EXTRACCIN DE ADN

Objetivos 1. Indicar las funciones biolgicas del ADN.2. Demostrar la presencia de AN en tejidos biolgicos.3. Explicar los principios fsico-qumicos en que se basa la extraccin y purificacin del ADN.4. Indicar los usos del ADN genmico humano en el diagnstico molecular, en gentica forense e ingeniera gentica. IntroduccinLa aplicacin de tcnicas moleculares inicia con la extraccin de ADN y la obtencin exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran medida, de la extraccin de ADN ntegro y puro.La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de ADN y se basa en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula. El ADN est constituido por dos cadenas de nucletidos unidas entre s formando una doble hlice.Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molcula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unin con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucletidos y permiten que el ADN precipite. A lo largo del tiempo se han diseado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, as como garantizar la eliminacin de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molcula. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneizacin del tejido, lisis celular, separacin de protenas y lpidos, precipitacin y redisolucin del ADN

Cuestionario de Revisin1. Describa los principios generales de Extraccin de ADN.El ADN se encuentra en el ncleo celular, muy replegado y unido a protenas formando la cromatina. Para extraerlo es necesario homogeneizar el tejido, romper las clulas para separar el ncleo, romper el ncleo y liberar el ADN, separar las protenas y precipitarlo para extraerlo de la solucin. El ADN aparecer como un agregado de fibras blanquecinas que se adhiere.5324}41

2. Diga usted para qu utilizamos detergentes en el procedimiento.EL DETERGENTE EN LA EXTRACCIN DEL ADNLpidos de la MembranaDetergenteCabezasColasSepara las membranas celulares del tejido vivoPermite la salida del ADN al exteriorAgente tenso activo, reduce la tensin superficial de las membranasCaptura los restos de lpidos y protenas de las membranas

3. Diga usted para qu utilizamos alcohol en el procedimiento.Neutraliza las cargas de la solucinHace precipitar el ADN, hacindolo visible.Remueve del ADN componentes como las concentraciones residuales de salesDeja expuestos los grupos fosfatos del ADN

4. Diga usted qu tipo de enzimas contienen los suavizadores de carne y el jugo de pia y para qu lo utilizamos en este procedimiento.ABLANDADOR DE CARNEContieneFuncinTiene papana, que es una enzima proteoltica (proteasa), la cual es una protena especializada en la degradacin de otras protenasDegrada completamente todo tipo de protenas y las separa del ADN

5. Diga usted cuntos usos se les puede dar al ADN una vez extrado.

6. Diga usted qu relevancia tiene e l ADN en el diagnstico clnico.EL ADN EN EL DIAGNOSTICO CLNICO

7. Diga usted cules son las funciones biolgicas del ADN.

EXTRACCIN

ADNARN

El ADN es muy estable y slo se requiere mantener las muestras congeladas antes de su extraccin. Inicialmente es necesario llevar a cabo una lisis para liberar al ADN del interior celular. Algunos paquetes comerciales de alto rendimiento son: PURIGEN, QUIAGEN, MILIPORE, GENTRA y MoBio. ARN total o Sub-celular (citoslico y nuclear) Primero es necesario agregarle una solucin que estabilice al ARN lo antes posible Se minimiza la actividad de ARNasa liberadas de las clulas lisadas Extraccin con fenol cido (pH 4.5 ) Paquetes comerciales de compaas como QIAGEN, Ambion y RNA-works

8. Diga usted cules son las diferencias en cuanto a la extraccin de ADN y ARN.

REACTIVOS EMPLEADOS EN LA EXTRACCIN DE:

ADNARN

Tris (Hidroximetil amonio metano) como tampn biolgico estabilizante del pH de la solucin entre 7,0 y 8,0 EDTA (cido etilendiamintetractico) como agente quelante, atrapa Mg+ inhibiendo las endonucleasas Cloruro de Sodio, a altas concentraciones solubiliza el ADN Cloruro de Potasio, sal equilibrante de fuerzas inicas Acetato de Sodio, sal que precipita el ADN Acetato de Potasio, sal que precipita protenas Fenol, solvente orgnico que denatura protenas; es txico Cloroformo, solvente orgnico, que denatura protenas, remueve lpidos, solubiliza fenol o lo elimina; es txico SDS (dodecil sulfato de sodio), detergente aninico que solubiliza protenas y membranas; es txico Sarkosyl (Lauril sarcosina), detergente aninico que solubiliza protenas y membranas CTAB (hexadecil trimetil bromuro de amonio), detergente catinico que solubiliza polisacridos Tritn X-100, detergente que solubiliza protenas y membranas B-Mercaptoetanol, antioxidante que inactiva protenas por reduccin de puentes disulfuro DTT (Ditiothreitol), antioxidante que reduce los grupos sulfuro de las protenas Octanolilsoamilalcohol, alcohol funciona como agente antioxidante y disminuye la formacin de espumas e interfases

PVP (polivinil pirrolidona), detergente que elimina compuestos fenlicos que inhiben la actividad enzimtica Etanol, alcohol que precipita los AN Isopropanol, alcohol que precipita los AN ARNasa, enzima que degrada el ARN

Uso de inhibidores de ARNasa y denaturantes fuertes de protenas (HCL Guanidina o Tiosanato de Guanidina con agentes reductores) Dado que las ARNasas no van a ser inactivadas en su totalidad en el autoclave, resulta esencial trabajar con material estril y de preferencia de un solo uso. Las micro esferas de vidrio, generalmente utilizadas en la extraccin para incrementar la lisis celular por accin fsica Es importante que los reactivos que se utilicen en la extraccin de ARN se mantengan en alcuotas con los volmenes mnimos necesarios para cada etapa del proceso y en caso de ser posible se pasen dos veces por el autoclave El mtodo utilizado con ms frecuencia es el de GIPS (por sus siglas en ingls; cido Tiosanato de Guanidina, fenol, Sarkosyl) El cido Tiosanato de Guanidina es sumamente fuerte y tiene un alto poder denaturalizante El fenol, al estar acidificado, provoca que el ADN se acumule en la interfase entre la fase acuosa y la del fenol, dejando al ARN en la fase acuosa El Sarkosyl, por su parte, es un detergente muy potente que ayuda a la lisis celular, pero no reemplaza la ruptura fsica de las clulas que generalmente se logra con micro esferas de vidrio agitadas con la ayuda de un vrtex o de un homogenizador celular (como Bead-Beater)

El mtodo BOOM, lleva a cabo la extraccin con el cido Tiosanato de Guanidina, separando los cidos nucleicos con base en su alta afinidad para enlazarse en matrices de slica, en vez de utilizar fenol. Dado que este mtodo aisla tanto ADN como ARN, resulta esencial utilizar las nucleasas especficas para ADN que lo eliminen de la muestra. Durante su precipitacin es comn utilizar cloruro de litio 8 M (libre de ARNasas). Este mtodo no debe ser utilizado para ARN que ser sometido a transcripcin reversa

9. Diga usted cules son las diferencias entre los procedimientos de extraccin de ADN animal y ADN vegetal.

DiferenciasLas diferencias entre el ADN de las plantas y los animales se encuentran en la secuencia de bases en la hlice. Los compuestos que se encuentran en las clulas vegetales estn ausentes en las clulas animales y las secuencias de bases de ADN reflejan esto, puesto que el ADN genmico de la planta es a menudo mayor que el ADN de los animales. Estas diferencias afectan los mtodos de extraccin, ya que impacta en el rendimiento y la pureza del ADN.

10. Diga usted qu principio de extraccin se usa para ADN plasmdico. Las tcnicas de Minipreps o mini preparaciones de plsmidos, permiten la recuperacin de plsmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las clulas con una base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario la configuracin superenrrollada del plsmido se mantiene estable.

Existen diversos protocolos para realizar lisis alcalina pero todos se rigen por los siguientes pasos bsicos. Remover las clulas del medio de cultivo en caldo mediante centrifugacin. Descartar el sobrenadante para reducir contaminacin mediante fragmentos de la pared celular del husped. Resuspender las clulas en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa. Lisar las clulas con NaOH y SDS. Unin de las hebras de DNA y remocin de contaminacin mediante el acetato de potasio. Precipitacin del DNA de plasmido mediante alcohol (etanol o isopropanol) y una sal (Acetato de amonio, Cloruro de litio, Cloruro de sodio o Acetato de sodio). Enjuague del material gentico con EtOH al 70%. Resuspender el material gentico.

11. Explique usted por qu la concentracin de ADN se mide a 260 nm.Las protenas y los cidos nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a longitudes de onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. Tal como se ha sealado anteriormente, la absorbancia mxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de protenas, a 280 nm.12. Indique usted qu tipo de contaminantes podemos encontrar en un extracto de ADN.

13. Explique usted por qu la medicin de una muestra de ADN a 260/280 nos da informacin sobre la pureza de la muestra.La concentracin de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un cociente. Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puro son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorcin a 230 nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de carbono, pptidos, fenoles, compuestos aromticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente.

La absorbancia mxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de protenas, a 280 nm. Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 280 nm y las que contienen protenas hacen lo propio a 260 nm, el cociente de los valores obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) proporciona una estimacin del grado de pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente a 50 g/ml de ADN bicatenario, 37 g/ml de ADN monocatenario, 40 g/ml de ARN o 30 g/ml de oligonucletidos. Si la muestra tambin contiene protenas, el cociente A260/A280 ser considerablemente inferior a dichos valores y no podr determinarse con exactitud la cantidad de cidos nucleicos.

14. Diga para qu fines se puede utilizar el ADN genmico humano.

15. Cuando realizamos una extraccin de ADN, aparte de concentracin y pureza, qu otros parmetros de calidad de la extraccin de ADN se deben investigar?

16. Diga usted para que utilizamos la sal en este procedimiento.La sal en disolucin acta disminuyendo la solubilidad de las protenas, lo que hace que precipiten y se separen ms fcilmente del ADN, es decir la sal evita la unin de las protenas al ADN.

17 .Para qu se hace uso de la licuadora en este procedimiento.La licuadora ayuda en la rotura de membranas celulares y cubiertas nucleares, permitiendo la separacin del ADN. Rompe las clulas y expone las paredes celulares y membranas a la accin del detergente.

Reporte de LaboratorioMATERIALES: Arvejas Balanza de compensacin NaCl Agua destilada Licuadora Beaker de 250 ml Colador plstico, oFiltro para cafetera Jabn lquido Reloj Tubos de ensayo 13 x 100 mm Gradillas Ablandador para carne Alcohol al 70% Reloj Pinchos de madera para carne

PROCEDIMIENTOS: Pesar 100g de lentejasAgregar 1g NaCl y 200 mL de H2OLicuar todo por 15 seg.En un Beaker colar la sopa resultanteAgregar 30 mL de jabn lquido, esperar 10 min.Distribuir la solucin en tubos de ensayoAgregar 1g gramo de ablandador, mezclarlo 5 min.

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2Agregar alcohol y dejar reposar 10 min.Con un pincho limpio extraer el ADN

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Para realizar el laboratorio, nos dispusimos a trabajar activamente cada uno en un procedimiento inicial diferente, sin embargo a partir del procedimiento de dividir la solucin en tubos de ensayo, nos reagrupamos en parejas. Cada pareja era encargada de un tubo de ensayo, por lo cual a travs de un apoyo mutuo finalizamos el procedimiento exitosamente. Resultados:

Luego de ciertas dificultades con los filtros, la innovacin de utilizar papel toalla fue la solucin para acelerar la realizacin de los procedimientos restantes, en la imagen observamos en un matraz la mezcla de la solucin colada con el detergente.

En esta imagen observamos los cinco tubos de ensayo, cada uno ya con ablandador de carne y alcohol. En cada uno de los tubos de ensayo se puede observar la interfase entre el alcohol y la solucin. Poco a poco est ocurriendo la precipitacin del ADN.AlcoholSolucin de lentejas

Finalmente logramos apreciar un poco la precipitacin del ADN, a pesar que no se precipito hasta arriba en estas dos muestras es donde mejor se observaba la precipitacin en la interfase.

Conclusiones1. La extraccin de ADN, es un mtodo esencial y multidisciplinario, ya que sus aplicaciones abarcan la Medicina clnica, Biotecnologa, Ingeniera Gentica, Medicina Forense entre muchas ms disciplinas cientficas en las cuales se ha abierto campo con los avances tecnolgicos de la ltima dcada.

2. La extraccin de ARN difiere de la extraccin de ADN, ya que los reactivos empleados son diferentes por las caractersticas fsico-qumicas de las molculas, en la extraccin de ARN el pH debe ser cido mientras que en el de ADN debe ser neutro.

3. Entre los buffer de extraccin de ADN tenemos el buffer CTAB, el buffer CTAB 2x, el buffer STE. Los cuales contienen Tris-HCL, EDTA, CTAB, NaCl, b-Mercaptoetanol entre otros reactivos.

4. En la extraccin de ARN se utiliza mayormente el mtodo GIPS, porque el mtodo BOOM no es recomendable para ARN que ser sometido a la tcnica de transcripcin reversa. El reactivo en comn de ambos mtodos es el cido Tiosanato de Guanidina.

5. Los parmetros de la calidad de la extraccin de cidos nucleicos incluyen la concentracin, la pureza, la integridad, el alto rendimiento de la muestra, la exactitud y su fiabilidad para reproducir los datos.

Webgrafa1. http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/530/cap16.pdf2. http://genmolecular.com/tecnicas-de-biologia-molecular/3. http://funimporadnyarn3.blogspot.com/4. http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf5. http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf6. http://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/ingen/practicos/arn/clases/Extraccion%20ARN.pdf7. http://www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf8. http://www.bteduc.bio.br/guias_es/69_Extraccion_de_ADN_(procedimiento_basico).pdf9. http://www.bteduc.bio.br/guias_es/70_Extraccion_de_ADN_de_diversas_fuentes.pdf