factibilidad tÉcnica para la reproducciÓn masiva de cinco cepas de hongos entomopatÓgenos para el...
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FACTIBILIDAD TÉCNICA PARA LA REPRODUCCIÓN MASIVA DE CINCO
CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DEL PSÍLIDO ASIÁTICO EN LA HUASTECA HIDALGUENSE.
MEMORIA PRESENTADA COMO REQUISÍTO PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA
AUTOR: AARÓN CRUZ HERNÁNDEZ ASESOR ACADÉMICO: ING. CUAUHTÉMOC HERNÁNDEZ CUELLAR ASESOR INDUSTRIAL: ING. EDI ARROYO CRUZ HUEJUTLA, HGO ABRIL DEL 2012
FACTIBILIDAD TÉCNICA PARA LA REPRODUCCIÓN MASIVA DE CINCO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DEL
PSÍLIDO ASIÁTICO EN LA HUASTECA HIDALGUENSE.
Memoria presentada
Por
AARÓN CRUZ HERNÁNDEZ
Ante la Universidad Tecnológica de la Huasteca Hidalguense como requisito parcial para optar
al título de
INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA Abril de 2012
DATOS GENERALES DE LA EMPRESA
EMPRESA
CESAVEH (COMISIÓN ESTATAL DE SANIDAD VEGETAL DEL ESTADO DE HIDALGO)
SECTOR
PÚBLICO
DIRECCIÓN
CARRETERA HUEJUTLA-CHALAHUIYAPA, Km. 3.5 BARRIO TEPOXTEQUITO
PROYECTO
FACTIBILIDAD TÉCNICA PARA LA REPRODUCCIÓN MASIVA DE CUATRO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DEL
PSÍLIDO ASIÁTICO EN LA HUASTECA HIDALGUENSE.
ASESOR INDUSTRIAL
ING. EDI ARROYO CRUZ
CARGO DEL ASESOR
COORDINADOR DE CAMPAÑA
iv
DEDICATORIAS
A mi angelito hermoso:
A veces llega un momento en la vida en que las cosas parecen ya no tener
sentido, que todo el mundo se viene abajo y las personas impiden que seas feliz.
En esos momentos no existe mayor preocupación que la nada, y la importancia
hacia la vida desaparece. No puedo expresar el dolor, impotencia y rabia que me
causa ver que cosas pasen delante de mis ojos, sin poder hacer nada. Tú le diste
una esperanza a mi vida, un haz de luz a la penumbra en mi alma y me diste
motivos para seguir viviendo cada día con felicidad.
Estás siempre conmigo; en mi alma, en mi mente y en mi corazón. Te amo.
A mi princesa:
Es curioso como el destino une a las personas.
Ese día estabas radiante. El mirarte ahí sentada inundó mi corazón de
felicidad y mi estómago de nauseas; los rayos de sol penetraban el follaje de un
árbol y hacían resplandecer tus ojos -cafés, profundos y llenos de vida-. Me
enamoré, como solo un loco puede hacerlo y supe que sería por toda la eternidad.
Tú me diste la fuerza que necesitaba para seguir adelante; cuando estaba
agonizante en mí soledad, me diste el regalo más hermoso que jamás habría
recibido, me diste tu amor incondicional. Solo en ese momento me di cuenta que
vivir valía la pena, si era por ti. Rubí Sánchez Palacios.
“En un beso, sabrás todo lo que he callado.”
Pablo Neruda (1904-1973) Poeta chileno.
v
AGRADECIMIENTOS
Agradezco infinitamente a esa gran mujer que en cada acción derramaba
un rio de amor incondicional, que con sacrificios, fuerza y determinación me dio las
armas para seguir adelante, a la mujer que estuvo allí desde que nací, que cuando
estoy feliz ríe, y cuando estoy triste llora. A esa mujer de voluntad inquebrantable.
A esa mujer de coraje y valor. Gracias por todo tu amor. Lilia Hernández Ramírez.
Gracias padre mío, de ti aprendí a enfrentar la vida y sobreponerme a las
dificultades que se presentan en la vida, me educaste como solo los hombres
formidables pueden hacerlo, la disciplina y trabajo que en mi inculcaste son un
regalo maravilloso. Gracias por tu amor, trabajador incansable. Arnulfo Cruz
Alvarado.
Hermana, eres muy importante para mí. Somos la misma carne y sangre.
Cuando sufres sufro. Infinitamente gracias por estar conmigo en todo momento,
eres mi pilar y mi fuerza. Te amo hermana. Gracias por tu amor incondicional.
Liliana Cruz Hernández.
A mis amigos. Aunque no se los dije antes; los quiero mucho.
A mi familia. Gracias por todo.
A todos mis profesores que en el deber de su trabajo se comprometieron de
todo corazón conmigo e hicieron posible un logro más en mi vida. Gracias.
A la Universidad Tecnológica de la Huasteca Hidalguense. Gracias.
Expreso mi gratitud al Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de
Hidalgo, en especial al Ing. Edi Arroyo Cruz y al Ing. Moisés Alvarado Martínez,
por su amistad y apoyo. A todas las personas que conocí ahí, gracias.
vi
ÍNDICE
INDICE DE CONTENIDO
Página
DEDICATORIAS………............................................................................................iv
AGRADECIMIENTOS...............................................................................................v
INDICE DE CONTENIDO.........................................................................................vi
INDICE DE FIGURAS..............................................................................................ix
INDICE DE TABLAS…………………………………………………….………….……..x
INDICE DE GRAFICAS…………………………………………………..………………xi
RESUMEN………………………………………………………………….……………..xii
ABSTRACT……………………………………………………………………………….xiii
I. INTRODUCCION...................................................................................…............1
II. ANTECEDENTES DE LA EMPRESA………..…………………….………………2
2.1.1 Datos generales de la empresa……………………………….................2
2.1.2 Descripción de la empresa………………………………………………..3
III. PLANTEAMIENTO DE LA PROBLEMÁTICA…………………………………...…4
3.1Justificación…………………………………………………………………....4
3.2 Objetivos……………………………………………………………………….5
3.2.1 Objetivo general…………………………………………………….5
3.2.2 Objetivos específicos…………….…………………………………5
3.3 Metas……………………………………….….……………………………….5
3.4 Duración del proyecto………………………………………………….…..…5
IV. FUNDAMENTOS TEÓRICOS…………………………………………………….....6
4.1 Huanglongbing (“citrus greening”)……………………………………..…....6
4.1.1 Antecedentes………………………………………..………………6
4.1.2 Definición………………………………………………………….....6
4.1.3 Formas de transmisión del HLB……………………………….…..7
4.1.4 Vectores que trasmiten la enfermedad……………………….…..7
vii
4.2 Vectores del HLB………………………………………………………….…..8
4.2.1 Psílidos que trasmiten la enfermedad........................................8
4.2.2 Diaphorina citri……………………………………..…………….....8
4.2.3 Características morfológicas y fisiológicas de Diaphorina
citri…………………………………………………………………………………..9
4.3 Hongos entomopatógenos………………………………………………....11
4.3.1 Generalidades……………………………………………………..11
4.3.2 Clasificación de los hongos entomopatógenos……………..….13
4.3.3 Mecanismo de infección de los hongos entomopatógenos…..13
4.3.3.1 Adhesión y germinación de la espora en la cutícula del
insecto……………………………………………………………………..14
4.3.3.2. Penetración dentro del hemocele……………………..15
4.3.3.3. Desarrollo del hongo que resulta en la muerte del
insecto……………………………………………………………………..15
4.4 Medio de cultivo……………………………………………………………...17
4.4.1 Definición…………………………………………………………..17
4.4.2 SABORAU……………………………….…………………………18
V. HIPÓTESIS……………………………………………………………………………19
VI. DESARROLLO DEL PROYECTO…………………………………………………20
6.1 Metodología…………………………………………………………………..20
6.2 Desarrollo…………………………………………………………………….21
6.2.1 Desarrollo del experimento………………………………….……21
6.2.1.1 Materiales utilizados……………………………….……21
6.2.1.2 Selección de cepas……………………………….…..…22
6.2.1.3 Lavado de cristalería y esterilización de áreas –
materiales…………………………………………………………………22
6.2.1.4 Preparación del medio de cultivo……………….…..…23
6.2.1.5 Vaciado en cajas Petri…………………………...……..24
6.2.1.6 Siembra…………………………………………………..24
6.2.1.7 Incubación………………………………………..………26
viii
6.2.2 Desarrollo del proceso de producción masiva..........................29
6.2.2.1 Materiales………………………………………...………29
6.2.2.2 Desinfecciones de cristalería y limpieza de las áreas de
producción………………………………………………………………...30
6.2.2.3 Preparación de la solución……………………………..30
6.2.2.4 Lavado de arroz……………………………………….…31
6.2.2.5 Embolsado de arroz…………………………………..…32
6.2.2.6 Esterilización……………………………………………..32
6.2.2.7 Inoculación……………………………………………….33
6.2.2.8 Crecimiento………………………………………………34
6.2.2.9 Deshumificación…………………………………………34
6.2.2.10 Cosecha....................................................................35
6.2.3 Determinacion de concentracion de esporas libres……………36
6.2.3.1 Materiales……………………….………………………..36
6.2.3.2 Desarrollo………..……………………………………….36
VII. RESULTADOS………………………..…….…………………………………….…44
7.1 Interpretación de resultados……………………….…………………………….…44
VIII. CONCLUSIONES………………………………………………………………….50
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………….51
X. ANEXOS………………………………………………………………………………52
ix
INDICE DE FIGURAS
Figura A…………………………………………………………………………………….9 Figura B………...…………………………………………………………………………11 Figura C……………………………..……………………………………………………14
Figura 1 Pesando los ingredientes para el medio de cultivo…………….………….53
Figura 2 Preparación del medio de cultivo.…………………………….…………..…53
Figura 3 Esterilización de materiales y medio de cultivo ……………………………54
Figura 4 Vaciado del medio de cultivo en cajas Petri…..……………………………54
Figura 5 Cajas Petri con cinco días de inoculadas…………………………………..55
Figura 6 Cajas Petri con quince días de inoculadas………………………...………55
Figura 7 Siembra.……………………………………………………..…………………56
Figura 8 Conteo de colonias……………………………………….……..……………56
Figura 9 Laboratorio…………………………………………………………….………57
Figura 10 Área de crecimiento de la producción masiva ……..……………………57
x
INDICE DE TABLAS
Tabla 1.1………………………………………………………………………………….26 Tabla 1.2………………………………………………………………………………….27 Tabla 1.3………………………………………………………………………………….27 Tabla 1.4………………………………………………………………………………….27 Tabla 1.5………………………………………………………………………………….28 Tabla 2.1………………………………………………………………………………….37 Tabla 2.2………………………………………………………………………………….37 Tabla 2.3………………………………………………………………………………….38 Tabla 2.4………………………………………………………………………………….38 Tabla 2.5…………………….……………………………………………………………38
xi
INDICE DE GRAFICAS Graficas A…………………………………………………………………………………45 Graficas B…………………………………………………………………………………46 Graficas C………………………………………………………………………………...47 Graficas D………………………………………………………………………………...48 Graficas E…………………………………………………………………………………49
xii
RESUMEN
FACTIBILIDAD TÉCNICA PARA LA REPRODUCCIÓN MASIVA DE CINCO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DEL
PSÍLIDO ASIÁTICO EN LA HUASTECA HIDALGUENSE.
ABRIL 2012
AARÓN CRUZ HERNÁNDEZ
INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA HUASTECA HIDALGUENSE
ASESOR ACADÉMICO: ING. CUAUHTÉMOC HERNÁNDEZ CUELLAR
ASESOR INDUSTRIAL: ING. EDI ARROYO CRUZ
El presente proyecto de investigación se llevó a cabo en el laboratorio Bio-Huas, perteneciente al Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Hidalgo (CESAVEH), con el objetivo de evaluar el factor crecimiento de cinco diferentes cepas de hongos entomopatógenos conservados en el propio laboratorio como referencia para la determinación de la factibilidad de inocular dichos hongos a nivel masivo. Las cepas evaluadas en la siguiente fueron: Beauveria bassiana, por excelencia de los hongos entomopatógenos mayormente utilizados en la región por su fácil reproducción y abundante esporulación, esta cepa presenta una coloración blanca a la hora de esporular; la cepa del hongo Metarhizium anisopliae (Ma59), al igual que la anterior una de las cepas mayormente utilizadas en la región, que fue adquirida del laboratorio de Sanidad Vegetal del Estado de Puebla y presenta un color verde soldado en su etapa de esporulación; las cepas de Isaria fumosorosea en sus variedades Pf14, Pf16 y Pf20, la diferencia entre cada cepa pudiese ser la procedencia de la cepa, insecto de la que fue aislada, humedad e incluso la hora en que fue colectada de campo, estas cepas presentan en la esporulación un color blanco amarillento. El experimento se realizó con el fin de determinar que cepa crecía mas rápidamente para utilizarla como inoculo ideal en la producción masiva y comercialización. Para ello se utilizaron cinco repeticiones de sembrado por cada cepa en cajas Petri con medio de cultivo SABOURAUD y con las mismas condiciones de humedad, temperatura, asepsia y condiciones terciarias. Palabras clave: Hongos entomopatógenos, cepas, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea, SABORAUD
xiii
ABSTRACT
TECHNICAL FEASIBILITY FOR MASS REPRODUCTION OF FIVE STRAINS OF FUNGI ENTOMOPATHOGENIC CONTROL OF THE ASIAN PSYLLID IN THE
HUASTECA HIDALGUENSE.
APRIL 2012
AARON CRUZ HERNÁNDEZ
ENGINEER IN BIOTECHNOLOGY
TECHNOLOGICAL UNIVERSITY OF THE HUASTECA HIDALGUENSE
ACADEMIC ADVISOR: ING. CUAUHTÉMOC HERNANDEZ CUELLAR
INDUSTRIAL ADVISOR: ING. EDI ARROYO CRUZ This research project was conducted in the laboratory Bio-Huas, belonging to the State Plant Health Committee of the State of Hidalgo (CESAVEH) in order to evaluate the growth factor of five different strains of entomopathogenic fungi preserved in their own laboratory for determining the feasibility of such fungi inoculated on a massive scale. The strains were evaluated as follows: Beauveria bassiana, for excellence of entomopathogenic fungi mostly used in the region for easy playback and abundant sporulation, this strain appears white when sporulate, the strain of the fungus Metarhizium anisopliae (Ma59 ), like the previous one strain mostly used in the region, which was acquired from the laboratory of Plant Protection of the State of Puebla and is green soldier in his stage of sporulation, strains of Isaria fumosorosea varieties in Pf14 , and PF20 Pf16, the difference between each strain could be the origin of the strain, that bug was isolated, humidity and even the time it was collected in the field, these strains present in the yellowish-white sporulation. The experiment was conducted to determine which strain grew more rapidly for use as inoculum ideal for mass production and marketing. This was accomplished by five repetitions of each strain seeded in Petri dishes with SABOURAUD medium with the same conditions of humidity, temperature, aseptic and tertiary conditions. Keywords: Entomopathogenic fungi, strains, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea, SABOURAUD
1
I. INTRODUCCIÓN
El uso excesivo de plaguicidas provoca efectos negativos en el suelo, el
agua y el ambiente. Además ha contribuido a aumentar los problemas de plagas
debido al desarrollo de resistencia y a la destrucción de los enemigos naturales.
Muchos plaguicidas también afectan la salud de las personas. Para reducir estos
efectos se procura la implementación de sistemas agrícolas sostenibles, basados
en el conocimiento de las relaciones entre los cultivos, el ambiente y los
organismos presentes en el campo. Una de las alternativas es el uso de
organismos entomopatógenos, los cuales tienen la capacidad de reducir las
poblaciones de plagas. Existen varios tipos de organismos entomopatógenos,
tales como virus, hongos, bacterias y nematodos. Actualmente, se han identificado
y estudiado diversas especies de hongos que afectan plagas de cultivos de
importancia económica; muchos de ellos son utilizados exitosamente en
programas de control biológico. Algunos de estos entomopatógenos son
reproducidos masivamente y se venden comercialmente.
Estos hongos se encuentran en la naturaleza, en rastrojos de cultivos,
estiércol, en el suelo, las plantas, etc. Logran un buen desarrollo en lugares
frescos, húmedos y con poco sol. Los hongos entomopatógenos constituyen el
grupo de mayor importancia en el control biológico de insectos plagas.
Prácticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades
causadas por estos hongos. Se conocen aproximadamente 100 géneros y 700
especies de hongos entomopatógenos. Entre los más importantes están:
Metarhizium, Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erynia,
Eryniopsis, Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y
Verticillium. De ahí la importancia para el desarrollo del siguiente proyecto basado
en un análisis de factibilidad para determinar la cepa que mejor se desarrollo para
nuestro fin.
2
II. ANTECEDENTES DE LA EMPRESA
2.1.1 DATOS GENERALES DE LA EMPRESA
El Comité Estatal de Sanidad Vegetal (CESAVEH) es un organismo
auxiliar de la Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentación (SAGARPA) conformada por una Asociación de productores de
Cítricos para el desarrollo e implementación de medidas fitosanitarias en la región
Huasteca del Estado de Hidalgo que atiende los municipios de Orizatlán, Jaltocán,
Huejutla, Atlapexco, Huautla, Yahualica, Chapulhuacán y Pisaflores.
El Comité Estatal de Sanidad Vegetal en Coordinación con el Gobierno del
Estado y la SAGARPA activan el programa emergente contra la langosta
Schistocerca piceifrons piceifrons (walker), para el control de la misma
llevándose a cabo acciones de exploración, muestreos y control químico.
La campaña contra la broca del café, se inició en el estado de Hidalgo en
julio de 1995, una vez que se localizó la plaga en la localidad de San Antonio el
Grande, municipio de Huehuetla, Hgo, y se confirmó por la Dirección General de
Sanidad Vegetal que se trataba de Hypothenemus hampei (Ferr.).
A partir de este año, se han realizado muestreos, capacitación, divulgación,
control químico y control biológico en las zonas afectadas, así como actividades
de prevención en las zonas libres del Estado.
Esta junta se establece el 11 de mayo de 1997 con la finalidad de controlar
las poblaciones de moscas de la fruta nativas, las cuales causan grandes pérdidas
en la producción de cítricos en la región.
3
2.1.2 DESCRIPCIÓN DE LA EMPRESA.
Mision:
Prestar servicios a los productores y coadyuvar con las autoridades en la
prevención, control y erradicación de plagas para mejorar la producción y
productividad agrícola a través del cumplimiento de los programas de trabajo
fitosanitarios.
Filosofía:
Trabajar para el beneficio de los productores, así como también mejorar la
calidad fitosanitaria de los productos agrícolas de la región.
Visión:
Alcanzar la sanidad, calidad e inocuidad, cumpliendo con las normas que
les permitan a los agricultores comercializar sus productos en el mercado nacional
e internacional.
Valores:
Ética profesional
Respeto
Humildad
Lealtad
Honestidad
Bien común
Objetivos:
Prevenir, controlar y/o erradicar plagas y enfermedades que atacan a los
cultivos de la región, las cuales ocasionan pérdidas económicas a los productores.
4
III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
3.1JUSTIFICACIÓN
La región de la Huasteca Hidalguense tiene como fuente importante de
ingresos la venta de productos agrícolas, uno de estos casos es la
comercialización de cítricos a nivel local y regional; siendo la naranja y la
mandarina los cultivos más demandados.
En fechas recientes, el cultivo de estos, está siendo amenazado por una
enfermedad por el momento incurable conocida como HLB (Huanglongbing) que
es causada por la bacteria Candidatus liberibacter spp., ésta enfermedad produce
la muerte exponencial de las plantas de cítricos y acaba con el cultivo total en
pocos años, dando origen a una gran pérdida económica para los productores.
Por tal motivo el CESAVEH; junto con diferentes organizaciones públicas y
privadas, toma medidas relacionadas con la inocuidad de los cítricos, ya que el
HLB es prioridad por su devastador modo de infección; y a sapiencia de la “no
cura” de la enfermedad, se opta por el control quimico y biológico del principal
insecto vector (Diaphorina citri o psílido asiático).
El control del insecto antes mencionado se realiza de manera química, con
insecticidas selectivos comerciales; y biológica, que engloba la parasitación del
psílido con hongos entomopatógenos y con el insecto parasitoide Tamarixia
radiata.
El presente proyecto opta por el método de control biológico con hongos
entomopatógenos; que se reproducirán masivamente en laboratorio y los cuales
darán significado al siguiente proyecto.
5
3.2 OBJETIVOS
3.2.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la metodología y condiciones necesarias para el aislamiento y
reproducción masiva de las cepas de los hongos entomopatógenos Beauveria
bassiana, Metarhizium anisopliae (Ma59) y de Isaria fumosorosea (Pf14, Pf16,
Pf20)
3.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
-Determinar la metodología que conduzca a los mejores resultados de
acuerdo a la respuesta de crecimiento de las cepas de hongos.
-Determinar que cepa de hongo resulta mas viable reproducir masivamente
para su aplicación en campo.
-Determinar que cepa tiene mayor capacidad de multiplicación y agresividad
parasitaria.
3.3 METAS
Identificar la especie más fácilmente reproducible a nivel laboratorio y demostrar
que cepa es más factible reproducir masivamente mediante previas pruebas.
3.4 DURACIÓN DEL PROYECTO
El desarrollo del siguiente proyecto tiene una duración aproximada de cuatro
meses, que van del 09 de enero al 30 de abril de 2012 del periodo de estadía.
6
IV. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
4.1 HUANGLONGBING (“Citrus greening”)
4.1.1 ANTECEDENTES
El primer reporte de síntomas de HLB se dio en la India en el siglo XVIII,
anteriormente, el patógeno estaba probablemente presente en plantas nativas de
rutáceas y cuando los cítricos se plantaron en áreas nuevas, los insectos psílidos
pudieron haberles transmitido la enfermedad. El HLB fue reportado por citricultores
del sureste de China a finales del siglo XIX. En África del Sur esta enfermedad fue
reportada por primera vez en los años veinte del siglo pasado. La existencia de
esta enfermedad en Asia y África propició que a través de los años se dispersara
hacia varios países de ambos continentes.
4.1.2 DEFINICIÓN
El HLB, yellow dragon, citrus greening o enverdecimiento de los cítricos es
una enfermedad causada por una bacteria “Candidatus Liberibacter spp.”, Gram
negativa, vascular, limitada al floema, que no es posible cultivarla en forma aislada
en medios artificiales. Es transmitida por psílidos, uno de los vectores más
importantes es el psílido asiático de los cítricos (Diaphorina citri), (Hemiptera:
Psyllidae).
La bacteria es de difícil control, afecta la vida útil de las plantas tanto
jóvenes como adultas de todos los cítricos, incluyendo a sus híbridos (Hall 2008).
Aunque la bacteria se restringe al floema de las rutáceaes, tiene la capacidad de
multiplicarse en la hemolinfa y las glándulas salivales de los psílidos vectores.
Dentro del insecto, la bacteria cruza la pared intestinal hasta llegar a las glándulas
salivales, vía hemolinfa, tomándose para esto de 1 a 3 semanas según la
virulencia de la cepa (Orozco 1995).
7
Se considera a esta enfermedad como una de las más destructivas de los
cítricos en el mundo, por la severidad de los síntomas, la rapidez con la que se
dispersa y porque afecta a todas las especies comerciales de cítricos. Es una
enfermedad que aún no tiene cura.
África y Asia se han establecido como dos orígenes diferentes del HLB por
lo que se reconocen dos formas del agente causal: “Candidatus liberibacter
asiaticus” y “Candidatus liberibacter africanus”.
El agente causal que afecta a la citricultura brasileña es una variante de
Candidatus liberibacter asiaticus a la cual se le ha denominado Candidatus
liberibacter americanus (Texeira et al. 2005).
4.1.3 FORMAS DE TRANSMISIÓN DEL HLB
La transmisión del HLB la realizan los insectos vectores: Diaphorina citri
Kuwayama y Trioza erytreae; pero también puede transmitirse por yemas
infectadas (injerto). La distribución de la bacteria dentro de un árbol infectado
puede ser irregular, por lo que no todas las yemas contendrán la bacteria o
transmitirán la enfermedad.
4.1.4 VECTORES QUE TRASMITEN LA ENFERMEDAD
Ca. liberibacter spp. es una bacteria persistente que se reproduce dentro
del insecto pero no se transmite a otras generaciones, de tal forma que la bacteria
infecta al vector sin afectar los procesos fisiológicos del insecto, este al
alimentarse de la planta transmite la enfermedad. La bacteria circula por el floema
de la planta impidiendo la circulación de los nutrientes por el taponamiento de los
vasos floemáticos, provocando síntomas típicos de deficiencias nutrimentales en
la planta (Da Graca 1991).
8
4.2 VECTORES DEL HLB
4.2.1 PSÍLIDOS QUE TRASMITEN LA ENFERMEDAD
- Trioza erytreae (África), que se adapta a climas mas fríos, es muy sensible al
calor y al clima seco las mejores condiciones para su desarrollo se encuentran
entre los 500 y 600 msnm.
- Diaphorina citri Kuwayama (Asia) esta especie tiene mayor distribución en el
mundo, se caracteriza por un corto periodo de vida y una alta fecundidad.
4.2.2 Diaphorina citri
Se limita a las rutáceas, tanto las especies silvestres como en los cítricos
comerciales, especialmente limones (Citrus limon), limón rugoso (Citrus jambhuri),
naranja agria (Citrus aurantium), toronja (Citrus paradisi) y limas (Citrus
aurantiifolia). Limonaria (Murraya paniculata) es una planta rutácea que se utiliza a
menudo como ornamental, es una de las
plantas preferidas de Diaphorina citri.
(htpp://eppo.org/QUARANTINE)
Figura A. Planta ornamental muy común
conocida como limonaria
(Murraya paniculata)
9
4.2.3 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y FISIOLÓGICAS DE Diaphorina
citri
• Tamaño: 3 a 4 mm de longitud; color marrón claro, con moteados recubiertos de
polvo ceroso.
• Cabeza: café con ojos rojos.
• Antenas: Con 11 segmentos, ápice negro con dos manchas café claro en la parte
media.
• Alas: Son anchas en tercio apical y transparentes con manchas marrón claro en
el borde, el cual es un carácter importante para la identificación.
• Huevos: Alargados de 0.3 mm de longitud, color amarillo claro a anaranjado.
• Ubicación: Ápices de las hojas nuevas y brotes, en forma vertical.
• Reproducción: La hembra oviposita hasta 800 huevos durante su vida y se
reproduce en forma sexual.
• Ciclo de vida:
Consta de 15 a 47 días dependiendo de las condiciones del clima.
Los adultos pueden vivir algunos meses.
Tienen 9 a 10 generaciones al año.
Ciclo de vida de Trioza erytrae: de 17 a 43 días
• Las ninfas mueren a temperaturas de -1°C. Los adultos a temperaturas de -10°C.
• Las mayores densidades de población se presentan en los meses secos, la cual
disminuye al aumentar la precipitación. (Mead, 1977).
El daño directo es causado por ninfas y adultos (Fig. 2) al extraer grandes
cantidades de savia de las hojas y pecíolos, lo cual debilita las plantas, al mismo
tiempo introducen sustancias tóxicas en los tejidos, dejando manchas cloróticas
en las hojas donde se han alimentado. El mayor daño e impacto económico de
Diaphorina citri es provocado por la transmisión del HLB.
10
La bacteria se trasmite de manera persistente, hay un periodo de latencia
después de que el psílido contrae la bacteria; ésta se multiplica en el insecto
vector antes de que pueda trasmitirla. Dado el período de latencia, casi todos los
psílidos capaces de transmitir el HLB son ninfas en la fase final o adultos, estos
siguen siendo capaces de transmitir la enfermedad durante toda su vida después
de haber contraído la bacteria.
Las ninfas al alimentarse de plantas infectadas por 15 a 30 minutos,
requieren un período de 21 días para incubar y transmitir la bacteria.
Los adultos son capaces de transmitir la enfermedad, con sólo alimentarse
durante 15 minutos de plantas enfermas.
Y la eficiencia aumenta al 100% cuando éstos se alimentan por 1 hora.
Figura B: A. Adulto de Diaphorina citri.
B. Estadíos juveniles con túbulos cerosos
C. huevecillos. Tomado de R. H. Brlansky y M. E. Rogers (University of Florida-IFAS Citrus Research and Education Center)
11
4.3 HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
4.3.1 GENERALIDADES
El manejo integrado de plagas (MIP), que se basa en principios totalmente
ecológicos, considera todo el agroecosistema en su conjunto. Como tal,
comprende la aplicación armónica de diferentes métodos de control, como la lucha
biológica y las prácticas culturales que requiere el cultivo, teniendo en cuenta los
niveles poblacionales de las plagas y enfermedades a controlar, la presencia de
los biorreguladores naturales, las etapas fenológicas del cultivo y las condiciones
ambientales presentes.
Uno de los componentes del MIP es el control biológico de las plagas
agrícolas mediante parasitoides, predadores (entomófagos) y organismos
entomopatógenos que pueden ser hongos, bacterias, virus, nematodos y
protozoarios. Los hongos entomopatógenos son los que han recibido mayor
atención por la gran variedad de especies y amplio rango de hospedantes así
como por su crecimiento microscópico sobre la superficie de su huésped. Todos
los insectos son susceptibles de ser afectados por algún hongo.
Ciertos hongos poseen características muy especiales que les permiten
sobrevivir en forma parasítica sobre los insectos y en forma saprofita sobre
material vegetal en descomposición. El crecimiento saprofito puede dar como
resultado la producción de conidióforos, conidias y desarrollo miceliano. Esta
característica permite que el hongo pueda ser cultivado en el laboratorio utilizando
técnicas de producción en masa de bajo costo.
Los hongos tienen un gran potencial para ser empleados como
biocontroladores.
12
Entre los principales hongos que presentan estas características están:
Beauveria, Metarhizium y Paecilomyces.
Las principales ventajas de estos hongos son:
1. Presentan grados variables de especificidad, pueden ser específicos a nivel de
familia o especies muy relacionadas. En el caso de las cepas, pueden ser
específicas a nivel de especie, sin afectar a los enemigos naturales.
2. Si el entomopatógeno encuentra las condiciones adecuadas para introducirse y
colonizar un ecosistema, se reproduce y renueva en forma continua, es decir, se
vuelve persistente, haciendo innecesarias nuevas aplicaciones.
3. Se pueden aplicar mezclas de hongos entomopatógenos con dosis sub letales
de insecticidas para lograr efectos sinérgicos superiores a los logrados con
aplicaciones de cada producto por separado.
4. No contaminan el medio ambiente ni afectan al hombre u otros animales
superiores.
5. Cuando el hongo no llega a causar la muerte directamente, se presentan
efectos secundarios que alteran el normal desarrollo del ciclo de vida del insecto.
Pero también presentan algunas desventajas, como:
1. Sensibilidad a la variación de las condiciones climáticas como temperaturas
extremas, desecación y luz ultravioleta. Estas limitantes están siendo
contrarrestadas mediante el uso de aditivos (protectores solares, aceites,
antidesecantes).
2. Requieren de condiciones de almacenamiento más exigentes que las moléculas
inorgánicas, para evitar que pierdan su patogenicidad.
3. En general, los insecticidas biológicos no matan instantáneamente. Alcanzan
buenos niveles de control entre una y tres semanas después de la aplicación,
dependiendo de la plaga y del ambiente.
13
4.3.2 CLASIFICACIÓN DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
De acuerdo a la clasificación realizada por Ainsworth (1973), los hongos
son separados en dos divisiones: Myxomycota, aquellos que forman plasmodios, y
Eumycota, aquellos que no forman plasmodios y son frecuentemente micelianos.
Los hongos entomopatógenos se encuentran en la división Eumycota dentro de
cinco subdivisiones: Mastigomycotina (forman zoosporas, oosporas y presentan
estado perfecto), Zygomycotina (no presentan zoosporas, presentan estado
perfecto y forman zygosporas), Ascomycotina (presentan estado perfecto y forman
ascosporas), Basidiomycotina (presentan estado perfecto forman basiodiosporas)
y Deuteromycotina (no presentan estado perfecto ni zoosporas y forman conidias).
Las clases de mayor importancia desde el punto de vista del control de
plagas agrícolas son Zygomycetes e Hyphomycetes (Tanada y Kaya, 1993).
4.3.3 MECANISMO DE INFECCIÓN DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
La enfermedad producida por hongos se llama micosis. Tanada y Kaya
(1993) mencionan que el desarrollo de la micosis puede ser separado en tres
fases.
Figura C: Mecanismo
de infección de hongos
entomopatógenos.
14
4.3.3.1 ADHESIÓN Y GERMINACIÓN DE LA ESPORA EN LA CUTÍCULA DEL
INSECTO
El proceso de adhesión, dependiendo del hongo, puede ser un fenómeno
específico o no específico. Mientras que la germinación de las esporas es un
proceso mediante el cual una espora emite uno o varios pequeños tubos
germinativos que al crecer y alargarse dan origen a las hifas, este proceso
depende de las condiciones de humedad y temperatura ambiental. En menor
grado la luz condiciona el ambiente alimenticio.
La espora que germina en el insecto forma un tubo germinativo el cual
funciona como una hifa de penetración de la cutícula. También puede producir una
estructura llamada apresorio, la cual ayuda a la adhesión de la espora. El éxito de
la germinación y penetración no dependen necesariamente del porcentaje de
germinación sino del tiempo de duración de la germinación, modo de germinación,
agresividad del hongo, tipo de espora y susceptibilidad del hospedante (Samson,
et al, 1988).
Los hongos, además, pueden infectar a los insectos a través de las
aberturas corporales como son cavidad bucal, espiráculos y otras aberturas
externas. Las esporas pueden germinar rápidamente en estos ambientes por ser
húmedos. Cuando lo hacen en los fluidos digestivos, pueden destruir a la hifa
germinativa. En este caso, el insecto no muere de micosis sino a causa de las
toxinas.
15
4.3.3.2. PENETRACIÓN DENTRO DEL HEMOCELE
Esta penetración por parte de la hifa es el resultado de la degradación
enzimática de la cutícula y la presión mecánica ejercida por el tubo germinativo.
Además, depende de las propiedades de la cutícula, grosor, esclerotización,
presencia de sustancias nutricionales y antifungosas (Charnley, 1984) y estado de
desarrollo del insecto.
La digestión del integumento se produce mediante las enzimas (proteasas,
aminopeptidasas, lipasas, esterasas y quitinasas). Cuando la hifa ha llegado al
hemocele, se pueden producir diferentes reacciones de defensa del insecto frente
a un cuerpo extraño: la fagocitosis, encapsulación celular y la formación de
compuestos antimicrobianos como las lisozimas, aglutininas y melanización.
En este caso, el hongo debe vencer el sistema inmunológico del
hospedante antes de entrar a la hemolinfa y desarrollarse dentro del insecto.
4.3.3.3. DESARROLLO DEL HONGO QUE RESULTA EN LA MUERTE DEL
INSECTO
Luego de que llegue al hemocele, el hongo puede evitar la defensa inmune del
insecto produciendo células parecidas a levaduras, llamadas blastosporas, que se
multiplican y dispersan rápidamente, desarrollando protoplastos, elementos
discretos ameboideos, sin pared celular que no son reconocidos por los hemocitos
del hospedante (Pérez, 2004) y produciendo micotoxinas (Tanada y Kaya, 1993).
16
La dispersión de éstos en el hemocele depende de la especie del hongo.
Las toxinas producidas juegan un rol muy importante en el modo de acción de los
hongos entomopatógenos. La muerte del insecto se produce con mayor rapidez
cuando es afectado por un hongo entomopatógeno que produce cantidades
considerables de toxinas, ya que se adiciona la toxemia a la destrucción de los
tejidos y a las deficiencias nutricionales.
A continuación del crecimiento del hongo en el hemocele, se producen los
síntomas fisiológicos del insecto afectado como convulsiones, carencia de
coordinación y comportamientos alterados (deja de alimentarse, reduce su
movimiento), entra en un estado letárgico y finalmente muere, lo que puede ocurrir
relativamente rápido o en unos cuantos días. Ocurre una competencia entre el
hongo y la flora intestinal. Los hongos pueden producir sustancias antibacterianas
que alteran la coloración del cadáver (Ferrón, 1978).
Con la muerte del insecto termina el desarrollo parasítico del hongo y
empieza la fase saprofítica: el hongo crece en el hemocele formando masas
micelianas que salen al exterior fundamentalmente por las regiones
intersegmentales –esporulando sobre el cadáver y produciendo inóculo para
infectar a otros insectos– y por las aberturas naturales (espiráculos, boca y ano).
La gran dependencia de la humedad es el mayor factor limitante que
presentan los hongos, ya que para que se produzca la germinación y esporulación
fuera del hospedante se requieren valores de humedad relativa superiores a 90%.
17
4.4 MEDIO DE CULTIVO
4.4.1 DEFINICIÓN
El medio de cultivo es una sustancia o solución que permite el desarrollo de
microorganismos, mientras que el cultivo es el producto del crecimiento de un
organismo. Los medios utilizados en micología deben contener los nutrientes
suficientes para asegurar el desarrollo y reproducción de los hongos (carbono,
nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc.) y un pH ligeramente ácido (6 – 6.3)
para facilitar su crecimiento e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros
microorganismos. Se puede añadir antibióticos antibacterianos para inhibir el
crecimiento de bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras.
Los medios pueden ser sólidos o líquidos. Para conseguir un medio sólido
se debe agregar una sustancia solidificante como el agar (gelatina vegetal) o el
agar agar (polisacáridos provenientes de algas), el cual no tiene valor nutritivo sino
que sirve simplemente para mantener la humedad por un tiempo más o menos
prolongado. La humedad es fundamental para el desarrollo de los hongos, porque
cuando ésta comienza a disminuir, la formación de micelio también disminuye y el
hongo tiene que asegurar su perpetuidad formando estructuras propagativas
(esporas, conidias) y de conservación (clamidosporas).
El agar empieza a derretirse a partir de 80 °C y soporta temperaturas altas
sin descomponerse, solidificándose entre los 35 y 50 °C.
Los medios de cultivo se vierten en placas Petri o en tubos inclinados. Los
primeros ofrecen la ventaja de tener mayor superficie para el desarrollo del hongo
y se utilizan para trabajos rutinarios de aislamientos, aspecto del cultivo, velocidad
de crecimiento, etc. sin embargo, son más fáciles de contaminarse. Los tubos, a
pesar de tener una superficie mucho más reducida, ofrecen seguridad en su
manipulación y buena resistencia a la deshidratación y a la contaminación.
18
Se utilizan para conservar cultivos por tiempo más o menos prolongado.
Los medios se seleccionan en base al tipo de muestra que queremos reproducir.
El pH recomendado para el cultivo de hongos en el laboratorio es de
alrededor de 7, un pH neutro o ligeramente ácido (6.8). Para seguridad del que
opera y evitar contaminaciones, los medios de cultivo se deben manipular en
campanas de flujo laminar.
4.4.2 SABORAUD
Es un medio de cultivo muy utilizado para aislar hongos de animales. Sirve
para el aislamiento y mantenimiento de hongos en tubo inclinado o caja petri.
Debido a su composición, los hongos crecen exuberantemente y esporulan bien.
Es el medio estándar para observar la morfología típica de los hongos, pero
no es el medio ideal de crecimiento o para estudiar la esporulación.
Extracto de malta 10 g
Extracto de levadura 10 g
Saboraud 65 g
Agua destilada 1000 ml
19
V. HIPÓTESIS
De acuerdo a la literatura, la rapidez del crecimiento así como la
agresividad y esporulación de los hongos entomopatógenos dependen de varios
factores; tanto climáticos, biológicos y de nutrición. En esta práctica se realizará
una evaluación y comparación de cinco cepas de hongos (Beauveria bassiana,
Metarhizium anisopliae (Ma59) y de Isaria fumosorosea (Pf14, Pf16, Pf20), con las
mismas condiciones de crecimiento.
Se intentará demostrar que la cepa del hongo Metarhizium anisopliae es la
que presenta un crecimiento mas acelerado en condiciones de laboratorio. Así
como la comparación de resultados, con la producción masiva de los mismos
sobre sustrato a base de arroz.
20
VI. DESARROLLO DEL PROYECTO
6.1 METODOLOGÍA
En la presente se llevaron a cabo dos metodologías diferentes para el
trabajo con hongos entomopatógenos en dos áreas del laboratorio: la experimental
y la de producción masiva, las cuales se realizaron en el laboratorio Bio-Huas,
perteneciente a las instalaciones del CESAVEH en Huejutla de Reyes, Hidalgo.
Las actividades tuvieron un lapso de realización de cuatro meses a partir de enero
de 2012.
Para ello se inició con una revisión de bibliografía para contar con
referencias para la realización del proyecto y establecer como objetivo analizar
que especie de cepa de hongo entomopatógeno tendrá el más rápido crecimiento
en condiciones de laboratorio y después hacer una comparación con el
crecimiento del hongo en condiciones de producción masiva.
Se establecerá un experimento con cinco tratamientos y cinco repeticiones.
Los tratamientos serán las cepas de Metarhizium anisopliae (Ma59), de Isaria
fumosorosea (Pf14, Pf16, Pf20) y Beauveria bassiana. Las unidades
experimentales serán cajas Petri con el mismo porcentaje de medio de cultivo y
condiciones de esterilización y manejo.
Para la evaluación de las cinco cepas de hongos entomopatógenos que se
emplearán en este trabajo, se utilizaran las que pertenecen a la colección del
centro nacional de referencias de control biológico, estas fueron seleccionadas
previamente con base a la prueba de separación de medias de Turkey; los
ensayos de laboratorio mostraron porcentajes de mortalidad de 100% en ninfas y
95.22% en adultos de D. citri.
21
6.2 DESARROLLO
6.2.1 DESARROLLO DEL EXPERIMENTO
6.2.1.1 MATERIALES UTILIZADOS
Para el desarrollo del experimento se utilizaron los siguientes materiales con el
fin de facilitar la obtención de resultados y obtener mayor comodidad en su
realización.
25 cajas Petri de cristal
Matraz Erlenmeyer de 2000 ml
Probetas graduadas de 1000 ml
Termociclador
Balanza Granataria
Campana de flujo laminar
Mechero de alcohol
Asas bacteriológicas
Indumentos de laboratorio (bata, cubre-bocas, cofia, guantes de asbesto)
Ollas de presión
Estufa
Parafilm
Cinta adhesiva
Bolígrafo
Bolsas de nylon
Algodón
Envases varios de cristal
Estereoscopio
22
6.2.1.2 SELECCIÓN DE CEPAS
Se utilizaron las 5 cepas de hongos entomopatogénos con las que contaba
el laboratorio Bio-Huas; Beauveria Bassiana (aislada en el propio laboratorio),
Metarhizium anisopliae (obtenida del laboratorio de Sanidad Vegetal de Puebla) e
Isaria fumorosea en sus variedades Pf14, Pf16 y Pf20 (obtenidas del mismo
laboratorio en Puebla) pertenecientes a la colección del centro nacional de
referencias de control biológico.
6.2.1.3 LAVADO DE CRISTALERÍA Y ESTERILIZACIÓN DE ÁREAS -
MATERIALES
En este apartado se puso especial atención a la asepsia de utensilios y
áreas de trabajo. Se lavó con agua y jabón toda la cristalería a utilizar en el
experimento, además se esterilizó con alcohol y lo que fue posible en ollas de
presión siguiendo el lineamiento del laboratorio.
Las áreas de trabajo fueron aseadas con especial cuidado y en la zona de
siembra se esterilizó con alcohol 95° de manera total.
El proceso de esterilización de materiales consistió en colocar el material a
esterilizar dentro de las ollas de presión sobre fuego, hasta llegar a una presión de
150 Psi marcados en el manómetro y contabilizando 20 minutos después de llegar
a la presión idónea manteniéndola constante. Dentro de la olla la temperatura
llega a 120° C; los suficientes para eliminar la mayoría de agentes bióticos y
algunas impurezas.
Los materiales que se esterilizaron fueron las 25 cajas Petri colocadas en
bolsas de nylon de cinco en cinco, el matraz que contenía el medio de cultivo y
agua potable en envases de cristal varios. El material esterilizado fue colocado en
la campana de flujo laminar para su posterior uso.
23
6.2.1.4 PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
Se estableció un promedio de 10 ml de medio por cada caja Petri, dando un
total de 250 ml necesario para cubrirlos en su totalidad y siguiendo el lineamiento
ideal de preparación siguiente se determinó que:
Agua-----------------------------------------1000ml
SABORAUD-----------------------------------65gr
Extracto de Malta----------------------------10gr
Extracto de Levadura-----------------------10gr
Se utilizó una regla de tres para la determinación del peso de los
ingredientes ideal para los 250 ml necesarios de medio de cultivo.
1000 ml agua------------------ 65 gr SABORAUD
250 ml agua------------------“16.5” gr SABORAUD
1000 ml agua------------------ 10 gr Malta
250 ml agua------------------ “2.5” gr Malta
1000 ml agua------------------ 10 gr Levadura
250 ml agua------------------ “2.5” gr Levadura
Una vez establecido el peso de cada ingrediente para la solución, se
procedió a verter en un matraz con 250 ml de agua potable los ingredientes antes
pesados junto con una pastilla de antibiótico comercial como procedimiento
establecido. El matraz fue colocado sobre el termociclador para disolver la mezcla
a una velocidad en nivel 7 y temperatura en nivel 4 durante aproximadamente 30
minutos, necesarios para observar un color caramelo que indicara el punto idóneo
de agitación. El matraz fue sellado con papel aluminio y esterilizado en una olla de
presión.
24
6.2.1.5 VACIADO EN CAJAS PETRI
El vaciado del medio dentro de las cajas Petri se realizó dentro de la
campana de flujo laminar con el indumento necesario y adecuada esterilización de
las manos con alcohol, igualmente se esterilizó la campana de flujo laminar y con
ayuda del mechero y un guante de asbesto -ya que la solución estaba caliente- se
realizó el vertido de aproximadamente 10 ml del medio en cada una de las cajas
Petri con la técnica básica, para que posteriormente fueran selladas con cinta
Parafilm.
6.2.1.6 SIEMBRA
El proceso de siembra inició nuevamente con la desinfección del área de
inoculación. Los materiales previamente esterilizados y las cajas Petri a utilizar se
encontraban ya en la campana de flujo, por lo que lo único necesario fue portar
vestimenta de laboratorio y esterilizar las manos para el manejo de los inóculos.
Las cepas a utilizar se encontraban en refrigeración en un empaque térmico para
conservarlos en buen estado y por ende se tuvieron que aclimatar a temperatura
ambiente durante 10 minutos.
Dentro de la campana se encontraban las 25 cajas petri, asas
bacteriológicas sumergidas en alcohol, un mechero de alcohol y cinta Parafilm,
sucesivamente se colocaron los sobres con la cepas de Metarhizium anisopliae
(Ma59), Isaria fumosorosea (Pf14, Pf17, Pf20) y el tubo de ensaye que contenía la
cepa de Beauveria bassiana.
Se quito la cinta Parafilm que sellaba las cajas Petri, se activó la campana
de flujo laminar, se encendió el mechero y se quemaron las asas de siembra para
su utilización. Una vez echo esto, el proceso de sembrado dio comienzo.
25
La primera en ser sembrada fue la cepa de Metarhizium anisopliae, más por
azar que por practicidad. Se destapó el sobre que contenía el hongo dentro de la
campana de flujo y con sumo cuidado se introdujo el asa previamente humedecida
con alcohol dentro del sobre para colectar algunas esporas, una vez que las
esporas estaban en el asa y la caja Petri cerca del mechero para evitar
contaminantes; se trazaron 11 líneas de siembra con el fin de hacer mas fácil el
conteo de las colonias.
Este proceso se realizó cinco veces con la cepa de Metarhizium anisopliae
siendo cuidadosos en quemar el asa en cada ocasión para evitar residuos
indeseables entre siembras. Cada caja fue sellada nuevamente con Parafilm y
señaladas con cinta adhesiva por el nombre de la cepa.
Posteriormente se sembraron con el mismo procedimiento pero con
diferente asa las cepas de Isaria fumosorosea en orden ascendente respecto al
nombre de su variedad (Pf14, Pf16, Pf20) cada caja fue señalada con el nombre
correspondiente y sellada con Parafilm.
Por ultimo se sembró desde el tubo de ensaye la cepa de Beauveria
bassiana aislada en el laboratorio, siguiendo la misma metodología, se sellaron y
señalaron con el respectivo nombre cada una de las cajas.
El resultado fueron cinco cajas Petri inoculadas con Metarhizium anisopliae
(Ma), cinco cajas inoculadas con Isaria fumosorosea (Pf14), cinco cajas con Isaria
fumosorosea (Pf16), cinco cajas Petri con Isaria fumosorosea (Pf20), y cinco mas
con Beauveria bassiana; dando un total de 25 cajas inoculadas.
Después de hacer la siembra se lavó y guardó el material que ya no era
necesario utilizar. Las cajas Petri ya inoculadas pasaron al área de incubación.
26
6.2.1.7 INCUBACIÓN
Las muestras se colocaron en orden en el área de incubación a temperatura
casi constante de 35°C durante 15 días a partir de la siembra para su óptimo
desarrollo y realizar las observaciones pertinentes.
En este proceso se realizaron observaciones del desarrollo de las cepas día
a día, mostrado en los siguientes párrafos:
Cronología
Las observaciones se realizaron continuamente excepto los fines de
semana, con anterioridad se había hecho la siembra de las cepas en medio de
cultivo que fueron obtenidas del laboratorio de Puebla con resultados
desalentadores, ya que todas las muestras presentaban signos de contaminación.
Al tercer día se pudo observar el crecimiento de cada caja Petri y se
contabilizaron las colonias.
Tabla 1.1
Metarhizium anisopliae (Ma59)
colonias/línea Día 1 Día 4 Día 7 Día 10 Día 13 Día 15 Observaciones
Caja 1 0 23 25 25 25 25 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 2 0 22 23 24 24 25 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 3 0 20 21 21 21 22 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 4 0 19 22 23 23 23 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 5 0 21 26 27 27 27 La muestra presentó
contaminación severa
27
Tabla 1.2
Isaria fumosorosea (Pf14)
Día 1 Día 4 Día 7 Día 10 Día 13 Día 15 Observaciones
Caja 1 0 7 7 6 5 5 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 2 0 6 5 5 5 5 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 3 0 2 2 2 2 2 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 4 0 9 8 8 8 6 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 5 0 11 10 9 9 9 La muestra presentó
contaminación severa
Tabla 1.3
Isaria fumosorosea (Pf16)
Día 1 Día 4 Día 7 Día 10 Día 13 Día 15 Observaciones
Caja 1 0 13 13 10 10 5 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 2 0 10 8 8 8 8 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 3 0 11 11 10 9 3 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 4 0 9 8 8 8 6 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 5 0 14 14 14 14 14 La muestra presentó
contaminación severa
Tabla 1.4
Isaria fumosorosea (Pf20)
Día 1 Día 4 Día 7 Día 10 Día 13 Día 15 Observaciones
Caja 1 0 6 5 3 3 2 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 2 0 5 5 5 5 3 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 3 0 6 6 6 5 5 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 4 0 5 5 5 3 1 La muestra presentó
contaminación severa
Caja 5 0 8 7 7 6 4 La muestra presentó
contaminación severa
28
Tabla 1.5
Beauveria bassiana
Día 1 Día 4 Día 7 Día 10 Día 13 Día 15 Observaciones
Caja 1 0 41 53 54 57 61 La cepa se desarrollo sin
contaminantes
Caja 2 0 46 51 51 54 59 La cepa se desarrollo sin
contaminantes
Caja 3 0 52 53 56 61 63 La cepa se desarrollo sin contaminantes
Caja 4 0 56 59 63 66 67 La cepa se desarrollo sin
contaminantes
Caja 5 0 46 51 57 63 64 La cepa se desarrollo sin
contaminantes
El conteo de las colonias se hizo tomando como referencia la línea
intermedia de las cajas Petri con ayuda de un estereoscopio y es aproximado.
29
6.2.2 DESARROLLO DEL PROCESO DE PRODUCCIÓN MASIVA
6.2.2.1 MATERIALES
Para la producción en masa de hongos entomopatógenos se utilizaron los
siguientes materiales para optimizar el crecimiento y esporulación de hongo.
Tinas
Malla mosquitera
Escurridor
Bolsas de nylon
Engrapadora
Arroz
Ollas de presión
Jeringa de inoculacion
Solución (a base de agua potable y antibiótico de amplio espectro)
Campana de flujo laminar
Cinta adhesiva
Marcador permanente
Deshumificador
Extractor de esporas
Sellador
Estufa
Marcador indeleble
Matraces
Vaso de precipitados
Termociclador
Mortero
Tijeras
30
6.2.2.2 DESINFECCIONES DE CRISTALERÍA Y LIMPIEZA DE LAS ÁREAS DE
PRODUCCIÓN
Este apartado es de gran importancia por que de el dependió el resultado
de la práctica. El medio ambiente se encuentra cargado generalmente de
microorganismos diversos que pueden contaminar el área de trabajo, por ello
conviene no descuidar la limpieza de los materiales, instrumentos y equipo
necesario para el trabajo.
Se lavó con agua limpia todo el material con agua limpia y se limpió
detalladamente cada área del laboratorio, se limpiaron los pisos, ventanas y
paredes con jabón y cloro, así como la limpieza con alcohol de algunos materiales
e instrumentos.
6.2.2.3 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN
Se preparó una solución con el fin de actuar como dispersante y
humectante para las esporas desecadas contenidas en los sobres. La cantidad de
solución dependió de la cantidad de bolsas con arroz a inocular, teniendo una
tendencia aproximada de 10 ml (capacidad de la jeringa de inoculación) por cada
bolsa. La solución se preparó con la siguiente formulación:
2000 ml ----------- 1 pastilla antibiótico molido
En un matraz de 2000 ml se vacío una pastilla de antibiótico de amplio
espectro molido en el mortero y se colocó en el termociclador para que la mezcla
se volviera homogénea. Una vez que estaba lista la solución se puso a esterilizar
en una olla de presión con la metodología establecida.
31
6.2.2.4 LAVADO DE ARROZ
Se lavaron aproximadamente 20 kg de arroz en cada ocasión con el fin de
eliminar la mayor cantidad de impurezas y contaminantes como polvo, insectos
muertos, pelos de rata y demás contaminantes.
El proceso consistió en colocar el arroz a lavar en dos tinas separadas para
hacer más fácil su limpieza, se vacío agua en las tinas y se agito con las manos;
tres repeticiones de agitación manual y escurrimiento se utilizaron para cada tina.
Al final al arroz escurrido en cada tina, se le agregó agua potable para la
desinfección con antibiótico. En cada tina se contuvo un aproximado de 20 lt de
agua y siguiendo la siguiente formulación se mezcló el antibiótico ya pesado:
1 lt --------- 2.5 gr antibiótico amplio espectro
20 lt -------- 50 gr antibiótico amplio espectro
Una vez mezclado el antibiótico, el agua y el arroz se dejó reposar durante
30 minutos, no sin realizar un movimiento manual de mezclado cada 10 minutos
durante la espera para su mayor efectividad.
Posteriormente a la espera se procedió a eliminar el exceso de agua de las
tinas con antibiótico con ayuda de la malla mosquitera pera evitar pérdidas de
arroz limpio.
Consecuentemente el arroz escurrido se colocó en escurridores que
consistían en mesas de metal con malla para su escurrimiento por gravedad. Este
proceso se realizó en el exterior del laboratorio por el factor sol que beneficiaba el
secado. En ese estado se dejo escurriendo 40 minutos más.
32
6.2.2.5 EMBOLSADO DE ARROZ
Una vez escurrido el arroz se embolsó en cantidad de aproximadamente
200 gr por bolsa de nylon, cantidad medida con ayuda de un vaso marcado como
referencia y colocado en tinas para su traslado a un área mas cómoda para
engraparlas.
Se utilizó un doblado especial señalado en el laboratorio para evitar el
escape de aire de la bolsa, dejando además una cantidad adecuada de aire dentro
para que el intercambio de oxigeno se realizara adecuadamente. Ya engrapadas
se pasaron al área de esterilización.
6.2.2.6 ESTERILIZACIÓN
La esterilización por calor húmedo o a presión se obtiene con el uso de
autoclave, pero en nuestro caso solo contábamos con olas de presión aunque
tienen el mismo principio de funcionamiento. A mayor presión, mayor es la
temperatura de ebullición del agua: cuando la presión aumenta a 15 psi cm2, la
temperatura llega a 121°C.
Pocos microorganismos toleran esta temperatura durante 20 minutos. El
tiempo es el factor que permite que el calor penetre en la masa de esteriliza con y
se absorba. De acuerdo a estos estándares se realizó la esterilización del arroz,
de la solución para la inoculación y del material utilizado para la inoculación.
Se colocaron dentro de la olla de presión estos artículos durante 20 minutos
a fuego constante para mantener la presión de 15 psi constante igualmente. El
arroz fue colocado en lotes de 20 bolsas por cada olla de presión.
33
Posterior se llevaron al área de inoculación para que se enfriaran y al día
siguiente se realizara la siembra. El arroz esterilizado se coloco en la sala de
inoculación acomodado sobre las mesas de trabajo en un aproximado de 120
bolsas cada vez durante el proceso.
6.2.2.7 INOCULACIÓN
Con la solución preparada anteriormente se mezclaron las cepas de los
hongos con cantidad aproximada de 10 gr por cada 2000 ml de solución y se
agitaron para su dispersión. Se procedió al armado de la jeringa veterinaria cerca
del mechero para mayor asepsia y se coloco la parte para succión dentro de la
disolución con hongos preparada.
Las bolsas con arroz fueron marcadas con marcador indeleble en un punto
intermedio específico para referencia de la inoculación. Después se tomaron cada
una de las bolsas para introducir la jeringa y vaciar su contenido dentro de la bolsa
con arroz, no sin antes quemar la punta de la jeringa en el mechero, la bolsa
inoculada fue sellada nuevamente con cinta adhesiva y se realizó un movimiento
lateral para la dispersión del inoculo dentro de a bolsa. El material sobrante fue
desechado y el material utilizado fue lavado y guardado en su respectivo sitio.
Este proceso siguió hasta consumar la inoculación total de las bolsas de
arroz estériles y posteriormente fueron colocadas en tinas para su traslado al área
de crecimiento. Cabe mencionar que este proceso se realizo día con día con cada
cepa de hongos con que el laboratorio contaba para obtener una producción
continua. Los lotes fueron de 120 – 150 bolsas cada día aproximadamente.
34
6.2.2.8 CRECIMIENTO
El crecimiento del hongo es la etapa donde las esporas germinan en un
determinado tiempo, y para esto debe reunir ciertas condiciones de humedad
cercanas al 90% y a una temperatura de 27°C, bajo estas condiciones fueron
sometidas las bolsas para su germinación y crecimiento durante un periodo de 15
días, las bolsas inoculadas se colocaron en un área un tanto oscura, acomodadas
sobre anaqueles de metal debidamente señalados con el nombre de la cepa y la
fecha.
Cada 5 días las bolsas eran agitadas para una mejor esporulación así como
la revisión de cada bolsa, para determinar que inóculos fueron contaminados y
decidir su conservación o desecho.
6.2.2.9 DESHUMIFICACIÓN
A los 15 días el hongo ya acabó de esporular y por lo tanto debería estar
listo para ser preparado para su cosecha. En este proceso se procedió a cortar
cada una de las bolsas para enrollar el sobrante de bolsa y que el arroz inoculado
quedara expuesto, esto con el fin de promover la deshidratación de las esporas
para realizar su cosecha más fácil.
La apertura de las bolsas se realizó con la ropa adecuada para evitar la
ingesta o aspiración accidental de esporas. Una vez abiertas todas las bolsas, se
colocaron los extractores de humedad dentro de las salas y se mantuvieron ahí
durante cuatro días para asegurar el secado de las esporas. En este proceso la
revisión diaria fue bien aceptada ya que fue necesario eliminar las bolsas
contaminadas o dañadas.
35
6.2.2.10 COSECHA
Después de llegar al punto ideal de secado de las esporas se procedió a
llevar las bolsas al are a de cosecha, este proceso se realizó de manera
semiautomática con ayuda de una cosechadora mecánica, que consiste en un
mecanismo que separa el arroz de las esporas, proceso que se realizo bajo las
siguientes condiciones de seguridad y debido a la excesiva concentración de
esporas que pudiera ocasionar trastornos de salud
Para este proceso se uso la bata de laboratorio obligatoria, gafas de
seguridad, cubrebocas doble con carbón activado y cofia. El proceso consistió en
vaciar el contenido de las bolsas en la parte superior de la cosechadora, la
recolección del arroz se uso en una apertura bajo la cosechadora en un costal
reutilizado y la recolección de las esporas en otra apertura colectada en una bolsa
de nylon para su refrigeración y posterior uso.
Esta metodología se repitió con cada cepa de hongo contenida en el
laboratorio, y a pesar de las medidas de seguridad e higiene la mayoría de los
inóculos obtenidos estuvieron con contaminación, excepto la Beauveria bassiana
que presentó una pureza aceptable.
36
6.2.3 DETERMINACION DE CONCENTRACION DE ESPORAS LIBRES
6.2.3.1 MATERIALES
Se decidió además hacer una determinación de concentración de esporas
libres de las cepas de hongos para ello se utilizaron los siguientes materiales.
Matraz
Alcohol
Termociclador
Algodón
Balanza
Cámara neubauer
Microscopio
Contador mecánico
Calculadora
6.2.3.2 DESARROLLO
Se pesaron 0.5 gr de la cepa y se disolvieron en 500 ml de agua potable
dentro del matraz, después se colocó éste -sellado- en el termociclador durante 10
minutos para que se disolviera correctamente.
En el área de formulación se limpio la cámara neubauer y los cubreobjetos
con alcohol, se coloco una gota de agua en cada extremo de la cámara y sobre
ésta un cubreobjetos, se colocó en el microscopio para enfocar los cuadrantes.
Para realizar la cuantificación de esporas por unidad de volumen o peso, se
utiliza un hemacitómetro o cámara de neubauer que esta conformado por dos
áreas de conteo, cuando las esporas están suspendidas en agua se precipitan
rápidamente en un aproximado de 5 minutos necesarios para empezar el conteo.
37
Para el conteo se utilizo el área dividida por 25 celdas a su vez divididas en
líneas triples, se utilizaron cinco celdas por área, las cuatro de las esquinas y la
del centro; en total se contaron diez celdas, cinco arriba y cinco abajo, debido a
que se cuanta el numero de esporas contenido en el volumen de agua es
necesario seguir un criterio uniforme, se inicio el conteo por la parte inferior
izquierda con la consideración de que las esporas que toquen la línea en la parte
inferior o la parte exterior por el lado izquierdo se consideran en el conteo, en
cambio aun y cuando las esporas estén dentro pero en la parte superior o en el
lado derecho no se consideran en el conteo.
Este proceso se realizó una vez con cada cepa de hongo arrojando que:
Tabla 2.1
Metarhizium anisopliae (Ma59)
Cuadrante 1 Cuadrante 2 Cuadrante 3 Cuadrante 4 Cuadrante 5
Primer
extremo 183 203 195 256 194
Segundo
extremo 220 263 183 228 205
Total de
esporas 2130
Tabla 2.2
Isaria fumosorosea (Pf14)
Cuadrante 1 Cuadrante 2 Cuadrante 3 Cuadrante 4 Cuadrante 5
Primer
extremo 105 122 118 130 98
Segundo
extremo 120 163 143 128 117
Total de
esporas 1244
38
Tabla 2.3
Isaria fumosorosea (Pf16)
Cuadrante 1 Cuadrante 2 Cuadrante 3 Cuadrante 4 Cuadrante 5
Primer
extremo 112 160 134 188 112
Segundo
extremo 143 208 172 156 201
Total de
esporas 1586
Tabla 2.4
Isaria fumosorosea (Pf20)
Cuadrante 1 Cuadrante 2 Cuadrante 3 Cuadrante 4 Cuadrante 5
Primer
extremo 101 94 126 129 129
Segundo
extremo 142 165 128 141 145
Total de
esporas 1300
Tabla 2.5
Beauveria bassiana
Cuadrante 1 Cuadrante 2 Cuadrante 3 Cuadrante 4 Cuadrante 5
Primer
extremo 390 380 396 360 425
Segundo
extremo 361 345 355 401 395
Total de
esporas 3839
39
Para la determinación de la concentración se realizaron una serie de
operaciones para tenerla como referencia, para ello se procedió a realizar lo
siguiente:
Metarhizium anisopliae (Ma59)
Numero total de esporas entre el número de conteos.
2130/10 = 231
El resultado se multiplica por el número total de celdas en la subarea.
231*25 = 5775
El resultado se multiplica por el número de esporas contenidas en la diezmilésima
parte de un mililitro.
5775*10000 = 5.7x107
Si consideramos que se suspendió un gramo en un litro de agua se obtiene:
5.7x1010
Por lo tanto para formular una concentración de 1.3 x 1012
Si:
1 gr/lt ---------------------5.7x1010
X ----------------------1.3x1010
Donde:
X= 0.228
Por lo tanto esto se formula para una hectárea diluida en 100 litros de agua
debemos realizar la siguiente operación:
100*0.288 = 28.8 gr de esporas libre/ Ht
40
Isaria fumosorosea (Pf14)
Numero total de esporas entre el número de conteos.
1244/10 = 124.4
El resultado se multiplica por el número total de celdas en la subárea.
124.4*25 = 3110
El resultado se multiplica por el número de esporas contenidas en la diezmilésima
parte de un mililitro.
3110*10000 = 3.1x107
Si consideramos que se suspendió un gramo en un litro de agua se obtiene:
3.1x1010
Por lo tanto para formular una concentración de 1.3 x 1012
Si:
1 gr/lt ---------------------3.1x1010
X ----------------------1.3x1010
Donde:
X= 0.419
Por lo tanto esto se formula para una hectárea diluida en 100 litros de agua
debemos realizar la siguiente operación:
100*0.419 = 41.9 gr de esporas libres/ Ht
41
Isaria fumosorosea (Pf16)
Numero total de esporas entre el número de conteos.
1586/10 = 158.6
El resultado se multiplica por el número total de celdas en la subarea.
158.6*25 = 3965
El resultado se multiplica por el número de esporas contenidas en la diezmilésima
parte de un mililitro.
3965*10000 = 3.9x107
Si consideramos que se suspendió un gramo en un litro de agua se obtiene:
3.9x1010
Por lo tanto para formular una concentración de 1.3 x 1012
Si:
1 gr/lt ---------------------3.9x1010
X ----------------------1.3x1010
Donde:
X= 0.333
Por lo tanto esto se formula para una hectárea diluida en 100 litros de agua
debemos realizar la siguiente operación:
100*0.333 = 33.3 gr de esporas libre/ Ht
42
Isaria fumosorosea (Pf20)
Numero total de esporas entre el número de conteos.
1300/10 = 130
El resultado se multiplica por el número total de celdas en la subarea.
130*25 = 3250
El resultado se multiplica por el número de esporas contenidas en la diezmilésima
parte de un mililitro.
3250*10000 = 3.2x107
Si consideramos que se suspendió un gramo en un litro de agua se obtiene:
3.2x1010
Por lo tanto para formular una concentración de 1.3 x 1012
Si:
1 gr/lt ---------------------3.2x1010
X ----------------------1.3x1010
Donde:
X= 0.406
Por lo tanto esto se formula para una hectárea diluida en 100 litros de agua
debemos realizar la siguiente operación:
100*0.406 = 40.6 gr de esporas libre/ Ht
43
Beauveria bassiana
Numero total de esporas entre el número de conteos.
3839/10 = 383.9
El resultado se multiplica por el número total de celdas en la subarea.
383.9*25 = 9597.5
El resultado se multiplica por el número de esporas contenidas en la diezmilésima
parte de un mililitro.
9597.5*10000 = 9.5x107
Si consideramos que se suspendió un gramo en un litro de agua se obtiene:
9.5x1010
Por lo tanto para formular una concentración de 1.3 x 1012
Si:
1 gr/lt ---------------------9.5x1010
X ----------------------1.3x1010
Donde:
X= 0.136
Por lo tanto esto se formula para una hectárea diluida en 100 litros de agua
debemos realizar la siguiente operación:
100*0.136 = 13.6 gr de esporas libre/ Ht
44
VII. RESULTADOS
7.1 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
El analisis de resultados se vió menguado por la cantidad de contaminantes
presentes en cada una de las muestras, pero aun asi se trato de utilizar el metodo
de conteo estratificado mas preciso posible.Cada caja petri fue observada en el
estereoscopio y registrados sus datos para hacer un diseño experimental. Pero la
aproximacion de los datos supuesta hizo renegar de la viabilidad de este. Por
ende en el siguiente apartado se muestran la cantidad de colonias formadas en
cada una y por cada una de las cepas de los hongos entomopatogenos.Se
menciona ademas que en experimentos anteriores las cepas utilizadas y aun en
uso fueron las siguientes:
Metarhizium anisopliae (Ma59): Fue obtenida en sobres provenientes del
laboratorio de sanidad vegetal de Puebla.
Isaria fumosorosea (Pf14): Fue obtenida en sobres provenientes del laboratorio
de sanidad vegetal de Puebla.
Isaria fumosorosea (Pf16): Fue obtenida en sobres provenientes del laboratorio
de sanidad vegetal de Puebla.
Isaria fumosorosea (Pf20): Fue obtenida en sobres provenientes del laboratorio
de sanidad vegetal de Puebla.
Beauveria bassiana: Esta cepa fue aislada en el laboratorio del CESAVEH
De acuerdo al conteo de colonias en cada caja Petri durante dos semanas
se obtuvieron las siguientes graficas.
45
Graficas A: Metarhizium anisopliae (Ma59)
A partir de la siembra; las esporas formaron colonias aquí cuantificadas y
representadas, sin embargo las gráficas muestran que en un principio el
crecimiento fue acelerado pero a partir del cuarto día las colonias mermaron su
crecimiento debido a la gran cantidad de agentes contaminantes que le hacían
competencia por los nutrientes pero el numero de colonias se mantuvo casi
constante.
0
10
20
30
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 1
Caja 10
10
20
30
Día 1Día 4Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 2
Caja 2
0
10
20
30
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 5
Caja 5
0
10
20
30
Día 1Día 4Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 4
Caja 40
10
20
30
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 3
Caja 3
46
Graficas B: Isaria fumosorosea (Pf14)
A partir de la siembra; las esporas formaron colonias aquí cuantificadas y
representadas, sin embargo las gráficas muestran que en un principio el
crecimiento fue acelerado pero a partir del cuarto día las colonias mermaron su
crecimiento debido a la gran cantidad de agentes contaminantes que le hacían
competencia por los nutrientes, al catorceavo día las colonias contaminantes
cubrieron algunas de las colonias deseadas.
0
5
10
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 1
Caja 10
5
10
Día 1Día 4Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 2
Caja 2
0
5
10
15
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 5
Caja 5
0
5
10
Día 1Día 4Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 4
Caja 40
1
2
3
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 3
Caja 3
47
Graficas C: Isaria fumosorosea (Pf16)
A partir de la siembra; las esporas formaron colonias aquí cuantificadas y
representadas, sin embargo las gráficas muestran que en un principio el
crecimiento fue acelerado pero a partir del cuarto día las colonias mermaron su
crecimiento debido a la gran cantidad de agentes contaminantes que le hacían
competencia por los nutrientes, al catorceavo día las colonias contaminantes
cubrieron algunas de las colonias deseadas.
0
5
10
15
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 1
Caja 10
5
10
15
Día 1Día 4Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 2
Caja 2
0
5
10
15
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 5
Caja 5
0
5
10
Día 1Día 4Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 4
Caja 40
5
10
15
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 3
Caja 3
48
Graficas D: Isaria fumosorosea (Pf20)
A partir de la siembra; las esporas formaron colonias aquí cuantificadas y
representadas, sin embargo las gráficas muestran que en un principio el
crecimiento fue acelerado pero a partir del cuarto día las colonias mermaron su
crecimiento debido a la gran cantidad de agentes contaminantes que le hacían
competencia por los nutrientes, al catorceavo día las colonias contaminantes
cubrieron la gran mayoría de las colonias deseadas.
0
5
10
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 1
Caja 10
2
4
6
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 2
Caja 2
0
5
10
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 5
Caja 5
0
2
4
6
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 4
Caja 402468
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 3
Caja 3
49
Graficas E: Beauveria bassiana
A partir de la siembra; las esporas formaron colonias aquí cuantificadas y
representadas, en esta cepa en particular el crecimiento fue satisfactorio, libre de
contaminantes y abundante esporulación. Las graficas muestran un crecimiento
acelerado durante los primeros días y un crecimiento consecutivo pero más lento a
partir del día catorce.
0
50
100
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 1
Caja 10
50
100
Día1
Día4
Día7
Día10
Día13
Día15
Caja 2
Caja 2
0
50
100
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 5
Caja 5
020406080
Día 1Día 4Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 4
Caja 40
20406080
Día 1 Día 4 Día 7 Día10
Día13
Día15
Caja 3
Caja 3
50
VIII. CONCLUSIONES
Mediante los análisis realizados se determinó que en un principio, la cepa
de Beauveria bassiana(Bb) crecía a la par de la cepa de Metarhizium anisopliae
(Ma), sin embargo la cepa de Ma comenzó a presentar signos de contaminación
desde el cuarto día junto con las tres cepas de Isaria fumosorosea(Pf) y por lo
tanto su desarrollo fue frenado llegando incluso a perder algunas colonias, cabe
mencionar que el desarrollo de Pf fue mucho mas lento en este orden
respectivamente, Pf20, Pf14 y por ultimo Pf16.
Las cajas que contenían Bb fueron las únicas que no presentaron signos de
contaminación, pero en contrapeso la lógica hizo suponer que las cepas de los
hongos eran las que venían contaminadas desde su empaquetado. Esto debido a
que el desarrollo del experimento tuvo lugar el mismo día de siembra, con las
mismas condiciones de asepsia y demás factores. Además la Bb fue la última
cepa en ser sembrada y por lo tanto tenia mayor riesgo de presentar
contaminación lo que hizo dudar de la pureza de la cepa usada por este pequeño
detalle. Los signos de contaminación se presentaron el varia repeticiones e incluso
al inocular para la producción masiva.
En conclusión la cepa que mas se desarrollo a nivel laboratorio fue la de
Bb, sin embargo esto fue un análisis aproximado ya que las cepas de Ma y Pf para
hacer la comparación eran impuras.
51
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Da Graca, J. V. 1991. Citrus greening disease. Annu. Rev. Phytopathol. 29: 109-36 Orozco, S. S. 1995. Cibrian T. J 2000. Manejo integrado de plagas y control biologico ed. CECSA. Mexico. Enfermedades presentes y potenciales de los cítricos en éxico, Universidad Autónoma Chapingo, México. 150 p. Tanada y Kaya, 1993, Control biológico. Sociedad Mexicana de Control Biológico. Taller Internacional sobre Huanglongbing de los cítricos “Candidatus Liberibacter spp” y el psílido asiático de los cítricos (Diaphorina citri), (I, Hermosillo, Son. México: 2008). Cañedo Verónica, Ames Teresa, 2004. Manual de laboratorio para el manejo de hongos entomopatógemos, (CIP). Lima. Peru. Memoria/ Ed. Por Mangussi, Da Graca, Hall. D. {et al}, CD.Texeira, D.C., J. Ayres, E.W. Kitajima, L. Danet, S. Jagoueix-Eveillard, C. Saillard, and J.M. Bové. 2005. Hernández Velázquez, Víctor Manuel, Berlanga Padilla Angélica M., 2005, Formulación de hongos entomopatógenos, Centro Nacional de Referencias de Control Biológico, Colima, Mexico. First report of a huanglongbing-like disease of citrus in Sao Paulo State, Brasil and association of a new Liberibacter species, “Candidatus Liberibacter americanus”, with the disease. Sao Paulo, Brasil.
52
X. ANEXOS
Fig. 1 Pesando los ingredientes para el medio de cultivo.
Fig. 2 Preparación del medio de cultivo.
53
Fig. 3 Esterilización de materiales y medio de cultivo.
Fig. 4 Vaciado del medio de cultivo en cajas Petri.
54
Fig. 5 Cajas Petri con cinco días de inoculadas.
Fig. 6 Cajas Petri con quince días de inoculadas.
55
Fig. 7 Siembra
Fig. 8 Conteo de colonias.
56
Fig. 9 Laboratorio
Fig. 10 Área de crecimiento de la producción masiva.