie an den Zellmembranen nachweisbar (Abb. 4d und g). Hier liegt nun ein sehr gleichf5rmiges Fermentreaktionsbild vor. Nur die l~andzellen,

b e

d e

f g

Abb. 4a--g. Geschwulstzellell bei Sueeillodehydrase-l~eaktioll. a 2 Std llach hnplalltation. Sichel- fSrmige granul~ire Fermeutreaktion im Cytopiaslna, ringf6rmige Reaktion an der Zellmembran. b 21 Std naeh Implantation, AuGenzone. Granul~Lre Fermelltreaktion im Cytoplasma. c 21 Std nach Implantation, Zentrum. Positive Fermentreaktioll vorwiegend an der Zelllnembran. d 9 Tage naeh Ilnplalltatiom solide Gesehwnlstabsehnitte. Feillgranul~Lre Reaktion im Cytoplasma. e 9 Tage naeb Implalltation. Iln Zentrum findell sich imlner noch einzellle Gesehwulstzellen mit Ferment- reaktien an der ~'Iembrau. Milchs~uredehydrase-Reaktion: f 3 Std nach Imlplantatien. Granul~ire ulld diffuse Reaktiou im Cytoplasma und an der Melnbran (vgl. a). g 9 Tage llach Implantation,

solide Gesehswulst: Sehwaehe feingl'anul~re Reaktioll im Cytoplaslna sowie an der Membrall. Vergr. 900 x

die z.T. auch zwischen die Muskelfasern infiltrierend einwachsen, zeigen die urspr/ingliehen starken Fermentreaktionen.

Fermenthistochemische Untersuchungen 359

Es wurden analoge Untersuehungen naeh heterologer Transplantation des Ehrlieh-Aseites-Tumors auf die Ratte durehgefiihrt. Naeh Injektion yon 0,3 his 0,5 ml Aseitesfl/issigkeit ergeben sieh 6 and 24 Std naeh der Injektion die gleiehen Verh~ltnisse wie bei der Maus. Es tritt eine ~hnliehe Sehiehtung der Ferment- aktivitgten auf, wie sie oben besehrieben wnrde.

B. Wallcer-Carcinom der Ratte

Wie beim Ehrlich-Mguse-Ascites-Tumor finden sich auch beim Walker- Ascites-Tumor der Ratte bei den histochemischen Fermentreaktionen nur in einem Teil der Zellen positive Reaktionen. Die Zahl der fermentpositiven Zellen schwankt betrachtlieh (bei der Milchs~ure-Dehydrase-Reaktion zwischen 5 und 20 %). Auffallend sind unter den fermentpositiven Zellen zahlreiehe Zellen mit besonders starker Real~tion.

W~hrend sich, hiervon abgesehen, im Aseites etwa/~hnliche Befunde wie beim Mguse-Ascites-Tumor ergaben, zeigen die Ver~ndernngen bei der subcutanen Implantation der Ascites-Tumor-Zellen wesentliehe Untersehiede. Auch bier tritt in der Zeit yon 5 rain bis 3--4 Std naeh der subcutanen Injektion eine Zu- nahme der Farbniedersehl~ge bei der Reaktion fiir Milchs~uredehydrase ein. Diese Zunahme beruht jedoch im wesentlichen darauf, dal~ die in Aseitesform negativen Tumorzellen nunmehr schwach positive Fermentreaktionen aufweisen; dagegen besteht naeh wie vor eine deutliehe Differenz gegeniiber den positiven Tumorzellen (Abb. 1 b). Der Umsehlag im Ausfall der Fermentreaktion wie beim M~use-Ascites-Tumor, bei dem zu diesem Zeitpunkt fast alle Zellen Iermentpositiv werden, fehlt hier. Die ~-Glyeerophosph~t- und ~pfels~ure-Dehydrase sind naeh der Transplantation entweder negativ oder sehwaeh positiv und zeigen dann gleiehfalls den Unterschied zwisehen starker reagierenden und weitgehend nega- riven Zellen. Die Sueeinodehydrase ist dagegen in den Gesehwnlstzellen gleieh- mgl3ig sehwaeh oder st/irker positiv.

Zwisehen 4 und 6 Std tritt morphologiseh aneh am Walker-Tumor eine Diffe- renziemng mit Entwieklung einer ringf6rmigen Augenzone ein, die aus gr6Beren Gesehwulstzellen besteht. In dieser Au6enzone nehmen die geaktionen fiir Mileh- s~ure-, ~pfelsgure- und ~-Glyeerophosphat-Dehydrase an Intensitgt zu, jedoeh ist auch noeh naeh 24-48 Std in dieser AuBenzone deutlieh der Untersehied zwisehen stark positiven nnd sehwgeher reagierenden Tumorzellen nachzuweisen. Im Zentrum dagegen erliseht zunehmend die I~eaktion dieser drei Fermente. Die Sueeinodehydrase ist im Bereich der Augenzone nut gleiehmgl~ig sehwaeh positiv, im Zentrum gleiehm~Big stark positiv.

Wesentlieh frfiher als beim M~use-Ascites-Tumor erfolgt an der Grenze des Zentrums zur Au/~enzone eine diehte Leukoeyteninfiltration, so dab bereits zu diesem Zeitpunkt (24 Std) vielfaeh ein breiter Leukoeytenring mit zunehmender Nekrose der Gesehwulstzellen ausgebildet ist. Hgufig sind aueh zwisehen den Gesehwulstzellen im zentralen Absehnitt einzelne Leukoeyten naehweisbar.

Etwa 48 Std naeh der subeutanen Implantation treten in der AuBenzone die ersten soliden Zellverb~nde auf. Diese entwiekeln sieh in den folgenden Tagen zn grogen soliden Gesehwnlstabsehnitten. Erst dann ist ein Ausgleieh der Intensitgt der Fermentreaktionen naehznweisen, so dab zunehmend gleiehmggige sehw/~chere

360 M. E1)ER u n d I-[. W R ~ A :

oder mittelstarke Fermentreaktionen fiir Milchs/~ure-, ~pfels/~ure- und e-Glycero- phosphat-Dehydrase sowie DPN-Diaphorase und sehw/tchere t~eaktionen ffir Sueeino-Dehydrase in Form kleiner Granula im Cytoplasma auftreten. Die Rand- absehnitte dieser soliden Gesehwulstformationen zeigen dabei meist stgrkere Fermentreaktionen, vereinzelte tubulgre Sprogbildungen gleiehms starke Reaktionen.

C. Yoshida-Sarkom der Ratte

Aueh bei dieser Tumorform zeigt sich nur in einzelnen Geschwulstzellen eine positive Fermentreaktion am Ascites-Tumor. Gegeniiber dem M~use-Ascites- Tumor und dem Walker-Ascites-Tumor der Ratte liegt hier jedoch die Zahl der

positiven Geschwulstzellen in der Regel betr~chtlich niedriger, so dal~ sieh nur etwa 2--5 % der Gesehwulst- zellen mit den Ferment- re~ktionen durstellen. Bei der subeutanen Implantation verh~lt sieh diese Ge- schwulstart s dem Walker-Tumor. In dem Zeit- raum yon 5 rain bis etwa 4 Std bleibt der Befund ein- zelner fermentpositiver Zel- fen erhalten, die urspr/ing- Iieh v611ig fermentnegativen Tumorze]len zeigen nur sehr sehwaehe Fermentreak- tionen bei Milehsgure-, ~pfel- s/~ure und ~-Glyeerophos-

phat-Dehydrase-Nachweis (Abb. 1 e). Der Unterschied gegenfiber dem M~use-

Abb. 5. Y o s h i d a - S a r k o m , 2'~ S t 4 n a c h I m p l a n t a t i o n . Die Ascites-Tumor nach der groBzellige Ani]enzone (oben) w i r d d u r c h eine b re i t e Leuko- cy tenzo~e u n d Nekrosesch ich t ve to kleinzel l igen Geschwuls t - s u b e u t & n e n Implantation ist

z e n t r u m g e t r e n n t , t t , - E . - F ~ r b u n g . Vergr . 60 • hier also noch starker a u s -

gepr/igt. In der Folgezeit entwiekelt sieh ab 4--6 Std morphologisch und histochemisch

aueh hier eine Sehichtung, wobei die Differenz zwischen stark positiven und schwach fermentaktiven Tumorzelien in der AuBenzone auch hier erhalten bleibt. Die anfangs meist nur sehwaehe gleiehm&ftige Suceinodehydrase-l~eaktion bleibt in der Au6enzone relativ schwaeh, w/~hrend die im zentralen Anteil vorhandenen TumorzeUen gleiehmgBig sts Fermentaktivit~ten aufweisen. Damit verhs sich diese Geschwulst ~ueh in der Folgezeit/s dem Walker-Tumor, nur sind insgesamt die Fermentreaktionen sehws ausgebildet. Bereits nach 24 Std ist zwischen der Aul~enzone und dem Geschwulstzentrum eine sehr starke leuko- eyts Zwisehenzone entwickelt (Abb. 5).

FermenShis~ochemische Untersuchungen 361

Zwischen 2 und 3 Tagen entwickelt sich das solide Gewebswachstum des Yoshid~-Sarkoms. Zugleich sind die Diaphorasen sowie die Dehydrasen ein- schlieNich der Snccinodehydrase schwaeh und ziemlich gleichfSrmig in allen Geschwnlstzellen r~achweisba,r.

Be~prechunlt Obwohl Ascites-Tumoren und hnpfgeschwfilste zu den meistverwandten

Studienobjekten der experimentellen Gesehwulstforschung gehSren, fehlen bis heute systematisehe morphologisehe nnd histochemische vergleiehende Unter- suehungen fiber die Friihphase der Entwieklung solider Gesehwiilste aus Ascites- tumoren. Vereinzelt ist mit histoehemischen Methoden die Aktivit~t der Dehy- drasen an soliden (Mosls, NACnLAS und S~LIG~Acr 1959, FIS~En und FIs~En 1961) und art Aseitestumoren (BlusS 1961) untersueht worden.

lJberraschend war bei unseren Untersuehungen die grote Xnderung der Aktivit/~t der untersuehten Fermente zwisehen der Ascitesform und der soliden Phase der Gesehwfilste sowie die Tatsaehe, dab sieh hierbei Untersehiede zwischen den verschiedeneu Tumoren eNaben. I~egelm~gig zeigte sieh beim Ehrlieh- Asei~es-Carcinom der Maus, dab bereits innerhalb der ersten Stnnde, im Unter- sehied zum Aseites, alle Gesehwulstzellen eine starke positive geaktion fiir Mileh- s~ure-, Xpfels~ure- und e-Glyeerophosphat-Dehydrase, DPN-Diaphorase und Sueeinodehydrase zeigten. Dal3 dieser Umsehlag im Ausfall der Fermentreaktion nicht auf die Entwieklung neuer enzymatischer Eigensehaften der Geschwulst- zellen zur/iekgef/ihrt werden kann, ergibt sich aus der knrzen Zeitspanne, in der die Xnderung dieses histochemischen Verhaltens auftritt. Es erseheint nahe- liegend, dieses Phgnomen auf Eiufliisse bei der Implantation oder teehnisehen Aufarbeitung zurfiekzuf/ihren. Auf genauere Untersuehungen zu dieser Frage werden wir art auderer Stelle eingehen.

Im tIinblick auf diesen Befund war die Beobach~ung auffallend, dab dieser plbtzliehe Umschlag in eine positive Fermentreaktion aller Geschwnlstzellen weder beim Walker- noeh beim Yoshida-Tumor zu beobaehten war (Abb. 1). Daraus ergibt sieh, dag, gleichg/iltig auf welehe Ursache dieses Umsehlags- phgnomen zurfiekzu{fihren ist, hier mit der histoehemischen Reaktion Unter- schiede zwisehen den. versehiedeneu Ascites-Tumoren zutage treten, die bisher sieht beobachtet worden sin& Bei allen drei GeschwNsten fa.nd sich, dal3 naeh der subcutanen Implantation die Ascitesfliissigkeit in das subeut~ne Binde- gewebe gedrfick~ wird, wghrend die Hauptmasse der Geschwulstzellen in einem oder mehreren Knotert subcutan zusgmmengelagert ist. tIierbei handelt es sich um dieht komprimiert liegende einzelne Ascites-Gesehwulstzellen; ersge Anzeiehen eines soliden Gewebswaehstums linden sich erst naeh 2--3 Tagen. Mit groBer t~egelm/~13igkeit treten an diesen Geseh~mlstzellhanfen in der Folgezeit Ver- anderungen ein, die an kleinen Gesehwulstzellgruppen, etwa im Bereich des StiehkanMs, nicht in dieser typischen Form zur Geltung kommen. Zwisehen 4 und 6 Std naeh der Implantation, vollentwiekelt naeh 24 Std, jedoeh auch z.T. noeh naeh 48 Std naehweisbar, bildet sich eine seharf abgesetzte Randzone. Diese morphologisch durch groge Geschwulstzellen mit gro/3em Zellkern und meist reichlich Protoplasma gekennzeiehnete AuBenschicht zeigt eine Lntensive, scharf abgegrenz~e I{eaktion Eir DPN-Diaphorase, Milchsgure-, Apfels/~nre- und oc-Gly- eerophosphat-Dehydrase (s. Abb. 2 und 3).

362 M. EDE~ und H. WRen:

W/ihrend beim Ehrlieh-Tumor hierbei alle Geschwulstzellen intensive Ferment- reaktionen aufweisen, bleibt beim Walker- und Yoshida-Tumor die urspr/ingliche Differenz zwisehen stark positiven und nunmehr nicht mehr negativen, sondern sehwach positiven Gesehwu]stzelIen bis zur Entwieklung des soliden Wachstums erhatten.

Die topographische Lage, die gleichmggige Dicke sowie die seharfe Ab- grenzung dieser Augenzone weisen darauf hin, dab ihre Entwieklung in Zu- sammenhang n i t der yon der Umgebung her einsetzenden Stoffzufuhr steht und es sieh bier um ein eindeutiges Grenzschichtdickenph~nomen handelt. Daraus ergibt sieh, dal3 eine bestimmte kritisehe Gewebsdicke in Abh/ingigkeit yon der Diffu- sionsgr6Be stoffweehselbegrenzend wirkt. Diese ist auch bei der Ubertragnng des Ehrlieh-Aseites-Tumors auf Ratten zu beobaehten. Beweisend fiir diese Deutung erscheint die Beobaehtung, dal3 in Gesehwulstzellknoten, bei denen durch das auseinandergepreBte Bindegewebe, also mitten dutch die Tumorzellen, t in gefgg- fiihrender Nerv lanft, um diesen herum die gleiehe Randsehieht n i t entspre- chendem Fermentverhalten zu beobaehten ist. Urn so auffallender ist dabei die Festste]lung, dug in dieser AuBenzone die Suceinodehydrasereaktion relativ sehwaeh ist, dagegen im Gesehwulstzentrum stark ausf/~llt.

Fiir die Erk]grung dieses Schichtphgnomens der histochemischen Ferment- reaktionen kommen zwei M6gliehkeiten in Betraeht. Es kann sieh hierbei um einen eehten Untersehied in der Anordnung der Fermentaktivit~t handeln. Ein solcher nile entspreehenden Fermente betreffender Untersehied kann aber aueh methodiseh vorget/iuseht sein, da die in der AuBenzone stark positiven geak- tionen DPN-abh/ingiger Fermente das Vorhandensein yon Diaphorase voraus- setzen; denn die Wasserstofffibertragung auf die als Reaktionsindicator benutzten Tetrazoliumsalze erfolgt erst naeh der Wirkung der Diaphorase. Demnaeh k6nnte im Zentrum z.B. Milehs~ure-Dehydrase vorhanden sein, der histoehemisch negative Ausfall ws nur auf das Fehlen der Diaphorase zurfiekzuf/ihren. Da- gegen sprieht allerdings die Tatsache, dab histoehemiseh die Diaphorase-Reaktion yon der AuBenzone noeh sehwaeh in die &uBersten Anteile des inneren Gesehwulst- zellanteils hineinreieht, wahrend die Milehs&uredehydrase-i~eaktion seharf auf die AnBenzone begrenzt ist. Ffir einen eehten und nieht nnr methodiseh bedingten Fermentuntersehied aller dieser Fermente sprieht weiterhin die entgegengesetzte Anordnung der Sueeinodehydrase; da dieses Enzym im Untersehied zu den an- deren Fermenten DPN-unabhangig ist, besteht die M6gliehkeit, dag die sehiehten- weise Fermentanordnung in Zusammenhang n i t einem stoffweehselbedingten DPN-Mangel steht. Dutch Sudanf~rbung wurde ausgesehlossen, dab der sehiehten- weise Aufbau bei den Fermentreaktionen lediglich dutch LipoidtSsung des Re- duktionsindieators in verfetteten Gesehwulstzellen zurfickzuffihren ist.

Bei allen drei Gesehwulstarten, besonders deutlieh beim Ehrlieh-Tumor, sind die Gesehwulstzellen im Zentrum morphologiseh dureh kleine Zellkerne und meist sehmales Cytoplasma ausgezeiehnet, wobei im Kern ein zartes Chromatin- gerfist, gr613ere Nueleolen und lnehrfaeh auch Mitosen naehweisbar sind. Beim Ehrlieh-Tumor sind naeh 24 Std die ersten Nekrosen sowie Leukoeyteninfiltrate nachweisbar, beim Yoshida- und Walker-Tumor meist sehon friiher und wesentlieh st/~rker. Besonders beim Ehrlieh-Tumor kommt dabei zur Geltung, dab diese nnr auf eine sehmale Sehieht begrenzt sind, die am l~ande des Zentrums direkt

Fermenthistochemische Untersuchungen 363

unter der AuBenzone auftritt. Dadurch entsteht eine deutliche Dreischichtung, die beim Yoshida- und WMker-Tumor zwar nicht so klar, aber immerhin ebenfalls zum Ausdruek kommt. Es liegt nahe, auch dieses Sehichtphgnomen als Ausdruek einer stoffwechselm~gigen Grenzschieht im Zu- sammenhang mit Wirkungen des ~rirts- organismus anzusehen. Eine weitere Um- ordnung, vor allem der fermenthistochemi- sehen Schiehtung, t r i t t dutch das Wachstum der Aul~enzone auf, deren innere Anteile nunmehr Ver/~nderungen durehmaehen, wie sie anfangs im Geschwulstzentrum beobachtet werden. Wghrend mmmehr die gut ern/ihrte Randzone nach aul~en ws ist gerade beim Ehrlich-Tumor zu beobachten, dab das stark verkleinerte ursprfingliche Geschwnlst- zentrum immer noch frei yon gr613eren Ne- krosen bleibt und yon einer Leukocytenzone umgeben ist.

Sowohl die morphologisehe und histo- chemisehe Schichtung als auch ihre sp/itere Umgestaltung beweist, dal~ die Ver~nderung der einzelnen Zellen bzw. ihre Beteiligung an der Bildung einer soliden Gesehwulst nicht auf einen genetiseh fixierten Selektions- vorgang, sondern auf ihre zuf~llige Lagerung innerhalb des Gesehwulstzellhaufens zurfiek- zuf/ihren ist. W~thrend bei der fJberffihrung einer primer soliden Gesehwulst in ihre Ascitesform offenbar eine Selektion jener Zellen stattfindet, die zum Waehstum im Bauchraum bef/~higt sind (MAKINO 1956, KLmN und KLEIN 1956, SCHOM~]~L~EDE~ 1954), trifft dies fiir die I%fickfiihrung in die solide Form nicht zu. Abb. 6 a - - e . Sehemat i sche Dars te l lung

Mit dem ~Jbergang in solides Gewebs- der Geschwulstent~dcklunt~ naeh sub- cu tane r I m p l a n t a t i o n yon ~kscites-Tu-

wachstum verlieren sich rasch die beschrie- moren , a Bis 3 S t d : Alle Geschwtllst- zellen morpho log i seh l ind h i s tochemisch

benen Sehichtungen, wobei die positiven gleichartig, b 4--24 Std: Entwicklun~ Fermentreakt ionennunmehr im wesentlichen ciner Augenzone u n d eines Zen t rums .

c 1 - - 2 T a g e : A u f t r e t e n e iner Leuko- in Form kleiner intracytoplasmatiseher cyten- l ind Nekrosezone zwischen Grarlu]a auftreten. Diese Befunde entspre- Aaaenzone und verkleinertem Zentrttm.

d 2 - - 3 T a g e : ~Vachs tum tier Augenzone , chen bei den untersuchten Fermentreak- Umwandlung ihres inneren Antei]s im tionen nach unseren heutigen Kenntnissen Sinne des Z e n t r u m s . e Ab 5. T g : Solide

Geschwuls t m i t um'egelm~13igen zen t ra len im wesentlichen den Mitochondrien. 1Vfit Nekrosen dieser Beobaehtung stehen die elektronen- optischen Beftmde yon WESSEL und BEI%NIIARD (1957) in Ubereinstimmung, die zeigten, dab Zellen solider Gewebsformationen, die sieh aus Ascites-Tumor-

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Zellen entwickelt haben, eine wesentlich st/~rkere Entwicklung des Ergasto- plasmas und der Mitochondrien aufweisen. Wahrend im Untersehied hierzu elektronenoptiseh die Ascites-Tumor-Zellen nut kleine oder degenerierte Mito- ehondrien aufweiscn, zeigen die histochemischen Reaktionen sehr starke Fer- mentreaktionen im Bereich der Zellmembran. Elektronenoptische Aquivalente linden sich hierzu anseheinend nieht, dagegen haben GnoPP, BONTKE und t IusE (1957) in der Gewebekultur ~hnliche Enzymreaktionen an der Zellmembran nachgewiesen.

In. tier morphologisehen and histochemischen Umgestal tnng sowohl der gesamten Geschwulstzellknoten als auch der einzelnen Gesehwulstzellen selbst, die, wie gezeigt wurde, bei den verschiedenen Gesehwfilsten z.T. untersehiedlich verl~uft, sehen wir ein experimentelles Modell, aus dem sich zahlreiehe Parallelen zur Metastasenbildung und -entwicMung menschlicher Geschwfilste ergeben.

Zusammenfassung Das morphologische und fermenthistochemische Verhalten der Geschwulst-

zellen beim Ubergang yon Ascitesform in solide Geschwiilste naeh subeutaner Implanta t ion zeigt Untersehiede zwischen dem Ehrlich-Tumor und dam Yoshida- bzw. Walker-Tumor. I m Transplantat aller drei Ascites-Tumorcn entwickelt sich zwisehen 6 and 24 Std eine morphologische Differenzierung in eine groB- zellige Augenzone und ein kleinzelliges Zentrum. In der Augenzone sind die Reaktionen ffir DPN-Diaphorasen und DPN-abMngige Dehydrasen stark positiv, im Zentrum negativ. Die Succinodehydrase zeigt ein entgegengesetztes Ver- halten. - - Eine weitere Schiehtung entsteht dutch eine Lenkocyten- and Nekrose- zone am Rand des zentralen Geschwulstanteils.

Summary The morphological and enzyme-histochemieal characteristics of tumor cells

during the transition of the ascites form into the solid tumor after subcutaneous implantat ion indicate differences between the Ehrlich tumor and the Yoshida and Walker tumors. In the transplants of all three ascites tumors ~ morpho- logical differentiation into an outer zone of large cells and a center of small cells develops between 6 and 24 hours. In the outer zone the reactions for DPN- diuphorases and DPN-dependent dehydrases ~re strongly positive; in the center they are negative. The suceinic dehydrogen~se shows the converse.

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Priv.-Doz. Dr. M. EDER und Priv.-Doz. Dr. H. W~BA, Pathologisches Institut der Universitiit Mfinchen 15, Thalkirchner Str. 36