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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE ESTOMATOLOGÍA

ESCUELA DE ESTOMATOLOGÍA

“Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal

a diferentes concentraciones a base de extracto

etanólico de Stevia rebaudiana sobre el crecimiento

de Streptococcus mutans ATCC 25175”

AUTORA: Becerra Quiroz, Layla Marinés

ASESORA: Dra. Teresa E. Ríos Caro.

TRUJILLO – PERÚ

2016

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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DEDICATORIA

A mi confidente y soporte en adversidades, Dios, por guiar mi camino de

tu mano haciéndome sentir que nunca estoy sola, enseñándome que todo

es posible con un corazón humilde, permitiendo que llegue hasta este

momento tan importante de mi formación profesional.

A mi querida mami: LUCINDA CHACÓN ROMERO, considerada por

todos los que te queremos como nuestro pilar, por tu amor infinito y gran

sapiencia.

A mis queridos padres: GLADIS Y ANTONIO. Por darme la vida y estar

conmigo en todo momento, por su apoyo, comprensión y enseñarme que

los sueños pueden ser más que eso.

A mis lindas hermanitas: CINTHYA Y KIARA, cómplices y amigas;

mosqueteras en la vida ―una para y todas para una‖.

A mi querida tía: HAYDEÉ, a quien considero como una madre y amiga,

por compartir momentos significativos y tu disposición para escuchar y

aconsejar a esta señorita de ―locas ideas‖.

A mi pequeña, SOFIA EMILIA, por tener esa inocencia que nos saca más

de una sonrisa y llena nuestras vidas de mucha felicidad.



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AGRADECIMIENTOS

―Donde hay fe hay amor, donde hay amor hay paz, donde hay paz esta

Dios y donde está Dios no falta nada‖. Mi agradecimiento será infinito

hacia ti y sobre todas la cosas, por darme lo más hermoso, mi familia.

A mis padres GLADIS Y ANTONIO, la vida no me alcanzará para

retribuirles todo cuánto me ha sido dado, a ustedes les debo mi formación

en principios y valores como persona. Los quiero mucho; en cada

elección y decisión son sus palabras las que me hace continuar con

coraje y perseverancia este arduo, pero gratificante camino.

A mis hermanitas CINTHYA, KIARA, y demás familiares; por depositar su

confianza en mi persona.

A la Dra. TERESA RÍOS CARO, por su gentileza, dedicación y excelencia

como mi asesora en la realización de este trabajo. Por su tiempo y

paciencia brindados.

A las Dras. ELVA MEJÍA RÍOS Y MARILÚ SOTO VÁSQUEZ, por su

paciencia, amabilidad, empeño y disposición para la ejecución del

presente trabajo.

A LUIS MIGUEL, por ser la persona maravillosa que eres y además de

ello, ser mi amigo. Destino o casualidad fueron los que permitieron

encontrarnos para compartir esta carrera, que es nuestra pasión.



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RESUMEN

Objetivo: El presente estudio de tipo experimental, tuvo como objetivo

determinar la actividad antibacteriana in vitro de un enjuague bucal a base

de extracto etanólico de hojas de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus

mutans ATCC 25175.

Materiales y método: Los extractos se obtuvieron a partir de hojas

frescas de Stevia rebaudiana, para luego ser agregado con solventes en

la elaboración de un enjuague bucal a seis concentraciones en etanol de

70° y seis concentraciones en etanol de 30°. La concentración inhibitoria

mínima se obtuvo por el método de dilución en caldo y agar y para el

efecto bactericida se empleó la técnica de difusión de discos de Kirby y

Bauer.

Resultados: El análisis estadístico permitió seleccionar a la CMI en 1,07

mg/mL en el enjuague a base de extracto de Stevia rebaudiana en etanol

de 70° y la concentración de 2,14 mg/mL, en etanol de 30° (p> 0.05).

Mientras la CMB en 75mg/mL en el enjuague bucal trabajado en etanol de

70° y siendo estadísticamente nulo en etanol de 30° (p< 0.01).

Conclusión: El enjuague bucal a base extracto etanólico de Stevia

rebaudiana posee efecto antibacteriano sobre Streptococcus mutans

ATCC 25175.

Palabras clave: Bactericida, Stevia, antiséptico bucal, Streptococcus

mutans.



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ABSTRACT

Objective: This experimental study, aimed to determine the antibacterial

activity in vitro of a mouthwash based ethanol extract of leaves of Stevia

rebaudiana on Streptococcus mutans ATCC 25175.

Materials and Methods: The extracts were obtained from fresh leaves of

Stevia rebaudiana, before being added solvent in the preparation of a

mouthwash to six concentrations of ethanol 70 ° and six concentrations of

ethanol 30 °. The minimum inhibitory concentration was obtained by the

broth dilution method and agar and the bactericidal effect diffusion

technique of Kirby and Bauer disc was used.

Results: statistical analysis allows to select the MIC 1.07 mg / mL based

on the rinse extract Stevia rebaudiana in ethanol 70 ° and the

concentration of 2.14 mg / mL in ethanol 30 ° (p> 0.05). While the WBC

75mg / mL in the mouthwash worked in ethanol 70 ° and being statistically

null in ethanol 30° (p <0.01).

Conclusion: that the ethanol extract mouthwash Stevia rebaudiana has

antibacterial effect on Streptococcus mutans ATCC 25175.

Keywords: Bactericide, mouthwash, Stevia, Streptococcus mutans.



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ÍNDICE

DEDICATORIA

AGRADECIMIENTOS

RESUMEN

ABSTRACT

I. INTRODUCCIÓN……………………………………………….…..7

II. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………28

III. RESULTADOS……………………………………………………..51

IV. DISCUSIÓN………………………………………………………...54

V. CONCLUSIONES………………………………………………….62

VI. RECOMENDACIONES……………………………………………63

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………64

VIII. ANEXOS……………………………………………………………78



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I. INTRODUCCIÓN.

Actualmente en nuestro país, la caries dental es un problema de

salud pública, siendo aún la atención odontológica de elevado costo y no

accesible a toda la población; teniendo en cuenta que la fitoterapia es una

alternativa viable para todos los profesionales de la Salud en el

tratamiento de diversas patologías; por ello, se apuesta a tratamientos

preventivos en donde se propone el uso de la Stevia rebaudiana, por sus

bondades antibacterianas hipocalórias y accesible por su bajo costo lo

que la calificaría para ser usada como un método en la prevención de

múltiples enfermedades, entre las que podría estar la caries dental.

Las enfermedades bucodentales, como la periodontitis y los

cánceres de la boca y la faringe, en especial, la caries dental, son un

problema de salud de alcance mundial que afecta a los países

industrializados, y cada vez con mayor frecuencia, a los países en

desarrollo, en especial entre las comunidades más pobres. La

Organización Mundial de la Salud (OMS) ha afirmado que «Existe la idea

de que la caries dental ha dejado de ser un problema en los países

desarrollados, cuando en realidad afecta entre el 60% y el 90% de la

población escolar y a la gran mayoría de los adultos y que la caries dental

es también la enfermedad bucodental más frecuente en varios países

asiáticos y latinoamericanos.»1



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En el paradigma actual se entiende la caries dental como una

―Enfermedad re-emergente, compleja y multifactorial, causada por un

desequilibrio en el balance fisiológico entre el mineral dental y el fluido de

la biopelícula, inducida microbiológicamente por bacterias endógenas y a

su vez, relacionada con procesos sociales de los individuos y las

colectividades‖ considerada a su vez, como el padecimiento de mayor

prevalencia y costo en el mundo.2

Hace casi 100 años Millar y Black identificaron los principales

componentes del proceso de la caries como dieta cariogénica, microflora

destructiva, y dientes susceptibles. A lo largo de los años, muchos

investigadores han demostrado la asociación de diferentes grados entre la

caries y factores bioquímicos, ambientales, físicos, microbianos,

sociodemográficos y de comportamiento. Desafortunadamente, ninguna

de estas asociaciones probó ser suficiente para permitir una predicción

exacta de la futura caries dental para el paciente individual.3

La OMS, en el 2003, reportó que 5 000 millones de personas

padecen caries, en América Latina afecta al 98 % de la población

adolescente. El índice de dientes cariados perdidos y obturados (CPO-d)

presenta incrementos permanentes de 5 dientes afectados a medida que

avanza la edad, este aumento en adolescentes sugiere que durante este

período se disminuye la prevención y control de la enfermedad que se

realiza en la etapa escolar y las consecuencias se evidencian en la alta

prevalencia en la adultez, por lo tanto, estudiar la experiencia de caries,

puede resultar útil para evaluar la efectividad de los programas de



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intervención de caries en la infancia y dirigir esfuerzos a la conservación

de lo logrado en las primeras etapas de la vida en materia de prevención.4

En el Perú, la condición de Salud Bucal, atraviesa una situación

crítica, el 90% de la población padece de caries dental, 85% enfermedad

periodontal y 80%, mal oclusión, constituyendo un problema de salud

pública; el índice de dientes cariados, perdidos y obturados (CPOD), a los

12 años es de aproximadamente 6, ubicándose según la OPS en un País

en estado de emergencia.5

La caries dental se define como un proceso o enfermedad dinámica

crónica, que ocurre en la estructura dentaria en contacto con los

depósitos microbianos y por el desequilibrio entre la sustancia dental y el

fluido de placa circundante, lo que da como resultado una pérdida de

mineral de la superficie dental, cuyo signo es la destrucción localizada de

tejidos duros; afecta tanto la corona como la raíz del diente y la ausencia

de atención es causa de la pérdida del órgano dentario, y constituye

además un foco de infección para el organismo. Se clasifica como una

enfermedad transmisible e irreversible6.

Fejerskov define la lesión cariosa como un mecanismo dinámico de

desmineralización y remineralización como resultado del metabolismo

microbiano agregado sobre la superficie dentaria, en la cual con el tiempo,

puede resultar una pérdida neta de mineral y es posible que

posteriormente se forme una cavidad. Concluyendo que la caries es el

signo de la enfermedad y no la enfermedad per se.7



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En numerosos estudios se describen los aspectos más importantes

del complejo mecanismo físico-químico de desmineralización del esmalte

y se conocen como principales factores: la influencia inhibitoria de las

proteínas salivales y del fluoruro, las variaciones anatómicas de los

elementos dentarios, el componente químico de los fosfatos, la

importancia de la carga y los coeficientes de difusión en el gradiente. La

estabilidad-inestabilidad del sistema dependen del pH del medio (está

demostrado que la descalcificación del diente se acentúa cuando el pH

disminuye por debajo de 5,5), de la concentración de fluoruros (los

dientes con esmalte fluorado son más resistentes a la descalcificación), y

a la fuerza iónica. Tanto in vitro como in vivo, la presencia la acidez

favorece la disolución, mientras que la reducción del tiempo de exposición

estimula la remineralización.3

La sacarosa, el carbohidrato más cariogénico presente en la dieta,

es un factor importante que contribuye a la formación y el desarrollo de la

placa bacteriana; esta es fácilmente metabolizada por las bacterias orales

quienes forman glucano8. Durante el metabolismo de carbohidratos,

liberan ácido láctico que se difunde de la placa dental al esmalte,

disolviendo el mineral, con la pérdida neta de minerales que puede

generar una cavidad.4

Entre 200 a 300 especies bacterianas aisladas de la placa dental las

más patógenas de la caries dental son: Streptococcus mutans,

Streptococcus sobrinus, Lactobacillus acidophilus, Actinomices viscusus y



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Bifidobacterium dentium, entre otros, contribuyen a la formación de

biopelículas dentales.4

Las lesiones de caries no se desarrollan sin presencia de la placa

bacteriana y cuando la placa contiene altas proporciones de bacterias

acidogénicas como el Streptococcus mutans y es expuesta a azúcares

fermentables se produce suficiente concentración de ácidos para

desmineralizar el esmalte9. Conforme aumenta el número de bacterias,

aumenta el riesgo de la caries dental.10

Durante el desarrollo de la caries, primero aumentan los

Streptococcus mutans y después los lactobacilos incrementan

significativamente; esto indica que el Streptococcus mutans está

involucrado con el inicio de la lesión de caries, mientras que el

Lactobacillus acidophilus lo es con el progreso de la lesión.11

Streptococcus mutans es un coco Gram positivo, dispuesto en

cadena, no móvil, catalasa negativo, pueden clasificar en 8 serotipos

(serotipos c, e, f y k propiamente dichos), es productor rápido de ácido

láctico con capacidad de cambiar un medio de pH 7 a pH 4.2 en,

aproximadamente, 24 horas. Fermentador de glucosa, lactosa, rafinosa,

manitol, inulina y salicina con la producción de ácido.12

Los hábitats principales para Streptococcus mutans son la boca, la

faringe y el intestino. Es el principal microorganismo que contribuyen a la

caries dental en los pacientes libres de caries, el cual se encuentra como

flora normal en la cavidad oral, además es dominante en la placa de



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pacientes con múltiples lesiones de caries activas. El período crítico de la

colonización de Streptococcus mutans se produce a la edad de 19 a 31

meses en los que se establece la ventana de infectividad. Sin embargo,

las pruebas mostraron que Streptococcus mutans se podría encontrar

poco después de la erupción del diente, incluso en bebés de 6 meses de

edad que no tienen ningún diente.13

Existen varios factores relacionados con la virulencia de

Streptococcus mutans, los cuales le permiten acumularse dentro de la

placa dental y a la vez producir y tolerar los ácidos que causan las caries.

El inicio de la infección ocurre en dos fases distintas; primero las

proteínas de superficie de la bacteria interactúan con el hospedador o con

los productos bacterianos adsorbidos en la superficie del diente11. Luego,

se forma una biopelícula de bacterias agregadas de Streptococcus

mutans y otras especies bacterianas, mediante la síntesis de

polisacáridos extracelulares específicos como los glucanos, a través de

un sistema enzimático llamado glucosiltransferasas (Gtfs),

quien desempeñan papeles críticos en el desarrollo de la placa dental

virulenta absorbiéndose para producir glucanos in situ sobre el esmalte y

proporcionar los sitios para la colonización ávida por microorganismos así

como una matriz insoluble para la formación de la placa14. También se

adsorben a las superficies de otros microorganismos orales

convirtiéndolos en productores de glucanos12.Por tanto, Streptococcus

mutans produce las proteínas que enlazan éstos, fortaleciendo así la

biopelícula.11



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Esta capa de glucano insoluble es esencial para la adherencia de los

microorganismos a las superficies de los dientes15.Otra característica del

Streptococcus mutans es su corto efecto post-pH, que puede definirse

como el tiempo necesario para recuperar su actividad de crecimiento

habitual, tras estar sometido a un bajo pH éste vuelve a la normalidad.

Según lo expuesto, no es de extrañar que estas especies bacterianas

sean las que consigan alcanzar más rápidamente el pH crítico 4.5

necesario para iniciar el proceso de desmineralización.16

A partir del metabolismo de la sacarosa estos microorganismos, en

particular el Streptococcus mutans, producen principalmente ácido láctico,

el cual es fundamental en la virulencia debido a que, aparentemente, es el

ácido más potente que interviene en la desmineralización del diente,

causando daño en la presencia de hidratos de carbono fermentables tales

como sacarosa, fructosa, y glucosa.9, 11

Tanto el Streptococcus mutans como el Lactobacillus acidophilus

producen ácido láctico a partir de azúcares fermentables y son capaces

de vivir en ambientes muy ácidos17. El Lactobacilo rhamnosus y el

Lactobacilo acidophilus son las dos especies más abundantes que se

encuentran con frecuencia en lesiones de caries superficiales y

profundas, en donde el pH tiende a ser ácido.18

Mientras el Streptococcus mutans es el principal microorganismo

que contribuyen a la caries dental en los pacientes libres de caries, ya que

se encuentra como flora normal en la cavidad oral, además de ser



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dominante en la placa de pacientes con múltiples lesiones de caries

activas12; el Lactobacillus acidophilus está más asociado con la dentina

cariada y al avance de las lesiones cariosas en vez de iniciar con la

enfermedad. Normalmente los lactobacilos son menos de 1% del total de

la microflora cultivables. Sin embargo, sus proporciones y la prevalencia

pueden aumentar en lesiones de caries avanzadas, tanto del esmalte y de

la superficie de la raíz19. Es por ello, que se encuentran con frecuencia en

grandes cantidades en las lesiones de caries superficiales y profundos.20

El Lactobacillus acidophilus no puede formar la placa en el diente

por si solo y dependerá del polisacárido extracelular producido por otros

microorganismos orales, principalmente los estreptococos, para la

colonización.21

Históricamente y en la actualidad, se ha observado una tendencia

hacia la investigación sobre el uso de sustancias de origen natural en

diversas áreas de la odontología; con el fin de evaluar su actividad y

posible aplicación para controlar la biopelícula dental22. Ha sido bien

documentado que las plantas medicinales confieren actividad

antimicrobiana para bacterias orales23. El control de la placa se puede

lograr mediante procedimientos de higiene oral mecánicas, pero en

muchos casos eso no es suficiente. Por tanto, la adición de agentes

antiplaca o antimicrobianos para productos de cuidado de la salud dental

ha sido de valor.24



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Hay varias tipos de edulcorantes en el mercado que varían en su

nivel de dulce; natural o artificial, éstos últimos son productos de un

proceso químico y su uso afecta al organismo humano de manera

negativa. Con el aumento en obesidad y diabetes mundialmente nació la

creación de edulcorantes naturales. Los creadores de estos productos

abogan en la posibilidad de ser una alternativa eficaz y saludable para los

diabéticos y/o para aquellas personas que buscan una estrategia para el

control de peso, entre otros problemas crónicos.25

La mayor parte de las enfermedades en la boca comienza con la

formación de la placa dental, por ello, tanto la caries dental y las

enfermedades periodontales pueden ser controladas si la formación de la

placa dental se reduce8. Los hábitos alimentarios son difíciles de cambiar,

especialmente cuando se relaciona con el consumo de productos dulces.

La búsqueda de un sustituto saludable del azúcar es una forma

importante de contribuir a la prevención de las enfermedades dentales y

de otro tipo. 26

No obstante, son muchos los estudios epidemiológicos que

correlacionan el consumo de azúcar con la prevalencia de caries y en los

que se demuestra una clara asociación entre frecuencia de consumo, la

ingesta entre comidas y el desarrollo de la misma27. La sacarosa se

metaboliza fácilmente por las bacterias orales que se encuentran en los

tejidos de la placa dental en el proceso dinámico de la caries26,

promoviendo la firme adhesión bacteriana a los dientes, límites ácidos de

la placa y tampón28. Por ello, el aumento de la disponibilidad de sustitutos



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seguros y eficaces para la sacarosa en la dieta durante períodos críticos

del desarrollo de los dientes, sería vital para la salud pública a largo

plazo.29

Una alternativa tanto al azúcar como a la fructosa es el uso de

edulcorantes no nutritivos. El consumo de alimentos y bebidas que

contienen edulcorantes no nutritivos ha aumentado dramáticamente en

las últimas décadas, se estima que en Estados Unidos un 15% de la

población consume edulcorantes no nutritivos como Sacarina, Aspartame,

Sucralosa, Ciclamato, Acesulfame K, Neotamo, Alitamo. En cambio un

estudio realizado en escolares chilenos muestra que la ingesta es cercana

al 99%.30

Cabe mencionar que la actividad antimicrobiana de sustancias de

origen natural como son los flavonoides, xylitol y el propóleo está bien

documentada. En el contexto de las bacterias cariogénicas, los

flavonoides han demostrado ser activos31, debido a sus diversas

propiedades muy apreciadas en la medicina, como antimicrobianos,

anticancerígenos, disminución del riesgo de enfermedades cardíacas,

entre otros efectos.32

Entre los edulcorantes no nutritivos ya incorporado cabe mencionar

a la Stevia, cuyo sabor es lo más parecido al azúcar, distinguiéndose de

los edulcorantes artificiales por no tener sabor metálico y no ser

cancerígeno30. Un conjunto considerable de evidencia científica apoya la

eficacia y la seguridad en la promoción de la salud humana de los



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extractos de la hoja de la "hierba dulce" Stevia (Stevia rebaudiana

Bertoni), pues es no calórico, no sintético y un potente edulcorante.28

La Stevia Rebaudiana Bertoni, es una planta originaria del Sudeste

de Paraguay y pertenece a la familia Asteraceae, conocida como "hoja

dulce"33. Considerada en varios estudios como un edulcorante natural que

ha demostrado responder beneficiosamente a la salud general y oral34.

Resulta efectiva mientras que el azúcar blanco, fructosa, miel y jarabe de

maíz que califican como edulcorantes naturales, ninguno de ellos es libre

de calorías, ni son los componentes dietéticos beneficiosos para aquellos

que sufren de trastornos de azúcar en la sangre y otras condiciones.35

Durante su desarrollo inicial no posee ramificaciones, tornándose

multicaule después del primer ciclo vegetativo, llegando a producir hasta

20 tallos en tres a cuatro años; puede alcanzar hasta 90 cm de altura en

su hábitat natural y en los trópicos puede llegar a tener alturas superiores

a 100 cm. La raíz es, pivotante, filiforme, y no profundiza, distribuyéndose

cerca de la superficie34. Hojas elípticas, ovales o lanceoladas, algo

pubescentes23, tienen aproximadamente 5 cm de longitud y 2 cm de

ancho y se disponen alternadas, enfrentadas de dos en dos35. En su

estado natural, crece en la región subtropical, semihúmeda de América,

con precipitaciones que oscilan entre 1.400 a 1.800 mm, distribuidos

durante todo el año, temperaturas que van desde los 24 a 28°C y

humedad relativa de 75% a 85%.36



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El botánico suizo Moisés Santiago Bertoni fue el primero que la

describió, en 1887, detallando su sabor dulce. En 1900 el químico

paraguayo Ovidio Rebaudi, logró aislar dos principios activos

responsables del dulzor30. Posteriormente, estos compuestos fueron

llamados esteviósido y rebaudiosido, que son de 200 a 300 veces más

dulces que la sacarosa, estables al calor y no fermentan.35

La propiedad más importante de la Stevia Rebaudiana Bertoni se

encuentra en sus hojas. Se utilizan como edulcorante natural o en

suplementos dietéticos por su contenido de glucósidos37. Se trata del

edulcorante natural llamado esteviósido, que está constituido por una

mezcla de ocho glucósidos diterpénicos28. Esteviósido (300 veces más

dulce que la sacarosa) y rebaudiósidos: A (Reb A, 250 - a 450 veces más

dulce), B (reb B, 300 - a 350 veces más dulce), C (Reb C, 50 - a 120

veces más dulce), D (Reb D, 250 - a 450 veces más dulce), E (Reb E (150

- a 300 veces dulce), Esteviolbiósido (100 - a 125 veces más dulce),

Dulcósido A (50 - a 120 veces más dulce); isosteviol y dihydroisosteviol;

cuyas características químicas y farmacológicas son adecuadas para el

uso en la alimentación humana.28, 30

Las hojas de la planta silvestre de Estevia contienen 0,3%

Dulcósido, 0,6% Rebaudiósido C, 3,8% Rebaudiósido A y el 9,1% de

Esteviósido. De las 110 especies estudiadas por el sabor dulce solo 18

muestran esta característica. De todas las especies la Stevia rebaudiana

Bertoni es la más dulce30. Debido a que son ricas en metabolitos como el

β-caroteno, tiamina, austroinulina, riboflavina, diversos terpenos y



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flavonoides, estos dan a la planta las ventajas de ser usado como

medicamento30, 37. En 1997 Ngowata purificó el extracto de Estevia

obteniendo un Esteviósido, un polvo blanco y altamente higroscópico, por

lo cual hay que mantenerlo en un envase hermético para evitar la

humedad.36

Muchos estudios de toxicidad llevados a cabo con extractos de

Stevia rebaudina indican que es seguro para el consumo humano38. Se ha

demostrado que los glucósidos de steviol cumplen con los criterios de

pureza establecidos por el Comité Conjunto de Expertos en Aditivos

Alimentarios de la OAA/OMS (JointFAO/WHO Expert Committee on Food

Additives, JECFA), no tienen efecto en la respuesta de la presión

sanguínea ni de la glucosa en sangre, lo cual indica que los edulcorantes

de Stevia son seguros para ser utilizados por las personas que tienen

diabetes39. Además, los esteviosidos han sido usados durante muchos

años en América del Sur y en Japón. Otros estudios sugieren que este

producto puede inhibir el desarrollo de microorganismos en la zona

bucal37. Además de ser antioxidante, no cariogénico, quimioprotector,

antiinflamatorio, digestiva, y vasodilatadora.28, 36

El Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios

(JECFA) en sus reuniones 68a y 69a del año 2008, estableció la Ingestión

Diaria Admisible (IDA) para los glucósidos de Esteviol de mg por kg de

peso corporal por día, es decir, peso molecular del total de Esteviol

presente en la mezcla30. Llevó a cabo a un minucioso análisis de los datos

científicos existentes sobre los glucósidos de steviol y ha concluido que



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son seguros para utilizarse en alimentos y bebidas. La revista Food and

Chemical Toxicology publicó un suplemento especial sobre el tema de la

seguridad de los edulcorantes de Stevia en mayo de 2008.38

Un 70% de la producción mundial de stevia es destinada para

procesar cristales de esteviósido, el otro 30% se destina a herbarios40. A

escala comercial la utilización de este edulcorante está de moda desde

principios de los setenta en Japón. Actualmente se cultiva en Japón,

Brasil, Canadá y China, siendo este último el principal exportador de

esteviósido.30

El cultivo de este fitoquímico en el Perú, ha sido introducido hace ya

una década mediante numerosos proyectos dado que es perfectamente

adaptable a sus regiones tropicales y subtropicales, pues presenta

condiciones ideales en altitud, clima, suelo y situación geográfica.

Actualmente está incluida en el portafolio de pequeñas extensiones de

Cajamarca, en la ceja de la selva; Amazonas, San Martin, Ucayali,

Apurímac y Arequipa.41

Las hoja de Stevia en América del sur contiene en promedio de 8 a

12% de esteviósido, en cambio las hojas de China contiene de 5 a 6% de

esteviósido que es compensado con el gran volumen de producción.42

En Perú se ha demostrado que es un cultivo viable en la Amazonía

alta, es muy rentable. Debido a su clima, así, la Amazonía es apta para su

cultivo, mucho más que en Paraguay, Brasil y Argentina, razón por la que

existe mayor productividad: hasta siete toneladas de hoja seca por



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hectárea frente a 1.5, 3 y 4 toneladas en otras regiones sudamericanas.

La variedad peruana contiene hasta un 80% de rebaudiósido A43. Su ciclo

de vida es de 8 años y rinde en promedio 7 TM de hoja seca por Ha/año a

partir del año 2 y en esteviósido 700 kgr/ha/año (10% del peso de las

hojas) 36. En otros países como Paraguay y Brasil se efectúan 3 ó 4 cortes

por Ha/año, siendo los rendimientos mucho menores (3 TM /Ha/año).44

A nivel nacional, se comercializa en bolsas plásticas transparentes,

básicamente en tiendas naturistas y ferias. Los envases son de 15 grs

con un precio al público de S/. 2.0 c/u y de 50 grs al precio de S/. 10 c/u.

En la actualidad hay solamente 3 empresas que comercializan la hoja de

Stevia seca en esta forma. Se debe indicar que muchos de estos

industriales no producen Stevia sino que compran a un promedio de S/.

20 soles el Kg.44

Hay estudios que informan de la actividad antimicrobiana de

extractos obtenidos de Stevia rebaudiana sobre los hongos y bacterias

Gram-negativas y Gram-positivas de los géneros Streptococcus y

Lactobacillus.45

Amaya Varas R46, en Perú. En 2015; demostró el efecto

antibacteriano del extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356. Según su estudio in vitro, las

concentraciones mínimas inhibitorias del extracto etanólico de Stevia

rebaudiana fueron de 1,07mg/ml en el extracto trabajado en etanol de 70°

y 2,14 mg/mL en extracto trabajado en etanol de 30°; y las



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concentraciones mínimas bacterianas fueron de 5 mg/mL en el extracto

trabajado en etanol de 70° y 10,7 mg/mL en etanol de 30°.

Deniņa L.et al47. En Letonia. En 2013. Demostraron inhibición en el

crecimiento de seis cepas de Lactobacillus reuteri en presencia de los

edulcorantes de los glucídos de la Stevia: Esteviósido y Rebaudiósido A.

Pérez Guevara S48, en Perú. En 2013; demostró el efecto

antibacteriano del extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre

Streptococcus mutans ATCC 25175. Según su estudio in vitro, las

concentraciones mínimas inhibitorias del extracto etanólico de Stevia

rebaudiana fueron de 1,07mg/ml en el extracto trabajado en etanol de 70°

y 4,28mg/mL en extracto trabajado en etanol de 30°; y las

concentraciones mínimas bacterianas fueron de 10mg/mL en el extracto

trabajado en etanol de 70° y 42,8mg/mL en etanol de 30°.

Mohammadi-Sichani M, Karbasizadeh V, Aghai F, Mohammad M, 33

en 2012, reportó que extractos de Stevia rebaudiana, tienen actividad

antibacteriana moderada contra SM, comparada con la concentración de

1% del antibiótico empleado (tetraciclina). El estudio mostró que los

extractos de Stevia rebaudiana en acetona y etanol presentan un efecto

inhibidor mejor en S. mutans que los de cloroformo y metanol. Por otra

parte, el extracto acuoso de hojas de Stevia rebaudiana, era

prácticamente ineficaz contra SM.

Vitery et al.49 en el 2010, compararon el efecto in vitro de diferentes

concentraciones de extractos de Stevia, en agua, metanol, etanol, hexano



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y acetato de etilo, en cepas de Streptococcus mutans y Lactobacillus

acidophilus utilizando vancomicina como control positivo. El extracto de

Stevia que mostró los mejores resultados en la inhibición del crecimiento,

fue en hexanoico, en el que después de 48 horas, se formaron halos de

inhibición con una media de 14,5 mm de Streptococcus mutans y 15,5

mm de Lactobacillus acidophilus en una concentración de 50 mg / ml.

Sathishkumar et al.50 en 2008, evaluaron la actividad antibacteriana

de la Stevia rebaudiana, extraída por medio de diversos disolventes frente

a Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella

typhi y Vibrio cholerae; encontrando que el extracto de acetona mostró

una mayor actividad contra las bacterias Gram positivas que las bacterias

Gram negativas.

Sato en Japón en 2000, reportado por Jarma A et. al42. Demostró la

acción antimicrobiana selectiva del extracto de Stevia; mencionado

extracto eliminó a E. coli, Salmonella, Estafilococcus, bacilos, y no afectó

bacterias útiles, lo que indicó una acción selectiva.

En un estudio in vivo, se midió la acumulación de la placa dental

después de enjuagar con una solución de sacarosa al 10% cuatro veces

al día durante 5 días y se comparó con un enjuague de solución al 10%

de la Stevia rabaudiana Bertoni cuatro veces al día, durante 5 días; El

análisis de los índices de Silness-loe y O'Leary después de 5 días del uso

de la solucion de Stevia demostró una menor capacidad para la formación

de la placa dental. El nivel de placa fue de 57, 82% menos en el índice de



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Silness-LOE y 10, 40% menos en el índice de O'Leary26. La transmisión y

colonización de Streptococcus mutans en la cavidad oral son factores

importantes para prevenir la caries dental teniendo en cuenta que

Streptococcus mutans tiene un papel potencial en la formación de caries

inicial13.

Existen diferentes estudios que evidencian que las principales

bacterias cariogénicas son Lactobacillus acidophillus y Streptococcus

mutans. Dentro de las medidas preventivas para esta patología se ha

propuesto el remplazo de los azúcares energéticos dentro de la dieta por

carbohidratos no energéticos, tal como la Stevia Rebaudiana Bertoni.51

En el ámbito odontológico, el importante crecimiento mundial de la

fitoterapia dentro de programas preventivos y curativos ha estimulado la

investigación con el fin de avalar la actividad antimicrobiana de distintos

extractos de plantas con el fin de ayudar en el control de la placa

bacteriana y por consiguiente en la disminución de la incidencia de caries

dental y enfermedad periodontal.52

El enfoque preventivo se debe encaminar a controlar los factores de

riesgo e instaurar tratamientos curativos antes de la aparición de lesiones

irreversibles que requieran la eliminación de la estructura cariada y

obturación de la lesión. La OMS y la Organización Panamericana de la

Salud comparten la ideología de atender a la caries dental como aspecto

fundamental de las condiciones generales de salud. Se pretende como

meta global establecida para el año 2020 que el 50% de los niños de 5 y 6



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años de edad estén libres de caries, que el promedio de CPOD no sea

mayor de 3 en niños de 12 años de edad y por ende que el 85% de la

población tenga todos sus dientes a los 18 años de edad52. Por tanto, la

atención odontológica debería visualizar el tratamiento contra la caries

dental desde un enfoque preventivo más que curativo teniendo en cuenta

la relación entre el gasto sanitario público de un país con la salud

bucodental.2

Teniendo en cuenta los estudios encontrados donde se observa una

relación directa entre el metabolismo de la sacarosa y su influencia en

crear un ambiente propicio para el desarrollo de la caries dental, y en

especial para el establecimiento de niveles nocivos de Streptococcus

mutans en cavidad oral; habiéndose demostrado su capacidad de

inhibición sobre los patógenos principales de la caries dental

Streptococcus mutans y Lactobacillus acidophillus buscamos evaluar su

efectividad como componente principal de un enjuague bucal, objetivo de

esta investigación, mismo que pueda ser utilizado como agente preventivo

de la caries dental teniendo en cuenta además que esta especie vegetal

es considerada como cultivo rentable y cuya industrialización es

prometedora en el marcado nacional e internacional. Actualmente estos

estudios han ido incrementándose siendo ya algunos de ellos

concluyentes; y habiéndose comprobado su efectividad en el crecimiento

del Streptococcus mutans.46, 48



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Por lo antes expuesto, dentro de esta misma línea de investigación,

el presente estudio propone establecer la efectividad e impacto en el

control de la caries dental de un colutorio a base de extracto etanólico de

Stevia rebaudiana in vitro sobre el crecimiento de sobre una cepa

estándar Streptococcos mutans.

1.1 PROBLEMA

¿Cuál es efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal

a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de

Stevia rebaudiana sobre el crecimiento de Streptococcus mutans

ATCC 25175?

1.2 HIPÓTESIS

El enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de

extracto etanólico de Stevia rebaudiana presenta algún efecto

antibacteriano in vitro sobre Streptococcus mutans ATCC 25175.

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 Objetivo General:

Determinar el efecto antibacteriano in vitro de

un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base

de extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre el

crecimiento de Streptococcus mutans ATCC 25175.



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1.3.2 Objetivos Específicos:

1.3.2.1 Determinar la concentración mínima

inhibitoria (CMI) in vitro de un enjuague

bucal a diferentes concentraciones a base

de extracto etanólico de Stevia rebaudiana

sobre el crecimiento de Streptococcus

mutans ATCC 25175.

1.3.2.2 Determinar la concentración mínima

bactericida (CMB) in vitro de un enjuague

bucal a diferentes concentraciones a base

de extracto etanólico de Stevia rebaudiana

sobre el crecimiento de Streptococcus

mutans ATCC 25175.



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II. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 TIPO DE ESTUDIO

La presente investigación es básica de acuerdo a su

orientación, experimental de acuerdo a su diseño de contrastación.

2.2 DEFINICIÓN DE LA POBLACIÓN MUESTRAL:

La población bajo estudio estuvo conformada por el conjunto

de placas petri que contenían cada una de las diferentes

concentraciones del enjuague bucal a diferentes concentraciones a

base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre el

crecimiento de Streptococcus mutans ATCC 25175 (3x108 UFC),

en el laboratorio de Microbiología, de la Facultad de Medicina de la

Universidad Nacional de Trujillo.

2.2.1 Criterios de Inclusión

Placas con presencia adecuada de Streptococcus

mutans (3x108 UFC/mL) a priori al enfrentamiento

con el enjuague bucal a diferentes concentraciones

a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana.

Placas utilizadas para la determinación de la

Concentración Mínima Bactericida (CMB) que

presentaron efecto antibacteriano (ausencia o



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presencia de halos de inhibición de un diámetro

mayor de 8mm).

Placas utilizadas para la determinación de la

Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), que no

presentaron crecimiento bacteriano ni

contaminación por otros microbios.

2.2.2 Criterios de Exclusión

Placas que después del proceso de incubación,

mostraron contaminación por otros microbios

(hongos).

2.3 CONSIDERACIONES ÉTICAS:

Esta investigación contó con la autorización del Comité

Permanente de Investigación de la Facultad de Medicina de la

Universidad Nacional de Trujillo y siguió los principios de la

Declaración de Helsinki de la asociación médica mundial,

adoptada por la 18a Médica Mundial (Helsinki 1964) y revisada

por la 64a Asamblea General de Fortaleza - Brasil 2013.

2.4 DISEÑO ESTADÍSTICO DE MUESTREO:

2.4.1 Unidad de análisis

La unidad de análisis para determinar la CMI lo

constituye cada una de las placas Petri que se

utilizaron. Las que contenían caldo de cultivo de



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Tioglicolato, enjuague dental a base de extracto

etanólico de Stevia rebaudiana a determinadas

concentraciones, y el inóculo de Streptococcus mutans

ATCC 25175.

La unidad de análisis para determinar la CMB lo

constituye cada una de las placas Petri inoculadas con

las suspensiones obtenidas a partir de la CMI.

2.4.2 Unidad de muestreo:

Las unidades de muestreo estuvieron

conformadas por las unidades de análisis. Éstas

cumplieron con los criterios de selección.

2.4.3 Marco de muestral

El marco muestral es el listado o registro de las

unidades de muestreo, es decir de las placas petri.

2.4.4 Tamaño de muestra

Para determinar el tamaño de muestra se hizo

uso de la fórmula que nos brinda el muestreo cuando el

interés es comparar la media de dos o más grupos de

estudio, para variable cuantitativa:

n = 2(Zα/2 + Zβ)2 (DE) 2/d2 donde:



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n : Tamaño (Número de elementos) de cada

grupo de estudio.

α : Probabilidad de cometer error tipo I.

β : Probabilidad de cometer error tipo II.

Z : Valor estándar (Coeficiente de confianza) de

la distribución normal asociada a un tipo de error.

DE : Desviación estándar de la variable

cuantitativa.

d : Diferencia mínima que se desea detectar

entre los promedios de ambos grupos, para rechazar

la igualdad de medias.

Asumiendo las exigencias del 95% de confianza

(α = 0.05 Zα/2= 1.96), una potencia de la prueba del

80% (β =0.20 Zβ= 0.842), una desviación estándar de

DE=37 para CMI según referencia, y una diferencia

mínima de d=55 para rechazar la igualdad de medias,

se obtiene:

n= 2*(1.96 +0.842)2*(37)2 = 7

552

Con estos valores se empleó una muestra de 7

repeticiones para cada grupo de estudio.

El total de tubos de ensayo y/o las placas Petri

que se utilizó como muestra, se determinó por el



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número de concentraciones que se utilizaron en el

experimento. Estas concentraciones fueron en total de

12 para la determinación de la Concentración Mínima

Inhibitoria y en número de 12 para la determinación de

la Concentración Mínima Bactericida, incluyendo los

controles. Por lo tanto la muestra total fue de:

n = n° de concentraciones x 7 repeticiones.

Para CMI:

n = 12 x 7 = 84 placas Petri.

Control A = 02 placas Petri.

Control B = 02 placas Petri.

Para CMB:

n = 12 x 7 = 84 discos de Kirby y Bauer. (21 placas).

Control = 01 placa Petri.

2.4.5 Diseño de contrastación:

El presente estudio es un diseño experimental,

con varios grupos de estudio y medición posterior. El

esquema puede representarse de la siguiente

manera:



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Grado de alcohol Grupo Variable dependiente Variable independiente

Concentración X

I UFC

Diámetro de halo. X1

IV

UFC


II UFC


III UFC


V UFC


VI UFC


30°

I UFC


IV UFC


II UFC


III UFC


V UFC


VI UFC


70°



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Donde:

X: Concentración del enjuague bucal a base de

extracto etanólico de Stevia rebaudiana.

X1: 1.07% usando etanol de 70° y 2.14% usando

etanol de 30°.

X2: 5 % usando etanol de 70° y 4.23 % usando

etanol de 30°.


etanol de 30°.


etanol de 30°.


etanol de 30°.


etanol de 30°.



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2.5 PROCEDIMIENTO E INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE

DATOS:

2.5.1 Recolección e identificación taxonómica

02 Kg de hojas se Stevia rebaudiana fueron

recolectadas el día 12 de Julio del 2015, de la localidad

de Timaruca, distrito de San Ignacio (1050 m.s.n.m)

provincia de San Ignacio, región de Cajamarca.

Un ejemplar completo de planta fue llevado al

Herbarium Truxillensis de la Universidad Nacional de

Trujillo, para su identificación y verificación taxonómica.

2.5.2 Preparación de la muestra54:

Selección y lavado de la muestra: El material

recolectado fue transportado al laboratorio de

Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y

Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo,

en donde se seleccionó las hojas en buenas

condiciones. Luego se procedió a lavar el material

vegetal con agua destilada, seguido de una

desinfección, utilizando hipoclorito de sodio al 0.5

%. Posteriormente se realizó un enjuague de la

planta con suficiente agua destilada estéril, esto es

para retirar los residuos de hipoclorito.



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Secado: Las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni

fueron colocadas sobre papel Kraft y sometidas a

secado primero a temperatura ambiente por 24

horas, y luego en la estufa a una temperatura de

40°C, por cinco días . Se realizó la determinación

de peso cada 24 horas hasta valores constantes.

Pulverización: Una vez secadas las hojas, estas

se pulverizaron con ayuda de un mortero.

Tamizaje: El material obtenido de la pulverización,

se pasó a través de los tamices Nº 2, 1.2, 0.7, 0.3.

La muestra de trabajo correspondió al tamiz 0.7.

Almacenamiento: El polvo de las hojas de Stevia

rebaudiana bertoni obtenidas, se guardaron en

frascos de vidrio de color ámbar de boca ancha.

2.5.3 Preparación del extracto etanólico54:

Se pesó 20g de la muestra previamente pulverizada

y tamizada. Luego se humectaron por separado

con 20 mL de etanol de 70º G.L., se colocaron en

una cápsula de porcelana y se mezclaron con

cantidad suficiente de arena lavada.

Luego se vertió en un cartucho de papel de filtro y

se colocó en el extractor del equipo de soxhlet y se



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extrajo con 150 mL de etanol de 70° Gay Lussac a

una temperatura de 60oC a 80oC durante 4 horas.

El producto se filtró 3 veces, primero con papel

filtro Whatman N° 41, un segundo filtrado se realizó

con papel filtro Whatman N°4 y por último un tercer

filtrado fue en papel Whatman N°2. Así se obtuvo

un extracto purificado libre de gérmenes.

La solución resultante fue llevada a sequedad en

una cámara de secado al vacío a una presión

reducida y a una temperatura de 40 °C; luego se

pesó el residuo seco y se guardó en refrigeración a

2°C en frasco de vidrio de color ámbar estéril. Del

residuo seco, se prepararán las concentraciones

de 1,07%, 5%, 10%, 25%, 50% y 75% disueltas en

etanol de 70ºGay Lussac respectivamente; y las

concentraciones de 2,14%, 4,23%, 10,7%, 21,4%,

32,1% y 42,8% en etanol de 30º Gay Lussac.

2.5.4 Preparación del enjuague bucal55:

El material recolectado fue trasportado al laboratorio

de Farmacología de la Facultad de Farmacia y

Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo Se

tomó el extracto etanólico de Stevia rebaudiana

como edulcorante del mismo, acompañado de



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saborizantes, conservantes y preservantes. Por

medio de procedimientos como:

2.5.4.1 Formulación del enjuague bucal a base de

extractos etanólicos de Stevia rebaudiana

Bertoni.

Para la formulación del enjuague bucal se

procedió de acuerdo a lo establecido por De

los Ángeles y Veloz (2011) con

modificaciones. Dentro de la formulación se

consideraron las materias primas más

importantes: un tensioactivo o detergente

(lauril éter sulfato de sodio), sustancias

humectantes (sorbitol y glicerina), y el

principio activo (extracto etanólico de Stevia

rebaudiana bertoni). Las concentraciones

utilizadas de cada materia prima estuvieron

dentro de los rangos sugeridos por la

bibliografía (Muñoz, 2000). En las Tablas del

1 al 12 se presentaron las fórmulas del

enjuague bucal para una presentación de 80

mL y en la tabla 13 el enjuague bucal sin el

extracto (control negativo). (Anexo 01)



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5.6.4.2 Elaboración del enjuague bucal a base de

extracto etanólico de Stevia rebaudiana

Bertoni.

En primer lugar se procedió a pesar y medir

todos los ingredientes de la fórmula de cada

enjuague bucal. Seguidamente se mezcló el

lauril éter sulfato de sodio junto con la

glicerina, el sorbitol en un agitador

magnético a 800 rpm durante 10 minutos y,

poco a poco, se añadió las ¾ partes del

disolvente (agua), luego el alcohol y el

extracto etanólico de Stevia. Así se fue

completando la formulación con el resto del

disolvente hasta alcanzar el volumen total

especificado en la fórmula.

Posteriormente, se procedió al envasado y

etiquetado del enjuague bucal en un frasco

de vidrio, dejándolo reposar por 24 horas

para que desaparezca la espuma formada

durante el proceso de manufactura.

Finalmente, se determinó el efecto

antibacteriano del enjuague bucal preparado

a las diferentes concentraciones.



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2.5.5 Método microbiológico56.

A. Obtención de la cepa:

Este estudio utilizó un cultivo liofilizado de la cepa

de Streptococcus mutans ATCC 25175, el cual se

obtuvo del laboratorio GenLab, de Lima.

La cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175

se reactivó cultivándola en Agar Soya Tripticasa –

Sangre, en microanaerobiosis utilizando el

método de la vela por 04 días a 37 °C.

La cepa preparada se diluyó en medio Tioglicolato

hasta alcanzar la turbidez del tubo 0.5 de la

escala de Mc Farland correspondiente a 108

bacterias/mL.

B. Preparación del inóculo:

Las cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175

se cultivaron en tubos de ensayo cerrados

herméticamente conteniendo el medio Agar Soya

Tripticasa - Sangre.

Se incubaron bajo condiciones de

microanaerobiosis a 37oC con el fin de obtener

colonias jóvenes. Luego de 24 horas cada cepa



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http://perso.wanadoo.es/microdominguez/c.htm

41

de Streptococcus mutans ATCC 25175 se diluyó

en caldo de Tioglicolato hasta que se obtuvo una

turbidez semejante al tubo número 05 de la escala

de Mac Farland. Los tubos con la bacteria fueron

girados entre las manos durante 30 segundos

antes de proceder al sembrado para distribuir los

microorganismos adecuadamente.

C. Determinación de la concentración mínima

inhibitoria (CMI):

Para determinar la concentración inhibitoria

mínima del extracto etanólico de la Stevia

rebaudiana se realizó lo siguiente: Se colocó 0.8

ml del del enjuague bucal a base de extracto

etanólico de la Stevia rebaudiana al 1,07%, 5%,

10%, 25%, 50% y 75% disueltas en etanol de

70ºGay Lussac respectivamente; y las

concentraciones de 2,14%, 4,23%, 10,7%, 21,4%,

32,1% y 42,8% en etanol de 30º Gay Lussac, cada

concentración en un tubo de ensayo, previamente

etiquetado. Después del proceso de dilución se

colocó un inoculo de 0.2 ml del cultivo preparado

de Streptococcus mutans ATCC 25175, en los

tubos que contenían las diversas concentraciones



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del enjuague bucal; así como al control A (tubo

que no contuvo extracto etanólico a base de

Stevia rebaudiana), y al control B (tubo que

contuvo la bacteria sin tratar) obteniéndose un

volumen final de 10mL para cada tubo y se llevó a

incubación a 37º C por un periodo de 24 horas en

condiciones de microanaerobiosis.

Luego de 24 horas se realizó la

determinación de la CIM con Agar Müller Hinton –

Sangre, tomando 0,1 ml de las suspensiones de

los tubos y se dispersó en toda la placa para

determinar las unidades formadoras de colonias

(UFC).Después del sembrado, se llevó a

incubación a 37oC por 24 horas en jarra Gaspak

en condiciones de microanaerobiosis 5 a 10% de

CO2.

Todo el procedimiento fue realizado bajo

condiciones asépticas y se efectuaron 07

repeticiones por concentración. Luego de 24

horas se realizó el conteo de las colonias en cada

una de las placas. La concentración inhibitoria fue

aquella en la que se llegó a inhibir completamente

el desarrollo de los gérmenes.



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D. Determinación de susceptibilidad de

Streptococcus mutans ATCC 25175 frente al

enjuague bucal a diferentes concentraciones

(CMB):

Determinación de la sensibilidad o resistencia

antibacteriana (Efecto antibacteriano).

Un hisopo estéril fue embebido con la cepa

preparada a una distancia de 10 cm de la llama

del mechero se procedió al sembrado en camada

en placas Petri conteniendo Agar Müeller Hinton -

Sangre, se estrió el hisopo uniformemente sobre

toda la superficie del agar, girando cada placa 30

grados, 10 veces aproximadamente. Las placas

recién sembradas fueron incubadas en

condiciones de microanaerobiosis a 37º C en

atmósfera con 5% de CO2 durante 24 horas. Para

el efecto antibacteriano se empleó la técnica de

difusión de discos de Kirby y Bauer, la cual

consiste en preparar discos de papel de filtro

estériles, los que fueron sumergidos dentro de

cada concentración del enjuague bucal a base de

extracto etanólico de Stevia rebaudiana, por el

periodo no menor de una hora. Además se



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colocaron los discos embebidos con cada

concentración del enjuague bucal empleando una

placa de control; se utilizó como control

Clorhexidina al 0.12% (Perio·Aid®), el cual fue

embebido de la misma forma que los discos

experimentales.

Luego con una aguja estéril, estos se colocaron

sobre los cultivos de Streptococcus mutans ATCC

25175 en las placas petri previamente

preparadas; las placas se mantuvieron en la

misma posición por un periodo de 5 minutos.

Luego de este tiempo las placas se voltearon de

posición y se incubaron en microanaerobiosis

utilizando la jarra de GasPack, con el método de

vela, mediante el cual se obtuvo un ambiente

aproximadamente de 5 a 10% de CO2, a 37º C

durante 24 horas.

Todo el procedimiento se llevó a cabo dentro

del diámetro de 10 cm de la llama de un mechero.

La lectura de los resultados se llevó a cabo

después de las 24 horas, mediante la inspección

visual de cada placa. Se efectuó tomando el

registro en milímetros de los halos de inhibición



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del crecimiento de Streptococcus mutans ATCC

25175.

Después de ese tiempo se observó si hubo o

no efecto, es decir, si hubo sensibilidad o

resistencia del Streptococcus mutans ATCC

25175 al enjuague bucal a las diferentes

concentraciones.

La sensibilidad se medió empleando una

regla calibrada (Vernier) y se utilizó la Escala de

Duraffourd para determinar cualitativamente el

efecto inhibitorio in vitro, según el diámetro del

halo de inhibición, zona alrededor del disco donde

una sustancia antibacteriana es capaz de impedir

el crecimiento de la bacteria al cabo de 18 a 24

horas de incubación.

La Escala de Duraffourd comprende 04

valores; siendo nula (-) para un diámetro inferior a

8 mm, de sensibilidad límite (sensible = +) para un

diámetro comprendido entre 8 a 14 mm, medio

(muy sensible = ++) para un diámetro entre 14 y

20 mm, y sumamente sensible (+++) para un

diámetro superior a 20 mm.57



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E. Controles:

Para la concentración inhibitoria mínima

(CIM): Se utilizó como control A el enjuague bucal

sin extracto etanólico a base de Stevia

rebaudiana, y como control B Streptococcus

mutans ATCC 25175 sin tratamiento suspensión

estándar (3x108 UFC/ mL).

Para determinar la susceptibilidad (CMB): Se

utilizó como control Clorhexidina al 0.12 %

(Perio·Aid®) de la Empresa DENTAID.

F. Instrumento

El instrumento de recolección de los datos

fue estructurado para el registro de la CMI y CMB

(Anexo 01, 02, 03 y 04).



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2.6 Variables de estudio:

2

2.6.1 Definición de las variables:

2.6.1.1 Streptococcus mutans ATCC 25175:

Conceptual: El Streptococcus mutans es un coco

Gram positivo, dispuesto en cadena, no móvil,

catalasa negativo12 está involucrado con el inicio de

la lesión de caries11. Cepa estándar de Streptococcus

Variable

Indicador

Tipo

Escala de

medición

Dependiente

Streptococcus

mutans ATCC 25175

UFC/ mL

mm

Cuantitativa

De razón

Independiente

Efecto

antibacteriano

del enjuague

bucal a

diferentes

concentracion

es a base de

extracto

etanólico de

Stevia

rebaudiana.

CMI

mg/ mL

Cuantitativa

De razón

CMB



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mutans con nomenclatura 25175 asignada por la

American Type Culture Collection.58

Operacional: Para efectos de la investigación fue

valorada mediante el conteo UFC/mL a la Cepa

estándar de Streptococcos mutans ATCC 25175.

2.6.2 Efecto antibacteriano del enjuague bucal a base de

extracto etanólico de Stevia rebaudiana

Conceptual:

Acción de una sustancia obtenida a partir de un

edulcorante natural como Stevia rebaudiana sobre la

inhibición y susceptibilidad de Streptococcos mutans

ATCC 25175.8

Operacional:

En la presente investigación el enjuague bucal a base

de extracto etanólico de Stevia rebaudiana fue a

diferentes concentraciones y su efecto antibacteriano

se evaluó mediante la determinación de la

concentración mínima inhibitoria (CMI), siendo

efectiva siempre que se inhiba completamente el

desarrollo bacteriano; y la Concentración Mínima

Bactericida (CMB), teniendo en cuenta la Escala de



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Duraffourd57. Donde la CMI fue la medición principal

que determine la acción antibacteriana.

EFECTO ANTIBACTERIANO

CON EFECTO

SIN EFECTO

CMI < 200 UFC > 200 UFC

CMB ≥ 8 mm < 8 mm

- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)

Conceptual: Fue interpretada como la mínima

concentración del enjuague bucal a base de

extracto que inhibe el crecimiento del

microorganismo después de su incubación.

Operacional: La definición coincidió con la

conceptual al ser valorada mediante el número

obtenido en mg/ mL del enjuague bucal a

diferentes concentraciones a base de extracto

etanólico de Stevia rebaudiana donde se

pretendió apreciar crecimiento del

Streptocococcus mutans menor a 200 UFC.33



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http://es.wikipedia.org/wiki/Crecimiento_celular

http://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismo

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- Concentración Mínima Bactericida (CMB)

Conceptual: Fue interpretada como la mínima

concentración del enjuague bucal a diferentes

concentraciones a base del extracto donde se

pretendió apreciar el diámetro del halo de

inhibición mayor a 8 mm.33

Operacional: Para efectos de la investigación la

definición coincidió con la conceptual al ser

valorada mediante el valor numérico obtenido

midiendo el halo de inhibición y escoger la

concentración del enjuague bucal a diferentes

concentraciones a base de extracto etanólico de

Stevia rebaudiana en mg/ mL.

2.7 Análisis estadístico e interpretación de datos:

Para analizar la información se aplicó el ANVA de un Diseño

Completamente Aleatorizado, con 3 repeticiones por cada

concentración. Para determinar cuál es la Concentración Mínima

Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB),

se hizo uso de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey

usando el software SPSS 18.0, con un nivel de significancia del

5% (p < 0.05).



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III. RESULTADOS

El presente estudio de tipo experimental in vitro, tuvo como

objetivo determinar el efecto antibacteriano in vitro de un enjuague

bucal a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de

Stevia rebaudiana sobre una muestra de 86 placas con el inóculo

Streptococcus mutans ATCC 25175, al análisis de los datos se

encontraron los siguientes resultados:

La acción inhibitoria del enjuague bucal a base de extracto

etanólico de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC

25175, se presentó a partir de la concentración de 1,07mg/mL en

el enjuague trabajado en etanol de 70° y a partir de la

concentración de 2,14 mg/mL, en el enjuague trabajado en etanol

de 30°. TABLA 01.

La acción bactericida del enjuague bucal a base de extracto

de etanólico de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans

ATCC 25175, se presentó a partir de la concentración de 75

mg/mL en el enjuague a base de extracto trabajado en etanol de

70° mientras que fue estadísticamente nula en etanol de 30°.

TABLA 02.



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TABLA 01

Determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI) de un enjuague bucal a diferentes concentraciones sobre

Streptococcus mutans ATCC 25175, usando extracto etanólico de Stevia rebaudiana en OH 30° Y 70°.

OH 30° OH 70°

2.14% 4.28% 10.70% 21.40% 32.10% 42.80% 1.07% 5.00% 10.00% 25.00% 50.00% 75.00%

Control

A

Control

B

Media 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 4760.5 109

Desv. estándar 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 753.1 0.0

Media ± DE

(OH)

0.0

±

0.0

0.0

±

0.0

Prueba entre

OH

Prueba entre concentración

Control A : Contiene solo excipientes Control B : Solo bacteria

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2

TABLA 02

Determinación de susceptibilidad de Streptococcus mutans ATCC 25175 frente al enjuague bucal a diferentes

concentraciones (CMB), usando extracto etanólico de Stevia rebaudiana en OH 30° Y 70°.

Indicador OH 30° OH 70°

2.14% 4.28% 10.70% 21.40% 32.10% 42.80% 1.07% 5.00% 10.00% 25.00% 50.00% 75.00%

Clorhexidina

0.12%

Media 6.0 6.0 6.0 7.9 7.9 6.9 6.0 6.0 6.0 8.4 10.8 11.8 26.4

Desv. estándar 0.0 0.0 0.0 1.4 0.7 0.6 0.0 0.0 0.0 0.7 0.9 1.9 5.1

Media ± DE (OH) 6.7 ± 0.9 8.2 ± 2.6

Prueba entre OH

Prueba entre concentración

Prueba Duncan* a a a b b c a a a b c d

*: Dos concentraciones con la misma letra no difieren estadísticamente en cada OH

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IV. DISCUSIÓN

La microflora oral es un complejo ecosistema que contiene

una amplia variedad de especies microbianas, el concepto actual

contempla en la patogénesis de la caries dental a microorganismos

que incluyen Lactobacillus acidophilus, Actinomyces spp y

Streptococcus mutans como el agente más importante asociado a

ella12. El reconocimiento de la importancia de estos

microorganismos en el inicio y progresión de la caries, conduce a

tomar medidas dirigidas a la disminución de estas bacterias en la

cavidad oral.

La humanidad tiene una marcada preferencia hacia los

alimentos dulces y con base en ello es que actualmente se

promociona el uso edulcorantes naturales quienes producen las

mismas sensaciones que el azúcar. Entre los edulcorantes no

nutritivos destacan: la Sacarina, Aspartame, Sucralosa, Ciclamato,

Acesulfame K, Neotamo, Alitamo, Xylitol, Sorbitol y recientemente

se ha incorporado a la Stevia rebaudiana bertoni, cuyo sabor es lo

más parecido al azúcar, distinguiéndose de los edulcorantes

artificiales por no tener sabor metálico y no ser cancerígeno30, 45.

En tal sentido el presente estudio fue realizado con la

finalidad de determinar la efectividad in Vitro de un enjuague bucal

a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana a diferentes



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concentraciones, sobre el crecimiento de una cepa estándar de

Streptococcus mutans ATCC 25175 para el control de la caries

dental.

Los resultados muestran que el enjuague bucal en estudio a

diferentes concentraciones, tanto en alcohol de 70° como en el de

30° son ciento por ciento efectivos para el control del

Streptococcus mutans ATCC 25175 (p 0.05). Resultados similares

fueron encontrados por Pérez S48, 2013, usando extracto etanólico

de Stevia rebaudiana en un estudio in vitro con las mismas

concentraciones.

De este modo es notoria la capacidad antibacteriana del

enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana

bertoni para el control del microorganismo, la cual puede ser

atribuida y/o asociada a los componentes químicos principales

obtenidos de las hojas de Stevia que contienen glucósidos de

esteviol de los cuales destacan con un 95% el esteviósido y el

rebaudiósido A, cuyas propiedades han demostrado ser

beneficioso para la salud sistémica como antioxidante,

quimioprotectora, antiinflamatoria, digestiva, vasodilatadora y

recientemente para la salud oral frente a diversos microorganismos

pues pasa por el cuerpo sin producir ningún tipo de efecto tóxico,

es decir, este producto sería seguro para su uso en embarazadas,

adultos y niños con restricciones de edad28, 33, 36, 49. Inclusive se



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puede pensar en un sinergismo entre estos glucósidos y sus

metabolitos secundarios para producir tal efecto, no obstante aún

no se han reportado trabajos donde se aíslen y estudien de

manera particular.

Por otro lado, los saborizantes, conservantes y preservantes

como lauril éter sulfato de sodio (tensioactivo o detergente),

sorbitol y glicerina (sustancias humectantes), además de alcohol

96° quienes acompañan su composición podrían ejercer un papel

coadyuvante en su efecto antibacteriano.

En términos generales los edulcorantes naturales están

ganando terreno debido a los múltiples beneficios que se les ha

observado; no obstante, con los antecedentes existentes, se

puede postular a este edulcorante como un potencial complemento

terapéutico en la atención odontológica, con su posible uso como

enjuague bucal en el control de la caries sobre Streptococcus

mutans como agente patógeno principal, bajo restricciones en la

edad y sobre todo en pacientes que presenten condiciones de

obesidad, diabetes e hipertensión.59

Este estudio ha evidenciado que el enjuague bucal a

diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de Stevia

rebaudiana es efectivo sobre este microorganismo a partir de la

concentración de 1,07 mg/mL y 2,14 mg/mL trabajado en etanol de

70° y 30° respectivamente (p 0.05).



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57

Al respecto, estos resultados se soportan con los estudios

realizados por Pérez Guevara S48, quién demostró el efecto

antibacteriano in vitro, del extracto etanólico de Stevia rebaudiana

sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, donde las

concentraciones mínimas inhibitorias del extracto fueron de 1,07

mg/ml en el extracto trabajado en etanol de 70° y 4,28 mg/mL en

extracto trabajado en etanol de 30°; y las concentraciones mínimas

bactericidas fueron de 10mg/mL en los enjuagues a base de

extracto trabajados en etanol de 70° y 42,8 mg/mL en etanol de

30°.

Vitery Sapuyes G. et al49. en 2010, demostraron la actividad

antibacteriana de la Stevia rebaudiana contra del Streptococcus

mutans y el Lactobacillus acidophilus, a través de un estudio in

vitro utilizando la técnica de difusión en Agar Mueller Hinton,

evidenciando efecto inhibitorio en su crecimiento.

Por otro lado, la concentración mínima bactericida del

enjuague bucal utilizado en este estudio, que mostró ser efectiva

sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, fue de 75 mg/mL en los

enjuagues a base de extracto trabajados en etanol de 70°, por lo

que se podría inferir que a mayor concentración del extracto

etanólico en el enjuague, mayor es su efecto bactericida; mientras

que fue estadísticamente nula en etanol de 30°.



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Estos resultados difieren con los encontrados por Gamboa

F45. et al. En Colombia en 2012, demostraron la actividad

antimicrobiana in vitro de 5 extractos: hexano, metanol, etanol,

acetato de etilo y cloroformo obtenidos a partir de hojas de Stevia

rebaudiana Bertoni sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 por

método de difusión en pozo, obtuvieron halos de inhibición de

10.0, 9.3, 9.0, 10.0, 12.0 en mm para 30 mg / ml, 120mg / ml, 120

mg / ml, 60 mg / ml y 60 mg / ml de cada extracto respectivamente.

Así mismo, Vitery Sapuyes G. et al49. en 2010. demostraron

la actividad antibacteriana de la Stevia rebaudiana contra del

Streptococcus mutans y el Lactobacillus acidophilus, a través de

un estudio in vitro, formándose halos de inhibición en promedio de

14,5 mm con el S. mutans y de 15,5 mm contra el L. acidophilus a

una concentración de 50 mg/ml soportado por la prueba

estadística.

En el presente estudio se realizó un control positivo

utilizando Clorheridina al 0.12 %, quién demostró su efectividad

como Gold Estándar en el control de la microflora oral y para tal

caso, sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, al no observarse

crecimiento del microorganismo y tener la capacidad de producir

halos de inhibición de 14.25 mm.

La mayor actividad antibacteriana frente a Streptococcus

mutans ATCC 25175 se obtuvieron con los extractos en etanol de



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70°, éstos resultados están de acuerdo con los de Mohammadi-

Sichani, (2012). Entre los cuatro extractos de Stevia rebaudiana,

los extractos de acetona (28,7 ± 2,8) y etanol mostraron

significativamente (p <0,05) mayor actividad en comparación con el

extracto de metanol y el extracto acuoso frente a Streptococcus

mutans en cada concentración. Por ello, probablemente los

metabolitos activos de Stevia rebaudiana son más solubles y

actúan mejor como sustancia antibacteriana cuando están

disueltos en etanol.

Vitery Sapuyes G. et al49. En 2010. Demostraron que los

resultados de los extractos de Stevia Rebaudiana con metanol y

etanol comparados con los de la Vancomicina son

estadísticamente iguales, con un valor de p igual al 20% para el

extracto con metanol y el 79% para el extracto con etanol, lo que

indica que sus efectos son similares, mientras que de extractos de

Stevia con hexanol y acetato de etilo mostraron evidencias

significativas, comparados con los resultados obtenidos con la

Vancomicina, con valores de p inferiores al 5%, lo que indica que

la Vancomicina mostró mejores resultados en la inhibición del

crecimiento que estos dos extractos.

Los promedios obtenidos en el control positivo, donde se

usó Penicilina muestra que este antibiótico es efectivo contra

Streptoccocus mutans, sin embargo no es factible su uso clínico



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debido a los diversos efectos adversos como las reacciones de

hipersensibilidad, las superinfecciones, manchas intrínsecas en los

dientes y en especial por generar resistencia bacteriana; éstos

inconvenientes orientan la investigación hacia nuevos productos

que sean seguros para el huésped y específicos para la flora

patógena de la boca, agentes antimicrobianos que pueden cumplir

un papel importante en la prevención de la caries dental.23

Los resultados del estudio corroboran lo reportado acerca

de los fitoquímicos naturales, sobre que podrían ofrecer una

alternativa a los antibióticos y representan un prometedor enfoque

en la prevención y estrategias terapéuticas para la caries dental y

otras enfermedades de la boca23, 45.

En el Perú, la caries dental es un problema de salud pública,

siendo aún la atención odontológica de elevado costo y no

accesible a toda la población; teniendo en cuenta que la fitoterapia

es una alternativa viable para el tratamiento de diversas patologías

orales; este estudio pone en evidencia que Stevia rebaudiana,

podría ser usada para prevenir la caries dental por su capacidad

para controlar el crecimiento del patógeno de la caries, por sus

propiedades beneficiosas en la salud y su bajo costo para la

elaboración del producto que se haría más accesible .

En tal sentido, este estudio, demuestra que existe un

potencial efecto en el enjuague bucal a diferentes concentraciones



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a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre el

crecimiento de Streptococcus mutans ATCC 25175, no obstante,

las pruebas de susceptibilidad bacteriana son sólo el inicio de una

línea de investigación cuyo objetivo final será la administración de

este producto aplicado clínicamente con fines preventivos contra la

caries dental. Por lo tanto, es de crucial importancia identificar y

aislar los metabolitos activos que estarían cumpliendo con la

función antimicrobiana específica, y de esta manera atacar

directamente a los patógenos de la cavidad oral con mayor

efectividad.

Finalmente, acogemos la hipótesis propuesta, pues de

acuerdo a los resultados podemos afirmar que el enjuague bucal a

base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana a diferentes

concentraciones presenta efecto antibacteriano in vitro sobre

Streptococcus mutans ATCC 25175; por lo que podría ser usado

para el control de los patógenos de la caries en pacientes previo

estudios in vivo.



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V. CONCLUSIONES

El enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia

rebaudiana tiene efecto antibacteriano sobre Streptococcus

mutans ATCC 25175.

La concentración mínima inhibitoria (CMI) evaluada fue de

1,07mg/mL trabajado en etanol de 70° y de 2,14 mg/mL en

etanol de 30°.

La concentración mínima bactericida (CMB) evaluada fue de

75 mg/mL trabajado en etanol de 70° y nulo en los

enjuagues a base de extracto trabajado en etanol de 30°.



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VI. RECOMENDACIONES

Realizar estudios que identifiquen las sustancias activas por el

cual se produce el efecto antibacteriano de un enjuague bucal a


rebaudiana.

Realizar estudios que determinen el mecanismo de acción por el

cual el enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia

rebaudiana ejerce un efecto antibacteriano sobre Streptococcus

mutans ATCC 25175.

Realizar estudios donde se enfrente el enjuague bucal a


rebaudiana con cepas de Streptococcus mutans aisladas de

pacientes.

Realizar estudios in vitro y estudios clínicos in vivo para

determinar la biocompatibilidad del enjuague bucal a base de

extracto etanólico de Stevia rebaudiana.



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natural y su uso en beneficio de la salud. Recibido 21 mayo 2014;

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inhibitoria de Stevia rebaudiana bertoni sobre Lactobacillus

acidophillus y Streptococcus mutans. Rev Nal Odo 2010; 6: 57-64.



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Antimicrobial and Antitumor Activities of Stevia Rebaudiana

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la stevia rebaudiana sobre el Lactobacillus acidophillus y

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http://www.imbiomed.com.mx/1/1/articulos.php?method=showDetail

&id_articulo=76271&id_seccion=3840&id_ejemplar=7583&id_revist

a=231

52. Rodríguez C. ―Eficacia Antimicrobiana de Soluçiões Irrigadotas de

Canais Radiculares‖ Dissertaçăo apresentada ao Programa de

Maestrad en Medicina Tropical de Universidad Federal de Goiás.

2000.

53. Torres H. Estudio epidemiológico sobre caries dental y

necesidades de tratamiento en escolares de 3 a 5 años de edad de

huacho, Perú. Huacho 2010. [Fecha de acceso 25 de Marzo del

2015]. Disponible en:

http://www.inppares.org/revistasss/Revista%20IX%202010/12-

Caries_Dental.pdf



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54. Miranda M. Métodos de Análisis de Drogas y Extractos. Instituto de

Farmacia y Alimentos. Universidad Habana de Cuba 2002. Revista

Habanera de Ciencias Médicas, Vol. 1, 101-105.

55. De los Ángeles, M; Veloz, T. Eficacia in-vitro de un colutorio

elaborado con aceite esencial de la hoja de Ishpingo ocotea quixos

(Lam.) Kostern. ex O.C. Schmidt y clavo de olor Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L.M. Perry. La Granja 13(1): 31-41. 2011.

Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador.

56. Koneman E. W. et al. Diagnóstico microbiológico. Texto y Atlas en

color. 6a Edición. 2008.

57. Duraffourd C, D'Hervicourt, LLapraz J. Cuaderno de Fitoterapia

Clínica. Barcelona: Masson, 1987

58. Pretel S. Efecto antibacteriano del extracto butanólico de Mauria

heterophylla (gian) sobre Streptococcus mutans ATCC 25175.

Estudio in vitro. [Tesis para optar el Grado de Maestro] Universidad

Nacional de Trujillo. Perú. 2011

59. Contreras S. Anticariogenic properties and effects on periodontal

structures of Stevia rebaudiana Bertoni. Narrative review. Journal of

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de Noviembre del 2015]. Disponible en:

file:///C:/Users/user1/Downloads/45-188-2-PB.pdf



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ANEXOS



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TABLA RESUMEN

“Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal a

diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de

Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC 25175”.

Enjuague bucal a

base Extracto

etanólico de Stevia

rebaudiana

CMI (mg/mL)

CMB (mg/mL)

OH 70°

1,07

75

OH 30°

2,14

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REPRESENTACIÓN FOTOGRÁFICA DEL PROCEDIMIENTO



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ANEXO 01

Tabla 1. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 1,07%.

Sustancia Porcentaje

Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p

3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 1,07 % 80 ml

Tabla 2. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 5 %.



3,75% 18,38% 5,63% 6,25%

5 % 80 ml

Tabla 3. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de

Stevia rebaudiana Bertoni al 10%.



3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 10 % 80 ml



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Tabla 4. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 25%.



3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 25 % 80 ml




3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 50 % 80 ml




3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 75 % 80 ml



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3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 2,14 % 80 ml




3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 4,23 % 80 ml

Tabla 9. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de

Stevia rebaudiana Bertoni al 10,7%.



3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 10,7 % 80 ml



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Tabla 10. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 21,4%



3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 21,4 % 80 ml




3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 32,1% 80 ml

Tabla 12. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 42,8%



3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 42,8 % 80 ml



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Tabla 13. Fórmula del enjuague bucal sin extracto etanólico de Stevia

rebaudiana Bertoni (control negativo)


Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Agua destilada c.s.p

3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 80 ml



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ANEXO 02

“Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico

de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC 25175”

1.- Determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI), usando extracto etanólico OH 70°.

Concentración de

enjuague bucal

(mg/ml)

Repeticion

UFC

Control A

Control B

1.07%

5%

10%

25%

50%

75%

R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7



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ANEXO 03



1.- Determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI), usando extracto etanólico OH 30°.

Concentración de

enjuague bucal

(mg/ml)

Repeticion

UFC

Control A

Control B

2.14%

4.28%

10.7%

21.4%

32.1%

42.8%

R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7



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ANEXO 04

“Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC 25175”

1.- Determinación de susceptibilidad de Streptococcus mutans ATCC 25175 frente al enjuague bucal a diferentes concentraciones (CMB), usando extracto etanólico OH 70°.

Concentración de

enjuague bucal

(mg/ml)

Repeticion

Diámetro de halo de Inhibición (mm)

Clorhexidina al

0.12 %

(Perio·Aid®

DENTAID)

1.07%

5%

10%

25%

50%

75%

R1

R2

R3

R4

R5

R6

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ANEXO 05



1.- Determinación de susceptibilidad de Streptococcus mutans ATCC 25175frente al enjuague bucal a diferentes

concentraciones (CMB), usando extracto etanólico OH 30°.

Concentración de

enjuague bucal

(mg/ml)

Repeticion

Diámetro de halo de Inhibición (mm)

Clorhexidina al

0.12 %

(Perio·Aid®

DENTAID)

2.14%

4.28%

10.7%

21.4%

32.1%

42.8%

R1

R2

R3

R4

R5

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ANEXO Nº 06

EVALUACIÓN DE LA TESIS

El Jurado deberá: Consignar las observaciones y objeciones pertinentes relacionados a los siguientes ítems. Anotar el calificativo final. Firmar los tres miembros del Jurado.

TESIS:……………………………………………………………………………..

………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………

1. DE LAS GENERALIDADES:

El Título ……………………………………………………………………….

….………………………………………………………………………………

Tipo de Investigación:………………………………………………………..

………………………………………………………………………………….

2. DELPLAN DE INVESTIGACIÓN:

Antecedentes:……………………………………………………………

Justificación:..................................................................................

Problema:……………………………………………………………….

Objetivos:………………………………………………………………..

Hipótesis:………………………………………………………………..

Diseño de Contrastación:………………………………………………



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Tamaño Muestral…………………………………………………………

Análisis Estadístico: ……………………………………………………

3. RESULTADOS:………………………………………………………………

………………………

4. DISCUSIÓN:…………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………

……………………………………………….

5. CONCLUSIONES:……………………………………………………………

6. REFERENCIAS

BIBLIOGRÁFICAS:………………………………………..

7. RESUMEN:……………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………..

8. RELEVANCIA DE LA INVESTIGACIÓN:………………………………….

9. ORIGINALIDAD:……………………………………………………………

10. SUSTENTACIÓN

10.1 Formalidad:………………………………………………………

10.2 Exposici6n:…………………………………………………………

10.3Conocimiento del Tema: …………………………………..



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CALIFICACIÓN:

(Promedio de las 03 notas del Jurado)

JURADO: Nombre Código

Docente

Firma

Presidente: Dr.……………………............. ……………………

……………………

Grado Académico: ……………………………………………………

Secretario: Dr.…………………………….. ….……………….

…………………..

Grado Académico: ……………………………………………………

Miembro: Dr.………………………………… ….……………….

…………………………

Grado Académico: …………………………………………………



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ANEXO Nº 07

RESPUESTAS DE TESISTAS A OBSERVACIONES DEL JURADO

El Tesista deberá responder en forma concreta de las observaciones del jurado a manuscrito en el espacio correspondiente: Fundamentando su discrepancia. Si está de acuerdo con la observación también registrarla. Firmar.

TESIS:

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………

1.- DE LAS GENERALIDADES:

El Titulo

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

Tipo de Investigación

…………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………

2.- DEL PLAN DE INVESTIGACIÓN:

Antecedentes:

…………………………………………………………………………………………

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Justificación:

………………………………………………………………………………………….

Problema:

…………………………………………………………………………………………

Objetivos:

………………………………………………………………………………………….

Diseño de Contrastación: …………………………………………………………

Tamaño Muestral:

………………………………………………………………………………

Análisis Estadístico: …………………………………………………………………

3.- RESULTADOS:

……………………………………………………………………………………

4.- DISCUSIÓN:

…………………………………………………………………………………….

5.- CONCLUSIONES:

………………………………………………………………………………….......

..................................................................................

6.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: ………………………………………….

7.- RESUMEN:………………………………………………………………………

…………………...

8.- RELEVANCIA DE LA INVESTIGACIÓN:…………………………………....

9.- ORIGINALIDAD:

………………………………………………………………………………….

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11. SUSTENTACIÓN:………………………………………………………

10.1 Formalidad:

………………………………………………………………

10.2 Exposición:

………………………………………………………………

10.3 Conocimiento:

…………..……………………………………………………………

………………………........

Nombre

Firma

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CONSTANCIA DE ASESORAMIENTO

El que suscribe Dra. Teresa Etelvina Ríos Caro, profesora de la Facultad de

Estomatología, de la Universidad Nacional de Trujillo, hace constar que es

ASESORA del proyecto de Investigación titulado: ―Efecto antibacteriano in

vitro de un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de extracto

etanólico de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC 25175‖,

perteneciente a la alumna: BECERRA QUIROZ, Layla Marinés, del sexto año

identificada con DNI. Nº 70495331, Matrícula. Nº 012100110.

Trujillo, 11 de Enero del 2016

_______________________________________

C.D. Esp.Dra Teresa Etelvina Ríos Caro

Cod. UNT 4118

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facultad de estomatologÍa escuela de estomatologÍa …

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