feno- ja genosüstemaatika ii

Feno- ja genosstemaatika II

T. Alame. Bakterid 2002

Genotbilised tunnused


Genotbilised tunnused: genoomi suurusSeda vib mrata kas daltonites vi aluspaarides. 1500 bp = 10 6 D.Kige viksema genoomiga bakter on Mycoplasma genitalium (0.58 Mb).

Arvatakse, et minimaalne bakterigenoom viks sisaldada 400-500 geeni. Nende produktidest peaks piisama, et hakkama saada. E. colil on 4300 geeni, prmil S. cerevisiae 6000 geeni, inimesel 30 000 geeni.


Genoomi suurus ja geenide arv


Genotbilised tunnused: genoomi suurusAinult genoomi suurus ei ole ilmselt organismi tsilikkuse mraja, sest niteks kahepaiksete genoom on 30 x suurem, kui inimese genoom. Siiski kehtib see, et vga vikese genoomiga bakterid (mkoplasmad ja klamdiad) on metaboolselt defektsed ja parasiteerivad krgematel organismidel. Prokarootidest on aga niteks suure genoomiga aktinomtseedid ja mksobakterid, kellel on keeruline morfoloogia, arengutskkel jne.

Myxococcus xanthuse genoomi suurus on 9.45 Mb. Vrdluseks Helicobacter pylori 1.66 Mb; E. coli 4.6 Mb


Genoomide sekveneerimine ja jrjestuste analsPraeguseks on sekveneeritud juba rida bakterite genoome (le saja genoomi kindlasti 2003 aasta seisuga). Infi saab aadressilt www.tigr.org/tdb/mdb/mdb.html.

Esimene bakterigenoom, mis sekveneeriti oli Haemophilus influenzae oma. Vikseima genoomiga senisekveneeritud bakter on Mycoplasma genitalium (0.58 Mb). See annab aimu, kui palju geene viks hel bakteril vaja olla.


Preaguseks on vga paljud bakterite genoomid sekveneeritud. Seisuga jaanuar 2004 oli tielikult sekveneeritud ja publitseeritud 169 prokarootset genoomi ning sekveneerimisel 428 genoomi http://wit.integratedgenomics.com/GOLD/


Genoomide sekveneerimine ja jrjestuste analsMethanococcus jannaschii (1.66 Mb) oli esimene sekveneeritud arhe. 62% tema valke kodeerivatest geenidest olid unikaalsed, neil ei olnud homolooge andmebaasides. See nitas, et arhed on testi bakteritest palju erinevad.

Synechocystis sp. (3.57 Mb) on tsanobakter. 5% tema orfidest olid seotud fotosnteesi funktsiooniga ja 99 orfi andis sarnasuse tranposaasi geeniga, mis nitab, et genoom vib transpositsiooni abil hlpsasti mber korralduda.


Genoomide sekveneerimine ja jrjestuste analsHelicobacter pylori (1.67 Mb) genoomi anals nitas, et palju on tal geene, mis olid seotud liikuvusega, adhesiooniga ja raua transpordiga. Regulaatorgeene ja sigma-faktorite geen oli suhteliselt vhe. See on ilmselt seotud bakteri stabiilse elukeskkonnaga (inimese magu). Escherichia coli K-12 (4.64 Mb) genoom sisaldas rohkesti IS elemente ja jnukeid faagi jrjestustest, mis annab tunnistust horisontaalsest geenitriivist.

H. pylori maohaavandis


Genoomide sekveneerimine ja jrjestuste analsMethanobacterium thermoautotrophicumi (1.75 Mb) genoomi anals nitas, et geenid, mis olid seotud DNA metabolismiga, transkriptsiooni ja translatsiooniga, olid eukarootide omadele sarnased. Genoomi lesehitus aga oli teistele prokarootidele sarnane (niteks esinevad operonid ja on rngaskromosoom).

Bacillus subtilis (4.21 Mb) oli esimene sekveneeritud grampositiivne bakter. Anals nitas, et genoomis oli toimunud palju duplikatsioone ja et vga suur osa geenidest oli seotud erinevate ssinikuallikate kasutamisega. Leiti ka vhemalt 19 profaagi, mis nitab, et faagide abil toimuv horisontaalne geenilekanne vis olla oluline batsillide genoomi evolutsioonis.


Genoomide sekveneerimine ja jrjestuste analsBorrelia burgdorferi B31 (1.44 Mb) genoom on unikaalne, sest ta koosneb lineaarsest kromosoomist (0.91 Mb) ja vhemalt 17-st lineaarsest ja rngasplasmiidist (kokku 0.53 Mb). Arvatakse, et plasmiidsed geenid osalevad antigeenses muutlikkuses ja immuunvastuse vltimises. B. burgdorferi (puukborrelioosi tekitaja spiroheet) ja erteem nahal


Genoomide sekveneerimine ja jrjestuste analsAquifex aeolicus (1.55 Mb) on hpertermofiilne kemolitoautotroof (oksdeerib vesinikku). Vike genoom piirab metaboolset paindlikkust. Kuigi ta on hpertermofiil, leiti genoomist vhe geene, mis viksid olla sellega seotud. Aquifex on vga vana haru bakterite evolutsioonipuul


Genoomide sekveneerimine ja jrjestuste analsChlamydia trachomatis (1.04 Mb) on obligaatne rakusisene parasiit. Puuduvad paljud biosnteesi geenid (anaboolne defektsus). Samal ajal on olemas geenid, mis on vajalikud peremeesraku metaboliitide kasutamiseks. Paljud klamdiate geenid on sarnased eukarootide vastavatele geenidele.


Genoomide sekveneerimine ja jrjestuste analsThermotoga maritima MSB8 (1.86 Mb) on termofiilne evolutsiooniliselt vana eubakter, kellel on leitud vga palju geene (24%), mis on sarnased arhede omadele. Arvatakse, et terved klastrid geene on Thermotoga omandanud arhedelt horisontaalse geenitriiviga.

Thermotoga rakul on peal valguline tooga


Genoomide sekveneerimine ja jrjestuste analsDeinococcus radiodurans R1 (3.28 Mb) on kiirgusresistentne bakter, millel on kaks kromosoomi (2.65 and 0.41 Mb) ja suur ning vike plasmiid (0.178 Mb ja 0.045 Mb). Leiti palju geene, mille funktsiooniks on vitlus oksdatiivse stressiga, kuivusega, nlgimisega ja DNA kahjustuste likvideerimisega. Deinokokkidel on pigmenteerunud rakud. Ka pigmendil on kiirgusevastane toime


GC% DNAs GC% = (G+C)/(A+T+G+C)x1001960-ndatel aastatel hakati he tunnusena sstematiseerimisel kasutama DNA GC%, mis bakterimaailmas varieerub 20-80%-ni. On stabiilne tunnus. Ei sltu raku vanusest, kasvatamistingimustest jne. Fenotpilised tunnused sltuvad. Loomadel ja krgematel taimedel see tunnus ei varieeru eriti ja on 30-50%.

GC% mrati esmalt DNA happelisel hdrolsil saadud produktide paberkromatografeerimisega ja paberilt elueeritud produktide kvantiteerimisega. Viks mrata ka hdrolsiproduktide mramisega HPLC abil.


GC% DNAs Lihtsam on kasutada aga DNA sulamistpi mramist, sest see on lihtsam. A ja T vahel on 2 H-sidet, G ja C vahel 3 sidet. Seega on GC-rikkad DNAd termostabiilsemad ja krgema sulamistpiga. DNA preparaati soojendatakse ja mdetakse pidevalt neeldumise suurenemist 260 nm juures. Denatureerunud (lahtikeerdunud) DNA neelab rohkem, kui natiivne. Kui kogu DNA on lahtikeerdunud, siis neeldumine enam ei suurene. Seda temperatuuri, mille juures pool DNA-st on denatureerunud, nim. DNA sulamistpiks (Tm). Et sulamistpp sltub puhvri ioonsest just, siis peab sulamistpi mramisel kasutama standardseid puhvreid.


DNA kuumutamisel katkevad vesiniksidemed DNA kaksikahelas. Mida enam on DNAs GC paare (nende vahel moodustub kaksikahelas 3 vesiniksidet), seda krgem on tema sulamistpp GC% DNAs


Determination of GC ContentTm is the temperature at which half the DNA is melted


DNA kaksikahelat on vimalik soojendades denatureerida heahelaliseks. Neeldumise jrgi ultraviolettkiirguses on vimalik hinnata denatureerunud (heahelalise) DNA hulka. Temperatuuri, mille juures pool DNAst on denetureerunud, nimetatakse DNA sulamistpiks.GC% DNAs saab mrata ka DNA sulamistpi kauduGC% DNAs


GC% DNAs NB! Sarnase jrjestusega DNAdel on ka GC% sarnane. Samal ajal vib GC% olla sarnane ka vga erineva jrjestusega DNAdel. Seetttu kasutatakse GC% sstemaatikas selleks, et viia mnda tve vi liiki mnest sstemaatilisest ksusest vlja.

GC% DNAs soovitatakse kasutada liikide ja perekondade mratlemisel he genoomse karakteristikuna. Niteks, kui kaks liiki on muidu fenotbilt vga sarnased, aga GC% DNAs on palju erinev, siis ei kuulu need liigid hte perekonda ja nende sstemaatika tuleks le vaadata.


Empiiriliselt on nidatud, et he perekonna liikidel ei erine GC% DNAs rohkem kui 10% vrra ja he liigi tvedel rohkem kui 5% vrra.

Kui kahe mikroorganismi DNA GC% erineb rohkem kui 20-30%, siis neil DNAdel ei ole sarnaseid jrjestusi. NB! Kui mingi organismi genoomist leitakse geene, mille GC% erineb tunduvalt selle organismi tpilisest GC%-st, siis on ilmselt tegu horisontaalse geenitriiviga omandatud geenidega.

GC% DNAs


GC% DNAs GC% on osutunud vrtuslikuks tunnuseks graampositiivsete bakterite jagamisel kaheks alagrupiks:krge ja madala GC-sisaldusega graampositiivsed bakterid. Esimesse kuuluvad aktinomtseedid ja teise niteks batsillid, staflokokid, klostriidid ning piimhapebakterid.


Niteks perekonna Staphylococcus liikidel on GC% DNAs 30-38%, perekonnas Micrococcus 64-75%. Mikrokokid ja staflokokid on fenotbilt hsti sarnased, aga juba GC% nitab, et nad ei ole sugulased. GC% varieeruvus perekonna piires on nende kahe perekonna puhul OK, so. 10% piires.


DNA denatureerimine ja renatureerimineDNA kuumutamisel katkevad vesiniksidemed DNA kaksikahelas. Jahutamisel need sidemed taastuvad ja DNA kaksikahel moodustub taas


Hbriidsed kaksikaheladKa erinevatest organismidest prinevat denatureeritud DNAd anna kokku segades renatureerida. Sel juhul saavad moodustuda ka hbriidsed kaksikheeliksid, kui kahe organismi DNA jrjestused on piisavalt sarnased


DNAde homoloogsuse vrdlemine bakteritel vimaldab mratleda nende suguslust DNAde homoloogsuse mramine bakteritel vimaldab mratleda nende suguslust Mida enam tekib hbriidseid kaksikahelaid, seda sarnasemad on jrjestuselt need vrreldavad DNAd.


Loomulikult saab DNAde sarnasust mrata ka DNA de sekveneerimisega ja saadud jrjestuste vrdlemisega vastavate arvutiprogrammidega,DNAde homoloogsuse mramine bakteritel vimaldab mratleda nende sugulust


DNAde homoloogsuse mramineEralda he bakteri DNA, denatureeri ja seo filtrile (nitrotselluloos- vi nailonfilter). Seejrel hbridiseeri filtri pinnal teise bakteri danatureeritud radioaktiivse DNAga. Hbridiseerumata DNA pese filtrilt maha (ttle nukleaasiga) ja mra filtri radioaktiivsus. Mida suurem see on, seda lhedasemad on uuritavad bakterid.


DNAde homoloogsuse mramineDNAde homoloogsust peegeldab ka hbriidse DNA sulamistpp.

Kui see on alanenud vhe, vrreldes algsete DNAde sulamistpiga, on jrjestused sarnased.

Sulamistpi muutust thistatakse Tm.

Tm ja DNAde suhteline homoloogsus korreleeruvad oma vahel hsti.

Liigi piires peaks Tm olema kuni 5oC (sellele vastav DNA homoloogsuse % liigi piires on ca 70%).


DNAde homoloogsuse mraminehte liiki kuuluvatel tvedel on DNA homoloogsus 70% vi enam. (Aga niteks selle kriteeriumi alusel peaks inimene ja kik primaadid kuuluma hte liiki).

Kui see homoloogsus on madalam, siis ei kuulu vrreldavad tved samasse liiki.

hte perekonda kuuluvatel liikidel peaks DNA homoloogsus olema 40-60%.


DNAde homoloogsuse mramineDNAde homoloogsuse mramine on niteks nidanud, et vana perekond Bacillus on heterogeenne: erinevate liikide vahel on DNA homoloogia 2-50%. Samal ajal on aga perekonnas ka homogeenseid gruppe. ks homogeenne grupp on niteks B. anthracis, B. cereus ja B. thuringensis. Nad on DNA hbridisatsiooni jrgi 80-100% homoloogsed. Seetttu on neid soovitatud kik kanda liigi B. anthracis alla alamliikidena. Tegelikult vivad aga nad kik olla tekkinud B. cereusest, omandades juurde virulentsusplasmiide. Nende kolme liigiga on sarnane ka B. mycoides. Ilmselt silivad need liigid ikkagi iseseisvatena, sest nad on fenotbiliselt hsti erinavad ja nende he liigi alla kandmine phjustaks kindlasti segadust.


DNAde homoloogsuse mramineBatsillide seas on ka teisi homoloogseid klastreid. B. amyloliquefaciens ja B. subtilis (mlemad lagundavad trklist) on 51-81% homoloogsed. Praegu ongi vana Bacillus perekonna baasil tehtud perekondi juurde. Niteks Paenibacillus, kuhu on le viidud B. polymyxa (nd Paenibacillus polymyxa), mis on ka perekonna tpliigiks. Perekonda Paenibacillus viidi le ka teisi batsille: nd P. alvei, P. larvae, P. macerans, P. azotfixans, P. amyloloyticus jmt.


DNAde homoloogsuse mramineUute perekondade loomisel vana Bacillus perekonna liikide basil on avestatud spoori kuju, soolataluvust, raku kuju, peptidoglkaani koostist, rasvhapete ehitust, anaeroobsust/aeroobsust jne. Liigirikkam sugukonna Bacillaceae perekond on ikkagi Bacillus (>60 liigi). Aga see perekond on ikkagi veel heterogeenne ja arvatavasti luuakse tema praeguste liikide arvel veel perekondi juurde.


DNAde homoloogsuse mraminePerekonnast Rhizobium on DNA homoloogsuse vrdlemisel osa liike eraldatud ja loodud nende jaoks uued perekonnad Sinorhizobium, Allorhizobium ja Mezorhizobium.

Rhizobium meliloti Sinorhizobium melilotiLiigi kandmisel uue perekonna alla jb liigiepiteet samaks!


DNAde homoloogsuse mramineDNAde hbridiseerimise alusel on eemaldatud perekonnast Pseudomonas osa tvesid ja viidud perekondade Comamonas ja Xanthomonas alla. Tehtud juurde veel perekonnad Burkholderia ja Ralstonia, millede alla viidi osa varem perekonda Pseudomonas kuulunud liike. Pseudomonas cepacia Burkholderia cepacia


DNAde homoloogsuse mraminePerekonnast Streptococcus on eraldatud osa tvesid ja kantud perekondade Lactococcus ja Enterococcus alla.

Lactococcus lactisStreptococcus lactis Enterococcus faecalisStreptococcus faecalis


Perekond Bacteroides, kes juba GC% alusel oli vga heterogeenne, on DNA homoloogsust arvestades lahutatud paljudeks erinevateks perekondadeks (kokku 12). Mned nited neist uutest perekonadest on jrgmisel slaidil toodud tabelis.


DNAde hbridiseerimise jrgi on vga lhedased (homoloogsus 80-89% ) enterobakterite perekonnad Escherichia ja Shigella. Seega viks nende perekondade esindajad kuuluda DNA homoloogsuse kriteeriumi alusel kik hte liiki. Viimasel ajal koguneb ka ha enam andmeid, et patogeensuse poolest on need 2 perekonda ka sarnased. Mlemad vivad kanda virulentsusplasmiide, mis kodeerivad enterotoksiine, shiga-taolist toksiini, adhesiine, siderofoore. Nende faktorite kombinatsioonist sltub, kas mikroob phjustab dsenteeriat, koolerataolist haigust, khulahtisust, uroinfektsiooni vi veremrgitust. DNAde homoloogsuse mramine


Seega tundub, et Shigella on auksotroofne, invasiooniplasmiide kandev, inimesega kohanenud E. coli. Oletatakse, et Shigella erinevad tved on tekkinud korduvalt E. coli tvede baasil, omandades uusi geneetilisi elemente, mis kannavad virulentsusfaktoreid. DNAde homoloogsuse mramine


Samal ajal on niteks erinevad Clostridium botulinumi tved DNA hbrdisatsiooni jrgi ainult 10% sarnased ja palju sarnasemad teiste perekonna Clostridium liikide tvedega. Aga kuna nad kik snteesivad botulismitoksiini, siis epidemioloogilistest kaalutlustest lhtudes ei soovitata neid teiste liikide koosseisu llitada.DNAde homoloogsuse mramine


rRNA geenide jrjestuste vrdlemine1965. a. arvasid Linus Pauling ja Emile Zuckerlandl, et biomolekulid vivad olla molekulaarsed kronomeetrid. Kmme aastat hiljem nitasid Carl Woese jt. , et 16SrRNA on ks selline molekulaarne kronomeeter.


rRNA geenide jrjestuste vrdleminePraegune Bergey sstemaatikaksiraamat ja suur koguteos Prokaryotes on oma flogeneetilise ssteemi ehitanud les just 16SrRNA jrjestuste vrdlemisel. rRNA geenid on head evolutsioonilised markerid, sest nende jrjestused on vhe muutunud. Ribosoom on vga oluline organell ja seetttu elimineeritakse populatsioonist mutatsioonid, mis valgusnteesi tugevasti hirivad.


Bakterite ribosomaalsete rRNAde ultratsentrifuugimisel eraldub 3 erinevat rRNAd: 23S, 16S ja 5S. Nende pikkused on 3300, 1650 ja 120 nt. rRNA geenide jrjestuste vrdlemine


rRNA geenide jrjestuste vrdlemineAjalooliselt sekveneeriti esmalt 5S rRNAd, sest ta oli kige lhem ja hlpsam sekveneerida.


rRNA geenide jrjestuste vrdlemine: 16SrRNA esimesed kataloogidMikroobist eraldatud 16SrRNA restrikteeriti RNAse T1-ga. RNAse T1 on guanosiini krvalt likav ensm. 16SrRNA-st moodustus selle ensmiga likamisel ca 500 oligot pikkusega kuni 20 nukleotiidi. Iga lik, mis oli pikem, kui pentameer, sekveneeriti. Kasutati RNA radioaktiivset mrgistamist ja kahedimensioonilist paberkromatograafiat. Lhemaid oligosid ei sekveneeritud, sest nende jrjestus sisaldas liiga vhe infot. Saadi kataloog, mis koosnes ca 80 oligonukleotiidsest jrjestusest.


rRNA geenide jrjestuste vrdlemine: 16SrRNA esimesed kataloogidSelle kataloogi jrjestused olid htlaselt jaotunud le kogu 16SrRNA geeni ja katsid sellest ca 35-45%. Kuigi rRNAd, mis isoleeriti krge GC%-ga bakteritest nagu deinokokid, aktinomtseedid ja paljud proteobakterid, andsid Rnase T1-ga likamisel rohkem fragmente, kui madala GC%-ga bakterite omad, olid paljud oligod heksameerist lhemad ja neid ei sekveneeritud. Madala GC%-ga mikroobide kataloogid olid informatiivsemad, sest sisaldasid rohkem pikemaid oligosid.Katalooge vrreldi omavahel, leiti sarnasuskoefitsiendid st. SAB, koostati maatriksid ja dendrogrammid.


rRNA geenide jrjestuste vrdlemineKui vrrelda dendrogramme, mis on koostatud 16SrRNA oligonukleotiidide kataloogimise andmete phjal ja dendrogramme, mis koostati 16SrRNA pikkade likude, vhemalt 1000 nukleotiidi, vi tispikkade 16SrRNAde sekveneerimise alusel, siis olid need pris sarnased. Niteks mlema meetodiga eristusid iseseisvate himkondadena Thermotoga rhm ja klamdiad.


rRNA geenide jrjestuste vrdlemine


rRNA geenide jrjestuste vrdleminePraegu on vga populaarne terve 16S rRNA sekveneerimine ja vastavate 16SrRNA jrjestuste hulk andmebaasides kasvab pidevalt. 16S rRNA on sobiva pikkusega: tema jrjestuses sisaldub rohkesti informatsiooni ja ta on sekveneerimiseks sobiva pikkusega.16SrRNAs on konserveerunud piirkonnad ja muutlikumad piirkonnad. Just need muutlikumad piirkonnad sisaldavad informatsiooni ja muutuste jrgi neis piirkondades saab vrrelda organismide evolutsioonilist kaugust.


rRNA geenide jrjestuste vrdlemineSpetsiifiliste praimerite abil amplifitseeritakse genoomselt DNA-lt 16SrRNA geen ja seejrel sekveneeritakse PCR produktilt.

Kasutatakse ka rRNA operoni 16SrRNA ja 23SrRNA vaheala jrjestusi. Need on suhteliselt muutlikumad, kui geenide enda jrjestused ja nende sekveneerimine vimaldab eristada ka madalamaid sstemaatilisi taksoneid, niteks perekondi ja ka liike.

23S rRNA on pikem molekul ja seetttu on tema geene vhem sekveneeritud ja andmebaasides on ka vhem neid jrjestusi.


rRNA geenide jrjestuste vrdlemineSpetsiifilised nukleotiidid erinevate flogeneetiliste rhmade 16SrRNAs


rRNA geenide jrjestuste vrdleminerRNA geenide jrjestuste alusel on koostatud evolutsioonipuud


rRNA geenide jrjestuste vrdlemine16S rRNA jrjestuste sarnasust/erinevust saab kasutada just krgema jrgu taksonite eristamiseks, kuna niteks liikide eristamiseks ei ole tal piisavalt lahutusjudu.

ldiselt on he perekonna liikidel 16SrRNAd ca 95% sarnased ja he liigi piires on sarnasus 97% ja krgem.

Videtakse, et kui mingi uus bakteri-isolaat on 16SrRNA geeni jrjestuselt vhem kui 97% sarnane talle lhima partneriga, siis ei ole mtet nende omavahelist DNA sarnasust hbridisatsiooniga vrrelda, sest see on kindlasti alla 70%.


rRNA geenide jrjestuste vrdlemineKui isoleeritakse uus liik, siis 16SrRNA jrjestus annab kindlasti vihjeid, millisesse domeeni, riiki ja himkonda viks bakter kuuluda. Ilmselt nutakse juba lhitulevikus iga uue bakteri kirjeldamisel ka tema 16SrRNA jrjestust. Seejrel tuleks uurida phjalikult bakteri fenotpi, et tpsustada, milliste teadaolevate liikidega uus liik sarnane on. Siis saaks ta paigutada niteks mne kirjeldatud perekonna alla ja kui ta hegi senikirjeldatud perekonna alla ei sobi, siis luuakse uus perekond.

ldiselt ei peeta heaks tooniks, kui perekond kirjeldatakse ainult he liigi phjal. Aga on tiesti vimalik, et perekonnas ongi ks liik vi vhe liike. Aga sel juhul nutakse selle liigi vga phjalikku fenotbilist kirjeldamist.


Muud genosstemaatilise analsi meetodid: RFLPDNA restriktsiooni fragmentide muster. Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

Erinevatest organismidest eraldatud DNA restrikteeritakse ja saadud fragmentide segu foreesitakse agaroosgeelil. Erineva pikkusega ligud liiguvad erinevale kaugusele. Geeli pildistatakse UV valguses. Saadakse nn DNA fingerprint. See on erinevatel organismidel erinev. Mida sarnasemad on kahe organismi DNA fingerprindid, seda lhedasemad on nende DNA jrjestused. Meetod on vga tundlik, seda saab kasutada tvede eristamiseks liigi sees ja ebatpiliste tvede kandmiseks liigi alla.


Muud genosstemaatilise analsi meetodid: RFLPRFLP anals on sama tundlik, kui fagotpimine ja immunoloogilised meetodid. Saab kasutada ka epidemioloogias haiguspuhangu ajal haigusetekitaja kindlakstegemiseks. Hda on aga selles, et pilt on sageli v. kirju ja erinevate mikroobide fingerprinte on raske vrrelda.


Muud genosstemaatilise analsi meetodid: RFLPKui kasutada mnda harvemini likavat restriktaasi, siis saab pikemad jupid ja fingerprint pole nii kirju. Aga neid juppe on raske agaroosgeelil tavalisel foreesil lahku ajada ja tuleks kasutada teisi foreesimeetodeid (pulsed field electrophoresis). Seda kasutatakse ka tervete kromosoomide eristamiseks foreesil.


Muud genosstemaatilise analsi meetodid: ARDRASee on amplified rDNA restriction analysis. Amplifitseeritakse genoomist DNA , mis kodeerib rRNAd, niteks 16SrRNAd ja fragmente restrikteeritakse.

Mustrite vrdlemine vimaldab eristada liike ja ka tvesid ligi sees. On kasutatud niteks fekaaldega saastunud veest E. coli erinevate isolaatide kindlakstegemiseks. Videtavasti vimaldab eristada erinevatest organismidest (inimene, veised, kodulinnud jne) prinevaid E. coli tvesid, kui restrikteerida amplifitseeritud DNAd vhemalt kahe erineva restriktaasiga.


Muud genosstemaatilise analsi meetodid: Restriktsioonifragmentide hbridiseerimine geeniproovidega DNA restriktsioonifragmendid kantakse le filtrile ja hbridiseeritakse mne geeniprooviga.

Kui hbridiseerida rRNAga, siis nimetatakse meetodit ribotpimiseks. Proovina saab kasutada ka geenilike niteks 16SrRNAd kodeerivatest geenidest.Vib hbridiseerida ka mne teise geeniprooviga. On kasutatud niteks elongatsioonifaktor Tu proovi, ribosomaalse valgu geeni proovi, viburivalkude geenide proove jne.


Muud genosstemaatilise analsi meetodid: teatud geenide restriktsioonimustrite vrdlemineTaimepatogeeni Pseudomonas syringae erinevatel patovaridel on suhteliselt sarnased levaansukraaside geenid. Neid annab PCR tehnikaga genoomist amplifitseerida ja nende jrjestust vrrelda restrktsiooniga.Niteks erinevatel patovaridel on nende geenide restriktsioonimuster XhoI ensmiga ligates erinev: mnedel tvedel ligatakse geen kaheks, mnedel patovaridel kolmeks.Saab kasutada patovaride eristamiseks ja detekteerimiseks.


Muud genosstemaatilise analsi meetodid:RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA analysis)

Lhikeste (ca 10 ap) praimeritega amplifitseeritakse genoomist les ligud ja mustreid vrreldakse. Vimaldab eristada liike ja tvesid liigi sees.


Muud genosstemaatilise analsi meetodid:RAPD Niteks ks praimer vimaldab eristada nelja erinevat Lactobacilluse liiki (L. curvatus, L. paracasei, L. rhamnosus ja L. plantarum). Igal liigil on oma spetsiifilised fragmendid (nidatud nooltega).


Genosstemaatika pakkus llatusiGenosstemaatiliste meetodite kasutamine andis vga llatavaid tulemusi: bakterid, kes fenotbilt olid vga sarnased, sattusid erinevatesse rhmadesse. Kui Bergey ssteemis olid sellised (fsioloogilised) rhmad, nagu ammooniumi oksdeerivad bakterid, fototroofsed bakterid, metaani ja metanooli oksdeerivad bakterid, CO-oksdeerivad bakterid, spiraalsed ja kverdunud bakterid, punguvad ja jtketega bakterid, siis genosstemaatika li selle ssteemi segamini.


Genosstemaatika pakkus llatusiFotosnteesivaid baktereid jagus paljudesse erinevatesse himkondadesse. Purpurbakterid on proteobakterite himkonna erinevates klassides, rohelised S- ja mitte-S-bakterid aga grupeeruvad kahte evolutsiooniliselt kaugesse himkonda.


Genosstemaatika pakkus llatusiRohelised vvli- ja mittevvlibakterid on evolutsiooniliselt kauged


Genosstemaatika pakkus llatusiSamal ajal grupeerusid genosstemaatika andmetel kokku need bakterid, kes on seotud mingil moel eukarootsete rakkudega. Sellised on perekonnad Agrobacterium, Xanthobacter, Azospirillum, Herbaspirillum, Rhizobium, Brucella, Rickettsia jne. Need kuuluvad kik alfaproteobakterite hulka.


Osa neist on oligaatsed rakusisesed parasiididPaljud alfaproteobakterid elavad koos eukarootsete organismidegaOsa elab kas taimede pinnal, risosfris vi juuremgarates


Genosstemaatika pakkus llatusiGenosstemaatikaga hsti korreleeruvaid tulemusi andis kemosstemaatika, just rakukesta koostise andmed, kinoonide ja rasvhapete tpiseerimine ja cyt c struktuur.

Kuna ka N2 fikseerimine on bakterimaailmas vga levinud, siis on mratud ka kromosoomsete nif-geenide jrjestust ja leitud, et ka sel teel saadud dendrogrammid on sarnased ribosomaalsete RNAde uurimisel saadud dendrogrammidega.


Evolutsioonipuud16SrRNA jrjestuste jrgi tehtud flogeneesipuudel eristus selgelt 3 rhma (domeeni): eukaroodid, bakterid ja arhed. Bakterite evolutsioonipuul eristub omakorda vhemalt 18 haru (uues Bergeys neid siiski 23), mida nimetatakse himkondadeks (Phylum, division).


EvolutsioonipuudFlogeneesipuu tegemisel saaks kasutada ka mne teise universaalselt levinud molekuli jrjestusi. Selliseid nii palju polegi. Andmebaasides on veel palju jrjestusi 23SrRNA, RNA polmeraasi, elongatsioonifaktor Tu, ATPaasi ja kuumashoki valkude kohta. Ka nende alusel on koostatud flogeneesipuid ja vrreldud neid puid 16SrRNA puudega. ldiselt tulevad ka teiste markerite jrgi koostatud puud sarnased 16S puuga. Eriti sarnased on 16S ja 23S jrgi tehtud puud.


Elongatsioonifaktori jrjestuste jrgi tehtud puudel niteks ilmneb, et madala GC%-ga g(+) bakterid ei ole monofleetiline rhm. Eraldi harudena eristuvad mkoplasmad (Mollicutes) ja klostriidid, mis 16S puul moodustavad hise haru.


ATPaasi puul eristuvad eraldi harudena batsillid, mkoplasmad ja klostriidid, mis 16S puul moodustavad hise haru. Ka proteobakterid jagunevad eraldi harudesse.


Kokkuvte ja kriteeriumidKui mikroobi fenotpilised tunnused ja DNA GC% langevad kokku mne teise seni kirjeldatud liigi omadega, siis vivad need mikroobid kuuluda hte liiki. Hea oleks siiski tiendavalt teha ka nende omavaheline DNAde hbridiseerimine vi mrata hbriidse DNA sulamistpi langust. Kui DNAde hbridiseerimise jrgi on nende mikroobide sarnasus vhemalt 70%, vi kui hbriidse DNA sulamistpp alaneb kuni 5 oC, siis nad kuuluvad hte liiki.


Kokkuvte ja kriteeriumid2. Erinevate perekondade eristamisel ei ole vaja DNAde hbridiseerimist kasutada. Piisab fenotpilistest tunnustest ja GC% mramisest. Perekonna piires ei tohiks liikide GC% erineda rohkem, kui 10%. Kui hbridiseeritakse eri liikide DNA-sid, siis perekonna piires peaks DNAde sarnasus olema 40-60%.


Kokkuvte ja kriteeriumid3. Liigisisese analsi jaoks on DNAde hbridiseerimine ebatpne. Seal on vaja teha fingerprintingut: kasutada DNA restriktsioonanalsi, RAPD analsi, valkude elektroforeesi jne.


Kokkuvte ja kriteeriumid4. 16SrRNA jrjestuste vrdlemine annab infot evolutsioonilise kauguse kohta, vimaldab eristada himkondi ja domeene.

Kui kahe mikroobi 16SrRNA sarnasus on ~97.5%, siis on nende DNAde homoloogsus enamasti 70% vi suurem. 5. Tervikgenoomide vrdlemine vimaldab tuvastada horisontaalselt prinevaid geene.


feno- ja genosüstemaatika ii

Documents