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EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA Y CRÓNICA, EN AGUA DE MAR Y AGUA DULCE, DEL DESINFECTANTE SAPROFORM

TABLA DE CONTENIDO

I. ANTECEDENTES ................................................................................. 2

II. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................. 5

III. RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS DE TOXICIDAD AGUDA Y

CRÓNICA DE SAPROFORM .............................................................. 15

IV. CONCLUSIONES DE LOS BIOENSAYOS DE TOXICIDAD AGUDA Y

CRÓNICA DE SAPROFORM EN AGUA DULCE Y AGUA DE MAR . 24

V. RESPONSABILIDAD DE LOS ENSAYOS ......................................... 24

VI. BIBLIOGRAFÍA CITADA Y CONSULTADA ....................................... 25

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I. ANTECEDENTES

SAPROFORM puede ser usado en plantas lecheras, plantas de productos lácteos, plantas de carnes, plantas pesqueras, vitivinícolas, casinos, supermercados, plantas de alimentos en general, como desinfectante de áreas y superficie. SAPROFORM se presenta como un líquido incoloro con olor característico penetrante, con un pH de 3,5 (concentrado), una densidad de 1,065 – 1,0755 g/mL y completa solubilidad en agua. De acuerdo al fabricante, Pacific Chem, se recomienda guardar SAPROFORM en envase cerrado, protegido de la humedad y fuentes de calor. Además, debe ser almacenado lejos de productos químicos de carácter alcalino. Durabilidad un año. Se recomienda para su manipulación el uso de mascarilla, guantes de caucho, lentes de seguridad y pechera de PVC. Se adjunta copia de la Hoja de Seguridad en Anexo 1 y Hoja Técnica en Anexo 2. SAPROFORM cuenta con Resolución Nº 67147 del 29/10/07 del SEREMI de Salud de la Región Metropolitana. Con el objeto de evaluar la toxicidad de este producto, tanto en agua de mar como en agua dulce, se procedió a efectuar un estudio de toxicidad aguda y crónica de SAPROFORM. En Chile, el método de Toxicidad Aguda, en agua dulce, está basado en la determinación del cálculo de la Concentración Letal al 50% o LC50 utilizando un microcrustáceo como indicador. De acuerdo a lo establecido por la NCh 2083 Of.1999 “Bioensayo de toxicidad aguda mediante la determinación de la inhibición de la movilidad de Daphnia magna o Daphnia pulex (Crustacea, Cladocera)”, única norma vigente en la actualidad en Chile para evaluar la toxicidad aguda de productos químicos en agua dulce. Este ha sido el cuerpo legal utilizado para este ensayo en el Laboratorio de Bioensayos y Biotecnología de la Universidad de Valparaíso. En agua de mar, no es posible aplicar el método de Toxicidad Aguda basado en la NCh. 2083 Of. 1999. Por lo anterior, dado que este producto también se requiere aplicar en agua marina, la Universidad de Valparaíso, a través de su Laboratorio de Bioensayos y Biotecnología, ha estandarizado un Bioensayo de Toxicidad Aguda utilizando el copépodo intermareal Harpacticus littoralis (Crustacea, Copepoda). H. littoralis tiene una amplia distribución geográfica, hallándose descrito en el océano Atlántico, en sectores como la costa sur y oeste de Noruega (Sars, 1910), Helgoland, Mar del Norte (Klie, 1927), Irlanda (Farrán, 1913) y bahía Chesapeake (Wilson, 1932); en el océano Índico, lago Chilca, golfo de Bengala y en el océano Pacífico, isla de Pascua (Goddard, 2003). En Chile se encuentra en todo el litoral nacional, razón por la cual puede considerarse un organismo cosmopolita, requisito de suma importancia al seleccionar una especie de prueba para bioensayos. Además, debe destacarse que para evaluar toxicidad aguda con disponibilidad de pequeños volúmenes de producto, es necesario contar con especies que puedan ser evaluadas con esta exigencia, lo que no puede hacerse, por ejemplo, con peces (e.g. el “baunco” Girella laevifrons) y megacrustáceos (como el “camarón de roca” Rhynchocinetes typus), en los cuales se requiere grandes volúmenes de muestra para evaluar en pruebas preliminares y definitivas de bioensayos.

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Cabe recordar que la Concentración Letal al 50% o LC50 se define como la concentración del producto a la cual el 50% de los organismos utilizados usados en los ensayos sobrevive en un tiempo determinado (24 ó 48 horas). La concentración es ajustada preliminarmente por un primer ensayo. Estos ensayos preliminares sirven para ajustar el rango de concentraciones en donde se hallaría el valor de LC50, mientras que las pruebas siguientes, finales, permiten establecer el punto final. De acuerdo a la actual normativa vigente, el “nivel de toxicidad” se deriva del valor LC50 a las 48 h (LC50-48 h). Por su parte, los bioensayos de Toxicidad Crónica, permiten evidenciar diferentes respuestas como: conducta, fecundidad, desarrollo, bioacumulación, etc. Se expresan como EC50 (concentración que provoca un efecto en el 50% de los estadíos u organismos ensayados), luego de un tiempo determinado (minutos u horas). Se estima que la toxicidad crónica puede causar efectos tóxicos acumulativos o efectos carcinogénicos, mutagénicos o teratogénicos en el ser humano. Para agua dulce, la normativa vigente actual corresponde a la NCh. 2706 Of. 2002, que establece para la determinación de toxicidad crónica, los “Bioensayos de inhibición de crecimiento de algas en agua dulce con Selenastrum capricornatum (Raphidocelis subcapitata)”. Las microalgas, entre las que se cuenta S. capricornatum, son organismos microscópicos fotosintetizadores, constituyentes principales de los cuerpos de agua tanto marinos como continentales, ya que son el primer eslabón en la cadena trófica. Desde la década del 50, algunas microalgas han sido utilizadas como indicadoras de la calidad del agua y actualmente son una herramienta importante en la evaluación del impacto de contaminantes en el medio acuático. La elección de las microalgas para bioensayos de toxicidad, debe considerar su fácil cultivo y rápido crecimiento, su sensibilidad a los tóxicos, su representatividad en el medio acuático y sus características morfológicas estables y definidas bajo diferentes condiciones de cultivo. La normativa NCh. 2706 Of. 2002 establece un método para la determinación de la toxicidad crónica de efluentes y aguas receptoras o efectos adversos de una sustancia, en el crecimiento de la microalga de agua dulce Selenastrum capricornutum (Raphidocelis subcapitata), por un período de exposición de 72 h o 96 h en un sistema de cultivo estático (modo batch). En este método, la respuesta evaluada es la inhibición medida como una reducción en el crecimiento o en la tasa de crecimiento de S. capricornatum en relación a cultivos de control realizados en idénticas condiciones al ensayo. La normativa NCh. 2706 Of. 2002 define la EC50 como la concentración efectiva que provoca un efecto sobre la tasa de crecimiento al 50% de la población expuesta, durante el periodo de duración del ensayo. En el presente Informe Técnico se evalúa la toxicidad crónica del desinfectante SAPROFORM sobre la tasa de crecimiento de Selenastrum capricornatum. Para agua de mar, se han evaluado varias especies y estadíos de estas especies para efectuar ensayos de toxicidad crónica. Una de las especies más utilizada han sido estadíos larvales y postlarvales de equinodermos, por constituir los estadios más sensibles de su ciclo de vida (Bellas et al., 2005). Se han realizado bioensayos de fertilización y embrionación evaluando el efecto de diversas sustancias químicas en el

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agua y sedimentos en diferentes especies de erizos marinos: Arbacia spatuligera (Valenciennes, 1846), Paracentrotus lividus Lamarck, 1816), Psammechinus miliaris (Gmelin, 1778), Sphaerechinus granularis (Lamarck, 1816), Tripneustes gratilla (Linnaeus, 1758) y Loxechinus albus (Olivos, 1994, Larrain et al., 1999; Ghirardini et al., 2001; Coteur et al., 2003; Vásquez, 2003; De Nicola et al., 2004; Pesando et al., 2004; Bellas et al., 2005). No obstante, también el Laboratorio de Bioensayos y Biotecnología de la Universidad de Valparaíso, ha estandarizado un Bioensayo de Toxicidad Crónica utilizando el copépodo intermareal Harpacticus littoralis (Crustacea, Copepoda). En el presente Informe Técnico se evalúa la toxicidad crónica del desinfectante SAPROFORM sobre la conducta natatoria, movilidad en periópodos y anténulas de Harpacticus littoralis.

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Fotografía 1. Detalle de ejemplares de Daphnia pulex.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

II.1 AGUA DULCE

II.1.1 Evaluación de la Toxicidad Aguda de SAPROFORM

Los ensayos fueron efectuados de acuerdo a lo establecido y recomendado por las normativas internacionales de APHA (1989), USEPA (1993, 1995) e ISO 6341:1996 (E) y las normativas nacionales NCh 2083 Of.1999 “Bioensayo de toxicidad aguda mediante la determinación de la inhibición de la movilidad de Daphnia magna o Daphnia pulex (Crustacea, Cladocera)” y NCh. 426/2, NCh. 2313/5, NCh. 411/2 y NCh. 411/3. A continuación se detalla el procedimiento.

Almacenamiento de las Muestras Las muestras de SAPROFORM fueron proporcionadas por el cliente. Éstas fueron guardadas en contenedores sellados a temperatura ambiente hasta su uso. Antes de comenzar el bioensayo las muestras fueron ambientadas a una temperatura de 20º C.

Equipamiento Las pruebas de toxicidad se efectuaron en placas de Petri de vidrio de 40 mL. Cada una de las placas fueron bombeadas con microdifusores, asegurando la buena oxigenación y distribución uniforme de este gas a través de toda la placa antes de comenzar los ensayos. Durante las pruebas y previo a ellas, la temperatura del agua se mantuvo a 20º C.

Reactivos Se utilizaron todos los reactivos necesarios de calidad p.a. (grado analítico). Como agua de prueba y agua de cultivo se utilizó agua reconstituida, es decir, agua para análisis Clase 4 (NCh. 426/2) a la cual se le adicionó sales inorgánicas de grado analítico.

Organismos de Prueba Se utilizaron especímenes neonatos de no más de 24 horas de edad de Daphnia pulex (Crustacea, Cladocera) (Fotografía 1) de tercera generación, obtenidos por partenogénesis acíclica. Los organismos utilizados fueron separados de sus correspondientes cultivos madres manualmente dentro de las 24 horas de nacidos en un volumen máximo de 1 mL de agua de dilución. Durante los bioensayos los organismos dejaron de alimentarse y se mantuvieron sin aireación y en oscuridad, a una temperatura de 20º C.

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Número de Organismos, Volumen de Líquido y Concentraciones de Producto En los Ensayos Preliminares realizados para determinar el intervalo de concentración de la muestra en la que se debe efectuar el ensayo definitivo, se utilizaron 15 dafnias por placa (la densidad no debe ser superior a 5 organismos por 10 mL). Se prepararon 6 diluciones preliminares de SAPROFORM, considerando su concentración base: 1,0 – 10 – 100– 1.000 – 10.000 – 40.000 ppm, más un control negativo. Este último se preparó utilizando agua de dilución en igual volumen al de las soluciones de prueba, inoculando en éste igual número de organismos por especie (20). Después de 24 y 48 h de incubación, se registró el intervalo de concentración en que se obtiene el 0% y el 100% de inmovilización. Se consideraron inmovilizados los organismos que después de una leve agitación de las placas, son incapaces de desplazarse aunque muevan sus antenas, durante un período de observación de 15 segundos. No obstante lo anterior, en todas las concentraciones los organismos murieron en un 100%. Producto de lo anterior, se ajustaron las concentraciones entre 1,0 y 5,0 ppm en progresión geométrica: 1,0 – 1,49 – 2,23– 3,32 – 5,0 ppm, más un control negativo. También en este caso resultaron todos muertos. Se volvieron a ajustar concentraciones geométricas, buscando algún intervalo de concentraciones donde aparecieran organismos vivos. Se probó con la siguiente progresión geométrica de concentraciones: 0,13 – 0,19 – 0,29– 0,44 – 0,66 ppm, más un control negativo. Nuevamente los organismos resultaron todos muertos en todas las concentraciones. Como se aprecia, ya se estaba trabajando bajo el umbral de 1,0 ppm, lo que da cuenta de la toxicidad del producto. Finalmente, se ajustaron las concentraciones a los siguientes rangos: 0,052 – 0,063 – 0,075– 0,090 – 0,108 ppm. Estas fueron las concentraciones ensayadas en las pruebas definitivas. Los Ensayos Definitivos se realizaron para determinar el porcentaje de organismos inmovilizados para diferentes concentraciones de la muestra y su correspondiente LC50 a las 48 h. Este corresponde a la estimación de la concentración del producto que inmoviliza al 50% de los organismos en 48 horas, expresada en porcentaje de muestra o en mg/l. En los ensayos definitivos se utilizaron las concentraciones que en el ensayo preliminar presentaron entre 0% (o cercano a este porcentaje) y 100% de inmovilización. En total se utilizaron 5 concentraciones finales, calculadas en progresión geométrica: 0,052 – 0,063 – 0,075– 0,090 – 0,108 ppm, más un control negativo. Para cada concentración se inocularon 15 organismos, divididos en tres réplicas para cada especie. Luego se incubaron por 24 y 48 h a 20° C y se contabilizaron los organismos sobrevivientes. Finalmente se registró la concentración de oxígeno disuelto en la placa de menor concentración de muestra, en el que todos los organismos resultaron inmovilizados.

Determinación del LC50 Para la determinación del LC50, dado los resultados obtenidos, se utilizó el diagrama de decisión de la Figura 1, concluyendo que se calcularía este parámetro utilizando el método del Probit. Para facilitar los cálculos, se utilizó el

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software suministrado por la US Environmental Protection Agency (US EPA): Probit Analysis Program, versión 1.5. El procedimiento Probit permite encontrar estimadores m-verosímiles de parámetros de regresión y de tasas naturales (por ejemplo, tasas de mortalidad) de respuesta para ensayos biológicos cuantales, analizando porcentajes de efecto vs. dosis dentro del marco de la regresión.

Figura 1. Árbol de decisión para determinar método a utilizar en el cálculo del LC50 o EC50.

Evaluación de la Toxicidad El nivel de toxicidad del producto se deriva del valor de LC50 48 h en referencia a la siguiente tabla:

Concentración (LC50-48 h) Nivel de Toxicidad

<1,0 ppm Altamente Tóxico

1 – 10 ppm Tóxico

10 – 100 ppm Ligeramente Tóxico

100 – 1.000 ppm Virtualmente No Tóxico

> 1.000 ppm Inocuo

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Fotografía 2. Matraces con S. capricornutum.

Fotografía 3. Detalle de células de S. capricornutum.

II.1.2 Evaluación de la Toxicidad Crónica de SAPROFORM

Los ensayos de tipo estático fueron efectuados de acuerdo a lo establecido y recomendado por las normativas internacionales de APHA (1989), US-EPA (1978, 1991, 1994, 1995); y la normativa nacional NCh. 2706 Of.2002 “Bioensayos de inhibición de crecimiento de algas en agua dulce con Selenastrum capricornatum (Raphidocelis subcapitata)” y NCh. 426/2. A continuación se detalla el procedimiento.

Almacenamiento de las Muestras Las muestras de SAPROFORM fueron proporcionadas por el cliente. Éstas fueron guardadas en contenedores sellados a temperatura ambiente hasta su uso. Antes de comenzar los bioensayos las muestras fueron ambientadas a una temperatura de 23º C.

Equipamiento Las pruebas de toxicidad se efectuaron en matraces Erlenmeyer de 25 mL de vidrio (Fotografía 2). Cada uno de las matraces fueron bombeados con microdifusores, asegurando la buena oxigenación y distribución uniforme de este gas a través de todo el matraz antes de comenzar los ensayos. Durante las pruebas y previo a ellas, la temperatura del agua se mantuvo a 23º C.

Reactivos Se utilizaron todos los reactivos necesarios de calidad p.a. (grado analítico). Como agua de prueba y agua de cultivo (solución de nutrientes) se utilizó agua reconstituida, es decir, agua para análisis clase 4 (NCh. 426/2 Of 97), a la cual se le adicionó sales inorgánicas de grado analítico. Como medio de cultivo se utilizó el Medio de Cultivo EPA/5. Para agua de uso general en el laboratorio, se utilizó agua clase 3 (NCh. 426/2 Of 97).

Organismos de Prueba Como organismos de prueba para los ensayos crónicos se utilizó la microalga Selenastrum capricornutum adquirida en la American Type Culture Collection (U.S.A.) (ATCC 22662) (Fotografía 3). Las cepas de S. capricornutum se mantuvieron en medio sólido de agar-agar al 1,5%, en tubos de ensayo. En este estado sólo se mantienen por un período de mantención de ocho meses en refrigeración a 4° C ± 2° C, en la oscuridad, luego de lo cual se efectúa el recambio del cepario.

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A partir de los cultivos en medio sólido, se prepararon cultivos en medio líquido mediante transferencia de inóculos a tubos de ensayo con medio líquido. Previo a la realización de los bioensayos, los inóculos se incubaron por 3 días, para obtener un crecimiento adecuado, y a partir de este nuevo cultivo se inocularon los matraces, efectuando los cálculos respectivos para matraces de 25 mL.

Condiciones de los Bioensayos y Concentraciones de Producto Dado que de acuerdo a la naturaleza de los productos a ensayar, estos corresponden a “una sustancia específica que tiene algún efecto en el crecimiento de la población algal” (NCh 2706 Of.2002), se realizaron dos tipos de bioensayos: ensayos preliminares y ensayos finales o definitivos. Las concentraciones de los en los Ensayos Preliminares y Definitivos se han descrito anteriormente. Cabe mencionar que los Ensayos Definitivos se realizaron para determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento celular de S. capricornutum medida como una reducción en el crecimiento o en la tasa de crecimiento en relación a cultivos de control realizados en idénticas condiciones al ensayo. Dado los resultados obtenidos en los ensayos preliminares y considerando antecedentes obtenidos en ensayos con agua de mar, se utilizaron 5 concentraciones finales: 0,052 – 0,063 – 0,075– 0,090 – 0,108 ppm, más un control negativo. La serie de concentraciones a ensayar se preparó mezclando volúmenes apropiados de muestra, agua clase 4, solución de nutrientes e inóculo. El volumen total fue el mismo en todas las unidades experimentales. Se procuró que la cantidad de solución de nutrientes fuera una parte en 10 del volumen total. La cantidad de inóculo agregada fue suficiente para obtener una densidad celular inicial de 104 células por mililitro. A las unidades control, se les adicionó solo agua clase 4, solución de nutrientes e inóculo. Al inicio de los bioensayos se registró el valor de densidad celular a tiempo 0; se midió luego el pH correspondiente a cada concentración y al control. Las condiciones de incubación de los ensayos fueron: temperatura de 23° C ± 2° C, Iluminación con luz blanca fría continua, con una intensidad lumínica de 90 μmol m-2 s-1 promedio y agitación orbital a 100 r.p.m. Se registraron las mediciones de densidad celular (N) y el pH en cada unidad experimental del ensayo y control, cada 24 h. La densidad celular fue medida contabilizando el número de células presentes en el inóculo mediante la cámara de Neubauer. En caso de emplear los cuadrantes de 1 mm2, la determinación del número de células se obtuvo mediante la relación:

Nº células en 0,1 mm3 = Nº Total Cel. Contadas / Nº. Cuadros 1 mm2 Contados

Este valor corresponderá al número total de células en 0,1 mm3. Para obtener el número por mL se multiplicó por 10 000. Los ensayos tuvieron una duración de 96 h.

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Determinación de la Tasa de Crecimiento, Inhibición de la Tasa de Crecimiento y el EC50 Para calcular la tasa de crecimiento, μ o k, para cada cultivo de ensayo, se utilizó la ecuación siguiente:

en que: tn: tiempo transcurrido entre el inicio y fin del bioensayo; N0: densidad celular inicial nominal; Nn = densidad celular al final del bioensayo. Para calcular el porcentaje de inhibición para cada concentración con respecto al control, se utilizó la siguiente ecuación:

donde: Iμi = porcentaje de inhibición de la tasa de crecimiento para la concentración i; μi = tasa de crecimiento promedio para la concentración i; μc = tasa de crecimiento promedio para el control. Para la determinación del EC50, dado los resultados obtenidos, se utilizó el diagrama de decisión de la Figura 1, concluyendo que se calcularía este parámetro utilizando el método del Probit.

II.2 AGUA DE MAR II.2.1 Evaluación de la Toxicidad Aguda de SAPROFORM

Ensayos de Toxicidad Aguda Los ensayos fueron efectuados de acuerdo a lo establecido y recomendado por las normativas internacionales de APHA (1989), USEPA (1993, 1995) e ISO 6341:1996 (E) y las normativas nacionales NCh. 2083 Of. 1999 “Bioensayo de toxicidad aguda mediante la determinación de la inhibición de la movilidad de Daphnia magna o Daphnia pulex (Crustacea, Cladocera)” y NCh. 426/2, NCh. 2313/5, NCh. 411/2 y NCh. 411/3, utilizando la especie tipo Harpacticus littoralis. A continuación se detalla el procedimiento.

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Fotografía 4. Detalle de Harpacticus littoralis.

Almacenamiento de las Muestras Las muestras de SAPROFORM fueron proporcionadas por el cliente. Éstas fueron guardadas en contenedores sellados a temperatura ambiente hasta su uso. Antes de comenzar el bioensayo las muestras fueron ambientadas a una temperatura de 20º C.


Reactivos Se utilizaron todos los reactivos necesarios de calidad p.a. (grado analítico). Como agua de prueba y agua de cultivo se utilizó agua reconstituida, es decir, agua para análisis Clase 4 (NCh. 426/2) a la cual se le adicionó sales inorgánicas de grado analítico.

Organismos de Prueba Se utilizó la especie Harpacticus littoralis (Crustacea, Copepoda) (Fotografía 4). Los especímenes adultos del copépodo intermareal fueron capturados en el sector litoral intermareal de la Concesión Marítima de la Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales de la Universidad de Valparaíso. Los organismos capturados fueron mantenidos en recipientes 15 días antes de comenzar las pruebas. Si durante este tiempo la tasa de muerte excede el 10%, el batch total de organismos es reemplazado. Durante esta etapa los microcrustáceos fueron alimentados con microalgas regularmente. Una vez aclimatados, se utilizaron especímenes neonatos de no más de 24 horas de edad de tercera generación. Los organismos utilizados fueron separados de sus correspondientes cultivos madres manualmente dentro de las 24 horas de nacidos en un volumen máximo de 1 mL de agua de dilución. Durante los bioensayos los organismos dejaron de alimentarse y se mantuvieron sin aireación y en oscuridad, a una temperatura de 20º C.

Número de Organismos, Volumen de Líquido y Concentraciones de Producto En los Ensayos Preliminares realizados para determinar el intervalo de concentración de la muestra en la que se debía efectuar el ensayo definitivo, se utilizaron 20 ejemplares por placa (la densidad no debe ser superior a 5 organismos por 10 mL). Al igual que en el caso de los ensayos efectuados en agua dulce, para la especie evaluada en agua de mar las concentraciones preliminares se ajustaron a los

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siguientes rangos: 0,052 – 0,063 – 0,075– 0,090 – 0,108 ppm. Estas fueron las concentraciones ensayadas en las pruebas definitivas. Los Ensayos Definitivos se realizaron para determinar el porcentaje de organismos inmovilizados para diferentes concentraciones de la muestra y su correspondiente LC50 a las 48 y 96 h. Este corresponde a la estimación de la concentración del producto que inmoviliza al 50% de los organismos en 48 y 96 horas, expresada en porcentaje de muestra o en mg/L (ppm). En los ensayos definitivos se utilizaron las concentraciones que en el ensayo preliminar presentaron entre 0% (o cercano a este porcentaje) y 100% de inmovilización. En total se utilizaron 5 concentraciones finales, calculadas en progresión geométrica: 0,052 – 0,063 – 0,075– 0,090 – 0,108 ppm, más un control negativo. Para cada concentración se inocularon 20 organismos, divididos en tres réplicas para cada especie. Luego se incubaron por 24, 48 y 96 h a 20° C y se contabilizaron los organismos sobrevivientes. Finalmente se registró la concentración de oxígeno disuelto en la placa de menor concentración de muestra, en el que todos los organismos resultaron inmovilizados.

Determinación del LC50 Para la determinación del LC50, dado los resultados obtenidos, se utilizó el diagrama de decisión de la Figura 1, concluyendo que se calcularía este parámetro utilizando el método del Probit antes descrito.

II.2.2 Evaluación de la Toxicidad Crónica de SAPROFORM

Ensayos de Toxicidad Crónica Los ensayos fueron efectuados de acuerdo a lo establecido y recomendado por las normativas internacionales de APHA (1989), USEPA (2001, 2002) y NCh. 426/2, NCh. 2313/5, NCh. 411/2 y NCh. 411/3. A continuación se detalla el procedimiento.

Almacenamiento de las Muestras Las muestras de SAPROFORM fueron proporcionadas por el cliente y almacenadas y ambientadas igual que para el ensayo agudo antes descrito.


Reactivos Se utilizaron todos los reactivos necesarios de calidad p.a. (grado analítico). Como agua de prueba y agua de cultivo se utilizó agua reconstituida, es decir, agua para análisis clase 4 (NCh. 426/2) a la cual se le adicionó sales inorgánicas de grado analítico.

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Organismos de Prueba: Recolección Los organismos de H. littoralis fueron recolectados en las pozas de la zona intermareal del área de Montemar, Valparaíso (33°S), en la Concesión Marítima de la Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales de la Univeraidad de Valparaíso, extrayéndose los de mayores tamaños. Los ejemplares se extrajeron mediante pipetas Pasteur, principalmente en los lugares con presencia del alga Chaetomorfa linum, ya que los copépodos intermareales harpactícidos son generalmente de características fitófilas (Goddard, 2006). Los ejemplares fueron depositados en un recipiente de plástico conjuntamente con anfípodos y otras especies de copépodos.). Durante los bioensayos los organismos dejaron de alimentarse y se mantuvieron sin aireación y en oscuridad, a una temperatura de 20º C.

Selección En el Laboratorio de Bioensayos y Biotecnología de la Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales de la Universidad de Valparaíso, mediante lupa Zeiss®, se separaron los ejemplares de H. littoralis, considerando su morfología y color café - rojizo característicos. Se depositaron en una cápsula de Petri que contenía 40 mL de agua de mar filtrada. Los organismos capturados fueron mantenidos en recipientes 15 días antes de comenzar las pruebas. Si durante este tiempo la tasa de muerte excede el 10%, el batch total de organismos es reemplazado. Durante esta etapa los microcrustáceos fueron alimentados con microalgas regularmente. Una vez aclimatados, se utilizaron especímenes neonatos de no más de 24 horas de edad de tercera generación. Los organismos utilizados fueron separados de sus correspondientes cultivos madres manualmente dentro de las 24 horas de nacidos en un volumen máximo de 1 mL de agua de dilución. Durante los bioensayos los organismos dejaron de alimentarse y se mantuvieron sin aireación y en oscuridad, a una temperatura de 20º C.

Bioensayos Para la realización del experimento se utilizaron 20 cápsulas de Petri, las cuales contenían 40 mL de agua de mar reconstituida. En 5 de ellas (y sus respectivas réplicas) se depositaron diferentes concentraciones de SAPROFORM: 0,052 – 0,063 – 0,075– 0,090 – 0,108 ppm, respectivamente (Tabla 1). Luego de 10 minutos, se depositaron 20 ejemplares de H. littoralis por cada cápsula. Pasadas 96 horas se observaron los organismos, mediante lupa y microscopio Zeiss. Se consideró como parámetros la presencia de organismos vivos o muertos, movilidad, forma de las anténulas y estado de los periópodos.

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Tabla 1 Diseño de experimento (Bioensayo), utilizando diferentes concentraciones de

SAPROFORM.

Número de cápsula/Tiempo (h)

Concentración Final de SAPROFORM (ppm)

0,052 0,063 0,075 0,090 0,108

1 - 96

2 - 96

3 - 96

4 - 96

* Cada cápsula contiene 40 mL de agua de mar reconstituida y 20 ejemplares de H. littoralis.

Determinación del EC50 Para la determinación del EC50, se utilizó el diagrama de decisión de la Figura 1, concluyendo que se calcularía este parámetro utilizando el método del Probit antes descrito.

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III. RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS DE TOXICIDAD AGUDA Y CRÓNICA DE SAPROFORM

III.1 AGUA DULCE III.1.1 Toxicidad Aguda de SAPROFORM a) Ensayos Finales en D. pulex Los resultados de los ensayos finales en D. pulex para SAPROFORM se detallan en la Tabla 2. Se presentan también los resultados del Control Negativo.

Tabla 2

Resultados de los ensayos finales de toxicidad aguda para SAPROFORM en D. pulex. Los resultados se expresan como número de organismos inmovilizados y mortalidad (%).

Número de Placas Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Placa 5 Control

Concentración 0,052 0,063 0,075 0,090 0,108 0,0

Réplica 1 - 24 Hrs. 0 (0,0%) 2 (13,3%) 6 (40,0%) 8 (53,3%) 12 (80,0%) 0 (0%)

Réplica 2 - 24 Hrs. 0 (0,0%) 3 (20,0%) 5 (33,3%) 8 (53,3%) 11 (73,3%) 0 (0%)

Réplica 3 - 24 Hrs. 1 (6,7%) 2 (13,3%) 5 (33,3%) 9 (60,0%) 10 (66,7%) 0 (0%)

% Mortalidad Promedio 2,3 15,5 35,5 55,5 73,3 0,0 Número de Placas Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Placa 5 Control

Concentración 0,052 0,063 0,075 0,090 0,108 0,0

Réplica 1 - 48 Hrs. 2 (13,3%) 3 (20,0%) 8 (53,3%) 10 (66,7%) 15 (100%) 0 (0%)

Réplica 2 - 48 Hrs. 1 (6,7%) 3 (20,0%) 7 (46,7%) 9 (60,0%) 15 (100%) 0 (0%)

Réplica 3 - 48 Hrs. 3 (20,0%) 5 (33,3%) 8 (53,3%) 10 (66,7%) 14 (93,3%) 0 (0%)

% Mortalidad Promedio 13,3 24,4 51,1 64,5 97,8 0,0

b) Cálculos de LC50 48 h en D. pulex El programa Probit arrojó los siguientes resultados para el test de X2 a las 48 horas utilizando D. pulex: Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 2,066 Chi - Square for Heterogeneity = 7,815 (tabular value at 0,05 level) Los parámetros de la curva resultante fueron los siguientes: μ = -1,127480

= 0,120468

16

Parámetro Estimado Error Estándar LC (95%) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Intercepto 14,359150 1,916300 (10,6032; 18,1151) Pendiente 8,300945 1,695890 (4,9770; 11,6245)

En la Tabla 3 se detallan los resultados de los cálculos de las LC50 - 48 horas en D. pulex para SAPROFORM:

Tabla 3 Concentraciones Letales (LC) – 48 h obtenidas de los ensayos de toxicidad aguda para

SAPROFORM utilizando D. pulex. Los resultados se expresan en ppm.

Punto Concentración Expuesta (ppm)

Límite Confidencia Superior (95%)

Límite Confidencia Inferior (95%)

LC 1.00 0,039 0,025 0,048

LC 5.00 0,047 0,034 0,055

LC 10.00 0,052 0,040 0,059

LC 15.00 0,056 0,045 0,063

LC 50.00 0,075 0,067 0,082

LC 85.00 0,099 0,089 0,124

LC 90.00 0,106 0,094 0,138

LC 95.00 0,118 0,101 0,163

LC 99.00 0,142 0,117 0,222

De estos resultados se desprende que el LC50 48 h para SAPROFORM determinada a través del método Probit es de 0,075 ppm (0,067 – 0,082).

d) Validez de los Resultados De acuerdo a lo requerido por la normativa actual los resultados son considerados válidos ya que:

- La concentración de oxígeno disuelto en la placa de menor concentración de muestra en el que todos (o casi todos) los organismos resultaron inmovilizados a las 48 horas, fue de 7,79 mg/L (>2 mg/L), en la placa 5 para D. pulex.

- El porcentaje de inmovilización de los controles fue menor al 10% (0% a las 24 y 48 horas).

17

III.1.2 Toxicidad Crónica de SAPROFORM a) Determinaciones de pH y Ensayos Finales en S. capricornutum Los resultados de las determinaciones de pH se detallan en la Tabla 4.

Tabla 4 Determinaciones de pH en las diversas concentraciones y horas de bioensayos.

Concentración 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas

Control 7,6 ± 0,1 7,5 ± 0,1 7,6 ± 0,1 7,6 ± 0,1

0,052 ppm 7,6 ± 0,1 7,5 ± 0,1 7,6 ± 0,1 7,5 ± 0,1

0,063 ppm 7,6 ± 0,1 7,5 ± 0,1 7,5 ± 0,1 7,6 ± 0,1

0,075 ppm 7,5 ± 0,1 7,5 ± 0,1 7,6 ± 0,1 7,5 ± 0,1

0,090 ppm 7,6 ± 0,1 7,6 ± 0,1 7,6 ± 0,1 7,5 ± 0,1

0,108 ppm 7,6 ± 0,1 7,5 ± 0,1 7,6 ± 0,1 7,6 ± 0,1

En tanto, en la Tabla 5 se entrega un detalle de los promedios de células por mL de los bioensayos finales, las tasas de crecimiento y porcentajes de inhibición de S. capricornutum, después de 96 horas de exposición a SAPROFORM.

Tabla 5 Resultados de los promedios de los bioensayos finales, las tasas de crecimiento y

porcentajes de inhibición de la tasa de crecimiento de S. capricornutum, después de 96 horas de exposición al producto SAPROFORM.

Concentración N96h k % Inhibición k

Control 4,72*106 3,924 0

0,052 ppm 9,90*105 2,927 25,4

0,063 ppm 6,10*105 1,955 33,2

0,075 ppm 2,90*105 1,069 45,3

0,090 ppm 1,10*105 0,416 61,1

0,108 ppm 5,00*104 0,109 73,9 N96h: Número de células por mL después de 96 horas de exposición. k: Tasa de crecimiento al final de las 96 horas.

En tanto, el análisis estadístico entregado por el programa Probit indica la siguiente información para las 96 horas:

2 para Heterogeneidad (calculado) = 0,714

2 para Heterogeneidad (valor tabulado a un nivel de 0,05) = 7,815

Los detalles de la curva resultante fueron los siguientes: µ = -1,109887

= 0,237345

18

Parámetro Estimado Error Estándar LC (95%) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Intercepto 9,676250 0,606904 (8,4867; 10,8658) Pendiente 4,213268 0,538391 (3,1580; 5,2685) Finalmente, en la Tabla 6 se detallan los resultados de los cálculos para la determinación de la dilución (ppm) que produce un 50% de inhibición de la tasa de crecimiento (EC50) a las 96 horas para SAPROFORM:

Tabla 6 EC50 a las 96 h obtenidas de los ensayos de toxicidad crónica para SAPROFORM. Los

resultados se expresan en ppm.




EC 1.00 0,022 0,014 0,028

EC 5.00 0,032 0,023 0,038

EC 10.00 0,039 0,030 0,045

EC 15.00 0,044 0,036 0,050

EC 50.00 0,078 0,073 0,083

EC 85.00 0,137 0,120 0,169

EC 90.00 0,156 0,134 0,202

EC 95.00 0,191 0,157 0,262

EC 99.00 0,277 0,212 0,430

De lo anterior se desprende que el EC50 96 h para SAPROFORM determinada a través de los bioensayos con S. capricornutum es de 0,078 ppm (0,073 – 0,083). b) Aceptabilidad de los Resultados Los resultados son considerados aceptables ya que:

- la tasa de crecimiento k (div ⋅ día-1) de los controles fue mayor a μ= 0,8 día–1. - la diferencia entre réplicas no fue superior a 20%; - la variación de pH para el control se mantuvo menor a ±1,50 unidades durante el

ensayo.

19

III.2 AGUA DE MAR III.2.1 Resultados de los Bioensayos Toxicidad Aguda de SAPROFORM a) Ensayos Finales en H. littoralis Los resultados de los ensayos finales en H. littoralis se detallan en la Tabla 7. Se adicionó a las concentraciones seleccionadas, las del Control Negativo.

Tabla 7

Resultados de los ensayos finales de toxicidad aguda para SAPROFORM en H. littoralis. Los resultados se expresan como número de organismos inmovilizados y mortalidad (%).


Concentración 0,052 0,063 0,075 0,090 0,108 0,0

Réplica 1 - 24 Hrs. 0 (0%) 3 (15%) 8 (40%) 13 (65%) 17 (85%) 0 (0%)

Réplica 2 - 24 Hrs. 1 (5%) 3 (15%) 7 (35%) 12 (60%) 16 (80%) 0 (0%)

Réplica 3 - 24 Hrs. 1 (5%) 5 (25%) 9 (45%) 11 (55%) 15 (75%) 0 (0%)



Concentración 0,052 0,063 0,075 0,090 0,108 0,0

Réplica 1 - 48 Hrs. 2 (10%) 5 (25%) 10 (50%) 15 (75%) 19 (95%) 0 (0%)

Réplica 2 - 48 Hrs. 3 (15%) 5 (25%) 10 (50%) 15 (75%) 18 (90%) 0 (0%)

Réplica 3 - 48 Hrs. 4 (20%) 7 (35%) 12 (60%) 13 (65%) 17 (85%) 0 (0%)


c) Cálculos de LC50 48 en H. littoralis El programa Probit arrojó los siguientes resultados para el test de X2 a las 48 horas utilizando H. littoralis: Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0,190 Chi - Square for Heterogeneity = 7,815 (tabular value at 0,05 level) Los parámetros de la curva resultante fueron los siguientes: μ = -1,132389

= 0,137387 Parámetro Estimado Error Estándar LC (95%) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Intercepto 13,242318 1,563705 (10,1775; 16,3072) Pendiente 7,278699 1,381333 (4,5712; 9,9861)

20

En la Tabla 8 se detallan los resultados de los cálculos de las LC50 - 48 horas en H. littoralis para el desinfectante SAPROFORM:

Tabla 8 Concentraciones Letales (LC) – 48 h obtenidas de los ensayos de toxicidad aguda para

SAPROFORM utilizando H. littoralis. Los resultados se expresan en ppm.




LC 1.00 0,035 0,022 0,044

LC 5.00 0,044 0,031 0,052

LC 10.00 0,049 0,038 0,056

LC 15.00 0,053 0,042 0,060

LC 50.00 0,074 0,067 0,081

LC 85.00 0,102 0,091 0,127

LC 90.00 0,111 0,097 0,143

LC 95.00 0,124 0,106 0,171

LC 99.00 0,154 0,125 0,240

De estos resultados se desprende que el LC50 48 h para SAPROFORM determinada a través del método Probit es de 0,074 ppm (0,067 – 0,081). d) Validez de los Resultados De acuerdo a lo requerido por la normativa actual los resultados son considerados válidos ya que:

- La concentración de oxígeno disuelto en la placa de menor concentración de muestra en el que todos (o casi todos) los organismos resultaron inmovilizados a las 48 horas, fue de 7,26 mg/L (>2 mg/l) para la placa 5, para H littoralis.

- El porcentaje de inmovilización de los controles para ambas especies fue menor al 10% (0% a las 24 y 48 h).

21

III.2.2 Resultados de los Bioensayos Toxicidad Crónica de SAPROFORM a) Mortalidades Los resultados de las mortalidades observadas en H. littoralis se detallan en la Tabla 9. Estos resultados representan los promedios a las 96 horas de ensayo.

Tabla 9 Mortalidad de los ejemplares de H. littoralis expuestos a diferentes concentraciones de

SAPROFORM por 96 horas.

Número de Placas 0,052 ppm 0,063 ppm 0,075 ppm

Concentración SAPROFORM (ppm) Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas

Réplica 1 15 5 13 7 7 13

Réplica 2 15 5 12 8 7 13

Réplica 3 13 7 11 9 5 15

Promedio 14,3 5,7 12 8 6,3 13,7

Número de Placas 0,09 ppm 0,108 ppm Control (0,0 ppm)

Concentración SAPROFORM (ppm) Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas

Réplica 1 1 19 0 20 20 0

Réplica 2 3 17 0 20 20 0

Réplica 3 0 20 0 20 20 0

Promedio 1,4 18,6 0 20 20 0

b) Observaciones

Concentración 0,052 ppm – 96 h Se observaron 14 ejemplares vivos (promedio) y 6 muertos (promedio). Los ejemplares vivos se hallaban en buen estado, mientras que los muertos se encontraban totalmente inmóviles, con abdomen y anténulas curvadas.

Concentración 0,063 ppm – 96 h Se observaron 12 ejemplares vivos (promedio) y 8 muertos (promedio). Los ejemplares vivos mostraron natación lenta y claros problemas de movilidad en periópodos y anténulas. Los muertos se encontraban totalmente inmóviles, con abdomen y anténulas curvadas.

Concentración 0,075 ppm – 96 h Se observaron 6 ejemplares vivos (promedio) y 14 muertos (promedio). Los ejemplares vivos presentaron escasa natación, estimulada con el movimiento de la placa, con evidentes problemas de movilidad en periópodos y anténulas. Los muertos se encontraban totalmente inmóviles, con abdomen y anténulas curvadas.

22

Concentración 0,09 ppm - 96 h Se observó 1 ejemplar vivo (promedio) y 19 muertos (promedio). Los organismos vivos presentaron escasa natación y problemas de movilidad en periópodos y anténulas. Los muertos se encontraban totalmente inmóviles, con abdomen y anténulas curvadas.

Concentración 0,108 ppm – 96 h Se observó mortalidad en todos los ejemplares. No presentaban movilidad alguna, abdomen y anténulas curvadas, setas de periópodos rígidas y adheridas unas con otras. c) Cálculo de EC50 Los resultados de la Tabla 10 fueron utilizados para efectuar el cálculo del EC50. El análisis estadístico entregado por el programa Probit indica la siguiente información para las 96 horas:

2 para Heterogeneidad (calculado) = 2,003

2 para Heterogeneidad (valor tabulado a un nivel de 0,05) = 7,815

Por tanto, es posible utilizar el método de Probit paramétrico. Los detalles de la curva resultante fueron los siguientes: µ = -1,195389

= 0,110015 Parámetro Estimado Error Estándar LC (95%) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Intercepto 15,865733 1,960583 (12,0230; 19,7085) Pendiente 9,089706 1,677669 (5,8015; 12,3779) Finalmente, en la Tabla 10 se detallan los resultados de los cálculos de las EC a las 96 horas para el desinfectante SAPROFORM.

23

Tabla 10 EC – 96 h obtenidas de los ensayos de toxicidad crónica para SAPROFORM.

Los resultados se expresan en mg/L o ppm.




EC 1.00 0,035 0,024 0,043

EC 5.00 0,042 0,031 0,049

EC 10.00 0,046 0,036 0,052

EC 15.00 0,049 0,040 0,055

EC 50.00 0,064 0,058 0,069

EC 85.00 0,083 0,076 0,096

EC 90.00 0,088 0,080 0,105

EC 95.00 0,097 0,086 0,120

EC 99.00 0,115 0,099 0,157

De lo anterior se desprende que el EC50 – 96 h para SAPROFORM determinada a través de los bioensayos con H. littoralis de 0,064 ppm (0,058 – 0,069).

24

IV. CONCLUSIONES DE LOS BIOENSAYOS DE TOXICIDAD AGUDA Y CRÓNICA DE SAPROFORM EN AGUA DULCE Y AGUA DE MAR

Los estudios antes detallados permiten concluir:

Los bioensayos de toxicidad aguda en agua dulce utilizando D. pulex para el desinfectante SAPROFORM determinaron un LC50 - 48 h de 0,075 ppm (0,067-0,082). En tanto, los bioensayos de toxicidad aguda en agua de mar utilizando H. littoralis para este desinfectante determinaron un LC50 - 48 h de 0,074 ppm (0,067-0,081). Lo anterior muestra que, considerando los intervalos de confianza, la concentración promedio de SAPROFORM que produce toxicidad aguda en agua dulce resultó ser prácticamente idéntica a la que produce este efecto en agua de mar.

Dado los LC50-48 h obtenidos, habrán de implementarse todas las medidas indicadas en el acápite MODO DE EMPLEO de la Hoja Técnica en el caso de utilizar este producto a concentraciones superiores a estos valores.

Por su parte, los bioensayos de toxicidad crónica en agua dulce utilizando H. littoralis para el desinfectante SAPROFORM determinaron un EC50 de 0,078 ppm (0,073-0,083). Por su parte, los bioensayos de toxicidad crónica en agua marina utilizando la microalga S. capricornutum para el desinfectante SAPROFORM determinaron un EC50 de 0,064 ppm (0,058-0,069). Se concluye, por tanto, que la concentración de SAPROFORM que produce toxicidad crónica en agua dulce es superior (17,9%) a la que produce este efecto en agua de mar.

V. RESPONSABILIDAD DE LOS ENSAYOS

Los ensayos y pruebas de laboratorio fueron realizados en el Laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales entre los días 10 y 24 de mayo de 2014, bajo la dirección del profesor Dr. Humberto Díaz Oviedo (Ph. Cs. Ingeniería m. Biotecnología) y la ejecución del Sr. Luis Rodríguez Siclari, Ayudante de Laboratorio, quien además estuvo a cargo del acondicionamiento de los especimenes en la sala de acuarios de la Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales para los ensayos de toxicidad. El apoyo logístico para la realización de este estudio fue proporcionado por el Sr. Julio Jara, Coordinador Administrativo de la Facultad. Se entrega el presente informe a petición del interesado para ser presentado a quien corresponda.

25

VI. BIBLIOGRAFÍA CITADA Y CONSULTADA

APHA (American Public Health Association). 1989. Toxicity Test Methods for Aquatic

Organisms, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 17th ed., Washington, DC, Part 8000.

Bellas, J, R. Beiras, M. Marino-Balsa & N. Fernandez. 2005. Toxicity of organic

compounds to marine invertebrate embryos and larvae: a comparison between the sea urchin embryogenesis bioassay and alternative test species. Ecotoxicol., 14:337-353.

Coteur, G., P. Gosselin, P. Wantier, Y. Chambost-Manciet, B. Danis, P. Pernet, M.

Warnau & M. Dubois. 2003. Echinoderms as bioindicators, bioassays, and impact assessment tools of sediment-associated metals and PCBs in the North Sea. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 45:190-202.

De Nicola, E., M. Gallo, M. Iaccarino, S. Meric, R. Oral & T. Russo. 2004. Hormetic

versus toxic effects of vegetable tannin in a multitest study. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 46: 336-344.

Farrán, G. 1913. Marine entomostraca. Proc. Roy. Irish Acad., sect 2, 31 (45): 1-20. Ghirardini, A.V., A.A. Novelli, B. Likar, G. Pojana, P.F. Ghetti & A. Marcomini. 2001.

Sperm cell toxicity test using sea urchin Paracentrotus lividus Lamarck (Echinodermata: Echinoidea): sensitivity and discriminatory ability toward anionic and nonionic surfactants. Environ. Toxicol. Chem., 20:644-651.

Goddart, M. 2003. Copépodos de pozas intermareales de la Isla de Pascua. Cienc.

Tecnol. Mar, 26 (1): 51-78. ISO 6341: 1996. Water quality – Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia

magna Straus (Crustacea, Cladocera) – Acute toxicity test. Klie, W. 1927. Die Copepoda Harpacticoida von. Hergoland. Wiss. Meeresuntersush., Abt.

Helgoland, new ser., 16 (9): 1-20. Larraín, A. 1975. Los equinoideos regulares fósiles y recientes de Chile. Gayana, zool.,

35:1-189 pp. Larraín, A, A. Riveros, J. Silva & E. Bay-Schmith. 1999. Toxicity of metals and

pesticides using the sperm cell bioassay with the sea urchin Arbacia spatuligera. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 62:749-757.

NCh. 2083 Of.1999. Aguas - Bioensayo de toxicidad aguda mediante la determinación de

la inhibición de la movilidad de Daphnia magna o Daphnia pulex (Crustacea, Cladocera). Norma Chilena Oficial NCh 2083. Of1999. Instituto Nacional de Normalización, INN-Chile. (Decreto Nº 152).

26

NCh. 426/2. Agua grado reactivo para análisis – Especificaciones – Parte 2: Análisis físico, químico y microbiológico de agua potable, aguas crudas y aguas residuales. Instituto Nacional de Normalización, INN-Chile.

NCh. 2313/5. Aguas residuales – Método de análisis – Parte 5: Determinación de la

Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO5). Instituto Nacional de Normalización, INN-Chile.

NCh. 411/2. Calidad del agua – Muestreo – Parte 2: Guía sobre técnica de muestreo.

Instituto Nacional de Normalización, INN-Chile. NCh. 411/3. Calidad del agua – Muestreo – Parte 3: Guía sobre la preservación y manejo

de muestras. Instituto Nacional de Normalización, INN-Chile. NCh. 2706 Of.2002. Bioensayos de Inhibición de crecimiento de algas en agua dulce con

Selenastrum capricornatum (Raphidocelis subcapitata). Olaechea, P., J.J. Panes & H. González-Figueroa. 2006. Desarrollo embrionario de

Tetrapygus niger (Molina, 1782) «erizo negro» en diferentes temperaturas. Biotempo, 6: 27-31.

Olivos, J. 1994. Evaluación mediante bioensayos de la toxicidad de un insecticida

piretroide en invertebrados marinos. Tesis Escuela de Biología Marina, Universidad Austral de Chile.

Pesando, D., S. Robert, P. Huitorel, E. Gutknecht, L. Pereira, J.P. Girard & B. Ciapa.

2004. Effects of methoxychlor, dieldrin and lindane on sea urchin fertilization and early development. Aquat. Toxicol., 66:225-239.

Sars, G.O. 1910. Copepoda Harpacticoida. An account of the Crustacea of Nor way with

shor t descriptions and figures of all species, 5: 337-368. USEPA. 1978. Selenastrum capricornutum Prinz algal assay: Bottle test. EPA - 600/9-78-

0181. US-EPA. 1991. Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving

Waters to Freshwater and Marine Organisms EPA- 600/4-90-027F. USEPA. 1993. Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving USEPA.

1995. Short-term methods for estimating the chronic toxicity of effluents and receiving waters to West Coast Marine and Estuarine Organisms. EPA/600/R-95/136.

USEPA. 1993. Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters

to freshwater and marine organisms. EPA/600/4-90/027F. August 1993. USEPA. 1994. Short-term methods for estimating the chronic toxicity of effluents and

receiving waters to freshwater organisms. EPA - 600/4 91/002.

27

USEPA. 1995. Short-term methods for estimating the chronic toxicity of effluents and receiving waters to West Coast Marine and Estuarine Organisms. EPA/600/R-95/136.

USEPA. 2001. Methods for Assessing the Chronic Toxicity of Marine and Estuarine

Sediment-Associated Contaminants with the Amphipod Leptocheirus plumulosus. EPA-600R01020.

USEPA. 2002. Short-term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and

Receiving Waters to Marine and Estuarine Organisms. EPA-821-R-02-014. Vásquez, L.C. 2003. Effect of sperm cell density on measured toxicity from the sea urchin

Tripneustes gratilla fertilization bioassay. Environ. Toxicol. Chem., 22:2191-2194. Wilson, C.B. 1932. The copepod crustaceans of Chesapeake Bay. Proc. U. S. Nat. Mus.

99:321-26.

Dr. Humberto Díaz O. Laboratorio de Bioensayos Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales Universidad de Valparaíso

Viña del Mar, 16 de Mayo de 2014

evaluaciÓn de la toxocidad y efectividad · las microalgas, entre las que se cuenta s....

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