factores que afectan la secreciÓn de las agps y su

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

FACTORES QUE AFECTAN LA SECRECIÓN DE AGPs Y SU

RELACIÓN CON EL CRECIMIENTO Y LA FORMACIÓN DE

AGREGADOS EN CULTIVOS DE Beta vulgaris L.

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTORADO EN CIENCIAS

EN DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

PRESENTA

I.Q. M.B JACQUELINE CAPATAZ TAFUR

DIRECTORAS

Dra. GABRIELA TREJO TAPIA

Dra. GABRIELA SEPÚLVEDA JIMÉNEZ

Yautepec, Morelos. México. Junio, 2010

http://www.ceprobi.ipn.mx/

Esta tesis corresponde a los estudios realizados con una beca

otorgada a Jacqueline Capataz Tafur por CONACyT

(233250) y del Programa Institucional de Formación de

Investigadores (PIFI). Se contó con los apoyos económicos

de los proyectos SIP-IPN (20070118, 20080101, 20090311)

El trabajo se realizó en el Departamento de Biotecnología

del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi)

del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra.

Gabriela Trejo Tapia y la Dra. Gabriela Sepúlveda Jiménez.

A mis padres Tercilia y César Enrique y a mi hermano

César Antonio que desde la distancia estuvieron siempre

conmigo brindándome su amor y apoyo incondicional.

A Paul Mauricio, por su amor y su ternura.

AGRADECIMIENTOS

Mi sincero agradecimiento a todas aquellas personas que de algún modo participaron en la

realización del presente trabajo.

A mis Directoras de tesis, Dra. Gabriela Trejo Tapia y Dra. Gabriela Sepúlveda Jiménez, por

el apoyo que me brindaron durante mi estadía en México, por su paciencia y confianza durante

la realización de este trabajo.

A los miembros de mi comité revisor:

- Dr. Mario Rodríguez Monroy por su amistad y contribución en la realización de este

proyecto de investigación.

- Dra. Kalina Bermúdez Torres, Dr. Alfredo Jiménez Pérez y Dr. Alejandro Zamilpa Álvarez

por las observaciones y opiniones que aportaron y contribuyeron a la mejora del trabajo.

Esta tesis no es el único resultado de mi estancia en el CeProBi, me llevo conmigo la

experiencia compartida con ustedes, con mis compañeros de estudios, docentes de CeProBi y

sobre todo su invaluable amistad.

Agradezco de forma especial al Instituto Politécnico Nacional y al Consejo Nacional de

Ciencia y Tecnología por las becas otorgadas para mis estudios de Doctorado.

CONTENIDO

Página

ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................................. ii

ÍNDICE DE CUADROS ........................................................................................................... iv

RESUMEN ................................................................................................................................. 1

ABSTRACT ............................................................................................................................... 2

INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 3

CAPÍTULO 1. LAS PROTEÍNAS ARABINOGALACTANAS EN CULTIVOS DE

CÉLULAS VEGETALES .......................................................................................................... 5

CAPÍTULO 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE SACAROSA EN EL

CRECIMIENTO CELULAR Y LA SECRECIÓN DE AGPs EN SUSPENSIONES

CELULARES DE Beta vulgaris L. .......................................................................................... 24

CAPÍTULO 3. SECRECIÓN DE AGPs EN CULTIVOS DE Beta vulgaris L. EN

RESPUESTA AL ESTRÉS OSMÓTICO ................................................................................ 43

CAPÍTULO 4. RELACIÓN DE LAS AGPs Y LA AGREGACIÓN CELULAR EN

SUSPENSIONES DE Beta vulgaris L. .................................................................................... 58

DISCUSIÓN GENERAL ......................................................................................................... 81

CONCLUSIONES .................................................................................................................... 85

ANEXOS .................................................................................................................................. 86

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Distribucion y función de las AGPs en las plantas. ..................................................... 6

Figura 2. Representación esquemática de la estructura de las AGPs .......................................... 8

Figura 3. Representación esquemática de la clasificación y de la composición de las AGPs

clásicas y no clásicas. .................................................................................................................. 9

Figura 4. Estructura química de los fenilglucósidos conocidos como el reactivo de Yariv. ..... 10

Figura 5. Representación esquemática del proceso de biosíntesis de las AGPs ....................... 11

Figura 6. Curva tipo de azúcares totales, utilizando como estándar galactosa. ......................... 28

Figura 7. Curva tipo de proteína. ............................................................................................... 29

Figura 8. Curva tipo de goma arábiga para la cuantificación de AGPs por el método de

difusión radial en gel de agarosa. .............................................................................................. 30

Figura 9. Representación esquemática de la electroforesis cruzada. ......................................... 32

Figura 10. Efecto de la concentración inicial de sacarosa en el crecimiento celular de Beta

vulgaris. ..................................................................................................................................... 33

Figura 11. Efecto de la concentración inicial de sacarosa en la secreción de AGPs en

suspensiones celulares de Beta vulgaris. ................................................................................... 34

Figura 12. Distribución del tamaño de los agregados celulares de Beta vulgaris a

diferentes concentraciones iniciales de sacarosa ....................................................................... 35

Figura 13. Electrofóresis cruzada de las AGPs de Beta vulgaris obtenidas a diferentes

concentraciones iniciales de sacarosa. ....................................................................................... 36

Figura 14. Fraccionamiento del material extracelular de Beta vulgaris utilizando

cromatografía de interacción hidrofóbica. ................................................................................ 37

Figura 15. Electroforesis cruzada de las fracciones B y C. ....................................................... 38

Figura 16. Curva tipo de sacarosa para la cuantificación de azúcares residuales por el

método fenol-sulfúrico. ............................................................................................................. 47

Figura 17. Cinéticas de crecimiento celular y de azúcar residual de células de Beta

vulgaris alimentadas con azúcares ............................................................................................ 49

Figura 18. Cinéticas de secreción y de rendimiento específico de AGPs de Beta vulgaris

alimentadas con azúcares........................................................................................................... 50

Figura 19. Cinéticas de crecimiento celular y de azúcar residual de celúlas de Beta

vulgaris alimentadas con NaCl y polietilenglicol ..................................................................... 52

Figura 20. Cinéticas de secreción y de rendimiento específico de AGPs de Beta vulgaris

alimentadas con NaCl y polietilenglicol. ................................................................................... 53

Figura 21. Curva tipo para la cuantificación de las AGPs de pared celular por el método

colorímetrico. ............................................................................................................................. 64

Figura 22. Cinéticas de crecimiento celular de las suspensiones de Beta vulgaris. .................. 67

Figura 23. Contenido de AGPs en las suspensiones de Beta vulgaris. ..................................... 70

Figura 24. Distribución de las fracciones de tamaños de agregados en las suspensiones de

Beta vulgaris. ............................................................................................................................. 73

Figura 25. Fotomicrografías de los agregados celulares de Beta vulgaris durante la cinética

de crecimiento............................................................................................................................ 74

Figura 26. Modelo hipotético para la secreción de AGPs y su relación con el crecimiento y

la agregación celular. ................................................................................................................. 83

ÍNDICE DE CUADROS

Página

Cuadro 1. Efecto de la concentración inicial de sacarosa en los parámetros cinéticos de las


Cuadro 2. Composición de las fracciones del materialextracelular de Beta vulgaris. .............. 37

Cuadro 3. Sustancias utilizadas para llevar el potencial osmótico a 95.97 mOsm kg-1

, en

suspensiones celulares B. vulgaris. ........................................................................................... 46

Cuadro 4. Efecto del aumento del potencial osmótico a 95.97 mOsm kg-1

en la biomasa,

secreción de AGPs y rendimiento de AGPs en suspensiones celulares de Beta vulgaris. ........ 54

Cuadro 5. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en la biomasa de las


Cuadro 6. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en el contenido de AGPs de

la pared y del medio de cultivo de Beta vulgaris. ..................................................................... 71

Cuadro 7. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en la formación de agregados

de Beta vulgaris. ........................................................................................................................ 74

RESUMEN

El objetivo del presente trabajo fue conocer los factores que influyen en la secreción de

AGPs y su relación con el crecimiento y la agregación celular de los cultivos de células de

Beta vulgaris L. A medida que se incrementó la concentración inicial de sacarosa (CIS) de

43.8 mM a 131.5 mM, los cultivos aumentaron el crecimiento celular y la secreción

volumétrica de AGPs. En respuesta al aumento de la CIS, las células tendieron a agregarse,

coincidiendo con una mayor secreción de AGPs, sugiriendo que estas glicoproteínas funcionan

como moléculas de adhesión celular. Al aumentar el potencial osmótico mediante la adición

de manitol, sorbitol, polietilenglicol y NaCl; las células de B. vulgaris incrementaron la

secreción y la acumulación específica de las AGPs en comparación al cultivo sin adición,

indicando que la secreción de AGPs es parte de la respuesta celular al estrés osmótico. Por

otro lado, a medida que las células tendieron a agregarse se observó un incremento del

contenido de AGPs en la pared celular (PC) y en el medio de cultivo (MC). Cuando la

glicosilación de proteínas fue inhibida con tunicamicina (TM), disminuyó el contenido de

AGPs, tanto en la PC como en el MC. Lo cual se relacionó con una disminución del

crecimiento y en la formación de agregados celulares de menor tamaño. Al retirar la TM de

los cultivos, las células volvieron a sintetizar las AGPs en la PC y secretarlas al MC, y hubo

una recuperación del crecimiento celular y la formación de agregados celulares de mayor

tamaño. La precipitación de AGPs por su interacción con el reactivo de Yariv redujo el

contenido de las AGPs en la PC y su secreción hacia el MC fue totalmente inhibida. Este

evento fue paralelo con la disminución del crecimiento celular y del tamaño de los agregados.

Al retirar el reactivo de Yariv de los cultivos, el contenido de AGPs en la PC y su secreción al

MC no se recuperó al igual que el crecimiento y la formación de agregados. Estos datos

indican que las AGPs de B. vulgaris, son requeridas en la agregación celular.

ABSTRACT

The aim of this study was to determine the factors that influence the secretion of AGPs and

their relationship with growth and cell aggregation of cell cultures of Beta vulgaris L. As the

initial concentration of sucrose (ISC) was increased from 43.8 mM to 131.5 mM, the cultures

enhanced their cell growth and AGPs secretion. In response to the increase in ISC, the cells

tended to aggregate, coinciding with increased secretion of AGPs, suggesting that these

glycoproteins function as cell adhesion molecules. By raising the osmotic potential by the

addition of mannitol, sorbitol, polyethylene glycol and NaCl, the B. vulgaris cells enhanced

the AGPs secretion and specific accumulation of these molecules in relation to the control,

suggesting that the AGPs secretion is part of the cellular response to osmotic stress. On the

other hand, as the cells tended to aggregate, it was observed an increase of the content of

AGPs in the cell wall (CW) and in the culture medium (CM). When protein glycosylation was

inhibited with tunicamycin (TM), there was a reduction in the AGPs content, in both the CW

and the MC. These were associated with a decrease of the cell growth and the formation of

smaller cell aggregates. When TM was removed from the media culture, the cells re-

synthesized AGPs in the CW and secreted them into the MC, and there was a recovery of cell

growth and the formation of larger cell aggregates. The precipitation of AGPs by its

interaction with the Yariv reagent led to the reduction of the content of AGPs in the PC and

their secretion into the CM was completely inhibited. This event was parallel with the

decrease in cell growth and size of the aggregates. After, removing the Yariv reagent, the

content of AGPs in the CW and its secretion to MC did not recover as well as the growth and

formation of aggregates. These data indicate that AGPs of B. vulgaris, are required in cell

aggregation.

INTRODUCCIÓN

Las proteínas arabinogalactanas (AGPs) son proteoglicanos de alto peso molecular,

ampliamente distribuidos en el reino vegetal y están presentes en la pared celular, en el

apoplasto, en la membrana plasmática y en el medio de cultivo de las células vegetales en

suspensión. Estas moléculas están implicadas en el crecimiento y el desarrollo vegetal, y en la

adhesión célula-célula.

Los cultivos en suspensión de Beta vulgaris L. tienden a acumular AGPs en el medio

extracelular y aumentar el tamaño de sus agregados a lo largo del tiempo del cultivo. Sin

embargo, los estudios de los factores involucrados con la secreción de AGPs son escasos y no

se conoce la relación de estas glicoproteínas con el crecimiento y la formación de agregados

celulares. La producción de arabinogalactanas, el principal polisacárido de las AGPs fue

incrementado al variar la concentración inicial de sacarosa en cultivos celulares de Silene

vulgaris (Moench) Garcke. También, el estrés salino puede ser un factor que afecta el

crecimiento y la secreción de AGPs en los cultivos de células vegetales. Por lo cual es

importante conocer el efecto de la concentración de sacarosa y de estrés osmótico sobre la

secreción de AGPs en cultivos celulares.

En base a las consideraciones expuestas, en el presente trabajo se estudiaron algunos de

los factores que podrían afectar la secreción de las AGPs por las células de B. vulgaris, tales

como la concentración inicial de sacarosa y el estrés osmótico. Así mismo, se estudió la

relación de la acumulación de las AGPs en el medio de cultivo con el crecimiento y la

agregación celular de Beta vulgaris. El documento de tesis se organizó de la siguiente manera:

En el Capítulo 1 se presenta una revisión de las AGPs, en cuanto a su composición,

clasificación y biosíntesis, así como su participación en el crecimiento y la diferenciación de

los cultivos de células vegetales. Además, se señalan algunos de los factores fisicoquímicos

que se podrían considerar en la secreción de las AGPs. Parte de esta revisión fue publicada en

4

la revista Interciencia, mar. 2009, 34(3): 170-176. ISSN 0378-1844.

En el Capítulo 2 se presentan los resultados del efecto de la concentración inicial de

sacarosa (CIS) en el crecimiento celular y la secreción de AGPs de las suspensiones celulares

de Beta vulgaris L. Parte de estos resultados fueron publicados en la revista Acta Physiologiae

Plantarum, doi:10.1007/s11738-010-0460-7.

En el Capítulo 3 se abordó el efecto del estrés osmótico en la secreción de las AGPs en

suspensiones celulares de B. vulgaris elevando el potencial osmótico del medio de cultivo

mediante la adición de manitol, sorbitol, NaCl y polietilenglicol (PEG).

En el Capítulo 4 se estudió la relación de AGPs con la agregación celular, a través del uso

de un inhibidor de la glicosilación de proteínas, la tunicamina (TM) y la reducción de su

acumulación por el tratamiento con el reactivo de Yariv. Estos resultados fueron sometidos

para publicación en la revista Biologia Plantarum.

Finalmente se presenta una discusión general de todos los resultados encontrados y se

propone un modelo de la secreción de las AGPs en respuesta a la CIS y al estrés osmótico, así

como su relación con el crecimiento y la agregación celular.

http://dx.doi.org/10.1007/s11738-010-0460-7

CAPÍTULO 1. LAS PROTEÍNAS ARABINOGALACTANAS EN CULTIVOS DE

CÉLULAS VEGETALES

INTRODUCCIÓN

Las proteínas arabinogalactanas (AGPs) son macromoléculas muy glicosiladas,

distribuidas ampliamente en el reino vegetal y se encuentran prácticamente en todos los

órganos de las plantas, como son las flores, el tallo, las raíces, las semillas y las hojas. Las

AGPs están implicadas en varios aspectos del crecimiento y el desarrollo de las plantas, tales

como la diferenciación de tejidos reproductivos y vegetativos, la expansión y la proliferación

celular y, la muerte celular programada (Figura 1). A nivel celular, estás glicoproteínas se

localizan principalmente en la membrana plasmática, en la pared celular, o como secreciones

en el espacio intercelular (Majewska-Sawka y Nothnagel, 2000; Showalter, 2001;

Rumyantseva, 2005).

El carbohidrato de las AGPs consiste en arabinogalactanas (AG) del tipo II, de donde

reciben el nombre estas glicoproteínas. Las AGPs pertenecen a la familia de las proteínas ricas

en hidroxiprolina (HRGPs), que también incluye a las extensinas, a las proteínas ricas en

prolina y a las lectinas (Nothnagel, 1997; Majeswska-Sawka y Nothnagel, 2000). Desde un

punto de vista práctico, las AGPs se diferencían de las otras HRGPs, por su capacidad de

unirse a un colorante sintético conocido como el reactivo de Yariv (Yariv et al., 1967).

Asimismo, el reactivo de Yariv, los anticuerpos monoclonales que reconocen a las AGPs y

técnicas genéticas son usados para conocer la participación de las AGPs en los procesos de

crecimiento y desarrollo vegetal (Showalter, 2001; van Hengel y Roberts, 2003; Gaspar et al.,

2004; Seifert y Roberts, 2007).

Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.

6

Figura 1. Distribución y función de las AGPs en las plantas.

Las AGPs son componentes abundantes de gomas y exudados, y muestran propiedades

funcionales relevantes para la industria de alimentos (Yadav et al., 2007). La goma arábiga de

Acacia senegal L. es uno de los aditivos más utilizados en alimentos por sus propiedades de

emulsión y la capacidad de prevenir la cristalización de azúcares (Verbeken et al., 2003;

Krishnan et al., 2005). La reducción de la acumulación de estas glicoproteínas a través de su

precipitación con el reactivo de Yariv genera cambios en la fisiología celular y que repercuten

en el crecimiento de las células cultivadas in vitro. Este efecto es dependiente de la

concentración y el tiempo que se aplique el reactivo de Yariv y de la etapa de desarrollo del

cultivo, pero si el tratamiento es muy severo puede llevar a la inducción de la muerte celular

programada (Gao y Showalter, 1999; Chaves et al., 2002).

La secreción de las AGPs en los cultivos celulares, podría facilitar su recuperación y su

análisis bioquímico y funcional. Dicho conocimiento es de particular interés por las posibles

aplicaciones biotecnológicas que podrían tener, como es su aplicación en sistemas de


7

micropropagación de plantas a través de la inducción de la embriogénesis somática y de la

organogénesis. La adición de AGPs al medio de cultivo puede inducir la embriogénesis de

cultivos que no son embriogénicos y aumentar los rendimientos de los embriones en cultivos

embriogénicos (Kreuger y van Holst, 1993; Kreuger et al,. 2000; Pereira-Netto et al., 2007).

La aplicación exógena de AGPs obtenidas del medio de cultivos embriogénicos induce la

formación de brotes a partir de callos derivados de protoplastos (Wiśniewska y Majewska-

Sawka, 2007). Sin embargo, hay pocos reportes acerca de los factores que puedan afectar su

secreción y como estás moléculas se relacionan con el crecimiento y la agregación celular.

En el presente capítulo se presenta una revisión de las AGPs, su composición,

clasificación y biosíntesis, así como su participación en el crecimiento y la diferenciación de

los cultivos de células vegetales. Además, se señalan algunos de los factores fisicoquímicos

que afectan la secreción de las AGPs.

1.1 GENERALIDADES DE LAS AGPs

1.1.1 COMPOSICIÓN Y CLASIFICACIÓN

Las AGPs son glicoproteínas que contienen en general de 91.0 a 98.5 % de carbohidratos

y de 1.5 a 9.0 % de proteína. El peso molecular de las AGPs se encuentra comprendido en un

intervalo de 60 a 300 kDa. El carbohidrato está compuesto por arabinogalactanas del tipo II y

su tamaño varía en un intervalo de 30 a 150 residuos de azúcares (Serpe y Nothnagel, 1999).

Las arabinogalactanas poseen una cadena lineal de D-galactosas unidas mediante enlaces (1-

3) sustituida en el C (6) por cadenas laterales de (1-6) D-galactosas. Estas cadenas laterales

presentan a menudo residuos terminales de L-arabinosa, L-fucosa, L-ramnosa o D-ácido

glucorónico (Nothnagel, 1997; Gaspar et al., 2001). El carbohidrato generalmente se une a la

proteína a través de la hidroxiprolina, sin embargo, también se reportan uniones a la proteína

vía serina o treonina (Figura 2).


8

Figura 2. Representación esquemática de la estructura de las AGPs (Adaptado de Gaspar et

al., 2001).

De acuerdo a su composición de aminoácidos, las AGPs son clasificadas como clásicas y

no clásicas (Figura 3). Las AGPs clásicas presentan dominios ricos en hidroxiprolina, alanina,

serina, treonina y glicina; mientras que las no clásicas tienen dominios pobres en

hidroxiprolina, y son ricos en cisteína o en asparagina (Nothnagel, 1997). Otra diferencia

bioquímica entre ambas clases de AGPs, es la presencia en el dominio C-terminal de una

señal para la unión de un grupo glicosilfosfatidilinositol (GFI), que se encuentra en las AGPs

clásicas y está ausente en las AGPs no clásicas. Desde el punto de vista estructural, la función

del GFI es permitir la unión de las AGPs a la membrana plasmática (Youl et al., 1998; Oxley y

Bacic, 1999). Por lo cual, las AGPs no clásicas que carecen de GFI estarían como moléculas

solubles en la superficie de la pared celular o en el espacio periplasmático (Gaspar et al.,

2001).


9

Clásicas

No clásica

Figura 3. Representación esquemática de la clasificación y de la composición de las AGPs

clásicas y no clásicas. En A, B y C se muestran los dominios de las proteínas y en D, E y F se

indica la estructura nativa de las AGPs (Adaptado de Gaspar et al., 2001).

Una característica distintiva de las AGPs es su capacidad para reaccionar con

fenilglucósidos sintetizados químicamente y conocidos como reactivo de Yariv (Yariv et al.,

1967). Se conocen con este nombre a cuatro moléculas diferentes de fenilglucósidos: -(D-

glucosil)3, -(D-galactosil)3, -(D-galactosil)3 y -(D-manosil)3 (Figura 4). De estos cuatro

fenilglucósidos, sólo el -(D-glucosil)3 y el -(D-galactosil)3 reaccionan con las AGPs, mientras

que los dos fenilglucósidos restantes, -(D-galactosil)3 y -(D-manosil)3 no reaccionan con las

AGPs. Sin embargo, son usados como controles negativos en los estudios de la búsqueda de la

función de estas glicoproteínas. El mecanismo de reacción entre las AGPs y el reactivo de

Yariv no es conocido, pero se sugiere que para que esta reacción se lleve a cabo se requiere

tanto de la proteína como del carbohidrato de las AGPs (Nothnagel, 1997).

Señal de secreción Señal para la adición de GFI

Dominio rico en hidroxiprolina Dominio rico en lisina

Anclaje GFI Arabinogalactanas del tipo II

Dominio rico en asparagina


10

Figura 4. Estructura química de los fenilglucósidos conocidos como el reactivo de Yariv. En

el recuadro se señalan los grupos químicos que diferencian una molécula de otra (Adaptado de

Showalter, 2001).

La precipitación de las AGPs con el reactivo de Yariv es una metodología para aislar a las

AGPs y realizar su caracterización bioquímica y funcional; así como, la localización y el

estudio de la función de las AGPs en los tejidos vegetales. La formación del precipitado AGP-

Yariv es una forma de inactivar a la glicoproteína en sistemas vegetales, y se usa para conocer

su repercusión en procesos biológicos importantes como la diferenciación y el crecimiento

vegetal.

1.1.2. SÍNTESIS DE LAS AGPs

La biosíntesis de las AGPs es un proceso coordinado en el cual, una vez que se sintetiza

la parte proteica, los residuos de prolina se modifican a hidroxiprolina y son glicosilados


11

(Figura 5). La enzima que cataliza la modificación a hidroxiprolina es la peptidil-prolina

hidroxilasa, que se encuentra en el retículo endoplasmático (Wojtaszeka et al., 1999). La

glicosilación de los residuos de hidroxiprolina ocurre en el aparato de Golgi y participan

galactosil transferasas responsables de la síntesis de (1,6)--D-galactana (Rumyantseva, 2005).

El análisis de predicción de secuencias indica que los lugares donde se presentan

hidroxiprolinas aisladas, son glicosilados con unidades de polisacáridos; mientras que sitios

con hidroxiprolinas arregladas en forma consecutiva, son glicosilados con cadenas de

oligoarabinosa (Kieliszewski y Shpak, 2001). Las AGPs sintetizadas son secretadas hacia la

superficie celular a través de vesículas, para ser depositados en la membrana plasmática, en la

pared celular o liberadas al apoplasto (Lamport et al., 2006).

P

P

P

P

P

P

PP

P

P

P

P

P

P

P

P

Figura 5. Representación esquemática del proceso de biosíntesis de las AGPs (Adaptado de

Schultz et al., 1998 y Rumyantseva, 2005).


12

En el caso de las AGPs clásicas, se propone que la eliminación del dominio C-terminal

hidrofóbico ocurre en coordinación con la adición del GFI en un aminoácido específico. El

GFI está formado de etanolamina unida a través de un oligosacárido, a un lípido inmerso en la

membrana plasmática. Esto implica que para la liberación de la AGP con GFI de la membrana

plasmática, a la pared celular o al espacio extracelular, se requiere de la actividad de al menos

una fosfolipasa C o D (Rumyantseva, 2005).

1.2 PARTICIPACIÓN DE LAS AGPs EN EL CRECIMIENTO Y LA

DIFERENCIACIÓN DE LOS CULTIVOS DE CÉLULAS VEGETALES

El crecimiento celular es uno de los parámetros más importantes a considerar para el

establecimiento de cultivos de células que pueden ser productoras de metabolitos secundarios

de importancia tales como los colorantes y los fármacos. El crecimiento celular involucra los

procesos de división y expansión celular, y es regulado a nivel del ciclo celular, el cual es un

proceso altamente ordenado que da como resultado la formación de células hijas y está

usualmente dividido en 4 fases: G1, S (replicación del ADN), G2 y M (cario y citocinesis) en

donde los puntos de transición claves son G1/S y G2/M (Stals y Inzé, 2001). La progresión del

ciclo celular es controlada por proteínas cinasas dependientes de ciclinas (CDKs). Diferentes

complejos CDK-ciclina fosforilan un gran número de sustratos en los puntos de transición,

dando lugar a la replicación del ADN y la mitosis, respectivamente (Inzé y De Veylder, 2006).

En cultivos de células vegetales, las AGPs son secretadas al medio de cultivo y se han

relacionado con el crecimiento y la diferenciación celular (Rumyantseva, 2005). La secreción

de las AGPs es un evento que ocurre durante el crecimiento de los cultivos celulares in vitro.

La adición en el medio de cultivo del reactivo de Yariv causa una suspensión del crecimiento

de los cultivos de células en suspensión (Langan y Nothnagel, 1997; Darjania et al., 2002). La

reducción de la acumulación de estas glicoproteínas a través de su precipitación con el

reactivo de Yariv genera cambios en la fisiología celular y que repercuten en el crecimiento de

las células cultivadas in vitro. Este efecto es dependiente de la concentración y el tiempo que

se aplique el reactivo de Yariv y de la etapa de desarrollo del cultivo, pero si el tratamiento es


13

muy severo puede llevar a la inducción de la muerte celular programada (Gao y Showalter,

1999; Chaves et al., 2002).

Al respecto, Serpe y Nothnagel (1994) reportaron que el crecimiento celular de los

cultivos de Rosa sp., fue inhibido al adicionar 50 µM del reactivo de Yariv en el medio de

cultivo. En vista de que el tamaño de las células tratadas con el reactivo de Yariv y el control

fue el mismo, se sugirió que la inhibición del crecimiento fue debida a la supresión de la

división celular. Los autores también determinaron que el 95% del reactivo se encontraba

asociado a la pared celular, mientras que el 5% restante se asoció a la superficie externa de la

membrana plasmática. Sin embargo, los autores sugieren que la inhibición de la división

celular pudo ser consecuencia de la interacción del reactivo de Yariv con las AGPs presentes

en la pared celular, en la membrana plasmática o de ambas.

Los mecanismos celulares que se proponen por los que el reactivo de Yariv inhibe la

división celular son diversos. Por un lado, se sugiere que la inhibición de la división celular

quizás es causada por la desorganización de la membrana plasmática, derivada de la

asociación del reactivo de Yariv con las AGPs presentes en ésta. Otra explicación es que la

unión Yariv-AGPs afecta la extensibilidad de la pared celular, limitando el crecimiento. Por

último se propone que la unión Yariv-AGPs altera la organización del citoesqueleto,

impidiendo el crecimiento celular (Serpe y Nothnagel, 1994).

La inhibición de la división celular por la interacción de las AGPs-Yariv depende de la

etapa del ciclo celular. Langan y Nothnagel et al. (1997) encontraron en cultivos de Rosa sp.,

que la inactivación de las AGPs con el reactivo de Yariv, ocasionó que las células detuvieran

su crecimiento en la fase G1 del ciclo celular. El mecanismo molecular propuesto incluye que

las AGPs son moléculas señal de elementos regulatorios del ciclo celular como son las ciclinas

o las CDKs. Por otro lado, Guan y Nothnagel (2004), señalan que en cultivos de Arabidopsis

thaliana (L.) Heynh., el reactivo de Yariv provocó una disminución en la transcripción de

genes regulatorios del ciclo celular, entre ellos los genes codificantes para ciclinas, así como la

expresión de genes relacionados a respuesta de herida y de los genes codificantes de las

proteínas de la pared celular y de los componentes de la transducción de señales.


14

La inhibición del crecimiento celular por el reactivo de Yariv también puede presentarse a

nivel de la expansión celular. En este contexto, la expansión de las células de Nicotiana

tabacum L. se inhibió en un 30% con respecto al control por la presencia del reactivo de

Yariv. Las células de N. tabacum tratadas con el reactivo de Yariv permanecieron de forma

esférica, a diferencia de las células control que fueron células elongadas. A través de la tinción

de las células con una solución de rojo Congo, se determinó que la adición del reactivo de

Yariv interfirió con el depósito de celulosa en la pared celular, que es necesario para la

expansión (Vissenberg et al., 2001). En forma similar, Willats y Knox (1996) también

reportaron la inhibición de la expansión de las células de Daucus carota L. agregando en el

medio de cultivo el reactivo de Yariv, sugiriendo la participación de las AGPs en la expansión

celular. Al respecto Lamport et al. (2006), señalan que las AGPs podrían estar actuando como

plastificantes de las pectinas de la pared celular, pero no se indica cómo podrían estar

modulando la expansión de la pared celular. Estos resultados son consistentes con los

reportados por Shibaya y Sugawara (2007), quienes demostraron que las AGPs son moléculas

fundamentales en la regeneración de la pared celular en cultivos de protoplastos de

Marchantia polymorpha L. En dicho estudio, la adición del reactivo de Yariv indujo una

disminución del índice de supervivencia de los protoplastos y una reducción de la

acumulación de callosa en las membranas de las células regeneradas.

Por otro lado, también se ha relacionado a las AGPs con los procesos de embriogénesis y

de diferenciación celular. Los estudios realizados por Immerzeel (2005) con cultivos de

células de D. carota indican que las AGPs controlan la embriogénesis somática, ya que las

AGPs secretadas por cultivos embriogénicos de D. carota son capaces de inducir este proceso

en cultivos no embriogénicos de esta misma especie vegetal. Resultados similares fueron

reportados por Pereira-Netto et al. (2007), quienes demostraron que una AGP aislada de

Anacardium occidentale L. puede estimular el desarrollo de embriones somáticos de cultivos

de D. carota en un período de 2 a 3 semanas, además de que favorece la conversión de los

embriones a plántulas.

En cuanto a la organogénesis, Wiśniewska y Majewska-Sawka (2007) reportaron que las

AGPs de cultivos embriogénicos de B. vulgaris, promovieron la organogénesis de callos e


15

incrementaron el número de brotes. La adición de AGPs provenientes de goma arábiga

comercial, previenen la muerte de los cultivos de microesporas de Triticum aestivum L., lo que

permite obtener embriones somáticos y promover el desarrollo de las plantas obtenidas

(Letarte et al., 2006).

En los cultivos de microesporas de Zea mays L., el desarrollo de embriones fue

correlacionado con la adición de AGP de goma arábiga. La adición de las AGPs revirtió el

efecto de inhibición en el desarrollo de los embriones, causado por un inhibidor de la

glicosilación de proteínas. Señalando que este paso de la biosíntesis es necesario para que las

AGPs puedan inducir el desarrollo de los embriones (Borderies et al., 2004).

El conocimiento de los mecanismos bioquímicos y/o moleculares, por los que las AGPs se

relacionan con los procesos de crecimiento y diferenciación en las células vegetales es escaso.

Existen propuestas en base a las características estructurales de las AGPs, a su localización

celular y al conocimiento de los modos de acción de las glicoproteínas participantes en los

procesos de crecimiento y diferenciación de las células animales. Estas propuestas se pueden

clasificar en dos grupos: aquellas que sugieren que las AGPs o los productos de su

degradación funcionan como moléculas señal y las que proponen que las AGPs funcionan

como moléculas de adhesión o de unión celular.

Como moléculas señal, se sugiere que el carbohidrato de las AGPs podría ser degradado

enzimáticamente dando lugar a oligosacáridos; que al unirse a receptores de la membrana

plasmática iniciarían un sistema de transducción de señales. De acuerdo a esta propuesta, las

AGPs portadoras de la molécula señal serían aquellas ubicadas en la membrana plasmática, la

pared celular o en el medio extracelular (Kreuger y van Holst, 1996; Showalter, 2001). Este

mecanismo de acción se podría estar presentando en el control de la embriogénesis en D.

carota, en donde las AGPs que contengan N-acetilglucosamina posiblemente serían las

moléculas portadoras de la señal (Immerzeel et al., 2004).

Por otro lado, en base al mecanismo de participación de glicoproteínas en las cadenas de

señalización de las células animales, Showalter (2001) sugiere que las AGPs de la membrana


16

plasmática, las de la pared celular y las extracelulares se unen a receptores de membrana, ya

sea de manera directa o con la ayuda de otras moléculas para el reconocimiento del receptor.

Otro de los mecanismos, propone que las AGPs participan en las interacciones célula-

célula a través de la señalización intercelular. La transmisión de la señal de una célula a otra se

realiza mediante la interacción iónica de las AGPs de la membrana plasmática de ambas

células. Esta interacción llevaría a una desorganización de la membrana celular y/o la apertura

de canales de Ca2+

, lo que se interpretaría como una señal. Por otra parte, probablemente la

AGP secretada al apoplasto se uniría a un receptor presente en la membrana plasmática de una

segunda célula y desencadenaría la señalización intercelular (Kreuger y van Holst, 1996;

Showalter, 2001).

Las AGPs pueden servir como moléculas de adhesión celular en la conexión de la

membrana plasmática con la pared celular. Al respecto, varios autores señalan que el reactivo

de Yariv podría inducir la formación de aglomerados anormales de las AGPs en la superficie

de la membrana plasmática y/o romper las conexiones esenciales de las AGPs requeridas para

el crecimiento y desarrollo normal vegetal (Kreuger y van Holst, 1996; Showalter, 2001). Por

otro lado, Kohorn (2000), ha señalado que los conectores del plasmalema y la pared celular

incluyen: a las cinasas asociadas a la pared celular (WAK), AGPs, pectinas, celulosa sintasa.

Johnson et al. (2003) reportaron que las AGPs tipo fasciclinas (FLAs) tienen, además de las

regiones glicosilada, supuestos dominios de adhesión celular conocidos como dominios

fasciclina. Las fasciclinas son moléculas de adhesión reportadas para las células neurales de la

mosca de la fruta, Drosophila melanogaster (Hortsch y Goodman, 1990). La precipitación de

las FLAs con el reactivo de Yariv, indica que ellas comparten características estructurales con

las AGPs. Debido a que las AGPs están preferencialmente localizadas en lado exterior del

plasmalema, se sugiere que las AGPs pueden interactuar con los componentes de la pared

celular, principalmente con pectinas y proveer la inserción del plasmalema a la pared celular

(Carpita y Gibeaut, 1993). También se ha señalado, que las arabinogalactanas (AG) están

conjugadas a ácidos fenólicos, que están involucrados en la agregación celular de las células

de arroz (Kato et al., 1994).


17

Otros reportes han señalado que las AGPs pueden están involucradas con elementos del

citoesqueleto. Andème-Onzighi et al. (2002) observaron que estos elementos están vinculados

en la morfogénesis de la raíz, en la mutante de A. thaliana. Esta mutante posee un fenotipo de

raíz epidérmica abultada “bulger” (reb1) y mostraron una disminución en la cantidad de AGPs

y desorganización de los arreglos de los microtúbulos (MT) en comparación a la A. thaliana

nativa, esto fue confirmado en estudios en los cuales las AGPs fueron pertubadas

exógenamente con disruptores del citoesqueleto (amiprofosmetil (APM) y citocalasina-D) y

con el reactivo de Yariv (Sardar et al., 2006; Nguema-Ona et al., 2007). Sardar et al. (2006),

propusieron un modelo de red para la superficie celular que implican interacciones entre las

AGPs y elementos del citoesqueleto tales como los microtúbulos (MT) y F-actina. Dichas

interacciones pudiesen estar mediadas por una interacción directa con proteínas de

transmembranas o por una interacción indirecta con los “rafts” (balsas) de lípidos.

Las AGPs son moléculas muy higroscópicas y esta característica las relaciona con la

organización física de la matriz extracelular, o como moléculas de protección como son las

AGPs secretadas por las plantas de Acacia senegal L. En las plantas, ciertas AGPs están

asociadas con el desarrollo del xilema, específicamente con el engrosamiento de la pared

celular y la muerte celular programada (Nothnagel, 1997).

Por otro parte, las AGPs podrían ser señales bioquímicas partícipes en la regulación de la

producción de metabolitos secundarios y en la percepción de estímulos relacionados con

respuestas de defensa. Cheng et al. (2008), mediante el análisis de expresión transiente del

anticuerpo JIM13 (específico para los epítopes β-D-GlcpA-(1→3)-α-D-GalpA-(1→2)-L-Rha y

posiblemente para otros no conocidos de las AGPs) en cultivos de células inmovilizadas de

Taxus cuspidata Siebold & Zucc., propusieron que la producción de taxol y de AGPs pudiesen

estar asociadas, ya que observaron que la acumulación de estas moléculas y del taxol se

incrementó en respuesta a la elicitación con metil jasmonato. Mientras que Mashiguchi et al.

(2008), al aplicar el reactivo de Yariv a células de aleuronas de cebada observaron la represión

en los genes inducidos por las giberelinas y la inducción de represores de la señalización por

las giberelinas, los genes WRKY y de la NAK cinasa. Este mismo efecto fue presentado por el


18

ácido jasmónico y un elicitor de quitina, indicando que la señalización por giberelinas está

regulada por la expresión de los genes de defensa.

1.3 ESTUDIOS SOBRE LA SECRECIÓN DE LAS AGPs

Se han reportado tres factores que afectan la secreción de las AGPs, entre ellos: la edad

del cultivo, el estrés salino y estrés hidrodinámico.

Langan y Nothnagel (1997), señalaron la influencia de la edad del cultivo en la liberación

de AGPs en líneas celulares de Rosa sp., de diferente año de descendencia (Rosa 57 y Rosa

93). La línea celular Rosa 57 mostró un mayor crecimiento (1.24 veces) y secreción de AGPs

(2 veces) en comparación a la línea Rosa 93. Por otro lado, el análisis electroforético y de

composición de las AGPs mostró que las líneas Rosa 57 y Rosa 93 difirieron tanto en el

número como en la abundancia de las AGPs aisladas de las paredes celulares y en el medio de

cultivo condicionado.

Zhu et al. (1993) reportaron que el estrés salino causó la reducción de la velocidad de

crecimiento de las células de N. tabacum BY-2 y la disminución del contenido de AGPs en la

membrana plasmática y en su velocidad de liberación al medio de cultivo. Las células

adaptadas a la sal fueron más pequeñas que las células control, y se propuso que las AGPs

pueden facilitar la expansión de las células. Mientras que, Lamport et al. (2006) demostraron

que las suspensiones de células de A. senegal, A.thaliana, Solanum lycopersicum L. y N.

tabacum adaptadas para crecer en la sal, secretaron más AGPs que las células no adaptadas; y

se sugirió que las AGPs migran a través de la pared celular actuando como plastificantes que

incrementan su extensibilidad.

Otros estudios, señalan que el daño mecánico que sufren las células de Beta vulgaris L.

crecidas en biorreactores tipo tanque agitado, puede ser una posible causa de la secreción de

proteínas como consecuencia del esfuerzo de corte (Rodríguez-Monroy y Galindo, 2000). Esto

podría ser similar a lo que sucede en las plantas de A. senegal, que secretan AGPs como una

respuesta a la herida (Showalter, 2001). El material secretado por las células de B. vulgaris


19

reaccionó con el reactivo de Yariv, indicando la presencia de AGPs, que posiblemente

provocó un aumento en la viscosidad de los caldos. La proteína presente en el medio podría

desempeñar una función protectora de la célula permitiéndole desarrollarse a altas

velocidades, ya que al aumentar la viscosidad del medio se reducen las condiciones de

turbulencia en el biorreactor (Rodríguez-Monroy y Galindo, 1999).

Otro de los factores que pudiese afectar la secreción de las AGPs es la fuente de carbono.

Los azúcares no solo funcionan como fuente metabólica y constituyente estructural de las

células, también actúan como importantes reguladores de varios procesos asociados al

crecimiento y desarrollo vegetal (Koch, 1996). Una variedad de genes, cuyos productos están

involucrados en diversas vías metabólicas y funciones celulares, son inducidas o reprimidas

dependiendo de la disponibilidad de los azúcares solubles. En general, se conoce que los

azúcares favorecen la expresión de las enzimas relacionadas con la biosíntesis, uso y

almacenamiento de las reservas (incluyendo el almidón, lípidos y las proteínas), mientras que

reprime la expresión de enzimas involucradas en la fotosíntesis y la movilización de reservas

(Koch, 1996).

Al respecto, Günter y Ovodov (2003) reportaron la influencia de la fuente de carbono en

el crecimiento y la producción del polisacárido arabinogalactana (AG), el principal

polisacárido de las AGPs en cultivos de Silene vulgaris (Moench) Garcke. Los autores

observaron que en presencia de galactosa, la concentración de las AG se incrementó en un

93% pero disminuyó un 83% en presencia de arabinosa. Mientras que en los cultivos celulares

de S. vulgaris, concentraciones de sacarosa de 20 a 50 g L-1

fueron favorables para el

crecimiento celular y la biosíntesis de AG.

CONSIDERACIONES

Las AGPs son macromoléculas formadas por carbohidratos y proteínas. Por su

localización celular y sus características bioquímicas se les asocia con el crecimiento y el

desarrollo celular (Serpe y Nothnagel, 1994; Willats y Knox, 1996; Immerzeel et al., 2004). Se

reporta que los cultivos de células vegetales en suspensión tienden a acumular AGPs en el


20

medio extracelular, en donde estas o sus derivados quizás participan como moléculas señal, o

como moléculas de unión entre la membrana plasmática y la pared celular, permitiendo que el

crecimiento celular se lleve a cabo (Showalter, 2001).

Por otro lado, los estudios sobre los factores que afectan la secreción de las AGPs (Zhu et

al., 1993; Langan y Nothnagel, 1997; Rodríguez-Monroy y Galindo, 1999; Rodríguez-Monroy

y Galindo, 2000; Lamport et al., 2006) no muestran cómo cambia el perfil de acumulación de

estas glicoproteínas a lo largo del tiempo de cultivo. Asimismo, se desconoce si la sacarosa

pudiera ser un factor que afecte la secreción de las AGPs de forma similar a lo reportado con

las AG de S. vulgaris (Günter y Ovodov, 2003). También se desconoce si las AGPs secretadas

pudieran relacionarse con el crecimiento de las células de B. vulgaris, como sucede en otras

especies vegetales tales como, la de A. thaliana (Darjania et al., 2002) y si existe una relación

entre las AGPs con la formación de agregados celulares B. vulgaris.

Al respecto, existen varias preguntas por resolver como son: ¿Puede ser la sacarosa un

factor que afecte el crecimiento y la secreción de AGPs? ¿Actuará la sacarosa como una

fuente de carbono o un agente osmótico? ¿Cambiará la cantidad de AGPs secretadas en

respuesta a un estrés osmótico? ¿Las AGPs secretadas son requeridas para el crecimiento y/o

la agregación celular? ¿Pueden las AGPs transducir señales adhesivas para que la agregación

célula- célula se lleve a cabo? ¿Cómo se relaciona la secreción de AGPs con el crecimiento

celular y la agregación celular?

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CAPÍTULO 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE SACAROSA EN

EL CRECIMIENTO CELULAR Y LA SECRECIÓN DE AGPs EN SUSPENSIONES

CELULARES DE Beta vulgaris L.

INTRODUCCIÓN

Las proteínas arabinogalactanas (AGPs) son proteoglicanos de alto peso molecular, que

consisten en un 90% de carbohidratos y un 10% de proteínas, aproximadamente. Las

arabinogalactanas (AG) tipo II son los principales polisacáridos de las AGPs (Fincher et al.,

1983). Estas glicoproteínas se distribuyen en las flores, tallos, raíces, semillas y hojas de las

plantas. A nivel celular, las AGPs se encuentran en la membrana plasmática, la pared celular o

las secreciones de los espacios intercelulares (Majewska-Sawka y Nothnagel, 2000;

Showalter, 2001; Rumyantseva, 2005). Mientras que en cultivos de células vegetales, las

AGPs se encuentran en el medio de cultivo lo que representa una gran ventaja, ya que facilita

su recuperación y ha permitido realizar estudios para una mejor comprensión del papel de las

AGPs en el crecimiento de las plantas.

En cultivos de células vegetales, se reporta que hay una relación entre el crecimiento

celular y las AGPs. El tratamiento de suspensiones de células de Rosa sp., con el reactivo de

Yariv, una molécula que se une selectivamente a las AGPs, causó la inhibición del crecimiento

celular; sugiriendo que las AGPs participan en la división celular (Serpe y Nothnagel, 1994).

Otros estudios mostraron que el aumento de las AGPs en el medio de cultivo de células de

Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., está estrechamente correlacionado con el aumento del

número de células (Darjania et al., 2002).

Los carbohidratos, especialmente la sacarosa, son fuentes importantes de carbono y

energía. Y ha sido demostrado que la concentración inicial de sacarosa (CIS) puede afectar el

crecimiento, el desarrollo y el metabolismo vegetal (Su-May, 1999). Así como un número de

Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.

25

parámetros del cultivo tales como la velocidad específica de crecimiento (µ) y el rendimiento

de metabolitos secundarios (Zhong y Yoshida, 1995; Akalezi et al., 1999).

Zhang et al. (1996), reportaron que en suspensiones celulares de Panax notoginseng

(Burk.) F.H. Chen, el máximo crecimiento celular y de producción polisacáridos fueron

alcanzados a una CIS de 116.9 mM de sacarosa. Mientras que a 175.3 mM de sacarosa estos

dos parámetros disminuyeron. Por otro lado, la producción de AG, el principal polisacárido de

las AGPs fue incrementado entre 58.43 a 146.07 mM de sacarosa en cultivos celulares de

Silene vulgaris (Moench) Garcke (Günter y Ovodov, 2003). Sin embargo, el efecto de la

concentración de sacarosa en el crecimiento celular y la secreción de AGPs en cultivos

celulares no ha sido evaluado.

Hernández (2007) reportó que durante toda la cinética de crecimiento de los cultivos de

Beta vulgaris L. con 87.6 mM de sacarosa, secretaron AGPs de peso molecular entre 115 y

159 kDa, alcanzando una acumulación máxima de 45.5 mg L-1

y de 25.1 mg L-1

en un

biorreactor de tipo tanque agitado y a nivel de matraces, respectivamente. Los perfiles de

secreción de las AGPs y del crecimiento de los cultivos fueron similares durante la fase

exponencial, lo que sugirió que la secreción de estas macromoléculas estuvo relacionada con

el crecimiento celular. Sin embargo, se desconoce si el cambio en la CIS pueda afectar las

propiedades electroforéticas de las AGPs.

En el medio de cultivo de suspensiones de células embriogénicas y no embriogénicas de

B. vulgaris se encontró una AGP con propiedades electroforéticas similares pero diferente

capacidad de unión a los anticuerpos JIM7 y LM2 contra pectinas y contra los epítopes JIM 14

y JIM15 (Wiśniewska y Majewska-Sawka, 2007), lo cual sugiere que en los cultivos durante

la biogénesis de las AGPs hay cambios dinámicos en la composición y estructura de los

dominios estructurales que son detectados por anticuerpos específicos.

Por lo cual, el objetivo fue determinar el efecto del aumento de la concentración inicial de

sacarosa sobre el crecimiento celular y la secreción de AGPs en cultivos de B. vulgaris así

como conocer algunas de las características bioquímicas de las AGPs.


26

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico

Se utilizó un cultivo celular de Beta vulgaris L. variedad crosby´s Egyptian de fenotipo

rojo obtenido por Ontiveros (1994). Las suspensiones celulares de B. vulgaris fueron

cultivadas según la metodología descrita por Rodríguez-Monroy y Galindo (1999). Las células

fueron cultivadas en medio B5 Gamborg's (Gamborg et al., 1968) suplementado con sacarosa

(87.6 mM), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (0.091 μM) y cinetina (0.465 μM). El pH del medio

se ajustó a 5.5 con NaOH (1 M) antes de la esterilización. Los cultivos se desarrollaron en

matraces Erlenmeyer (500 mL) con 100 mL de medio de cultivo y se incubaron en un agitador

orbital (modelo 6040, Vichi, México) a 120 rpm, 25 ºC y con un fotoperiodo de 16 h luz/ 8 h

oscuridad (32 W m-2

). La línea celular fue subcultivada cada 14 días.

Efecto de la concentración inicial de sacarosa (CIS)

Se utilizaron matraces Erlenmeyer de 125 mL con 30 mL medio cultivo B5, inoculados

con 0.8 g peso fresco de cultivo de células de 7 días de edad. Las concentraciones iniciales de

sacarosa (CIS) ensayadas fueron de 43.8, 87.6 y 131.4 mM (15, 30 y 45 g L-1

,

respectivamente). Se realizaron tres experimentos independientes en los cuales se retiraron tres

matraces cada 2 o 3 días de muestreo para realizar las determinaciones de crecimiento celular

y contenido de AGPs. Los resultados son el promedio de 9 muestras ± el error estándar (EE).

Métodos analíticos

Crecimiento celular

El crecimiento celular se evaluó por la determinación del peso en seco (PS). Para ello, 5

mL del cultivo se filtraron a través de un filtro de papel Whatman No. 1, de peso seco

conocido. Las células se secaron hasta peso constante (70 °C, 1 día) y el PS se calculó por

diferencia de peso.


27

La velocidad específica de crecimiento (μ) se calculó mediante un método gráfico. Los

datos en logaritmo natural del crecimiento celular se graficaron contra el tiempo.

Posteriormente, en esta gráfica se identificó la región lineal y se calculó la pendiente de la

recta, la cual correspondió a μ (días-1

).

El rendimiento específico de la biomasa con respecto al sustrato consumido fue calculado

de acuerdo a la siguiente ecuación:

fo

of

SX

SS

XXY

(1)

donde Xf es la biomasa final (g L-1

), Xo es la biomasa inicial (g L-1

), So es el sustrato

inicial (g L-1

); y Sf es el sustrato final (g L-1

).

Viabilidad celular

La integridad de la membrana fue medida mediante el test de exclusión del colorante de

azul de Evans (Rodríguez-Monroy y Galindo, 1999). Las células fueron incubadas con 0.25%

(p V-1

) de azul de Evans (Sigma-Aldrich) durante 5 min. Se contaron un total de 500 células

en el microscopio (Iroscope MG-110) con el objetivo de 10×. El porcentaje de viabilidad de

una muestra fue calculado basado en el número de células no teñidas (viables) en relación a las

células totales.

Distribución del tamaño de los agregados

La distribución de tamaño de los agregados celulares fue determinado en el día 15 del

cultivo utilizando la metodología reportada por Trejo-Tapia et al. (2003). Se utilizó un

conjunto de tamices metálicos con luz de malla de diferentes tamaños estándar: 125, 250, 500

y 1000 µm. Estos tamices permitieron la separación de la población de células en cuatro

fracciones: 125-250, 250-500, 500-1000, y >1000 µm. Una muestra de 10 mL se suspensión

celular se pasó suavemente a través del tamiz de 125 µm y se lavó tres o cuatro veces con agua


28

desionizada. Las células y los agregados que pasaron a través del tamiz se recolectaron por

filtración en un papel Whatman No. 1 previamente pesado. Las células retenidas en el tamiz

de 125 µm se resuspendieron en agua desionizada y luego se pasaron por el tamiz de 250 µm.

El procedimiento se repitió con los tamices de 500 y1000 µm. Las células y agregados de

células retenidas en cada tamiz fueron sometidos a análisis de peso seco, a fin de obtener la

distribución de tamaño global en términos de los porcentajes de peso seco.

Recuperación del material extracelular (MEC)

Las células fueron removidas del medio de cultivo a través de un filtro Whatman No. 1. El

filtrado obtenido fue dializado contra agua destilada por 48 h a 4 °C, utilizando membranas de

celulosa (Sigma, Chemical Company) de peso molecular de corte de 12 kDa. Luego el

dializado fue concentrado por liofilización, obteniéndose el material extracelular (MEC) que

se almacenó a -20 ºC hasta su análisis.

Determinación de azúcares totales

Los azúcares totales fueron determinados mediante el método de fenol-sulfúrico (Dubois

et al., 1956). La Figura 6 muestra la curva tipo de calibración para la cuantificación de

azúcares utilizando galactosa como estándar.

y = 0.0091x + 0.0126

R² = 0.9990

µg Galactosa

0 50 100 150 200

Asb

49

0 n

m

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Figura 6. Curva tipo de azúcares totales, utilizando como estándar galactosa. Las barras de

error representan el E.E. (n=3)


29

Determinación de proteína

La determinación de proteína se realizó mediante el método de Bradford (1976). Para

obtener los valores de concentración de proteína de las muestras, se empleó una curva tipo de

proteína realizada con albúmina de suero bovino (Figura 7).

y = -0.0290+0.0136x

R² = 0.9986

µg Proteína

0 5 10 15 20 25

Ab

s 5

95

nm

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Figura 7. Curva tipo de proteína, utilizando como estándar albúmina de suero bovino. Las

barras de error representan el E.E. (n=3).

Cuantificación de AGPs

La cantidad de AGPs en el MEC se cuantificó utilizando la prueba de difusión radial en

gel de agarosa descrita por van Holst y Clarke (1985). Para ello, se elaboraron geles de

agarosa (1% p V-1

) con un contenido de NaCl (0.15 M), NaN3 (0.02% p V-1

) y 10 µg mL-1

de

β-glucosil Yariv (7.7 × 2.6 × 0.1 cm). En el gel solidificado se realizaron dos filas de 7 pozos,

cada uno de 1.2 mm de diámetro y una separación de un centímetro entre cada pozo y entre las

filas. En cada pozo se colocó 1 µL de una solución del material recuperado a través de la

diálisis y la liofilización. La concentración de las soluciones fue de 1 mg L-1

o 2 mg L-1

dependiendo del día de cultivo.

Los geles se incubaron en una cámara húmeda y a temperatura ambiente durante 20 h.

Posteriormente se tomaron imágenes con un microscopio estereoscópico Nikon SMZ 1500

(Tokio, Japón) con un objetivo de 1.5 ×, el cual tenía acoplada una cámara 3CCD (MTI,


30

Michigan, EEUU). La imágenes fueron adquiridas mediante el Software MetaVue v7.5.0. El

diámetro de los halos de precipitación formados por la reacción de las AGPs con el reactivo de

Yariv, fue medido utilizando el programa ImageJ v1.40 (http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

El área del halo se calculó mediante la ecuación del área de un círculo. Para calcular el

contenido de AGPs en las muestras, se realizó una curva estándar por triplicado utilizando la

goma arábiga (Sigma). La goma arábiga posee galactosa y arabinosa como los principales

monosacáridos neutros (Gal: Ara = 1:1) (van Holst y Clarke, 1985) (Figura 8).

y = 21.829x + 0.293

R² = 0.997

AGPs (µg µL-1)

0.0 0.2 0.4 0.6

Aréa

(m

m2

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Figura 8. Curva tipo de goma arábiga para la cuantificación de AGPs por el método de

difusión radial en gel de agarosa. Las barras de error representan el E.E. (n=3).

El rendimiento específico de AGPs (YAGPs/X) y la productividad de AGPs (QAGPs) se

calcularon de acuerdo con las siguientes ecuaciones:

of

of

XX

AGPsAGPs

XAGPs

Y

(2)

)X(Xt

AGPsAGPsQ

of

of

AGPs

(3)

donde AGPsf son las AGPs final (mg L-1

), AGPso son las AGPs inicial (mg L-1

), Xf es la

biomasa final (g L-1

), Xo es la biomasa inicial (g L-1

); y t es tiempo final (días).

http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html


31

Fraccionamiento del MEC utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH)

El fraccionamiento por CIH fue realizado según la metodología reportada por Orozco-

Villafuerte et al. (2003). Para ello, se utilizó como soporte una columna empacada con metil

Macro-Prep® (Kit Econo-Pac® Methyl CIH Cartridges, 5 mL, Bio-Rad Laboratories) con un

diámetro de partícula de 50 μm (nominal) y un tamaño de poro de 1.000 Å. Como efluente se

utilizó NaCl 4.2 M. Una solución del MEC dializado y liofilizado se preparó al 4.0 % p V-1

(600 mg de MEC en 15 mL de NaCl 4.2M), que fue degasificada y filtrada a través de un filtro

Millipore de 0.45 µm. 10 mL de la solución de MEC en NaCl 4.2 M fue pasada a través de la

columna por gravedad, con una velocidad de flujo de 40 cm3 h

-1. La absorbancia fue

monitoreada a 280 nm utilizando un sistema de cromatografía de baja presión (Biologic LP,

Bio-Rad, CA, USA).

La mayoría de la muestra que pasó a través de la columna fue colectada y se le denominó

como la fracción A. Una parte de la muestra que fue absorbida en el gel de metil Macro-

Prep®, fue desorbida por elución con NaCl (2.0 M). El NaCl de la columna y el resto de la

muestra fue desorbida por elución con agua destilada, para obtener dos fracciones más

llamadas fracciones B y C. Las tres fracciones recuperadas fueron dializadas contra agua

desionizada, liofilizadas y se almacenaron a -20 ºC hasta su empleo. El contenido de proteínas,

azúcares y AGPs fueron determinados en cada fracción.

Electroforesis cruzada

Para la electroforesis cruzada se empleó el método descrito por Van Holst y Clarke (1986).

En la Figura 9 se muestra la representación esquemática de este procedimiento. Los geles de

6.5 x 6.5 cm fueron preparados con agarosa al 1%, Tris 0.025 M y glicina 0.2 M a un pH de

8.3. En el gel solidificado y con ayuda de una pipeta Pasteur se realizaron pozos, cada uno de

5.5 mm de diámetro. En un pozo se colocaron 15 μL de una solución de azul de bromofenol

(0.2 mg mL-1

) en Tris-HCl 50 mM a un pH de 8.0. En un segundo pozo se colocaron 15 μL de

la muestra (14-16 μg de AGP disueltos en una solución de Tris-HCl 50 mM), pH de 8.0 más


32

0.8 μL de una solución de azul de bromofenol (3 mg mL-1

). La solución de corrida fue Tris

(0.025 M) y glicina (0.2 M), a pH 8.3. El gel se corrió a 250 V por 14 minutos.

Después de la primera electroforesis, la porción del gel donde se separaron las AGPs (1.5 x

6.5 cm) se cortó y se alineó en un segundo gel (6.5 x 6.5 cm) que consistía de agarosa al 1%,

Tris al 0.025 M, glicina al 0.2 M, a un pH de 8.3 y 30 μg mL-1

del reactivo de Yariv β-(D-

glucosil)3. El segundo gel se corrió a 127 V por 24 minutos y después de este tiempo se lavó

con una solución de NaCl al 1% pV-1

, hasta eliminar el exceso del reactivo de Yariv.

A B C

Figura 9. Representación esquemática de la electroforesis cruzada. (A) La muestra de AGPs

se coloca en el gel de agarosa al 1%. (B) Las AGPs se someten a un campo eléctrico y migran

hacia el ánodo permitiendo su separación. La porción del gel donde se separaron estas

glicoproteínas se corta, se gira en un ángulo de 90º y se coloca en un segundo gel que contiene

el reactivo de Yariv. (C) Las AGPs se someten a un campo eléctrico por segunda vez y

durante su migración hacia el ánodo, interaccionan con el reactivo de Yariv contenido en el

gel formando una línea de precipitado rojo (complejo AGP-Yariv) y en forma de campana,

que es roja después de eliminar el exceso Yariv con NaCl al 1% pV-1

. (─) Cátodo, (+) Ánodo

(Tomado de Hernández, 2007).

Análisis estadístico

A los datos de los parámetros cinéticos a las diferentes CIS se les realizó un análisis de

varianza ANOVA simple para medidas repetidas y la comparación de medias fue realizada

con una prueba de Tukey utilizando con el programa SigmaStat v3.5.


33

RESULTADOS

Efecto de la CIS en el crecimiento celular.

La respuesta de los cultivos de suspensiones celulares de B. vulgaris a la CIS evaluadas se

muestran en la Figura 10. El crecimiento celular se incrementó a medida de que la

concentración de sacarosa aumentó. Las células cultivadas en la CIS más baja (43.8 mM)

mostraron una μ = 0.10 días-1

y alcanzaron una biomasa máxima de 10.33 g L-1

(día 11). En

contraste, con 87.6 mM y 131.4 mM de sacarosa, las células crecieron más rápido con una μ =

0.13 y 0.15 días-1

, respectivamente y la biomasa máxima fue de 15.97 g L-1

y 23.68 g de L-1

,

respectivamente.

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Bio

ma

sa (

g L

-1)

0

5

10

15

20

25

43.8 mM

87.6 mM

131.4 mM

Figura 10. Efecto de la concentración inicial de sacarosa (CIS) en el crecimiento celular de

Beta vulgaris. Las barras de error representan el E.E. (n=9).

El rendimiento máximo de biomasa (YX/S) fue de 0.66 a la CIS de 131.4 mM (Cuadro 1).

La viabilidad celular fue del 80% y no cambió a lo largo de la cinética del crecimiento en las

diferentes concentraciones de azúcar evaluadas (datos no mostrados).


34

Cuadro 1. Efecto de la concentración inicial de sacarosa (CIS) en la biomasa (X), velocidad

específica de crecimiento (µ), rendimiento de biomasa (YX/S), secreción de AGPs (AGPs),

rendimiento de AGPs (YAGPs/X) y productividad de AGPs (QAGPs) en suspensiones celulares de

Beta vulgaris.

Sacarosa

(mM)

X

(g L-1

)

µ

(días-1

)

YX/S

(g g-1

)

AGPs

(mg L-1

)

YAGPs/X

(mg g-1

)

QAGPs

(mg L-1

días-1

)

43.8 10.33 ± 0.18a 0.10

a 0.38 ± 0.01

a 13.49 ± 0.11

a 1.45 ± 0.03

a 0.11 ± 0.00

a

87.6 15.97 ± 0.93b 0.13

b 0.52 ±0.04

b 59.12 ± 0.18

b 4.48 ± 0.52

b 0.27 ± 0.03

b

131.4 23.68 ± 0.81c 0.15

c 0.66 ± 0.01

c 67.80 ± 0.10

c 4.45±0.30

b 0.26 ± 0.01

b

Las letras iguales dentro de cada una de las columnas indican que no hay diferencias estadísticamente

significativas. ANOVA (Tukey, p <0.05) (n=9).

Efecto de la CIS en la secreción de AGPs

La Figura 11 muestra el efecto de la CIS sobre la secreción de AGPs. A medida de que la

concentración de sacarosa se incrementó, aumentó la secreción volumétrica de esta

glicoproteína. La máxima secreción de AGPs fue de 13.49, 59.12 y 67.80 mg L-1

con 43.8,

87.6 y 131.4 mM de sacarosa, respectivamente (Cuadro 1). La máxima productividad de

AGPs (QAGPs) fue de 0.11 y 0.27 mg g-1

día-1

con la CIS de 43.8 y 87.6 mM, respectivamente,

pero con 131.4 mM de sacarosa fue de 0.26 mg g-1

día-1

(Cuadro 1).

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

AG

Ps

(mg

L-1

)

0

10

20

30

40

50

60

70

43.8 mM

87.6 mM

131.4 mM

Figura 11. Efecto de la concentración inicial de sacarosa (CIS) en la secreción de AGPs en

suspensiones celulares de Beta vulgaris. Las barras de error representan el E.E. (n=9).


35

Efecto de la CIS en el tamaño de agregados celulares.

La Figura 12 muestra la distribución del tamaño de los agregados de B. vulgaris en

respuesta a la CIS. En todos los tratamientos, el tamaño de los agregados fue >250 µm. A una

concentración de 43.8 mM de sacarosa, 24.3% de los agregados midieron entre 250-500 µm,

28.3% entre 500-1000 µm y 47.3% de los agregados fueron >1000 µm. A medida que la CIS

aumentó, la fracción de los agregados >1000 µm fue más alta, indicando un incremento en el

tamaño de los agregados. A la CIS de 87.6 mM, la fracción >1000 µm constituyó el 61.4% y

alcanzó un 76% cuando la CIS fue de 131.4 mM. Estos resultados indican que un efecto de

CIS es la formación de grandes agregados celulares. La tendencia a la agregación celular

coincidió con aumento de la secreción de AGPs, señalando un posible papel de las AGPs

como moléculas de adhesión celular.

Concentración de sacarosa

43.8 mM 87.6 mM 131.4 mM

Agre

ga

dos

(% P

eso s

eco)

0

20

40

60

80

100

250-500 µm

500-1000 µm

>1000 µm

Figura 12. Distribución del tamaño de los agregados celulares de Beta vulgaris a diferentes

CIS. El porcentaje en peso seco que corresponde a cada tamaño de agregado fue mostrado

como función de la concentración de biomasa seca. Las barras de error representan el E.E.

(n=9).

Características bioquímicas de las AGPs secretadas

Para cada CIS, se analizó la muestra del MEC del día en que hubo mayor cantidad de

AGPs. Las electroforesis cruzadas de las muestras, mostró la presencia de un solo pico; lo que


36

indica que se tratan de una sola AGP con un factor de retención (Rf) de 0.52 (Figura 13) lo

que sugiere que las AGPs secretadas en cada CIS podrían ser iguales en su composición.

Figura 13. Electroforesis cruzada de las AGPs de Beta vulgaris obtenidas a diferentes CIS.

Fraccionamiento por cromatografía de interacción hidrofóbica del MEC

Debido a que no se observaron diferencias en el Rf de las AGPs de las diferentes CIS, una

muestra del material glicoproteico (400 mg) obtenido con 87.6 mM de sacarosa, fue separado

en tres fracciones (A, B y C), en base a su hidrofobicidad mediante CIH, utilizando como

eluentes NaCl 4.2M, NaCl 2.0 M y agua respectivamente (Figura 14).

Rf=0.52

Rf=0.52

Rf=0.52

A. 43.8 mM

B. 87.6 mM

C. 131.4 mM


37

Tiempo (min)

0 20 40 60 80 100 120 140

Ab

s (2

80

nm

)

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

A B C

NaCl 4.2 M

NaCl 2.0 MH2O

Figura 14. Fraccionamiento del MEC de Beta vulgaris utilizando cromatografía de

interacción hidrofóbica (CIH).

La composición de cada una de las fracciones es mostrada en el Cuadro 2. La fracción A,

presentó un bajo contenido de carbohidratos y de proteínas, con un 5.16 y 0.46%

respectivamente. En ésta fracción no se detectaron AGPs.

El análisis de composición de las fracciones B y C, mostraron una relación de

carbohidratos y proteínas de 9:1 y fueron positivas para AGPs. El contenido de AGPs para la

fracción B y C fue de 13.63 y 10.71%, respectivamente.

Cuadro 2. Composición de las fracciones obtenidas después de la CIH del MEC de Beta

vulgaris.

Fracción Carbohidratos totales

(%)

Proteínas

(%)

AGPs

(%)

A 5.16 0.46 n.d

B 23.25 2.57 13.63

C 54.28 5.95 10.71

n.d: no detectado


38

La electroforesis cruzada de las fracciones B y C, reveló la presencia de un solo pico de la

AGP en cada fracción, mientras que se observó diferencia en su posición con un Rf de 0.19 y

de 0.33 para la proteína de las fracciones B y C, respectivamente (Figura 15), sugiriendo que

los cultivos de B. vulgaris secretan al medio de cultivo dos AGPs.

Figura 15. Electroforesis cruzada de las fracciones B y C.

DISCUSIÓN

El aumento de la CIS de 43.8 a 131.4 mM en las suspensiones celulares de B. vulgaris

favoreció los valores de: rendimiento celular (2.3 veces), μ (1.15 veces), y YX/S (1.7 veces)

(Cuadro 1). Estos resultados indican que el incremento de la CIS favoreció el crecimiento de

las células de B. vulgaris en forma similar a lo reportado en otras especies, como P.

notoginseng (Zhang et al., 1996) y S. vulgaris (Günter y Ovodov, 2003).

Los perfiles de secreción de AGPs en los cultivos de B. vulgaris con CIS de 87.6 a 131.4

mM mostraron que este fue un evento parcialmente asociado al crecimiento durante la fase

exponencial (Figura 10 y 11). Hernández (2007) demostró que las AGPs son moléculas

fundamentales para el crecimiento celular de B. vulgaris, adicionando el reactivo de Yariv

para inhibir a las AGPs. Los resultados mostraron que la presencia de Yariv redujo el

crecimiento celular en forma no reversible; sin embargo, la viabilidad, el tamaño y la

morfología de las células no se modificaron. Lo cual sugirió que la reducción de la secreción

de las AGPs no indujo la muerte celular ni cambios en la expansión de las células, y que la

Rf=0.19 Rf=0.32

Fracción B Fracción C


39

secreción de AGPs en los cultivos de B. vulgaris quizás está relacionada a eventos de división

celular (Hernández, 2007).

Los resultados de esta investigación muestran que la sacarosa es un factor que favorece la

secreción de las AGPs en los cultivos de B. vulgaris. Se observó que la acumulación

volumétrica de las AGPs en el medio de cultivo fue mejorada (5 veces) como consecuencia

del incremento de la CIS de 43.8 a131.4 mM. Mientras, que el rendimiento específico de las

AGPs (YAGPs/X) fue incrementada 3 veces entre las CIS de 43.8 a 87.6 mM. Sin embargo, la

CIS de 131.4 mM no tuvo efecto en YAGPs/X, ya que mostró un valor similar al obtenido con la

CIS de 87.6 mM. Un comportamiento similar fue obtenido con la productividad de las AGPs

(QAGPs) (Cuadro 1). Por otro lado, no es claro si la secreción de las AGPs al incrementar la

CIS, es debido a un efecto de la sacarosa como fuente de carbono o al estrés osmótico dado

por los cambios en la concentración del sustrato.

En el presente trabajo, a través de la electroforesis cruzada del MEC obtenido con las

diferentes CIS, se observó que las células de B. vulgaris secretaron una AGP con un Rf de

0.52 (Figura 13). Sin embargo, al fraccionar el MEC, se obtuvieron dos fracciones ricas en

AGPs (B y C) (Figura 14 y Cuadro 2) las cuales difirieron en su Rf (Figura 15), sugiriendo

que los cultivos de B. vulgaris secretan dos AGPs como mezcla al medio del cultivo y que

podrían corresponder a las AGPs de 115 a 159 KDa identificadas previamente por Hernández

(2007).

Wiśniewska y Majewska-Sawka (2007), reportaron que las suspensiones embriogénicas y

no embriogénicas de B. vulgaris secretaron una AGP con un Rf de 0.55. Mientras que,

Kjellbom et al. (1997) reportaron que la membrana plasmática de hojas de B. vulgaris cv.

Hilma, contienen dos subfamilias de AGPs, con peso moleculares de 82 y 97 kDa. Cada

subfamilia consiste de isoformas ácidas de AGPs, reconocidas por los anticuerpos

monoclonales MAC207 y JIM8 que reconocen a los epítopes de los carbohidratos β-D-GlcpA-

(1→3)-α-D-GalpA-(1→2)-L-Rha, β-D-GlcpA (1-O-Me), L-Ara, D-GlcA y otros posiblemente

desconocidos de las AGPs (Yates et al., 1996). Mientras que, Langan y Nothnagel (1997)

reportaron que la suspensiones de Rosa sp. 57 secretaron una AGP con un Rf de 0.35 y que


40

este pico al parecer contiene dos AGPs relacionadas, la AGP-(a) y AGP-(b), reportadas

previamente por Komalavilas et al. (1991). La AGP-(a) presentó un Rf de 0.16 y la AGP-(b)

de 0.23, con una relación Gal: Ara de 1.6: 1 para la AGP-(a) y de 1.8: 1 para la AGP-(b).

Por otro lado, se observó que el cultivo presentó una tendencia a agregarse como un efecto

del aumento de la CIS (Figura 12). Este fenómeno coincidió con la mayor secreción de AGPs

y sugiere un posible papel de la AGPs como moléculas de adhesión celular. Así, Showalter

(2001) señaló que las AGPs sirven como moléculas de adhesión celular necesaria para el

crecimiento y desarrollo normal. El papel de las AGPs en la adhesión entre la pared celular y

la plasmalema se puso de manifiesto con los datos obtenidos con tomate transgénico. Los

autores utilizaron una construcción de genes de LeAGP_1, que produce una AGP extracelular

de tomate para obtener una línea transgénica de Nicotiana tabacum BY-2 (Zhao et al., 2002).

Durante la plasmólisis celular, las AGPs fueron encontradas en las hebras Hectian, líneas de

conexión de la pared celular y del plasmalema. Estos sitios pueden ser el resultado de la

adhesión de las regiones de la AGPs del plasmalema y de la pared celular. Estas zonas pueden

estar involucradas en el ensamble de la pared celular y el metabolismo (García-Gómez et al.,

2000) o como sitios de anclaje, que facilitan la mitosis y la citocinesis (Cleary, 2001). Por lo

tanto, las AGPs pueden servir como moléculas de adhesión celular que conectan la membrana

celular con la pared celular.

Al cambiar la CIS, la productividad de las AGPs fue mejorada, lo que es importante si se

considera que estas moléculas pueden tener una aplicación en el desarrollo de los sistemas de

micropropagación de plantas.

En conclusión, la secreción volumétrica de las AGPs en las suspensiones celulares de B.

vulgaris, se favoreció al incrementar la CIS. Las AGPs secretadas por B. vulgaris están

parcialmente relacionadas con el crecimiento celular y pueden jugar un papel como moléculas

de adhesión en los agregados celulares. Estos hallazgos son importantes para la comprensión

de los factores implicados en la secreción de las AGPs en cultivo de células vegetales.


41

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CAPÍTULO 3. SECRECIÓN DE AGPs EN CULTIVOS DE Beta vulgaris L. EN

RESPUESTA AL ESTRÉS OSMÓTICO

INTRODUCCIÓN

El estrés osmótico es el resultado de un cambio en la concentración de soluto alrededor de

una célula, causando un cambio en el movimiento de agua a través de la membrana celular

(George et al., 2008). El potencial osmótico regula el balance de agua en las células, proceso

celular crucial en la vida de las plantas (Wu et al., 2005).

Los cambios en el potencial osmótico son generados en las células vegetales utilizando

agentes osmóticos tales como polioles (manitol y sorbitol, azúcares no metabolizables), sales

(cloruro de sodio, NaCl), o agentes no-permeabilizantes (polietilenglicol, PEG). El NaCl se

utiliza comúnmente para generar estrés osmótico, pero puede afectar la extensibilidad de la

pared celular y el crecimiento celular (Zhu et al., 1993). Por otro lado, un incremento en la

presión osmótica con manitol favoreció la producción de polisacáridos en suspensiones

celulares de Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen (Zhang et al., 1995). Una mayor

producción de metabolitos primarios y secundarios a partir de cultivos de tejidos in vitro bajo

un estrés osmótico ha sido reportada en algunas especies vegetales tales como P. notoginseng,

Taxus chinensis (Pilger) Rehd y Cistanche deserticola Y. C. Ma (Zhang y Zhong, 1997; Kim

et al., 2001; Liu y Cheng, 2008).

El estrés osmótico puede ser un factor que afecta el crecimiento y la secreción de AGPs

en los cultivos de células vegetales. En este sentido, Iraki et al. (1989a) observaron que el

crecimiento celular de Nicotiana tabacum cv W38, fue similar al control en los cultivos

expuestos a un estrés osmótico con polietilenglicol (PEG) (-23 bar), mientras que en presencia

de un estrés impuesto con NaCl (-28 bar), se observó una reducción del crecimiento. Iraki et

al. (1989b) reportaron que las características bioquímicas de las AGPs cambiaron ante un

Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.

44

estrés osmótico. En dicho estudio se muestra que los cultivos de N. tabacum crecidos bajo

estrés impuesto por la presencia de NaCl o de PEG, secretan una AGP con un contenido de

arabinosa y galactosa mayor al de aquella secretada por los cultivos crecidos sin NaCl o PEG.

Sin embargo, la diferencia en el contenido de carbohidratos no muestra una relación clara con

los cambios en los pesos moleculares de las glicoproteínas. Las AGPs liberadas en

condiciones sin y con un estrés salino, mostraron un peso molecular de 35 kDa, mientras que

la AGP liberada por los cultivos crecidos con PEG presentó un peso molecular <17kDa.

Por otro lado, Zhu et al. (1993) reportaron que el estrés salino causa la reducción de la

velocidad de crecimiento de las células de Nicotiana tabacum BY-2 y la disminución del

contenido de AGPs en la membrana plasmática y en su velocidad de liberación al medio de

cultivo. Las células adaptadas a la sal fueron más pequeñas que las células del control, y se

propuso que las AGPs pueden facilitar la expansión de las células. Lamport et al. (2006)

demostraron que las suspensiones de células de Acacia senegal L., Arabidopsis thaliana (L.)

Heynh., Solanum lycopersicum L. y N. tabacum adaptadas para crecer en la sal, secretaron

más AGPs que las células no adaptadas. Al respecto, se sugirió que las AGPs migran a través

de la pared celular actuando como plastificantes que incrementan la extensibilidad de la pared.

En el capítulo 2, se mostró que un incremento en la concentración inicial de sacarosa

(CIS) estimuló la secreción de las AGPs al medio de cultivo en las suspensiones celulares de

Beta vulgaris L. Sin embargo, no se observaron diferencias en el rendimiento específico y la

productividad de las AGPs en las concentraciones de 87.6 y 131.4 mM, por lo que no se pudo

discernir si dicho efecto en la secreción de las AGPs fue en respuesta a un efecto nutricional u

osmótico dado por el incremento de la sacarosa.

Los azúcares no solo funcionan como fuente metabólica y constituyente estructural de las

células, también actúan como importantes reguladores del varios procesos asociados al

crecimiento y desarrollo vegetal (Koch, 1996). La sacarosa puede actuar como un agente de

estrés osmótico y servir como una fuente vital de carbono y de energía. Un incremento del

potencial osmótico con azúcares no metabolizables (el manitol y el sorbitol) y el PEG han


45

mejorado la acumulación de polisacáridos en suspensiones celulares de P. notoginseng (Zhang

et al., 1995).

En el presente trabajo, se evaluó el efecto del estrés osmótico en la secreción de las AGPs

en suspensiones celulares de B. vulgaris elevando el potencial osmótico del medio de cultivo

mediante la adición de polioles (manitol y sorbitol), NaCl y PEG.


Cultivo de células de B. vulgaris

Las células de B. vulgaris fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer (500 mL) con 100

mL de medio de cultivo y mantenidas bajo las condiciones de incubación indicadas en el

capítulo 2.

Para los experimentos se utilizaron matraces Erlenmeyer de 125 mL con 30 mL de medio

cultivo B5 suplementado con 43.8 mM de sacarosa (15 g L-1

), inoculados con 0.8 g de células

(base húmeda) de 7 días de edad. Se realizaron tres experimentos independientes y se retiraron

tres matraces cada 2 o 3 días para realizar las determinaciones de crecimiento celular y la

cantidad de AGPs secretadas hacia el medio de cultivo. Los resultados son el promedio de 9

muestras ± el error estándar (E.E).

Efecto osmótico

La condición de estrés osmótico se generó en suspensiones celulares de 7 días de edad.

Para ello, se elevó el potencial osmótico del medio de cultivo de 23.78 mOsm kg-1

(equivalente a 21.74 mM de sacarosa residual en el día 7) a 95.97 mOsm kg-1

(equivalente a

87.6 mM de sacarosa) adicionando de manera independiente varios compuestos: sacarosa,

manitol, sorbitol, NaCl y PEG-4000 (Cuadro 3). Todos ellos, previamente esterilizados

mediante autoclave. Como control se utilizaron los cultivos con 43.8 mM de sacarosa y sin


46

adición de los compuestos arriba señalados. Los resultados obtenidos son el promedio de 9

muestras ± el error estándar (E.E).

Cuadro 3. Sustancias utilizadas para llevar el potencial osmótico a 95.97 mOsm kg-1

, en 30

mL de medio de cultivo en suspensiones celulares de Beta vulgaris de 7 días de edad.

Sustancias

Utilizadas

Concentración madre

(M)

Volumen adicionado

(mL)

Concentración final

(mM)

Sacarosa 0.584 3.384 65.91

Manitol 1.098 1.985 72.62

Sorbitol 1.098 1.985 72.62

NaCl 3.422 0.318 36.34

PEG 4000 0.050 8.722 14.54

El potencial osmótico dado por la sacarosa fue calculado mediante la ecuación de Van’t

Hoff reportada por de Paiva Neto y Otoni (2003)

(1) iCRTψ

Donde ψ es el potencial osmótico (MPa), i es el índice de disociación (1.095 para

sacarosa, 1 para manitol y sorbitol, 2 para el NaCl), C es la concentración molar (mol L-1

), R

es la constante universal de los gases (0.00831 L MPa mol-1

K-1

); y T es la temperatura (K).

El potencial osmótico fue convertido en unidades de osmolalidad utilizando el factor de

conversión reportado por George et al. (2008): 1 mOsm kg-1

= 2.4789 MPa.


Biomasa

El crecimiento celular se evaluó por la determinación del peso en seco (PS), descrito en el

capítulo 2.


47

Determinación de azúcares residuales

La concentración de azúcar residual fue determinada mediante el método fenol-sulfúrico

reportado por Dubois et al. (1956), utilizando sacarosa como estándar (Figura 16).

y = 0.0088x - 0.0302

R² = 0.9967

µg Sacarosa

0 50 100 150 200

Asb

49

0 n

m

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Figura 16. Curva tipo de sacarosa para la cuantificación de azúcares residuales por el

método fenol-sulfúrico. Las barras de error representan el E.E. (n=3).

Cuantificación de las AGPs en el medio de cultivo

La cantidad de AGPs del medio de cultivo (MC) fue cuantificada mediante el test de

difusión radial en agarosa descrito por van Holst y Clarke (1985) y detallado en el capítulo 2.

El rendimiento específico de AGPs (YAGPs/X) se calculó de acuerdo a la ecuación (2)

detallada en el capítulo 2.


A los datos de los parámetros cinéticos con las diferentes sustancias alimentadas para

elevar el potencial osmótico se les realizó un análisis de varianza ANOVA simple para

medidas repetidas y la comparación de medias fue realizada con una prueba de Tukey

(p<0.05) utilizando el programa SigmaStat v3.5.


48

RESULTADOS

Efecto de la sacarosa y de azúcares no metabolizables en el crecimiento celular y la

secreción de AGPs

La Figura 17 muestra las cinéticas de crecimiento celular y de azúcar residual de las

suspensiones celulares de B. vulgaris expuestas a un incremento del potencial osmótico con

sacarosa, manitol y sorbitol.

Los cultivos alimentados con sacarosa mostraron un aumento de 2 veces en la biomasa,

alcanzando un máximo de 21.56 g L-1

. En contraste, los cultivos tratados con manitol y

sorbitol alcanzaron una biomasa máxima de 11.17 g L-1

, valor similar al crecimiento que se

observó en el cultivo no alimentado (10.62 g L-1

) (Figura 17A).

Los azúcares residuales permanecieron alrededor de 12 g L-1

después de 18 días de cultivo

en los tratamientos con manitol y sorbitol, confirmando que estos azúcares no son

metabolizables en las suspensiones celulares, mientras que las células alimentadas con

sacarosa, mostraron un consumo total del carbohidrato (Figura 17B).


49

Bio

ma

sa (

g L

-1)

0

5

10

15

20

25

Control

Sacarosa

Manitol

Sorbitol

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Azú

car

resi

du

al

(g L

-1)

0

5

10

15

20

25

30Control

Sacarosa

Manitol

Sorbitol

A

B

Figura 17. Cinéticas de crecimiento celular (A) y de azúcar residual (B) de células de Beta

vulgaris alimentadas con sacarosa, manitol y sorbitol. La flecha indica el día 7 del cultivo, en

el cual se elevó el potencial osmotico a 95.97 mOsm kg-1

. Las barras de error representan el

E.E. (n=9).

La Figura 18 muestra las cinéticas de acumulación de AGPs y de rendimiento específico

(YAGPs/X). La secreción de AGPs en los cultivos alimentados con sacarosa fue de 78.24 mg L-1

,

mientras que los cultivos alimentados con manitol o sorbitol secretaron 84.19 mg AGPs L-1

.

Esto indica que las células alimentadas secretaron 6 veces más AGPs, en relación al cultivo no

alimentado que secretó 13.91 mg AGPs L-1

(Figura 18A).


50

En los cultivos alimentados con sacarosa se observó un aumento de 3 veces en el YAGPs/X

(4.51 mg g-1

PS). Mientras que con manitol y sorbitol se alcanzó un YAGPs/X de 9.20 mg g-1

PS, es decir 6 veces más al alcanzado con el cultivo no alimentado que fue de 1.52 mg g-1

PS

(Figura 18B).

AG

Ps

(mg

L-1

)

0

20

40

60

80 Control

Sacarosa

Manitol

Sorbitol

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

YA

GP

s/X

(m

g g

-1 P

S)

0

2

4

6

8

10

12

A

B

Control

Sacarosa

Manitol

Sorbitol

Figura 18. Cinéticas de secreción (A) y de rendimiento específico de AGPs (B) de células de

Beta vulgaris alimentadas con sacarosa, manitol y sorbitol. La flecha indica el día 7 del

cultivo, en el cual se elevó el potencial osmotico a 95.97 mOsm kg-1

. Las barras de error

representan el E.E. (n=9).


51

Efecto del PEG y el NaCl en el crecimiento celular y la secreción de AGPs

Para confirmar el efecto del potencial osmótico dado por los azúcares no metabolizables

en la secreción de las AGPs, se analizó el efecto del potencial osmótico generado por otras

sustancias químicas tales como el PEG-4000 y el NaCl.

La Figura 19 muestra el comportamiento de crecimiento celular y del azúcar residual de

los cultivos suplementados con PEG y NaCl. En los cultivos tratados con el PEG, que es un

agente osmótico no permeablizante, el crecimiento celular fue similar al del cultivo no

alimentado, alcanzando una biomasa máxima de 10.43 g L-1

(Figura 19A). El comportamiento

de los azúcares residuales también fue similar al cultivo no alimentado. En ambos casos se

observó un agotamiento de la disponibilidad de la fuente de carbono (Figura 19B).

Las células alimentadas con NaCl, disminuyeron 1.9 veces su crecimiento en relación al

cultivo control (10.62 g L-1

), alcanzando una biomasa máxima de 9.74 g L-1

(Figura 19A). El

contenido de azúcares residuales fue de 2.3 g L-1

en los cultivos con NaCl, mientras que en el

cultivo no alimentado se agotaron los azúcares (Figura 19B).


52

Bio

ma

sa (

g L

-1)

0

2

4

6

8

10

12

Control

NaCl

PEG

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Azú

ca

r r

esi

du

al

(g L

-1)

0

5

10

15

Control NaCl PEG

A

B

Figura 19. Cinéticas de crecimiento celular (A) y de azúcar residual (B) de los cultivos Beta

vulgaris alimentados con NaCl y polietilenglicol (PEG). La flecha indica el día 7 del cultivo,

en el cual se elevó el potencial osmotico a 95.97 mOsm kg-1

. Las barras de error representan el

promedio ± E.E. (n=9).

La Figura 20 muestra el comportamiento de la secreción y del rendimiento específico de

las AGPs. La máxima secreción de AGPs en los cultivos tratados con PEG fue de 64.70 mg

L-1

, es decir 4.65 veces mayor a la encontrada en el cultivo sin alimentación (13.91 mg L-1

)

(Figura 20A). Por otro lado, se observó un aumento de 6 veces en el YAGPs/X (9.15 mg g-1

PS)

con respecto al cultivo no alimentado (1.52 mg g-1

PS) (Figura 20B). Estos resultados sugieren

que el incremento en la secreción de las AGPs fue provocado por un estrés osmótico.


53

Los cultivos alimentados con NaCl, secretaron un máximo de 103.83 mg L-1

de AGPs, lo

cual fue 7.46 veces mayor con respecto al control (13.91 mg L-1

) (Figura 20A). Esto

correspondió a un aumento de 11.34 veces en el YAGPs/X, que fue de 17.23 mg g-1

PS, mientras

que el cultivo no alimentado fue de 1.52 mg g-1

PS (Figura 20B).

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

YA

GP

s/X

(m

g g

-1 P

S)

0

5

10

15

AG

Ps

(mg

L-1

)

0

20

40

60

80

100Control

NaCl

PEG

A

B

Control

NaCl

PEG

Figura 20. Cinéticas de secreción (A) y de rendimiento específico de AGPs (B) de células de

Beta vulgaris alimentadas con NaCl y polietilenglicol (PEG). La flecha indica el día 7 del

cultivo, en el cual se elevó el potencial osmotico a 95.97 mOsm kg-1

. Las barras de error

representan el E.E. (n=9).

En el cuadro 4 se resumen las principales variables determinadas en los tratamientos

utilizados.


54

Cuadro 4. Efecto del aumento del potencial osmótico a 95.97 mOsm kg-1

en la biomasa

máxima (X), secreción máxima de AGPs (AGPs) y rendimiento máximo de AGPs (YAGPs/X)

en suspensiones celulares de Beta vulgaris.

Tratamiento X

(g L-1

)

AGPs

(mg L-1

)

YAGPs/X

(mg g-1

)

*Control 10.62 ± 0.21a 13.91 ± 0.28

a 1.52 ± 0.15

a

Sacarosa 21.56 ± 0.36b 78.24 ± 2.32

b 4.51 ± 0.32

b

Manitol 11.17 ± 0.81a 84.19 ± 0.30

c 9.20 ± 0.30

c

Sorbitol 11.15 ± 0.84a 84.16 ± 0.25

c 9.18 ± 0.34

c

PEG 10.43 ± 0.89a 64.69 ± 0.10

d 9.15 ± 0.30

c

NaCl 10.62 ± 0.17c 103.83 ± 1.07

e 17.23 ± 0.42

d

*Control: cultivo no alimentado.



DISCUSIÓN

Debido a que el manitol y el sorbitol son azúcares no metabolizables, no fueron utilizados

para el crecimiento celular de B. vulgaris (Figura 17). Sin embargo, la secreción de AGPs se

estimuló 6 veces en relación al del cultivo no alimentado (Figura 18 A). Cuando los cultivos

de B. vulgaris fueron tratados con el PEG que es agente no permeabilizante, no se observaron

cambios en el crecimiento celular (Figura 19A), pero si un incremento de 4.65 veces en la

secreción de AGPs (Figura 20A). Mientras que el rendimiento específico de AGPs (YAGPs/X)

fue favorecido de forma similar a lo observado con los azúcares no metabolizables (Figura

20B). Estos resultados sugieren que la secreción de AGPs fue parte de la respuesta osmótica

de las células de B. vulgaris. De igual manera, Iraki et al. (1989a) observaron que el

crecimiento de células de N. tabacum tratadas con PEG fue similar al del cultivo sin

tratamiento. Sin embargo, la secreción de polisacáridos extracelulares conteniendo una

pequeña cantidad de AGP (<17kDa) se redujo en presencia de PEG y fue consistente con la

restricción de la porosidad de la pared celular. Los autores señalan que esto probablemente fue

debido a un efecto detergente del PEG más que un resultado de la disminución del potencial

acuoso del medio o a una inhibición específica del metabolismo.


55

En el caso de la adición de NaCl se observó un incrementó en la secreción y el

rendimiento especifico de las AGPs, sin embargo el crecimiento celular disminuyó (Figuras

19A y 20). Las AGPs secretadas pueden estar relacionadas a la repuesta de adaptación al

estrés impuesto por el NaCl. Lamport et al. (2006) y Zagorchev et al. (2008) también

observaron que el estrés salino favoreció la secreción de AGPs en suspensiones de N. tabacum

y de Dactylis glomerata L.

La secreción de AGPs en repuesta al estrés osmótico puede estar relacionada con el

mantenimiento de la homeóstasis celular. Iraki et al. 1989(a) y Zhu et al. 1993 señalaron que

las células de N. tabacum se adaptaron rápidamente al estrés inducido por sal, aumentando su

concentración de sales en las vacuolas, conllevando a un incremento en la presión de turgencia

varias veces más alto que las células no adaptadas al estrés salino. Mientras que, Lamport et

al. (2006) mostraron que en suspensiones de N. tabacum no adaptadas, el tiempo de residencia

de las AGPs enlazadas a la membrana celular fue 10 veces mayor que el encontrado en las

células adaptadas al NaCl. Lo cual llevo a sugerir que un tiempo de residencia corto de las

AGPs en la membrana plasmática es consistente con una mayor velocidad de secreción de las

AGPs al medio de cultivo. Así mismo los autores propusieron dos posibles funciones de las

AGPs secretadas en las suspensiones celulares de N. tabacum expuestas a estrés salino. En

primer lugar, las AGPs pueden actuar como un amortiguador periplásmico para la

estabilización de la interfase entre la membrana plasmática y la pared celular, de las células

sometidas a alta presión hidrostática interna. Otro postulado implica que las AGPs actúan

como moléculas plastificantes en la red de pectinas, con lo que se aumentaría la porosidad de

la pared celular mediante el relajamiento de las pectinas.

En este trabajo se desconoce si las AGPs que se secretan al medio de cultivo son del tipo

clásicas, pero la liberación de éste tipo de AGPs podría estar regulado por estrés osmótico. Las

AGPs clásicas presentan en el dominio C-terminal una señal para la unión de un grupo

glicosilfosfatidilinositol, el cual permite su anclaje a la membrana plasmática (Youl et al.,

1998). Las AGPs clásicas de la superficie celular, pueden ser secretadas al espacio extracelular

a través de la acción de una fosfolipasa C o D activadas probablemente por estrés osmótico

(DrØbak y Watkins, 2000; Munnik et al., 2000). Esta liberación de las AGP ancladas a la


56

superficie celular podría ser un mecanismo para regular la cantidad de las AGPs en la

superficie celular o su secreción dentro de la matriz extracelular, donde actuarían como una

señal soluble para las células vecinas (Schultz et al., 1998).

En conclusión, los cultivos celulares de B. vulgaris secretaron AGPs en repuesta al estrés

osmótico dado por el manitol, sorbitol, PEG y NaCl.

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CAPÍTULO 4. RELACIÓN DE LAS AGPs Y LA AGREGACIÓN CELULAR EN

SUSPENSIONES DE Beta vulgaris L.

INTRODUCCIÓN

Los cultivos de células vegetales están formados por células meristemáticas, es decir

células no diferenciadas, que no se separan después de la división y forman agregados

multicelulares de diferente tamaño y forma (Meyer et al., 2002). Los agregados pueden incluir

hasta 100 células, tener diámetros milimétricos y tienden a sedimentar (Kieran et al., 1997). El

fenómeno de agregación es común en las células vegetales y la secreción de polisacáridos

extracelulares, especialmente en las últimas etapas del crecimiento puede contribuir a su

aumento (Taticek et al., 1991, Kolewe et al., 2010).

Los patrones de formación de agregados varían dependiendo de la línea celular, la edad

del cultivo y las condiciones de cultivo; por lo cual, cualquier cambio en dichos patrones

puede ser un indicativo de las variaciones del cultivo como respuesta a factores ambientales

(Kieran et al., 1997). En general, la formación de agregados celulares promueve la

organización y la diferenciación celular que resulta en una mejor producción de metabolitos

secundarios. La agregación celular también puede afectar la transferencia de masa del

oxígeno, de nutrientes o de inductores químicos importantes para el crecimiento de los

cultivos de células (Kieran et al., 2000; Trejo-Tapia y Rodríguez Monroy, 2007; Kolewe et al.,

2010). El fenómeno de agregación es uno de los factores limitante en el escalamiento de los

procesos, ya que juega un papel importante en el diseño del reactor, escalado y separación

(Hsu et al., 1993). Por lo cual, es importante conocer los factores biológicos y químicos

involucrados en la formación de los agregados celulares.

En el caso de las células vegetales en suspensión, se conoce que durante su cultivo,

secretan una matriz de polisacáridos y de proteínas hacia el medio extracelular que son

similares a las que forman la pared celular. Así las xiloglucanas (Bauer et al., 1973, Hayashi et

Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.

_________________________________________________________________________

59

al., 1986), arabinoxilanas y galacturonanas (Webster et al., 2008) y, las proteínas

arabinogalactanas (AGPs), han sido identificadas en el medio de cultivo (Langan y Nothnagel,

1997; Darjania et al., 2002; Lamport et al., 2006; Hernández, 2007).

En particular, las AGPs están codificadas por una gran familia de genes en las

angiospermas y pueden desempeñar múltiples funciones en el desarrollo de plantas, tales

como en el crecimiento y el desarrollo vegetal y en la adhesión célula-célula (Majewska-

Sawka y Nothnagel, 2000, Showalter, 2001). Johnson et al. (2003) reportaron que las AGPs

tipo fasciclinas (FLAs) tienen, además de las regiones glicosiladas, supuestos dominios de

adhesión celular conocidos como dominios fasciclina. La precipitación de las FLAs con el

reactivo de Yariv, indica que ellas comparten características estructurales con las AGPs

(Johnson et al., 2003). Debido a que las AGPs están preferencialmente localizadas en el lado

exterior del plasmalema, se sugiere que las AGPs pueden interactuar con los componentes de

la pared celular, principalmente con pectinas y proveer la inserción del plasmalema a la pared

celular (Carpita y Gibeaut, 1993). Sin embargo, son escasos los estudios que muestran la

relación de las AGPs con el proceso de agregación celular que ocurre en los cultivos de células

vegetales.

La glicosilación proteica es importante para el correcto plegamiento, la estabilidad de la

conformación y la actividad biológica de las proteínas, y para la protección contra la

degradación proteolítica (Martínez y Chrispeels, 2003; Mitra et al., 2006). La tunicamicina

(TM) es un antibiótico que se utiliza para modular el proceso de glicosilación. La TM inhibe

la UDP-N-acetil-D-glucosamina: fosfato de dolicol N-acetil-D-glucosamina-1-fosfato

transferasa (GPT), la enzima que transfiere la primera N-acetil-D-glucosamina al dolicol

fosfato (Koizumi et al., 1999). Hori y Elbein (1981) reportaron que la TM inhibió la síntesis

de oligosacáridos unidos a lípidos y la incorporación de [3H] manosa en la pared celular y en

las macromoléculas extracelulares en suspensiones celulares de Glycine max L. También la

TM afectó la adhesión célula-célula en el moho de limo, Polysphondylium pallidum (Nakata y

Ochiai, 1996). Por otro lado, Borderies et al. (2004), mostraron que la adición de AGPs en el

medio de cultivo de embriones somáticos de Zea mays L. revierte el efecto de inhibición


_________________________________________________________________________

60

causado por la TM en el desarrollo de los embriones. Lo cual indicó que la glicosilación de

las AGPs es necesaria para que estas moléculas puedan inducir el desarrollo de los embriones.

Por otra parte, el reactivo de Yariv (Yariv et al., 1962), que se une selectivamente a las

AGPs, es usado para conocer algunas de las funciones de las AGPs. La formación del

precipitado AGP-Yariv es una manera de inactivar a las AGPs en el cultivo de células

vegetales, que conlleva a conocer la repercusión de su ausencia en los procesos biológicos

importantes como es la diferenciación y el crecimiento vegetal (Serpe y Nothnagel, 1994;

Willats y Knox, 1996; Showalter, 2001; Guan y Nothnagel, 2004).

Las células de Beta vulgaris L. son de forma esférica con diámetros alrededor de 20 μm y

pueden crecer en forma de agregados de 200 - 500 μm, tanto en cultivos desarrollados en

matraces como en biorreactor (Rodríguez-Monroy y Galindo, 1999). Los agregados celulares

de B. vulgaris, cambian su tamaño a lo largo del tiempo de cultivo, alcanzando su máximo

tamaño durante la fase exponencial, pero disminuyen su tamaño en la fase estacionaria

(Jiménez, 2005). Una tendencia a la agregación fue observada como un efecto del aumento de

la concentración inicial de sacarosa. Y este fenómeno coincidió con la mayor secreción de

AGPs, sugiriendo un posible papel de la AGPs como moléculas de adhesión celular

(resultados del Capítulo 2). Por lo cual, podrían ser un modelo de estudio para conocer la

relación de las AGPs con la formación de los agregados en cultivos de células vegetales.

En este estudio, a través del uso de la TM y del reactivo de Yariv se evaluó el efecto de

reducir el contenido de las AGPs sobre el crecimiento y los perfiles de agregación celular de

las suspensiones celulares de B. vulgaris.


_________________________________________________________________________

61


Cultivo de células de B. vulgaris

Las células de B. vulgaris fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer (500 mL) con 100

mL de medio de cultivo y mantenidas bajo las condiciones de incubación indicadas en el

capítulo 2.

Para los experimentos se utilizaron matraces Erlenmeyer de 125 mL con 30 mL de medio

de cultivo B5 suplementado con 131.4 mM de sacarosa (45 g L-1

), inoculados con 0.8 g de

células (base húmeda) de 7 días de edad. Se realizaron dos experimentos independientes y se

retiraron tres matraces cada 2 o 3 días para realizar las determinaciones de crecimiento celular,

distribución del tamaño de los agregados y el contenido de AGPs en la pared y en el medio de

cultivo. Los resultados son el promedio de 6 muestras ± el error estándar (E.E).

Tratamiento con tunicamicina

Las suspensiones de 5 días de edad fueron tratadas con tunicamicina (TM) (Sigma), un

agente conocido por prevenir la glicosilación proteica (Koizumi et al., 1999). Se adicionaron

60 L de una solución stock de TM a 60.56 µM preparada en buffer de fosfato de sodio (BF)

10 mM en agua (pH 10.5) y esterilizada mediante filtración, para alcanzar una concentración

final de 1.21 µM. Se tomaron muestras durante 3 días, mientras las células estuvieron en

contacto con el inhibidor para evaluar el crecimiento, el contenido de AGPs y la distribución

del tamaño de los agregados.

Después de la exposición a TM, los cultivos se lavaron dos veces con medio fresco,

utilizado para el crecimiento de las células. En el primer lavado bajo condiciones de

esterilidad, el medio de cultivo conteniendo el inhibidor fue retirado por decantación y se

agregaron 50 mL de medio de cultivo fresco. Posteriormente, el cultivo se colocó en agitación

orbital a 120 rpm por 30 min. Pasado este tiempo se procedió a eliminar nuevamente por

decantación el medio de cultivo y se adicionaron 50 mL de medio fresco, se agitó ligeramente

y el contenido del matraz se filtró con un tamiz.


_________________________________________________________________________

62

Las células filtradas fueron transferidas a un matraz de 125 mL, conteniendo 30 mL de

medio fresco de cultivo. Las condiciones de crecimiento del cultivo fueron 25 ºC ± 2 °C,

fotoperiodo de 16 h luz/8 h oscuridad y agitación a 120 rpm. Se tomaron las muestras en los

días 1, 3, 5 y 7 posteriores al tratamiento para evaluar el crecimiento, el contenido de AGPs y

la distribución del tamaño de agregados. Como controles se utilizaron los cultivos sin TM

(control positivo) y con BF (control negativo), los cuales fueron sometidos a todo el

procedimiento anterior. Los resultados son el promedio de 6 muestras ± el error estándar

(E.E).

Tratamiento con el reactivo de Yariv

Las suspensiones celulares de B. vulgaris de 5 días de edad fueron tratadas con el reactivo

de Yariv (Biosupplies Australia Pty, Ltd.), el cual se enlaza a las AGPs (Yariv et al., 1962). Se

adicionaron 576 L de una solución de reactivo de Yariv a 1041.67 M, previamente

esterilizada mediante autoclave, para alcanzar una concentración final de 20 M. Las muestras

para los análisis fueron tomadas diariamente durante el tratamiento con el inhibidor (3 días).

El reactivo de Yariv fue retirado de los cultivos de forma similar a la descrita para el

tratamiento con TM. Se tomaron muestras en los días 1, 3, 5 y 7 después de retirar el

inhibidor. Los cultivos celulares sin reactivo de Yariv (control positivo) y con un análogo del

reactivo de Yariv, el (β-D-manosil)3, fenilglicósido Yariv (β-D-ManY)3 (control negativo), que

no se enlaza a las AGPs; fueron utilizados como controles. Los resultados son el promedio de

6 muestras ± el error estándar (E.E).


Biomasa

El crecimiento celular se evaluó por la determinación del peso en seco (PS), descrito en el

capítulo 2.


_________________________________________________________________________

63

Viabilidad celular

La integridad de la membrana fue medida mediante el test de exclusión del colorante de

azul de Evans según la metodología reportada por Rodríguez-Monroy y Galindo (1999) y

descrita en el capítulo 2.


La distribución del tamaño de los agregados fue determinada según la metodología

reportada por Trejo-Tapia et al. (2003). Se utilizó un tamiz metálico con luz de malla de

tamaño estándar: 500 µm, que permitió la separación de la población de células en dos

fracciones: <500 y >500 µm. Una muestra de 20 mL de suspensión celular se pasó suavemente

a través del tamiz de 500 µm y se lavó tres o cuatro veces con agua desionizada. Las células y

los agregados retenidos (fracción >500 µm) y que pasaron a través del tamiz (fracción <500

µm) se recolectaron por filtración en un papel Whatman No. 1 previamente pesado. Las

células y agregados de células de cada una de las fracciones fueron sometidas a análisis de

peso seco, a fin de obtener la distribución de la fracciones en términos de los porcentajes de

peso seco.

Cuantificación de las AGPs de la fracción de la pared celular

La fracción de la pared celular (PC) de B. vulgaris fue obtenida mediante el método

reportado por Lamport et al. 2006. Las células fueron removidas del medio de cultivo

mediante filtración a través de un filtro Whatman No. 1 y se lavaron rápidamente con NaCl al

1% para eliminar macromoléculas débilmente unidas. Alícuotas de células (30-100 ±0.2 mg de

peso fresco) fueron transferidas a microtubos de 2 mL y las células fueron rotas mediante

sonicación en 1 mL de NaCl al 1% (frío), a 40 kHz a 150 Watts por 60 s (Bransonic Ultrasonic

cleaner, modelo 2510, Lorain Road Cleveland, USA). Los precipitados de pared celular fueron

recuperados mediante centrifugación a 1000 g por 10 min, se lavaron y centrifugaron 10


_________________________________________________________________________

64

veces con NaCl al 2% y agua destilada para obtener las fracciones de la pared celular. Después

de cada lavado, se descartó el sobrenadante.

Las AGPs de la PC fueron cuantificadas mediante el ensayo de colorimetría con el

reactivo de Yariv. Para esto, los pellets obtenidos fueron incubados con 200 µg del reactivo de

Yariv por una hora en 750 L de NaCl al 1% a temperatura ambiente, o con el (β-D-ManY)3,

como control. El reactivo de Yariv no permeabiliza la membrana plasmática intacta, pero se

asocia específicamente con las arabinogalactanas de las cadenas laterales de las AGPs de la

superficie celular formando un complejo AGPs-Yariv insoluble en sal, que se disocia

rápidamente en 0.02 M NaOH acuoso (Jermyn y Yeow, 1975). Luego se le adicionó 1 mL de

NaOH 20 mM al complejo AGPs-Yariv, y la absorbancia fue medida a = 457 nm (Lamport

et al., 2006). Para calcular el contenido de AGPs en las muestras de pared celular, se realizó una

curva estándar (Figura 4.1). Las unidades de absorción fueron convertidas a µg de AGPs de

B. vulgaris utilizando un factor de corrección de 1.61, el cual fue obtenido a partir de la

absorbancia de 20 µg de AGPs de goma arábiga (0.798 AU) y de 20 µg de AGPs del medio de

cultivo de B. vulgaris (0.495 AU).

y = 0.004x - 0.045

R² = 0.995

mg células frescas

0 20 40 60 80 100

AG

Ps

de

pared

cel

ula

r (A

U)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

Figura 21. Curva tipo para la cuantificación de las AGPs de pared celular por el método

colorímetrico. Las barras de error representan el E.E. (n=3).


_________________________________________________________________________

65

Cuantificación de las AGPs en el medio de cultivo

La cantidad de AGPs del medio de cultivo (MC) fue cuantificada mediante el test de

difusión radial en agarosa descrito por van Holst y Clarke (1985) y detallado en el capítulo 2.


Se realizó un análisis de varianza ANOVA simple para medidas repetidas y la comparación

de medias fue realizada con una prueba de Tukey realizado con el programa SigmaStat v3.5

para los datos de los cuadros 5, 6 y 7.

RESULTADOS

Crecimiento celular de las suspensiones celulares de B. vulgaris

La Figura 22A muestra la cinética de crecimiento celular de B. vulgaris sin inhibidor, en

donde se observa que no hay una fase de adaptación celular. Las células crecieron de forma

lineal hasta el día 13 del cultivo, con una velocidad de crecimiento de μ = 0.13 días-1

y un

tiempo de duplicación de 5.3 días, alcanzando una biomasa máxima de 23.82 g L-1

a los 15

días del cultivo (Cuadro 5).

El crecimiento celular de B. vulgaris fue reducido durante la exposición a TM (Figura

22B). A los tres días de exposición con TM (día 8 de crecimiento) el cultivo alcanzó una

biomasa de 7.09 g L-1

; mientras que en los cultivos controles, la biomasa fue de 12.03 g L-1

(Cuadro 5). Esto indica que hay una reducción del 42 % en el crecimiento de los cultivos en

presencia de TM. Sin embargo, la viabilidad celular no fue afectada por la presencia del

inhibidor, ya que con TM la viabilidad (75.6 %) fue muy similar a la encontrada en los

controles (70 a 80%).

Después de la exposición a TM, las células de B. vulgaris fueron transferidas a medio de

cultivo fresco y crecidas durante 7 días (hasta el día 15 de la cinética del cultivo). Los cultivos


_________________________________________________________________________

66

tratados con TM presentaron una recuperación del crecimiento celular alcanzando una

biomasa de 19.75 g L-1

hacia el final del cultivo. Sin embargo fue menor a la encontrada en los

cultivos control (sin TM, 23.45 g L-1

) (Cuadro 5).

En la Figura 22C se muestra el crecimiento de los cultivos al ser expuestos al reactivo de

Yariv durante tres días del cultivo. El tratamiento con éste reactivo provocó un menor

crecimiento de los cultivos comparados con el control, (β-D-ManY)3. Este efecto es más

evidente al tercer día de exposición con el reactivo de Yariv. En el día 8, el crecimiento de los

cultivos con tratamiento fue de 5.52 g L-1

, mientras que el de los controles (β-D-ManY)3 fue de

11.96 g L-1

. Esto indica que hubo una reducción del 55 % en el crecimiento de los cultivos en

presencia del reactivo de Yariv. Después de retirar el reactivo de Yariv los cultivos de B.

vulgaris, no recuperaron su crecimiento; mientras que los cultivos controles (con (β-D-

ManY)3) alcanzaron una biomasa máxima para el día 15 de 23.29 g L-1

(Cuadro 5).


_________________________________________________________________________

67

0

5

10

15

20

25

Control

Bio

ma

sa (

g L

-1)

0

5

10

15

20

25 TM (-)

TM (+)

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

5

10

15

20

25 Yariv (-)

Yariv (+)

A

B

C Tiempo de

exposición

Tiempo de

exposición

Figura 22. Cinética de crecimiento celular de las suspensiones de Beta vulgaris tratadas con

tunicamicina (B) y el reactivo de Yariv (C). Control (A), células sin inhibidores; TM (-), con

buffer fosfato (BF); TM (+), con tunicamicina; Yariv (-), (β-D-ManY)3; Yariv (+), con

reactivo de Yariv. Las barras de error representan el E.E. (n=6).


_________________________________________________________________________

68

Cuadro 5. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en la biomasa de las

suspensiones celulares de Beta vulgaris.

Tratamiento Biomasa (g L-1

)

Día 8

† Día 15

Control 12.15 ± 0.47a 23.82 ± 0.45

a

TM (-) 12.08 ± 0.44a 24.45 ± 0.47

a

TM (+) 7.09 ± 0.54b 19.75 ± 0.55

b

Yariv (-) 11.96 ± 0.34a 23.29 ± 0.48

a

Yariv (+) 5.52± 0.27c 5.51 ± 0.18

c

† 3 días después del tratamiento.



Contenido de AGPs en la pared celular y en el medio de cultivo de células de B. vulgaris.

La Fig. 23A muestra los perfiles del contenido de AGPs en la fracción de pared celular

(PC) y la secretada al medio de cultivo (MC) de B. vulgaris. La concentración de AGPs de la

PC se incrementó durante el tiempo del cultivo, alcanzando en el día 15 una concentración de

0.33 mg AGPs g-1

de células secas (Cuadro 6). Sin embargo, los niveles de AGPs fueron más

altos en el MC con una concentración máxima de 1.53 mg g-1

. Estos resultados sugieren que la

mayor parte de las AGPs de B. vulgaris son secretadas al medio de cultivo durante el

crecimiento del cultivo.

La exposición por tres días con el inhibidor TM, causó que los cultivos de B. vulgaris

presentaran una reducción del contenido de las AGPs tanto en la PC como en el MC (Figura

23B). En el día 8 del cultivo, los contenidos de las AGPs en la PC y en el MC fue de 0.085 mg

g-1

y de 0.34 mg g-1

, respectivamente. Mientras que los controles (con BF) presentaron

contenidos de AGPs de 0.16 mg g-1

y de 0.95 mg g-1

en la fracción de PC y del MC,

respectivamente (Cuadro 6). Sin embargo, después de eliminar el inhibidor, las suspensiones

de B. vulgaris presentaron nuevamente una tendencia a incrementar el contenido de las AGPs

tanto en la fracción de la PC como las secretadas al MC. En el día 15 del cultivo, el contenido


_________________________________________________________________________

69

de AGPs en la PC y en el MC con TM fueron de 0.27 mg g-1

y de 1.12 mg g-1

,

respectivamente (Cuadro 6).

La Figura 23C muestra los resultados del contenido de AGP en la fracción de PC y las

secretadas hacia el MC cuando los cultivos fueron tratados con el reactivo de Yariv. El

contenido de las AGPs enlazadas a la PC disminuyó considerablemente con el tiempo de

exposición al reactivo de Yariv. Para el día 8, se encontró una reducción hasta del 62% de las

AGPs de la PC en comparación a los cultivos control tratados con (β-D-GlcM)3. La secreción

de las AGPs al MC fue inhibida hasta en un 99% en los cultivos tratados con el reactivo de

Yariv. Después del contacto de las células con el reactivo de Yariv, las células transferidas

nuevamente a medio fresco no recuperaron su capacidad para acumular AGPs tanto en la

fracción de PC como en el MC (Cuadro 6).


_________________________________________________________________________

70

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

PC Control

MC Control

AG

Ps

(mg

g-1

PS

)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6PC TM (-)

MC TM (-)

PC TM (+)

MC TM (+)

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

PC Yariv (-)

MC Yariv (-)

PC Yariv (+)

MC Yariv (+)

Tiempo de

exposición

Tiempo de

exposición

B

A

C

Figura 23. Contenido de AGPs en las suspensiones de Beta vulgaris tratadas con tunicamicina

(B) y el reactivo de Yariv (C). Control (A), células sin inhibidores; TM (-), con buffer fosfato

(BF); TM (+), con tunicamicina; Yariv (-), (β-D-ManY)3; Yariv (+), con reactivo de Yariv.

Las barras de error representan el E.E. (n=6).


_________________________________________________________________________

71

Cuadro 6. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en el contenido de AGPs de la

pared (PC) y del medio de cultivo (MC) de Beta vulgaris.

Tratamiento AGPs en la PC (mg g-1

) AGPs en el MC (mg g-1

)

Día 8† Día 15 Día 8

† Día 15

Control 0.160 ± 0.017a 0.330 ± 0.015

a 0.962 ± 0.008

a 1.534 ± 0.013

a

TM (-) 0.158 ± 0.015a 0.325 ± 0.017

a 0.957 ± 0.009

a 1.532 ± 0.017

a

TM (+) 0.085 ± 0.018b 0.273 ± 0.014

b 0.344 ± 0.008

b 1.124 ± 0.012

b

Yariv (-) 0.157 ± 0.009a 0.323 ± 0.013

a 0.959 ± 0.009

a 1.529± 0.013

a

Yariv (+) 0.061 ± 0.005c 0.059± 0.006

c 1.083 ± 0.007

c 0.006± 0.001

c





La distribución del tamaño de los agregados cambió a lo largo de la cinética de cultivo

(Figura 24). En el cultivo control, se observó al inicio del cultivo, que la fracción <500 µm

representó el 43.3 % del peso seco (PS); mientras que al día 15, disminuyó a un 6.8% del PS.

Por el contrario, al inicio del cultivo la fracción con agregados >500 µm fue del 56.7% y se

incrementó en el día 15 del cultivo hasta un 93.2% del PS (Cuadro 7). Estos resultados indican

que las suspensiones de B. vulgaris tienden a formar agregados más grandes conforme avanza

la cinética de crecimiento (Figuras 24A y 25A-C).

La Figura 24B muestra el perfil de distribución del tamaño de los agregados en presencia

de TM y el control respectivo (con BF); y el aspecto al estereomicroscopio de estos agregados

es mostrado en la Figura 25D-F. En el día 8 del cultivo, tiempo en el que las suspensiones

celulares habían sido tratadas con TM por tres días, se encontraron cambios en la proporción

de los agregados celulares en comparación al control. En el cultivo tratado con TM, ambas

fracciones, >500 y < 500 μm, se presentaron en una proporción similar (50%), mientras que

en el cultivo no tratado (control con BF) la fracción mayoritaria fue la de >500 μm (75.3%)

(Cuadro 7). Lo cual significa que en presencia de TM hay una disminución del tamaño de los

agregados, estos cambios son mostrados en la figuras 25D-E. Este efecto de TM fue


_________________________________________________________________________

72

reversible, ya que después de retirar el inhibidor se observó una tendencia de reiniciar la

agregación celular. En el día 15 del cultivo, la fracción de los agregados >500 μm constituyó

el 89.7% del PS de los agregados. La Figura 25F muestran el cambio del tamaño de los

agregados después de la exposición con TM.

Los resultados del tratamiento de las suspensiones celulares con el reactivo de Yariv y

como control manosil Yariv se muestran en las figuras 24C y 25G-I. Al término del

tratamiento (día 8 del cultivo), en los controles, la fracción de los agregados celulares >500

μm fue del 76.3% del peso seco. Esta fracción con el tratamiento del reactivo de Yariv se

redujo a un 36.9 %. Mientras que la fracción de los agregados de menor tamaño (<500 μm)

aumentó de 23.7% del PS a 63.1% del PS (Cuadro 7). La Figura 25H muestra la disminución

del tamaño de los agregados durante su exposición al reactivo de Yariv.

Después de retirar el reactivo de Yariv, la fracción con agregados de mayor tamaño mostró

una tendencia a disminuir con el tiempo de cultivo, alcanzando en el día 15 un valor de 16.5

%. La fracción con agregados de menor tamaño continuó aumentando con el tiempo de cultivo

y al final de la cinética representó el 83.5 % del PS (Figura 25I). Un comportamiento contrario

fue observado en los controles, donde para las fracciones de <500 μm y >500 μm

representaron el 6.8 y del 93.2 % del PS, respectivamente (Cuadro 7).


_________________________________________________________________________

73

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

20

40

60

80

100

< 500 m Yariv (+)

> 500m Yariv (-)

< 500m Yariv (+)

> 500 m Yariv (+)

Ag

reg

ad

os

(% P

S)

0

20

40

60

80

100Tiempo de

exposición

Tiempo de

exposiciónC

B0

20

40

60

80

100

< 500 m Control

> 500 m Control

A

< 500 m TM (-)

> 500 m TM (-)

< 500 m TM (+)

> 500 m TM (+)

Figura 24. Distribución de las fracciones de tamaños de agregados en las suspensiones de

Beta vulgaris expuestos a tunicamicina (B) y el reactivo de Yariv (C). Control (A), células sin

inhibidores; TM (-), con buffer fosfato (BF); TM (+), con tunicamicina; Yariv (-), con (β-D-

ManY)3; Yariv (+), con reactivo de Yariv. Las barras de error representan el E.E. (n=6).


_________________________________________________________________________

74

Cuadro 7. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en la formación de agregados de

Beta vulgaris.

Tratamiento Día 8†

Día 15

< 500 µm > 500 µm < 500 µm > 500 µm

Control 23.7 ± 1.54a 76.29 ± 2.64

a 6.79 ± 2.64

a 93.21 ± 2.49

a

TM (-) 24.7 ± 1.47a 75.30 ± 2.43

a 7.10 ± 2.42

a 92.90 ± 2.53

a

TM (+) 50.5 ± 1.48b 49.50 ± 2.61

b 10.30 ± 2.16

b 89.70 ± 2.55

b

Yariv (-) 24.20 ± 1.54a 75.80 ± 2.68

a 7.00 ± 2.36

a 93.00 ± 2.49

a

Yariv (+) 63.10 ± 1.53c 39.90 ± 2.64

c 83.50± 2.27

c 16.50 ± 2.38

c




Día 3 Día 8 Día 15

Control

TM

Reactivo de

Yariv

Figura 25. Fotomicrografías (2×) de los agregados celulares de Beta vulgaris durante la

cinética de crecimiento. Cultivo control a los 3 días del cultivo (A) a los 8 días del cultivo (B)

y a los 15 días del cultivo (C). Cultivo a los 3 días antes de agregar TM (D) y con TM por 3

días (E) y después de retirar TM a los 15 días del cultivo (F). Cultivo antes de incubar con el

reactivo de Yariv (G), incubado por 3 días (H, día 8 de cultivo) y después de retirar el reactivo

de Yariv en el día 15 del cultivo (I). Barras: 10 µm.


_________________________________________________________________________

75

DISCUSIÓN

Un incremento en la agregación celular fue observada durante el crecimiento de B.

vulgaris (Figuras 22A y 24A). Al respecto, Jiménez (2005), reportó que los agregados

celulares de B. vulgaris, cambian su tamaño a lo largo del crecimiento celular. Al inicio del

cultivo, los agregados fueron pequeños, de contorno irregular y de compactación media, pero

alcanzan su máximo tamaño durante la fase exponencial con contornos poco irregulares y de

aspecto compacto.

El incremento en la formación de agregados de mayor tamaño estuvo asociada con un

incremento en el contenido AGPs en la PC y en el MC (Figuras 23A y 24A). Estos eventos

ocurrieron principalmente durante la fase exponencial, a partir del día 5 al 9 del crecimiento

celular. Las suspensiones celulares de B. vulgaris también presentaron una tendencia a

agregarse como un efecto del incremento de la concentración inicial de sacarosa, lo cual

coincidió con una aumento en la secreción de AGPs (resultados del Capítulo 2). Sin embargo,

Leboeuf et al. (2004) reportaron que las células en suspensión de Arabidopsis thaliana (L.)

Heynh., mostraron una disminución de la adhesión celular durante las etapas exponencial

tardía y estacionaria y esto estuvo relacionado con un aumento de la secreción de las AGPs al

medio de cultivo.

Es probable que las AGPs desempeñen un papel en la vinculación de las macromoléculas

de la pared celular, principalmente con pectinas y de esta forma facilitar la conexión entre el

plasmalema y la pared celular (Rumyantseva, 2005).

Los datos de esta investigación muestran que cuando la glicosilación de proteínas fue

inhibida con TM, hay una disminución del contenido de AGPs en la PC y en el MC (Figura

23B). Lo cual se relacionó con una disminución del crecimiento y en la formación de

agregados celulares de menor tamaño (Figuras 22B, 24B y 25E). Estos resultados sugieren que

al afectar el contenido de las AGPs tanto en PC como su secreción al MC, el crecimiento y la

agregación celular de los cultivos no es sostenible. Otros estudios han señalado que la TM

puede afectar la síntesis de glicoproteínas relacionadas con la agregación celular. Yamada et


_________________________________________________________________________

76

al. (1982) observaron que la TM afectó la biosíntesis de las glicoproteínas involucradas en la

agregación celular de Dictyostelium discoideum y evidenciaron que varias proteínas de la

membrana celular desaparecieron en presencia de TM. Mientras que Nakata y Ochiai (1996)

reportaron que en las células de P. pallidum, la disminución de la adhesión celular coincidió

con una reducción en el contenido de la glicoproteína gp64.

Cuando la TM fue retirada de los cultivos de B. vulgaris y estos fueron transferidos a

medio de cultivo fresco, las células volvieron a sintetizar las AGPs en la PC y secretarlas al

MC (Figura 23B), lo cual coincidió con una recuperación en el crecimiento celular y la

formación de agregados celulares de mayor tamaño (Figura 22B, 24B y 25F). Así fue claro

que hay un paralelismo entre la síntesis de las AGPs con la recuperación de la agregación

celular. De forma similar, Nakata y Ochiai (1996) observaron que al eliminar la TM de las

células de P. pallidum, comenzaron a agregarse nuevamente lo que estuvo acompañado de un

incremento de la glicoproteína gp64. Por otro lado, Borderies et al. (2004) observaron que el

desarrollo de microsporas de Z. mays es bloqueado al aplicar TM y que dicha inhibición fue

suprimida cuando los cultivos fueron trasferidos a medios de cultivo ricos en AGPs o en una

solución de goma arábiga, sugiriendo que las AGP son glicoproteínas requeridas en el

desarrollo de las microesporas. Las AGPs como componentes integrales de la superficie

extracelular de las unidades embriogénicas podrían ser importantes para la adhesión célula-

célula de dichas unidades, así como para la señalización de célula-célula y reconocimiento

(Sămaj et al., 1999).

La precipitación de AGPs por su interacción con el reactivo de Yariv fue otro mecanismo

para reducir la acumulación de las AGPs de B. vulgaris. Cuando las células permanecieron en

contacto con el reactivo de Yariv, se observó una reducción de las AGPs de la PC mientras

que su secreción hacia el MC fue totalmente inhibida (Figura 23C). Estos eventos fueron

paralelos a la reducción del crecimiento celular y a la disminución del tamaño de los

agregados (Figura 22C, 24C y 25H). La inhibición del crecimiento y de la agregación celular

no se debió a una disminución en la viabilidad celular, ya que con y sin el reactivo de Yariv

los cultivos mostraron una viabilidad similar. En los cultivos de Rosa sp., también se encontró


_________________________________________________________________________

77

que la disminución del crecimiento celular no es consecuencia de una reducción en la

viabilidad celular (Serpe y Nothnagel, 1994).

Al retirar el reactivo de Yariv de los cultivos, los cultivos no recuperaron la producción

de AGPs en la PC ni su secreción al MC, por lo tanto la inhibición del crecimiento y la

agregación celular no fueron eventos reversibles. Estos datos sugieren que la presencia de las

AGPs es fundamental para el crecimiento y la agregación celular. Al respecto, Hernández

(2007) reportó que después de eliminar el reactivo de Yariv en los cultivos de B. vulgaris hay

una inhibición en el crecimiento celular, una disminución en el tamaño de los agregados y un

cambio en la forma de los mismos.

Las AGPs como moléculas de adhesión celular podrían ser capaces de formar una

conexión esencial entre la membrana y la pared celular requeridas para el crecimiento y

desarrollo normal, estas conexiones pueden involucrar a las AGPs de la pared celular y a otras

moléculas de la pared, tales como las pectinas (Showalter, 2001). Aunque el mecanismo

exacto entre AGPs-Yariv, es desconocido, la configuración estructural del reactivo de Yariv le

permite asociarse a las moléculas de AGPs para formar un precipitado dando el complejo

AGP-Yariv. Además, el reactivo de Yariv es capaz de entrar a la pared celular donde se

encuentran enlazadas las AGPs con otros componentes moleculares de la pared y de la

membrana plasmática (Serpe y Nothnagel, 1994). Así al adicionar el reactivo de Yariv, se

puede inducir una agregación “anormal” de las moléculas de las AGPs en la superficie de la

membrana plasmática y/o romper las conexiones de las AGPs requeridas para el crecimiento

“normal”.

En conclusión, estos resultados indican que las AGPs de B. vulgaris son requeridas en la

agregación celular.

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DISCUSIÓN GENERAL

Los cultivos de B. vulgaris crecidos con 87.6 mM (30 g L-1

) de sacarosa, alcanzaron una

biomasa máxima de 15.97 g L-1

(Figura 10) con una velocidad específica de crecimiento (μ)

de 0.13 días-1

y un tiempo de duplicación (td) de 5.3 días. Los valores de μ y td fueron

diferentes a los reportados por Rodríguez-Monroy y Galindo 1999 (μ de 0.06 días-1

con un td

de 11.6 días) y por Hernández (2007) (μ de 0.12 días-1

con un td de 5.8 días). Estas diferencias

probablemente fueron debidas al tamaño del inóculo, a la edad de la línea celular empleada y

a la posible adaptación de las células de B. vulgaris a las condiciones de cultivo como

consecuencia de su resiembra periódica. La línea celular usada en este trabajo, es la misma a la

empleada por aquellos autores, lo cual implica que tiene al menos 12 años de resiembras. Sin

embargo, en un estudio realizado por Jiménez (2005), el cultivo de B. vulgaris presentó una μ

de 0.172 días-1

y el td de 4 días.

Así mismo, en este trabajo se encontró que los cultivos crecidos con 87.6 mM de sacarosa

mostraron una acumulación de AGPs de 59.12 mg L-1

(Figura 11). Este contenido fue 2.84

veces mayor a lo reportado por Hernández (2007), que fue de 20.8 mg L-1

; sugiriendo que la

edad del cultivo puede inducir una mayor secreción de las AGPs. Al respecto, Langan y

Nothnagel (1997), señalaron que líneas celulares de Rosa sp. con diferente año de

descendencia (Rosa 57 y Rosa 93) mostraron diferencias en su secreción de AGPs al medio de

cultivo. Las suspensiones celulares de mayor edad, Rosa 57, secretaron mayor contenido de

AGPs que la de Rosa 93. Mientras que las células de Rosa 93 incrementaron en 1.5 veces su

secreción de AGPs a medida que se aumentó el número de subcultivo.

A través de la electroforesis cruzada, se observó que las células de B. vulgaris secretaron dos

AGPs (Figura 15) que pudieran corresponder a las AGPs de 115 a 159 kDa identificadas

previamente por Hernández (2007).

Discusión general

82

El perfil de acumulación de las AGPs secretadas por los cultivos de B. vulgaris, presentó

una asociación parcial al crecimiento celular, especialmente en la fase exponencial de la

cinética de crecimiento. Este comportamiento en la secreción de AGPs también ha sido

reportado por otros autores. Darjania et al. (2002) señalan un aumento en la acumulación de

las AGPs secretadas por los cultivos de A. thaliana conforme al crecimiento celular del

cultivo. En forma semejante, en los cultivos de Rosa sp., la acumulación de las AGPs ocurre

durante el crecimiento de los cultivos (Komalavilas et al., 1991).

Los resultados de esta investigación mostraron que la secreción de las AGPs en los

cultivos de B. vulgaris se incrementó en respuesta al aumento de la concentración inicial de

sacarosa (CIS) y al estrés osmótico (Figuras 11, 18 y 20). El crecimiento celular y la

acumulación volumétrica de las AGPs en el medio de cultivo fueron mejorados como

consecuencia del incremento de la CIS. Mientras, que la acumulación específica de las AGPs

aumentó 3 veces al cambiar la CIS de 43.8 a 87.6 mM. Sin embargo, la CIS de 131.4 mM no

tuvo efecto en el rendimiento y la productividad de las AGPs (Cuadro 1), sugiriendo un

posible efecto osmótico por el incremento de la CIS. Cuando los cultivos fueron sometidos a

estrés osmótico mediante la adición de manitol, sorbitol, PEG y NaCl, la secreción de AGPs se

incrementó entre 6 a 7.46 veces, sin embargo, el crecimiento celular fue similar o disminuyó

en relación a los cultivos no alimentados (Figuras 17 y 19). Estos resultados indican que la

secreción de AGPs por las células B. vulgaris pueden estar relacionados con el crecimiento

pero también son parte de la respuesta celular al estrés osmótico.

Por otro lado se observó, que los células de B. vulgaris en medio líquido presentaron una

tendencia a agregarse como un efecto del aumento de la CIS y que este fenómeno coincidió

con la mayor secreción de AGPs sugiriendo un posible papel de la AGPs como moléculas de

adhesión celular (Figura 12). Los experimentos con tunicamicina (TM) y el reactivo de Yariv,

demostraron que las AGPs son requeridas para el crecimiento y la agregación celular de B.

vulgaris (Figuras 22-24).

Basados en los resultados de esta investigación se propone un modelo hipotético de cómo

las AGPs pueden ser secretadas en respuesta a la CIS y/o al estrés osmótico y cómo estás

Discusión general

83

moléculas participarían en el crecimiento y en la formación de agregados de B vulgaris

(Figura 26).

La sacarosa presenta una acción dual. Una como fuente carbono, estimulando el

crecimiento y la secreción de AGPs en las células de B. vulgaris. La otra, ejerce un efecto

osmótico incrementando la secreción de AGPs de forma similar a los agentes osmóticos tales

como el manitol, sorbitol, PEG y NaCl. Así, la secreción de AGPs tiene un efecto positivo en

el crecimiento y la formación de agregados. Por otro lado, cuando se disminuye parcial o

totalmente la cantidad de AGPs en los cultivos celulares, por exposición a la acción de

inhibidores como la TM y el reactivo de Yariv, se inhibe el crecimiento y la agregación

celular de B. vulgaris.

Figura 26. Modelo hipotético para la secreción de AGPs en respuesta al incremento de la CIS

y al estrés osmótico y su relación con el crecimiento y la agregación celular. Las líneas indican

el efecto positivo (+) y las líneas discontinuas el efecto negativo ().

En este trabajo se observó que los cultivos en suspensión de B. vulgaris secretan dos

AGPs en repuesta a la CIS y al estrés osmótico, además su acumulación en el medio de cultivo

está relacionada con el crecimiento y la agregación celular. Sin embargo, aún falta por conocer

Discusión general

84

la composición química de estas glicoproteínas, lo que ayudaría a precisar si se trata de AGPs

clásicas o no clásicas. Conociendo que tipo son las AGPs secretadas por los cultivos, se podría

inferir cuál es su localización celular antes de ser secretadas, lo que proporcionaría indicios de

los mecanismos de su secreción y de su relación con el crecimiento celular y la agregación

celular. Esto llevaría a contestar preguntas como: ¿Las AGPs secretadas por los cultivos de B.

vulgaris actúan como una señal?, sí es así ¿En qué parte de la molécula reside esa señal?, o

¿Se tratan de AGPs estructurales que interaccionan con el citoesqueleto o la pared celular y

que permiten que el crecimiento celular se lleve a cabo? ¿Son las AGPs secretadas moléculas

de adhesión entre célula-célula? ¿Si sirven como moléculas de adhesión celular, la presencia

del anclaje GFI y su subsecuente procesamiento, facilitarán el remodelamiento de la pared

celular? ¿Compartirán dominios similares a los de otras moléculas de adhesión celular, tales

como las fasciclinas?

El estudio de la secreción de AGPs por los cultivos de B. vulgaris podría dirigirse también

desde un enfoque biotecnológico, estas moléculas pueden ser utilizadas como sustancias

inductoras de la embriogénesis somática en programas de micropropagación de plantas. La

adición de AGPs al medio de cultivo puede inducir la embriogénesis en cultivos que no son

embriogénicos y aumentar el rendimiento en cultivos embriogénicos (Kreuger et al., 2000;

Pereira-Netto et al., 2007). Sin embargo, es escaso el conocimiento del mecanismo por el cual

las AGPs participan en estos cambios de diferenciación, como también si tales efectos son

atribuidos a un solo tipo de AGP o una mezcla de AGPs y cuáles características bioquímicas

particulares presentan.

También se ha reportado que las AGPs poseen actividad inmunoestimulante (Yamada,

2000), lo que despierta el interés de producirlas a escala comercial. La alimentación con

sacarosa sería una estrategia futura a evaluar en la secreción de AGPs, en un sistema de mayor

escala como los biorreactores de tipo tanque agitado. El hecho de que los cultivos de B.

vulgaris secreten AGPs al medio de cultivo, facilitaría la recuperación y posterior purificación

de esta glicoproteína redundando en una disminución de costos.

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CONCLUSIÓN

En respuesta al incremento de la concentración inicial de sacarosa, los cultivos de Beta

vulgaris L. en suspensión aumentaron la secreción volumétrica de AGPs, lo cual coincidió con

un mayor crecimiento y la formación de agregados celulares. La secreción de AGPs también

fue parte de la respuesta celular al estrés osmótico impuesto por el manitol, sorbitol, NaCl y

polietilenglicol. Y la inhibición del contenido de estas glicoproteínas, demostró que las AGPs

son requeridas para el crecimiento y la agregación celular de B. vulgaris.

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ANEXOS

Anexo 1. Portada del artículo de revisión: Las proteínas arabinogalactanos en cultivos de

células vegetales.

Anexo 2. Portada del artículo: Sucrose induces arabinogalactan protein secretion by Beta

vulgaris L. cell suspension cultures.

170 MAR 2009, VOL. 34 Nº 3

PALABRAS CLAVE / AGPs / Cultivo de Células / Embriogénesis Somática / Proteínas Extracelulares /

Recibido: 20/05/2008. Modificado: 21/02/2009. Aceptado: 26/02/2009.

Arianna Michelle Hernández Sánchez. Maestra en Ciencias, Centro de Desarrollo de Produc-tos Bióticos, Instituto Politécnico Nacional (CeProBi-IPN), México. e-mail: [email protected]

Jacqueline Capataz Tafur. Estudiante de Doctorado en Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi-IPN), México. e-mail: [email protected]

Mario Rodríguez-Monroy. Doctor en Ciencias, Universidad Autónoma de México (UNAM), México. Investigador, CeProBi-IPN, México. e-mail: [email protected]

Gabriela Sepúlveda Jiménez. Doctora en Ciencias, UNAM, México. Investigador, CeProBi-IPN, México. Dirección: Departamento de Biotecnología, CeProBi-IPN. Apdo. Postal 24. Carretera Yautepec-Jojutla Km. 8.5. Yautepec, Morelos. México. C.P. 62730. e-mail: [email protected]

LAS PROTEÍNAS ARABINOGALACTANOS EN CULTIVOS DE CÉLULAS VEGETALES

ARIANNA MICHELLE HERNáNDEz SáNCHEz, JACqUELINE CAPATAz TAfUR, MARIO RODRÍGUEz-MONROy

y GABRIELA SEPúLVEDA-JIMÉNEz

as proteínas arabinoga-lactanos (AGPs) son ma-cromoléculas glicosila-

das, distribuidas ampliamente en el reino vegetal, que se encuentran prácticamente en todos los órganos de las plantas. Las AGPs están implicadas en varios aspectos del crecimiento y el desarrollo de las plantas, tales como la diferenciación de tejidos reproductivos y vegetativos, la ex-pansión y la proliferación celular, y la muerte celular programada (Figura 1). A nivel celular, estas glicoproteínas se loca-lizan principalmente en la membrana plas-

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mática, en la pared celular, o como secre-ciones en el espacio intercelular (Majews-ka-Sawka y Nothnagel, 2000; Rumyantse-va, 2005). El carbohidrato de las AGPs consiste en arabinogalactanos del tipo II, de donde reciben el nombre estas glico-proteínas. Las AGPs pertenecen a la fami-lia de las proteínas ricas en hidroxiprolina (HRGPs), que también incluye a las ex-tensinas, a las proteínas ricas en prolina y a las lectinas (Majewska-Sawka y Nothna-gel, 2000). Desde un punto de vista prác-tico, las AGPs se pueden diferenciar de las otras HRGPs por su capacidad de

unirse a un colorante sintético conocido como el reactivo β-glicosil Yariv (Yariv et al., 1967). Asimismo, el reactivo de Yariv y anticuerpos monoclonales que reconocen a las AGPs son usados para conocer la participación de las AGPs en los procesos de crecimiento y desarrollo (Seifert y Ro-berts, 2007).

Las AGPs son componen-tes abundantes de gomas y exudados, y muestran propiedades funcionales relevan-tes para la industria de alimentos; por ejemplo, la goma arábiga de Acacia sene-gal es usada por sus propiedades de emul-

RESUMEN

Las proteínas arabinogalactanos (AGPs) son macromoléculas que se encuentran prácticamente en todos los órganos de las plantas, siendo asociadas con varios aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal. Estas moléculas se caracterizan bioquímica-mente por contener carbohidratos y proteínas en relación 9:1. El carbohidrato está compuesto principalmente por arabinogalacta-nos tipo II; mientras que la parte proteica está organizada en dominios que definen a las AGPs como clásicas o no clásicas. Las primeras se caracterizan además por presentar una secuen-cia C-terminal que predice la incorporación de un grupo gli-cosilfosfatidilinositol (GFI), que permite su unión a la membrana plasmática. En cultivos de células vegetales se reportan varias especies que liberan AGPs al medio de cultivo. Se presenta una revisión de las características bioquímicas de las AGPs liberadas

al medio y de las propuestas sobre los mecanismos bioquímicos y celulares por los cuales las AGPs participan en la diferencia-ción y crecimiento de las células vegetales. Los cultivos de célu-las liberan al medio de cultivo AGPs clásicas y no clásicas, y se propone que podrían provenir de la membrana plasmática o la pared celular. Las AGPs intervienen en el control del crecimien-to celular, además de estar relacionadas con la embriogénesis somática y la organogénesis, procesos de diferenciación celular importantes en los sistemas de micropropagación de plantas. El mecanismo bioquímico por el cual las AGPs participan en el crecimiento celular y la diferenciación implica que éstas, o los productos de su degradación, quizás actúen como moléculas de señalización.

ORIGINAL PAPER

Sucrose induces arabinogalactan protein secretionby Beta vulgaris L. cell suspension cultures

Jacqueline Capataz-Tafur • Arianna M. Hernandez-Sanchez •

Mario Rodrıguez-Monroy • Gabriela Trejo-Tapia •

Gabriela Sepulveda-Jimenez

Received: 3 August 2009 / Revised: 9 December 2009 / Accepted: 13 January 2010

� Franciszek Gorski Institute of Plant Physiology, Polish Academy of Sciences, Krakow 2010

Abstract The aim of this study was to determine if the

increase of the initial sucrose concentration (ISC) improves

cell growth and arabinogalactan protein (AGP) secretion of

Beta vulgaris L. cultures. ISC tested were 43.8, 87.6 and

131.4 mM. Cell growth and specific growth rate were

improved increasing the ISC. Cell cultures grown with ISC

43.8 mM were fed with sucrose, and cellular growth was

enhanced twofold, revealing the stimulatory effect of

sucrose on cell growth. The AGP secretion was stimulated,

increasing the ISC. This event was partially associated with

the exponential growth phase of the culture. AGP precip-

itation with Yariv reagent of cell cultures inhibited cell

growth without changes in viability. The assay of sucrose

feeding confirmed the relationship between cell growth and

AGP secretion. These observations suggest that AGPs may

be required for cell division. The increase of AGP secretion

by ISC coincided with a higher cellular aggregation, sug-

gesting a possible role of AGP as cellular adhesion mole-

cules. To determine whether AGP secretion is also

stimulated by an osmotic effect, mannitol was fed to raise

the osmotic potential from 23.78 to 95.97 mOsm kg-1.

Mannitol was not used for cell growth, but AGP secretion

was stimulated sixfold in relation to the control. These

results are important for understanding the possible factors

involved in the AGP secretion of plant cell culture and that

may be considered to improve the AGP production.

Keywords Cell growth � Osmotic potential �Cellular aggregates � Adhesion molecules

Abbreviations

AG Arabinogalactans

AGPs Arabinogalactan proteins

DW Dry cell weight

ISC Initial sucrose concentration

QAGPs AGP productivity

l Specific cell growth rate

YX/S Specific biomass yield with respect to sucrose

consumed

YAGPs/X Specific arabinogalactan protein yield

Introduction

Arabinogalactan proteins (AGPs) are high molecular

weight proteoglycans consisting of *10% protein and 90%

carbohydrates. Arabinogalactan (AG) type II are the

polysaccharides mainly found in AGPs (Fincher et al.

1983). These glycoproteins are distributed in flowers,

stems, roots, seeds, and leaves of plants. At the cellular

level, AGPs are located on the plasma membrane, the cell

wall or as secretions of the intercellular spaces (Majewska-

Sawka and Nothnagel 2000; Showalter 2001; Rumyantseva

2005). While in the plant cell culture, AGPs are found in

the culture medium. This represents a biological system

that facilitates AGP recovery and is used to perform studies

for a better understanding of the role of AGPs on plant

growth.

AGPs have a structural role as plant cell wall compo-

nents and may be active in signaling mechanisms. AGPs

Communicated by E. Lojkowska.

J. Capataz-Tafur � A. M. Hernandez-Sanchez �M. Rodrıguez-Monroy � G. Trejo-Tapia �G. Sepulveda-Jimenez (&)

Departamento de Biotecnologıa, Centro de Desarrollo de

Productos Bioticos, Instituto Politecnico Nacional,

P.O. Box 24, Yautepec, Morelos 62730, Mexico

e-mail: [email protected]

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Acta Physiol Plant

DOI 10.1007/s11738-010-0460-7

factores que afectan la secreciÓn de las agps y su

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