farmakokinetika uvod 20.10.2004

ANALITIKE METODE U FARMAKOKINETIKIM ISPITIVANJIMARazvoj farmaceutske industrije doprineo je ekspanziji novih preparata i lekova. Primena novih lekova zahteva detaljna ispitivanja da bi se izbegle neeljene posledice neadekvatne primene. Ovo je uslovilo neophodnost poznavanja ne samo naina na koji lek pokazuje svoje efekte (farmakodinamika), ve i puteva kojima se lekovi inaktiviraju i izluuju tj farmakokinetike.U farmakokinetikim ispitivanjima analitikim metodama se ispituju i odreuju lekovi i njihovi metaboliti u biolokom materijalu u cilju:

1. odreivanja farmakokimetikih parametara

2. praenja metabolizma lekova

3. individualizacije terapije

4. korelacije koncetnracije leka sa terapijskim efektom

5. odreivanje bioloke raspoloivosti i bioloke ekvivalentnosti lekova

6. ispitivanje interakcija lekoa pri kombinovanoj terapiji.

O koncentraciji neke supstance u odreenom biolokom materijalu zakljuuje se na osnovu selektivno merenja neke jasno izraene fiziko-hemijske osobine analita. S obzirom na velike razlike u fiziko hemijskim osobinama, u farmakokinetikim istraivanjima se koriste praktino sve analitike metode.

BIOLOKI MATERIJAL ZA FARMAKOKINETIKA ISPITIVANJA

Farmakoloko delovanje jednog leka najee zavisi od njegovog reverzibilnog vezivanja za odgovarajui receptor, tj od afiniteta leka za receptor i aktivnosti nastalog kompleksa. Da bio delovanje bilo merljivo, potrebno je da koncentracija leka u biofazi (mesto interakcije lek-receptor) dostigne odreene vrednosti. Kako direktna procenakoncentracije leka na nivou receptora nije mogua, vre se indirektna merenja iz biolokog materijala, jer je prihvaenoda postoji ravnotea koncentracije leka na mestu delovanja i sredine koja ga okruuje (tkivo, telesne tenosti itd).

Prati se kinetika leka, tj promena koncentracije leka u funkciji vremena iz uzorka biolokog materijala

Izbor biolokog materijala za farmakokinetika ispitivanja zavisi pre svega od od tipa ispitivanja i cilja eksperimenta. Svako istraivanje ima svoj optimalan uzorak materijala iz koga se moe dobiti najvie svrsishodnih podataka.

Bioloki materijal za in vivo farmakokinetika ispitivanja je:

1. plazma

2. serum

3. puna krv

4. saliva5. urin

6. likvor

7. dijalizat sa hemidijalize

8. feces

Bioloki materijal za in vitro farmakokinetika ispitivanja:

Homogenati tkiva Najvanije mesto za metabolizam lekova je jetra. Enzimi odgovorni za metabolizam nalaze se u endoplazmatinom retikulumu-mreu visokoorganizovanih intracelulatnih membrana u citoplazmi parenhima jetre. Tokom izolacije endoplazmatinog retikuluma jetre dolazi do fragmentacije i prekoncentracije (ultracentrifugiranje 140000g) uz izdvajanje mikrozomalne frakcije.

uvanje i konzervacija uzoraka biolokog materijala

Sakupljaju se u posude od inertnog materijala, koji ne interferira sa matriksom. Uzorci se uvaju uglavnom rashlaeni na temperaturama 4 0C, -20 0C ili -80 0C u zavisnosti od osobina aktivne supstance.

Preparati tkiva se uvek pripremaju ex tempore.

Parametri analitikih metoda1. Selektivnost-zavisi od fiziko hemijskih osobina leka koji se ispituje i od prisustva potencijalno prisutnih interferirajuih materija

2. Osetljivost-minimalna koncentracija koja moe biti detektovana metodom (LOD-limit of detection). Minimalna koliina koja moe biti odreena sa odgovarajuom tanou je granica kvantifikacije (LOQ-limit of quantification)

3. Tanost-izraena u procentima kao koeficijent odstupanja od prave vrednosti.

(%)4. Preciznost- odnosno ne preciznost izraava se koeficijentom varijacije, koji pokazuje rasipanje rezultata. Dobija se kada se kolinik standardne devijacije niza merenja i srednje vrednosti pomnoi sa 100.

EKSTRAKCIJA SUPERKRITINIM FLUIDIMA

Ekstrakcija superkritinim fluidima je u industrijskim razmerama rutiniziran postupak, razvijen 80-tih godina, i koristi se u procesima dekofeinizacije kafe i ajeva, ekstrakciji nikotina iz duvana, depigmantaciji pigmentisanih biljaka (Perrut M., 1989) .

Krajem osamdesetih i poetkom devedesetih godina, ekstrakcija fluidima u superkritinom stanju poinje da se primenjuje i u analitike svrhe. Robusni industrijski ureaji su prevedeni u laboratorijske uslove, a razvoj raunarske tehnike je omoguio on-line povezivanje raunara i ekstraktora pa samim tim i programibilno voenje ekstrakcije.

Slika 1. ema superkritinog ekstraktora HP 7680

Superkritina ekstrakcija (Supercritical Fluid Extraction-SFE) je teno-vrsta ekstrakcija u kojoj je -tenost- fluid u superkritinom stanju. ak i kada je uzorak u tenom stanju mogue je izvriti ekstrakciju uz prethodno nanoenje uzorka na inertnu vrstu podlogu.

OSOBINE SUPERKRITINOG FLUIDA

iste materije mogu da se nalaze u vrstom, tenom ili gasovitom stanju u zavisnosti od uslova temperature i pritiska. U pT grafiku, oblasti koje odgovaraju ovim stanjima razdvojene su krivama promene stanja koja se seku u trojnoj taki. Kriva isparavanja (tenost-gas) se zaustavlja u kritinoj taki, mestu preseka kritine temperature i kritinog pritiska. Iznad kritine take fluid postoji samo u superkritinom stanju i ono se za veinu jedinjenja moe dosta lako postii (Perrut M., oct.1988).

Slika 2. pT dijagram -kritina taka i supertkritina oblast

Fluid u superkritinom stanju predstavlja kombinaciju transportnih osobina gasa i moi rastvaranja rastvaraa u tenom agregatnom stanju. Ovo znai da superkritini fluid penetrira u intersticije matriksa poput gasa, a rastvara analit istom moi rastvaranja kao teni rastvara odgovarajue polarnosti. Princip ekstrakcije superkritinim fluidima je vrlo slian klasinoj ekstrakciji organskim rastvaraima, osim injenice da se fluid mora drati iznad kritine take. Vie kritine temperature, pri izradi instrumenta, zahtevaju jae grejae i bolju izolaciju od okoline, a vii kritini pritisak robusniju konstrukciju i mnogostruko skuplje setove pumpi i ventila za postizanje eljenih pritisaka.

Tabela 1. Minimalne kritine vrednosti temperature i pritiska za pojedne fluide.

FluidKritina temperatura, 0CKritini pritisak, bar

etilen9.350.4

ugljendioksid31.173.8

etan32.348.8

azotoksid36.572.7

propilen91.946.2

propan96.742.5

amonijak132.5112.8

heksan234.230.3

voda374.2220.5

Zbog navedenih razloga, primenjeni fluid, treba da zadovoljava sledee karakteristike:

niska kritina temperatura i kritini pritisak

hemijski inertan

nije lako zapaljiv i nije podloan eksploziji

nije toksian

Iz podataka u tabeli se moe zakljuiti da ove uslove najbolje ispunjava ugljen dioksid-CO2. Njegova kritina temperatura je tek neto iznad sobne Tc 31.1 0C, a kritini pritisak se postie ve na pc 73.8 bar. Hemijski je inertan, netoksian, moe se dobiti u zadovoljavajuoj istoi. Kako je prisustvo CO2 sastavni deo atmosfere, nije toksian po okolinu i ne postoji problem njegovog lagerovanja u smislu hemijskog otpada (Hewlett Packard, 1990).

superkritini CO2 kao solvent

Ugljen dioksid je fluid male polarnosti, veoma kompresibilan, tako da se menjanjem parametara temperature i pritiska menja njegova gustina a samim tim i polarnost. Njegova gustina moe da varira od 0.6 g/cm3 (gustina gasova) do cca 2.5 g/cm3 (gustine tenosti). Generalno pravilo koje se moe primeniti na sve superkritine fluide je da se mo rastvaranja ili rastvorljivost analita poveava sa gustinom.

Slika 3. Fazni dijagram CO2

Promenljve na dijagramu su redukovane promenljive, izraene kao odnos aktuelne i kritine vrednosti. Kritina taka je taka u kojoj se sreu redukovane vrednosti za p, T i ( kada su njihove vrednosti jednake jedinici te je superkritina oblast ona za koju su vrednosti redukovanog pritiska i redukovane temperature vee od jedan (Perrut M. 1989) .

Ako se na grafiku predstavi samo superkritina oblast i vrednosti iz redukovanih prevedu u realne (za CO2) , dobija se jasna i jednostavna slika kako se malim poveanjem pritiska znatno poveava gustina superkritinog fluida, a samim tim i rastvorljivost analita i mo rastvaranja solventa.

Slika 4. Dijagram superkritinog stanja-promena gustine sa poveanjem pritiska

U nekim ekstrakcijama mo rastvaranja ili postignuta polarnost ne zadovoljavaju uslove ekstrakcije. Dodavanjem nekoliko procenata acetona, metanola ili metilenhlorida (modifaeri) u CO2 menjaju osobine solventa i u veini sluajeva se znatno poveava efikasnost ekstrakcije (Onsuka F.I. et al. 1989). Rezultujui fluid je i dalje u superkritianoj oblasti, ali predstavlja kombinaciju osobina CO2 i dodatog modifaera.

OSNOVI SUPERKRITINE EKSTRAKCIJE

Superkritina ekstrakcija se moe izvoditi na dva naina:

online i

offline

Online nain rada predstavlja superkritinu hromatografiju, pri emu se rastvor analita u superkritinom fluidu direktno vodi do instrumenta za analizu.

U offline nainu rada su ekstrakcija i analiziranje odvojene operacije. Ekstrakcijom se dobija rastvor analita rastvoren u odgovarajuem rastvarau, spreman za dalju analizu.

Postoje dve varijacije ekstrakcionog postupka:

statika i

dinamika.

Dinamika ekstrakcija podrazumeva pumpanje superkritinog fluida kroz uzorak do prijemnika (viala za kolektovanje gotovog rastvora), pri emu fluid kroz uzorak prolazi samo jednom. Ovo je efikasan nain ekstrakcije samo u sluaju kada je priroda matriksa takva da fluid lako penetrira, a analit je dobro rastvorljiv u fluidu zadate gustine.

Slika 5. Princip dinamike ekstrakcije

Tokom Statike ekstrakcija uzorak se natapa superkritinim fluidom odredjeno vreme, posle koga fluid odlazi u prihvatni sud.

Slika 6. Pricip statike ekstrakcije

Faza I

Faza II

Natapanje uzorka fluidom je veoma korisno u sluajevima kada se analit teko odvaja od matriksa. Ovoj pojavi moe da bude uzrok ili slaba rastvorljivost analita u fluidu ili velika gustina matriksa (matriks male poroznosti).

PRINCIP RADA SUPERKRITINOG EKSTRAKTORA

Priprema uzorka superkritinim CO2 odvija se u tri faze:

1. Superkritini fluid (sa ili bez modifaera) ekstrahuje analit iz uzorka

2. Nanoenje ekstrahovanog analita na trap

3. Eluiranje analita sa trapa u vial

Slika 7. ema ekstrakcionog procesa

Odmereni uzorak se stavlja u ekstrakcionu auru -TIMBLU- cev od nerdjajueg elika, sa navojima na oba kraja. Oba zavrtnja poseduju porozne fritove da bi dozvolili prolaz superkritinog fluida, a istovremeno zadrali uzorak u auri.

Granulirani uzorci se direktno mogu sipati u auru, dok se komadni vrsti uzorci moraju prethodno isitniti na male komade. Granulacija uzorka mora da bude vea od pora na fritovima-sinteri male poroznosti (0.2 mm).

Ekstrahovanje analita superkritinim fluidom

Nakon postavljanja timble u ekstrakcionu komoru i startovanja programa ekstrakcije , ekstrakcioni fluid, jo uvek smea gasova i tenosti, se pre ulaska u ekstrakcionu auru zdrava u komori (bypass) do postizanja zadatih superkritinih parametara.

Ovaj nain punjenja ekstrakcione aure spreava perturbaciju uzorka dok se ne uspostavi setovan pritisak i protok. Punjenje timble preko bajpasa poinje onog trenutka kada se dostignu superkritini uslovi.

Po dostizanju zadate gustine, uzorak se natapa superkritinim fluidom u vremenskom intervalu koji odreuje analitiar. Ovo je period statike ekstrakcije.

Nakon zavretka perioda statike ekstrakcije nastupa dinamika ekstrakcija i fluid sa analitom iz timble se kree ka trapu.

Nanoenje analita na trap

Superkritini fluid po izlasku iz timble nosi sa sobom rastvoreni analit, prolazi kroz regulacioni ventil i mlaznicu. Prolaskom kroz mlaznicu superkritini pritisak pada na atmosferski, pri tome superkritini fluid prelazi u stanje gasa i odlazi u atmosferu sistemom ventilacije, dok analit zaostaje na trapu.

Slika 8. Postupak odlaganja analita na trap

Pakovanje trapa, na koji se nanosi analit nakon ekspandiranja CO2, su vrste faze tipine za tenu hromatografiju i kuglice od nerdjajueg elika.

ELUIRANJE ANALITA SA TRAPA

Analit rasporedjen na povrini pakovanja trapa se eljenim rastvaraem eluira i kolektuje (sakuplja) u vial za analizu (frakciju) ili u otpad. Rastvarai za eluiranje moraju biti istoe za tenu hromatografiju.

Slika 9. Korak eluiranja analita sa trapa

.

Superkritini ekstraktor predstavlja kombinaciju superkritine ekstrakcije i tene hromatografije i treba da ispunjava sledee uslove:

nezavisnu kontrolu pritiska i protoka

interni trap za prihvatanje analita

statiku, dinamiku i kombinaciju ove dve ekstrakcije

viestepene ekstrakcione korake svaki sa svojim operacionim uslovima

selektivno eluiranje sa trapa korienjem vie rastvaraa ili smea rastvaraa razliitih polarnosti

on-line proces kontrolisan i vodjen raunarom

Do momenta svoenja superkritinog fluida u stanje gasa na atmosferskom pritisku, aparat se ponaa kao superkritini ekstraktor . Po ekspandiranju na mlaznici, analit se vezuje za trap - koloni za tenu hromatografiju, sa koje se eluiraju eljene frakcije ekstrahovanog analita. Ekstrakcije obino ne traju due od 30 min. (King J.W, 1989), a kolektovane frakcije su, bez potrebe za dodatnim preiavanjem, dalje , spremne za analizu gasnom ili tenom hromatografijom. Mogunost dodatnog on-line povezivanja SFE sa gasnim ili tenim hromatografom ine ovu tehniku izuzetno prijatnom za rad tako da je nala primenu na svim poljima analitike.

EKSTRAKCIJA NA VRSTOJ FAZI

(SOLID PHASE EXTRACTION - SPE)

Sorbent ekstrakcija predstavalja fiziku ekstrakciju koja ukljuuje raspodelu izmedju vrste i tene faze, u kojoj izmedju vrste faze i izolata postoji jaa interakcija nego izmedju izolata i rastvaraa u kome je bio rastvoren. (Van Horne K.C, 1985)

Konstrukcija ekstrakcionog kartrida je vrlo jednostavna i sastoji se od tela prica sa luer nastavkom u kome se nalazi sendvi pakvanje sinter (frit) - sorbent (vrsta faza na kojoj se odvija ekstrakcija) - sinter. Postoji mogunost odabira preko dvadeset razliitih faza za ekstrakciju i sve su dizajnirane za brzu, jednostavnu i reproduktivnu pripremu uzorka

Konstrukcija kartrida omoguava njihovu medjusobnu kombinaciju to dodatno poveava mogunosti razdvajanja i izolovanja eljene komponente.

Princip ekstrakcije se zasniva na prolasku rastvora uzorka kroz sorbent, pri emu se izolat (analit) zadrava i koncentrie u uskom sloju na povrini sorbenta, dok ostale komponente prolaze.

Visoka selektivnost ekstrakcija i izolacija analita se postie odabirom odgovarajueg sorbenta i rastvaraa (ili smea rastvaraa).

Sorbent je u osnovi silicijumski supstrat za koji su kovalentno vezane funkcionalne grupe. Priroda funkcionalnih grupa diktira specifine osobine sorbenta. Sorbenti se prema svojim osobinama mogu podeliti na:

Polarne

Slabo polarne

Srednje polarnosti

Slabo nepolarne

Nepolarne

Katjonska izmena

Anjonska izmena

Na slici 10. je prikazan princip izolacije analita iz matriksa ekstrakcijom na sorbentu

Slika 10. Princip izolacije analita iz matriksa ekstrakcijom na sorbentu

SINTEZA MODIFIKOVANOG SILIKA SORBENTA

Sinteza sorbenta polazi od aktiviranog silikagela i organosilanskih jedinjenja pri emu dolazi do stvaranja silil etarskih veza. Rezultat je sorbent sa funkcionalnom grupom organosilana. Reakcija koja se odvija kasnije je reakcija deaktiviranja silanolnih grupa na silikagelu. Na ovaj nain se dobijaju takozvani endcapped sorbenti. Cilj je da se dobije sorbent takvih osobina kod kojih e interakcije funkcionalnih grupa i silicijumskog supstrata biti svedene na minimum.

Slika 11. Sinteza silika sorbenta

silicijumski supstrat

b)formirani silika sorbent sa slobodnim SiOH krajem

(unendcapped)

formirani silika sorbent sa vezanim SiOH krajem

(endcapped)

HEMIJSKA STABILNOST MODIFIKOVANOG SILIKA SORBENTA

Modifikovani silika sorbenti su stabilni u opsegu pH od 2 do 7.5. U praksi se ovi sorbenti mogu koristiti u itavom opsegu pH vrednosti jer se sorbenti rastvaraima izlau veoma kratko vreme, tako da ne dolazi do degradacije strukture sorbenta. Stabilnost modifikovanih silika sorbenata se ogleda i u mogunosti primene skoro svih organskih rastvaraa.

FIZIKE OSOBINE SILIKA SORBENTA

Vezani silika sorbenti su rigidni materijali koji ne podleu uticajima razliitih organskih rastvaraa. Zbog svojih osobina lako se prilagodjavaju novim uslovima. Ovo omoguava primenu kompleksnih ekstrakcionih procedura koje tokom ekstrakcije ukljuuju izmene vie razliitih rastvaraa. estice sorbenta su veliine izmedju 15 i 100 ( i uglavnom su nepravilnog oblika. Ove osobine omoguavaju brz protok solventa u uslovima minimalnih vakuum pritisaka (10 - 15 psi).

Slika. 12 Poroznost modifikovanog silika sorbenta

SOLVATACIJA SORBENTA

Na mikroskopskom nivou struktura silika sorbenta je slina moru funkcionalnih grupa usidrenih za silika supstrat preko siloksanskih mostova-silil etarske veze. Ove veze su odgovorne za dve vane osobine silika sorbenta: potreba za solvatacijom sorbenta i potencijalne sekundarne interakcije sa molekulima izolata. Solvatacija sorbenta je neophodna pre interakcije sa molekulima izolata. Ona predstavlja natapanje sorbenta kreirajui pri tome okolinu pogodnu za zadravanje analita. Za solvataciju sorbenta se moe koristiti bilo koji rastvara koji moe solvatisati i polarnu povrinu silika osnove i funkcionalne grupe vezane za njega. Rastvara koji se koristi za solvataciju sorbenta treba da se mea sa rastvaraem u kome je rastvoren analit. Jednom solvatisan, sorbent ne bi smeo da se desolvatie (preteranim suenjem) posebno pre aplikacije analita na sorbent. Kada je izolat jednom nanet na povrinu sorbenta dalje suenje ne predstavlja problem. Suenje sorbenta se preporuuje kada ekstrakcioni postupak zahteva vie koraka i kada se koriste rastvarai koji se na meaju. Sorbent se sui proputanjem blage struje vazduha ili azota izmedju primene dva rastvaraa koja se ne meaju.

Slika. 13 Nesolvatisan i solvatisan sorbent

MEHANIZMI SORBENT EKSTRAKCIJE

Retencija (zadravanje) predstavlja fenomen privlaenja izmedju sorbenta i molekula izolata. Analit se imobilie na povrini sorbenta dok solvent prolazi kroz njega. Retencione osobine izolata se menjaju primenom razliitih vrsta sorbenta i rastvaraa. Retencija izolata je funkcija tri faktora:

Izolata

Rastvaraa

Sorbenta

Eluiranje je proces u kome se izolat uklanja sa sorbenta na kome je bio zadran. Prednosti sorbent ekstrakcije su u zadravanju izolata na povrini sorbenta dovoljno jako da se analit ne kree kroz sorbent, sve dok se ne izvri eluiranje pogodnim solventom. Izolat treba da se eluira sa sorbenta to manjom zapreminom dobro odabranog solventa. Koncentracija izolata u finalnom ekstraktu e biti najvea kada se analit zadrava na sorbentu u to tanjem sloju i eluira najmanjom moguom koliinom solventa.

Slika 14. Kapacitet i selektivnost sorbenta

Kapacitet datog sorbenta je definisan ukupnom masom izolata koja moe biti zadrana na datoj masi sorbenta pod optimalnim uslovima.

Selektivnost sorbenta predstavlja sposobnost sorbenta da razlikuje izolat od ostalih komponenata uzorka tj. da izdvoji i zadri analit od matriksa.

SORBENT-IZOLAT INTERAKCIJE

Najee sorbent ekstrakcione interakcije se mogu grupisati u jednu od etiri klase:

Nepolarne

Polarne

Jonska izmena

Kovalentne

Ekstrakcija pesticida iz zemljita predstavlja tip nepolarnih sorbent izolat interakcija te e u radu ovaj vid interakcija biti opisan.

Nepolarne interakcije se javljaju izmedju ugljovodoninih veza funkcionalnih grupa sorbenta i ugljovodoninih veza izolata. Ove interakcije su poznate kao Van der Waalsove sile ili meumolekularne tipa disperzionih sila.

Najee korien sorbent za nepolarne interakcije je oktadecilsilan vezan za silika supstrat, poznat kao C18. Ovaj sorbent je veoma neselektivan zato to zadrva veliki broj organskih molekula. Nepolarne ekstrakcije su manje selektivne u odnosu na polarne i ekstrakcije jonske izmene, posebno u sluajevima kada treba selektivno odvojiti molekule analita od molekula matriksa slinih struktura.

Slika 15. Struktura nepolarnih sorbenta

Nepolarne ekstrakcije su veoma efikasne u izolaciji grupa komponenata razliitih molekulskih struktura. Zbog toga ova tehnika je tehnika izbora u aplikacijama u kojima je potrebno izolovati vei broj izolata razliitih hemijskih struktura. Iz ovih razloga se ova vrsta sorbenta veoma primenjuje u mnogim environmental aplikacijama analize polutanata u ivotnoj sredini. Nepolarne interakcije izmedju nepolarnog sorbenta i nepolarnih molekula izolata su olakane korienjem veoma polarnih rastvaraa. ak i kada molekul izolata sadri polarne grupe, nepolarni deo molekula interreaguje sa funkcionalnim grupama sorbenta u polarnoj sredini.

Slika 16. Interakcije na nepolarnoj fazi iz polarne sredine

Analit se za nepolaran modifikovan silika sorbent vezuje slabim Van der Vaalsovim silama. Nepolarne interakcije izmedju izolata i sorbenta se raskidaju primenom rastvaraa ili smea rastvaraa veeg stepena nepolarnosti. Odabirom serije rastvaraa ili smee solventa odgovarajuih polarnosti, selektivno se sa sorbenta mogu eluirati analiti ija je polarnost najslinija polarnosti smee kojom se vri eluiranje. Eluenti se biraju po principu (slino se u slinom rastvara(.

KREIRANJE metode

U postupku kreiranja metode ekstrakcije postoje dva razliita pristupa:

1. Prvi pristup je zasnovan na retenciji izolata, selektivnom eluiranju interferirajuih supstanci i konano eluiranju eljenog analita.

2. Drugi pristup je zasnovan na retenciji interferirajuih supstanci, dok izolat prolazi kroz sorbent.

Prvi tip ekstrakcije se generalno vie koristi iz nekoliko razloga:

koncentrovanje izolata na sorbentu se postie sve dok je zapremina za eluiranje manja od zapremine originalnog uzorka

selektivna retencija izolata obino zahteva manju koliinu sorbenta za ekstrakciju nego u sluaju zadravanja interferiajuih supstanci

Kreiranje metode ukljuuje etiri glavna koraka:

1. Definisanje problema ekstrakcije

Shodno prirodi matriksa i izolata treba odabrati najpogodniji sorbent za savladjivanje datog problema ekstrakcije

2. Izbor sorbenta

Selekcija sorbenta se vri u saglasnosti sa prvim korakom, uzimajui u obzir interakcije sorbent-izolat-matriks

Slika 17. Interakcije u sorbent ekstrakciji

3. Testiranje sorbenta

Odabrani sorbent se testira za retenciju, eluiranje, kapacitet i selektivnost u aplikaciji

4. Verifikacija metode

Verifikcija pilot metode se vri radi mogunosti primene metode na realnim uzorcima.

EKSTRAKCIONI PROTOKOL

Sutina ekstrakcionog postupka je :

preiavanje uzorka (clean-up)

koncentrisanje i

zamena primarnog solventa (www. varian.com)

Ove tri opte faze se kod SPE sprovode u etiri jednostavna koraka:

1. Kondicioniranje - priprema sorbenta reproduktivnu interakciju sa matriksom uzorka. Ovaj korak se odvija prethodno prolaskom odgovarajueg solventa kroz kroz kartrid-ekstrakciona kolona, praen solventom koji ima osobine sline matriksu.2. Retencija - nanoenje uzorka na kondicionirani sorbent. Analit (izolat) se zadrava u uskom sloju sorbenta, i biva zadran na povrini sorbenta specifinim hemijskim interakcijama (Van der Waalsove sile)3. Ispiranje - postupkom ispiranja se otklanjaju interferirajua jedinjenja, ostavljajui analit netaknut na povrini sorbenta.

4. Eluiranje - predstavlja krajnji korak u izolaciji analita, a odvija se prolaskom odabranog rastvaraa koji e raskinuti izolat-sorbent interakcije

Slika 18. Ekstrakcioni koraci

KAKO KORISTITI SPE EKSTRAKCIONE KOLONE

Postoji nekoliko naina korienja SPE kartida. Pojedinani uzorci se mogu ekstrahovati koristei obian pric, sa odgovarajuim adapterom za protok solventa kroz kartrid. U iste svrhe se moe koristiti i centrifugalna sila, postavljajui kartid-ekstrackionu kolonu, sa solventom u kivetu za centrifugiranje. Komercijalni vakuum sistemi, u zavisnosti od zapremine i tipa mogu simultano da ekstrahuju 12, 24 ili 96 uzoraka. Postolja sa 96 mesta se koriste za on-line pripremu. Uz primenu odgovarajuih adaptera je mogua kombinacija kartrida sa sorbentima razliite polarnsti tako da se dobro odabranom kombincijom sorbenata dodatno poveava selektivnost ekstrakcije odnosno izolacije analita od interesa iz sloenih matriksa.

Slika 19. Razne mogunosti izvoenja ekstrakcije

Iz prethodno navedenog, moe se zakljuiti da se radi o nainu pripreme uzorka koja je veoma jednostavna, uz mali broj manipulativnih koraka, brza, male potronje organskih hemikalija, veoma prilagodljiva za rad u malim laboratorijama i poetne investicije u opremu su veoma prihvatljive.

Prve primene i razvoj sorbent ekstrakcionih tehnologija su poele osamdesetih godina, da bi danas postigle primenu u najrazliitijim i najzahtevnijim vidovima izolacija i ekstrakcija analita (www.aglient.com/chem, www.varianic.com,www.marcherynagel.com,www.waters.com, www.chrompack.com, www.ist.com, www.jtbaker.nl).

TENO-TENA EKSTRAKCIJA Izolovanje lekova zasnovano na razlici rastvorljivosti aktivne materije leka izmeu dve tene faze koje se ne meaju. Koeficijent raspodele treba da je to vii. Analitiar moe modofikovati uslove ekstrakcije-raspodele, menjanjem pH, dodavanjem pufera, isoljavanja, u zavisnosti od prirode samog analita.Ekstrakcija organskim rastvaraima obino ide u tri koraka:

1. Ekstrakcija pogodnim rastvaraem

2. koncentrisanje i rekonstituisanje

3. detekcija

Pri ekstrakciji sloenih smesa, pri ispitivanju metabolizma pre ekstrakcije i odabira organske faze izvri se klasifikacija supstanci prema pH i zatim pristupi selektivnoj ekstrakciji.Faktori koji utiu na ekstrakciju su:

1. nain ekstrakcije (mukanje, vortex, sonikacija)

2. prisustvo neorganskih soli

3. pH

4. uticaj modifaera

TENO-TENA EKSTRAKCIJA NA HIDROMATRIKSU

Klasina teno-tena ekstrakcija lipofilnih supstanci organskim rastvaraima, levkovima za odvajanje je esto praena nizom problema: formiranje emulzija, slabo odvajanje faza (vodenog od organskog sloja) , velika potronja rastvaraa, nizak stepen automatizacije, visoka cena analize. (www.chromatography.co.uk, Majors R.E. 1997). Pored ovih karateristika treba navesti sekundarno zagaenje ivotne i radne sredine upotrebljenim toksinim organskim rastvaraima, to se nuno odraava i na zdravlja analitiara.

Ekstrakcione kolone sa hidromatriksom svojim osobinama u potpunosti zamenjuju levkove za odvajanje, obezbeujui rutinsku, jednostavnu teno-tenu ekstrakciju, koja se odvija u samo jednom koraku. Glavne prednosti u odnosu na konvencionalnu t-t ekstrakciju su :

ne dolazi do formiranja emulzija

jednostavnost izvoenja

visoka istoa i reproduktivnost uzoraka

tedi rastvarae, materijal i vreme

Kartridi su polipropilenske ili staklene cevi sa luer zavretkom, napunjene inertnom, posebno pripremljenom (flux-calcined) diatomejskom zemljom, visokog stepena istoe, stabilni na promene pH opsegu od 1 do 13.

Ova inertna podloga-stacionarna faza- postaje hidromatriks, aplikacijom vodenog rastvora analita, pri emu se vodena faza zadrava na nosau.

Slika 20. STM povrine hidromatriksa

(Scanning Tuneling Microscopy)PRIVATE "TYPE=PICT;ALT=exnt03.gif (37603 bytes)"INCLUDEPICTURE "D:\\vukosava\\magistarski pisanije\\exnt03.gif" \* MERGEFORMATINET \d"

INCLUDEPICTURE "D:\\vukosava\\magistarski pisanije\\exnt04.gif" \* MERGEFORMATINET \d"

INCLUDEPICTURE "D:\\vukosava\\magistarski pisanije\\exnt05.gif" \* MERGEFORMATINET \d"

INCLUDEPICTURE "D:\\vukosava\\magistarski pisanije\\exnt03.gif" \* MERGEFORMATINET \d"

INCLUDEPICTURE "D:\\vukosava\\magistarski pisanije\\exnt04.gif" \* MERGEFORMATINET \d"

Primenom nepolarnog rastvaraa, lipofilne supstance se ekstrahuju iz vodene faze u organsku, iz koje se analiziraju odmah ili nakon dodatnog koncetrisanja . Protok solventa obezbeuje gravitacija, tako da nije potrebna primena vakuuma ili nadpritiska.

Postupak ekstrakcije je veoma jednostavan i odvija se u nekoliko koraka. U zavisnosti od koliine uzorka i/ili oekivane koncentracije analita primenjuje se kolona odgovarajue zapremine.

U prvom koraku se uzorak u vodenom medijumu nanese na inertnu stacionarnu podlogu. Neophodno vreme za formiranje hidromatriksa, nakon natapanja uzorkom, je izmeu tri i pet minuta. Nakon proteklog vremena sledi finalni korak izolacije analita iz matriksa eluirajem pogodnim organskim nepolarnim rastvaraem. Ovako pripremljen uzorak se dalje analizira ili se pre identifikacije i kvantifikacije vre dodatna preiavanja i/ili koncentrisanja.

Ekstrakcija se za modifikovanu teno-teno ekstrakciju na hidromatriksu odvija po istim zakonima kao i za klasinu, u levkovima za odvajanje. Iz tih razloga se veina klasinih ekstrakcija moe preneti na ovaj vid kolonske ekstrakcije. Kao i za prethodnu SPE ekstrakciju , i za ovaj vid ekstrakcije postoji veliki broj ve razraenih aplikacija tampanih u vidu sumiranih bibliografskih podataka ili objavljenih na internet adresama (www.varianic.com, www.marcherynagel.com, www.waters.com, www.chrompack.com, www.ist.com, www.jtbaker.nl). Prednosti ove metode su jednostavno i brzo izvoenje, niska cena kotanja uz primenu malih koliina solventa kao i primenljivost na sve tipove matriksa.

Ekstrakcija rastvaraima na povienom pritisku

Ekstrakcija solventima na povienom pritisku (Accelerated Solvent extraction - ASE), predstavlja automatizovan sistem za ekstrakciju analita mahom iz terestralnog i sedimentnog matriksa. Porcije od 10 do 30 grama uzorka se meaju a nekim desikacionim sredstvom ( na primer Na2SO4), sipaju u elije za ekstrakciju i nakon same ekstrakcije se ekstrakt prihvata u viale (prihvatni sud). Dobijeni uzorak podlee daljoj manipulaciji koja e ga uiniti kompatibilnim za hromatografsko analiziranje.

ASE se odvija na pritiscima veim od 1000psi i solventi se greju do temperatura koje prevazilaze taku kljuanja. Ova injenica potvruje i dobijene rezultate, koji ukazuju na veu efikasnost ovakve ekstrakcije u odnosu na klasine. Vreme ekstrakcije je obino manje od 20 minuta, a konana zapremina solventa nije vea od 50 ml (www.p2000.umich.edu, www.dionex.com, ). Raunato na utroak organskih rastvaraa pri Soxhlet ekstrakciji, po jednom uzorku ekstrahovanog ASE tehnikom se utedi i do 500 ml primenjenog solventa.

Slika 23. ema ekstraktora na povienom pritisku

kontrolna tabla

ekstrakciona komora

eluacioni solvent

trap

frakcioni dispenzer

stalak za viale

Pritisak (bar)

Gustina CO2 (g/cm3)

prihvatni sud-vial

uzorak

pumpa

pumpa

uzorak

prihvatni sud-vial

prihvatni sud-vial

uzorak

pumpa

izolat

teni uzorak sa analitom

interference

DD

C

B

A

A-uzorak se proputa kroz sorbent

B-sorbent selektivno zadrava izolat dok interfernce prolaze bez zadravanja

C-ispiranje sorbenta u cilju eluiranja eventualno vezanih interferenci

D-eluiranje preienog i koncentrovanog izolata

ugljenik

vodonik

kiseonik

silicijum

solvatisan sorbent

nesolvatisan sorbent

neselektivna retencija

nizak kapacitet izolacije analita

selektivna retencija

visok kapacitet izolacije analita

Van der Vaalsove sile

Vezane funkcionalne grupe C8

Silika osnova

IZOLAT

SORBENT

MATRIKS

EMBED Word.Picture.8

Inertni gas

Ekstrakciona aura

Solvent rezervoar

Vial sa izolovanim

analitom

Pumpa

_1159635059.unknown

_1159636511.unknown

_1159636752.unknown

_1159634144.unknown

_1001241993.doc