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Evaluacin de la actividad antitumoral de nuevos compuestos metlicos y estudio de la reprogramacin metablica en cncer de pulmn: bsqueda de nuevas

dianas teraputicas y biomarcadores diagnsticosRoldn Corts Girldez

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Programa de Doctorado en BiotecnologaDepartament de Bioqumica i Biologia MolecularFacultat de Biologia

Evaluacin de la actividad antitumoral de nuevos compuestos metlicos y estudio de la reprogramacin metablica en cncer de pulmn: bsqueda de nuevas dianas teraputicas y biomarcadores diagnsticos

Memoria presentada por Roldn Corts Girldez para optar al grado de Doctor por la Universitat de Barcelona

Marta Cascante SerratosaDirectora

Roldn Corts GirldezDoctorando

E V A L U A C I ND E L A A C T I V I D A DA N T I T U M O R A L D EN U E V O S C O M P U E S T O SM E T L I C O S Y E S T U D I O D E L A R E P R O G R A M A C I NM E T A B L I C A E N C N C E R D E P U L M N : B S Q U E D A D E N U E V A S D I A N A ST E R A P U T I C A S Y B I O M A R C A D O R E SD I A G N S T I C O S .

ROLD N C O R T S G I R L D E Z

Hacer una Tesis parece fcil, pero hay que estar ah.

Friedrich Nietzsche

TESIS DOCTORALUB 2014

ROLDN CORTSGIRLDEZ

PG. 6

0 0 . N D I C E

00. _NDICE PG. 7

1. INTRODUCCIN GENERAL ................................................................................................. 1.1. El cncer .................................................................................................................... 1.2. El cncer de pulmn ................................................................................................. 1.3. KRAS y cncer de pulmn ....................................................................................... 1.4. El ciclo celular ........................................................................................................... 1.5. La apoptosis .............................................................................................................. 1.6. Mtodos para la evaluacin del ciclo celular y la apoptosis ................................... 1.7. Factores de transcripcin FOXO y su relacin con el cncer ................................. 1.8. Evaluacin de la localizacin intracelular de FOXO .............................................. 1.9. Metalofrmacos en quimioterapia ............................................................................ 1.09.1. Compuestos cicloplatinados de 7 miembros ..................................... 1.09.2. Compuestos de platino con iminas polifuncionalizadas .................. 1.09.3. Compuestos de platino y paladio derivados del pirazol.................... 1.09.4. Compuestos derivados del ferroceno.................................................. 1.10. El metabolismo tumoral.......................................................................................... 1.10.1. La gluclisis y el efecto Warburg......................................................... 1.10.2. La glutaminlisis ................................................................................. 1.10.3. La sntesis de cidos grasos ................................................................. 1.10.4. La ruta de las pentosas fosfato ............................................................ 1.11. La metabolmica y la flujmica ............................................................................. 1.11.1. La flujmica basada en trazadores ...................................................... 1.11.2. Anlisis de la distribucin isotopomrica .......................................... 1.12. Explotacin de las alteraciones metablicas del cncer de pulmn

en el diagnstico mediante el anlisis del aire exhalado ....................................... 1.13. Mtodos de anlisis metabolmico .......................................................................

2. OBJETIVOS .................................................................................................................................

3. INFORME DEL DIRECTOR ....................................................................................................

4. RESUMEN DE RESULTADOS, DISCUSIN GLOBAL Y CONCLUSIONES ................. 4.1. Resumen de resultados .............................................................................................. 4.2. Discusin global ........................................................................................................ 4.3. Conclusiones .............................................................................................................

5. BIBLIOGRAFIA ...........................................................................................................................

6. PUBLICACIONES ...................................................................................................................... 6.1. Captulo 1 ................................................................................................................. 6.1.1. Captulo 1a ........................................................................................... 6.1.2. Captulo 1b ......................................................................................... 6.1.3. Captulo 1c ......................................................................................... 6.1.4. Captulo 1d ......................................................................................... 6.1.5. Captulo 1e ......................................................................................... 6.2. Captulo 2 ............................................................................................................... 6.3. Captulo 3 ............................................................................................................... 5.4. Captulo 4 ...............................................................................................................

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0 1 .I N T R O D U C C I NG E N E R A L

01. _INTRODUCCIN GENERAL PG. 9

1.1. EL CNCER

El cncer es un concepto genrico que designa a un gran nmero de patologas dife-rentes. Todas ellas, sin embargo, comparten como caracterstica comn la divisin acelerada y descontrolada de las clulas del organismo, que son capaces no solo de aumentar su nmero ms all de los lmites fisiolgicos normales, sino tambin de invadir otros tejidos de manera local o a distancia, propagndose a travs de los vasos sanguneos y linfticos. Con cerca de 14.1 millones de diagnsticos y ms de 8 millones de muertes a nivel global en 2008 (Bray, Jemal et al. 2012) y una incidencia en aumento, el cncer constituye una de las principales causas de mortalidad no solo en los pases desarrollados, sino tambin en aquellos en vas de desarrollo.

En los tejidos sanos la proliferacin celular est estrictamente controlada me-diante diferentes vas de sealizacin, y una vez superada la etapa de crecimien-to la gran mayora de las clulas del organismo nicamente se dividen para reemplazar a otras clulas daadas o muertas. En el cncer, por el contrario, los mecanismos de control de la proliferacin celular dejan de funcionar correcta-mente, lo que provoca que las clulas se multipliquen sin control de manera autnoma provocando la aparicin de un tumor.

Para que el tumor se desarrolle, en cualquier caso, no basta con una desregula-cin de las seales que controlan el crecimiento celular. Tambin es necesario superar diferentes programas biolgicos que controlan la proliferacin mediante mecanismos muy diversos, como la muerte celular programada o la respuesta inmunolgica. As, tanto el desarrollo inicial como la posterior progresin y expansin del cncer requieren de mltiples adaptaciones que permitan a las clulas mantener un potencial proliferativo descontrolado y acelerado a pesar de los distintos mecanismos de control directos e indirectos existentes en el orga-nismo. Aunque hay una gran variabilidad intertumoral (e incluso intratumoral) entre las clulas tumorales, existen ciertas caractersticas comunes a las clulas de cncer que han sido definidas por Douglas Hanahan y Robert A. Weinberg (Hanahan and Weinberg 2011) y que se recogen en la figura 1.

La adquisicin de todas las caractersticas necesarias para el desarrollo del cncer se realiza de manera secuencial. La teora monoclonal, ampliamente aceptada en la actualidad, sostiene que el cncer se genera a partir de una nica clula sana, que genera un tumor canceroso a travs de las tres etapas que conforman el proceso carcinognico. Esta transformacin resulta de la interaccin entre los factores genticos propios de cada individuo con factores externos llamados carcingenos, que pueden ser fsicos (como distintas radiaciones, entre las que se encuentra la luz ultravioleta), qumicos (como el humo del tabaco o diversos


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productos contaminantes) o biolgicos (como distintas infecciones, que pueden ser vricas, bacterianas o parasitarias).

Observaciones empricas, inicialmente realizadas en modelos experimentales de melanoma, apuntan a que la carcinognesis es un proceso dividido en tres pasos diferenciados: La iniciacin, la promocin y la progresin (Hennings, Glick et al. 1993). En la primera etapa de iniciacin, un agente iniciador (el carcingeno) pro-voca un dao en el material gentico celular, lo que resulta en una mutacin. La exposicin continuada a agentes iniciadores acaba provocando una acumulacin de diferentes mutaciones en la clula, que se convierte as en lo que se denomina una clula iniciada. Esta clula iniciada, aunque an no presenta cambios detecta-bles en su tasa de proliferacin, s ha incrementado exponencialmente su suscep-tibilidad para dar origen a un tumor.

La segunda etapa de la carcinognesis, la promocin, requiere la accin de promoto-res: agentes carcingenos que no son mutagnicos por s mismos pero que provocan, en el tejido en el que se encuentra la clula iniciada, un trastorno capaz de propiciar una proliferacin descontrolada a partir de la misma. La accin de los promotores facilita la aparicin de tumores benignos, que resultaran fcilmente reversibles en au-sencia de nuevos promotores pero que pueden generar un tumor con un crecimiento acelerado consistente si su efecto se mantiene en el tiempo (Rubin 2003).

Tras la promocin, se forma un tumor con clulas que ya son capaces de man-tener de manera autnoma un crecimiento acelerado. La mortalidad del cncer, sin embargo, recae en la capacidad de las clulas tumorales para extenderse a otros tejidos del organismo mediante la adquisicin de capacidad invasiva en la ltima etapa carcinognica: la progresin. En esta etapa intervienen diferen-tes mecanismos que regulan la invasin local, la angiognesis (generacin de nuevos vasos sanguneos a partir de los preexistentes), la intravasacin a vasos sanguneos y linfticos, la extravasacin en otros tejidos diferentes y la aparicin de tumores metastticos a distancia.

En las clulas tumorales aparecen, durante la progresin tumoral, mltiples muta-ciones distintas. De acuerdo a las leyes darwinianas de la evolucin, las mutacio-nes que confieren a las clulas una mayor viabilidad son seleccionadas, vindose aumentada su proporcin en el tumor (Greaves and Maley 2012). Las mutaciones que ms ventajas aportan para la progresin tumoral no son nicamente las que aumentan la velocidad de crecimiento celular, sino tambin las que proporcionan a la clula los mecanismos para sobrevivir en el entorno tumoral, captar nutrientes y oxgeno o evadir las seales supresoras del crecimiento o las defensas del sistema inmune del organismo. Como norma general, una nica mutacin no es sufi-


ciente para provocar la transformacin de una clula sana en una clula tumoral, pero en cualquier caso algunas de las mutaciones aparecidas deben afectar a genes relacionados directa o indirectamente con el control del crecimiento tumoral. Es-tos genes reciben el nombre de proto-onocogenes y genes supresores de tumores.

Los proto-oncogenes estn relacionados con funciones promotoras de la proli-feracin celular. Codifican para factores de transduccin y molculas de vas de sealizacin relacionadas con la divisin y el crecimiento, as como para factores reguladores del ciclo celular o de la apoptosis (muerte celular programada). Un oncogen es un proto-oncogen que ha sufrido una mutacin de ganancia de fun-cin, lo que implica que se encuentra activo de manera constitutiva sin necesi-

FIGURA 01. Caractersticas del cncer. La figura refleja las capacidades que la clula debe adquirir para iniciar y mantener la progresin tumoral. Figura adaptada con permiso Elsevier de Hallmarks of cancer: the next generation, Cell 144(5): 646-674.


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dad de seales activadoras. As, la aparicin de oncogenes provoca un aumento de la tasa de proliferacin celular (Adamson 1987; Weinstein and Joe 2006).

La funcin de los genes supresores de tumores, por otro lado, es la de limitar el crecimiento tumoral, respondiendo a situaciones de estrs o a daos bioqu-micos mediante la activacin de mecanismos de reparacin celular o, en los casos en los que la reparacin ya no es una opcin, mediante la activacin de programas de muerte celular programada que eliminan las clulas sobrantes o defectuosas. Cuando uno de estos genes tiene una mutacin que hace que pier-da su funcin, se genera un efecto sinrgico al generado por los oncogenes, con lo que el aumento de la proliferacin celular se ve potenciado (Weinberg 1991).

En definitiva, mediante el proceso de carcinognesis la clula adquiere y se-lecciona una serie de mutaciones que le permiten adquirir las caractersticas necesarias para mantener una proliferacin acelerada y descontrolada, esqui-var los mecanismos inmunolgicos y supresores del crecimiento, sobrevivir en el entorno tumoral e invadir otros tejidos localmente y a distancia generando metstasis en otros puntos del organismo.

1.2. EL CNCER DE PULMN

El cncer de pulmn es actualmente el tipo de cncer que ms mortalidad pro-voca a nivel mundial, siendo adems el cncer ms diagnosticado en hombres y el cuarto ms diagnosticado en mujeres (Bray, Jemal et al. 2012). La causa ms comn de cncer de pulmn es el tabaquismo, siendo alrededor del 90% de los pacientes con esta enfermedad fumadores y ex fumadores. El 10% restante de casos de cncer de pulmn se atribuyen a una combinacin de causas genticas y exposicin a agentes carcingenos como el gas radn, el asbesto, la contami-nacin atmosfrica o el humo de tabaco (fumadores pasivos).

El cncer de pulmn se clasifica comnmente en dos grupos: cncer de pulmn de clulas pequeas (SCLC) y cncer de pulmn de clulas no pequeas (NS-CLC, del ingls non-small cell lung cancer). El NSCLC constituye alrededor del 85% del total de casos de cncer de pulmn, y a su vez se subdivide en tres grupos: adenocarcinoma, carcinoma pulmonar de clulas escamosas y carcinoma pulmo-nar de clulas grandes. El adenocarcinoma es el tipo de cncer de pulmn ms comn tanto en fumadores y exfumadores como en no fumadores. El carcinoma pulmonar de clulas grandes, por otro lado, suele ser el cncer de pulmn de cre-cimiento ms rpido.


Dependiendo del tamao del tumor generado, el grado de afectacin linftica y la apa-ricin o no de metstasis distantes, el cncer de pulmn se puede clasificar en funcin de su grado de desarrollo segn el mtodo de clasificacin TNM (Goldstraw 2013).

Categoras T de cncer de pulmn:

T1, cuando el tumor no mide ms de tres centmetros, no ha alcanzado las membranas que rodean los pulmones (pleura visceral), y no afecta las ramas principales de los bronquios. Si el tumor mide 2 cm (alrededor de 4/5 de pulgada) o menos, se le llama T1a. Cuando el tumor mide ms de 2 cm, pero no mide ms de 3 cm, se le llama T1b.

T2, cuando el tumor presenta al menos una de las siguientes caractersticas:

Mide ms de 3 cm, pero no ms de 7.

Involucra a un bronquio principal, pero no est a menos de 2 cm de la carina (el punto donde la trquea se divide en los bronquios principales izquierdo y derecho).

Ha crecido hacia el interior de las membranas que rodean a los pulmones (pleura visceral).

El tumor obstruye parcialmente las vas respiratorias, pero esto no ha causado el colapso de todo el pulmn ni la apari-cin de neumona.

Si el tumor mide 5 cm o menos, se le llama T2a. Si el tumor mide ms de 5 cm (pero no mide ms de 7 cm), se le llama T2b.

T3, cuando el tumor presenta una o ms de las siguientes caractersticas:

Su tamao es mayor de 7 cm.

Ha crecido hacia el interior de la pared del trax, el msculo que separa el trax del abdomen (diafragma), las membranas que rodean el espacio entre los dos pulmones (pleura me-diastinal), o a las membranas del saco que rodea el corazn (pericardio parietal).


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Invade a un bronquio principal, y est ms cerca de 2 cm de la carina, pero no afecta la carina en s.

Ha crecido hacia el interior de las vas respiratorias lo suficiente para causar el colapso total de un pulmn o neumona en la totalidad del pulmn.

Dos o ms ndulos tumorales separados se encuentran presen-tes en el mismo lbulo de un pulmn.

T4, cuando el cncer presenta una o ms de las siguientes caractersticas:

Un tumor de cualquier tamao ha crecido hacia el espacio que existe entre los pulmones (mediastino), el corazn, los vasos sanguneos grandes cercanos al corazn (tal como la aorta), la trquea, el tubo que conecta la garganta con el estmago (esfago), la columna vertebral o la carina.

Dos o ms ndulos tumorales separados se encuentran en l-bulos diferentes del mismo pulmn.

Categoras N de cncer de pulmn:

N0, cuando no hay propagacin a los ganglios linfticos adyacentes.

N1, cuando el cncer se propag a los ganglios linfticos dentro del pul-mn y/o alrededor del rea donde los bronquios entran al pulmn (a los ganglios linfticos hiliares). Los ganglios linfticos afectados se encuentran en el mismo lado del tumor primario.

N2, cuando el cncer se propag a los ganglios linfticos que se encuentran alrededor de la carina (el punto donde la trquea se divide en los bronquios izquierdo y derecho), o en el espacio entre los pulmones (mediastino). Los gan-glios linfticos afectados se encuentran en el mismo lado del tumor primario.

N3, cuando el cncer se propag a los ganglios linfticos que se en-cuentran cerca de la clavcula en cualquiera de los lados, y/o se propag a los ganglios linfticos hiliares o mediastinales que se ubican en el lado opuesto al tumor primario.


Categoras M de cncer de pulmn:

M0, cuando el cncer no se ha propagado a reas u rganos distantes. Esto incluye al otro pulmn, los ganglios linfticos de ubicacin ms distante que los mencionados anteriormente en las etapas N, y otros rganos o tejidos tales como el hgado, los huesos o el cerebro.

M1a, cuando se da cualquiera de los siguientes casos:

El cncer se propag al otro pulmn.

Se detectan clulas cancerosas en el lquido que rodea el pul-mn (llamado derrame pleural maligno).

Se detectan clulas cancerosas en el lquido que rodea el cora-zn (llamado derrame pericrdico maligno).

M1b, cuando el cncer se propag a ganglios linfticos distantes o a otros rganos, como el hgado, los huesos, o el cerebro.

El cncer de pulmn es uno de los tipos de cncer ms agresivos que existen. El 50% de los pacientes de cncer de pulmn mueren en el primer ao tras el diag-nstico, y menos del 15% sobreviven ms de cinco aos. La limitada eficacia que en la mayora de los casos presentan los tratamientos quimioteraputicos actuales en NSCLC hace que la extirpacin quirrgica del tumor sea la estrategia ms utilizada en el tratamiento de la enfermedad (Padda, Burt et al. 2014), y una de las causas fundamentales de la elevada tasa de mortalidad del cncer de pul-mn es que los tumores diagnosticados acostumbran a presentar numeraciones altas segn la clasificacin TNM, lo que indica que se encuentran en un estado de desarrollo demasiado avanzado que imposibilita su extraccin por ciruga.

La quimioterapia se suele usar en NSCLC como tratamiento posterior a la extirpa-cin quirrgica del tumor, con la intencin de minimizar el riesgo de recada del paciente, as como en los casos en los que la ciruga no es una opcin viable. En solitario o en combinacin con radioterapia, los tratamientos ms habituales impli-can el uso de quimioterapia basada en compuestos de platino, como cisplatino o carboplatino (Zarogoulidis, Zarogoulidis et al. 2013). A medida que la comprensin de los mecanismos moleculares del NSCLC ha aumentado, a la quimioterapia convencional se ha aadido el uso de inhibidores biolgicos dirigidos contra dianas


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moleculares especficas. De entre los ms usados, podemos destacar los que tienen actividad antiangiognica, como por ejemplo bevacizumab, y los dirigidos a inhibir el receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR, del ingls epidermal growth factor receptor), como por ejemplo Erlotinib, un inhibidor de la actividad tirosina quinasa del EGFR que resulta especialmente efectivo en pacientes con mutaciones activadoras del gen EGFR (Reungwetwattana and Dy 2013).

As, para mejorar la prognosis del cncer de pulmn, y excluyendo estrategias pre-ventivas (de entre las cuales la ms exitosa es sin duda la de no fumar), resulta de cru-cial importancia el desarrollo de nuevos compuestos con actividad antitumoral que resulten efectivos en el tratamiento del cncer de pulmn, ya sea por s mismos o formando parte de nuevas terapias combinadas, as como nuevos mtodos diagns-ticos que permitan detectar la enfermedad en las primeras etapas de su desarrollo.

1.3. KRAS Y CNCER DE PULMN

KRAS es parte de la familia de proto-oncogenes RAS, que en humanos incluye tambin a NRAS y HRAS. La protena codificada por KRAS, la GTPasa KRas, juega un papel esencial en el control de distintas vas de transmisin de seal que regulan procesos como la apoptosis, el progreso en el ciclo celular o la transcripcin, y por lo tanto KRas tiene un papel clave en la proliferacin, la diferenciacin y la supervivencia celulares (Chetty and Govender 2013). En c-lulas quiescentes sanas, KRas se encuentra unida a guanosn difosfato (GDP) en un estado inactivo. Tras recibir seales de activacin provenientes de receptores de factores de crecimiento, el GDP pasa a su forma activada guanosn trifosfato (GTP), y el complejo KRas-GTP resultante es capaz de activar diversas vas, incluyendo las de proten quinasas activadas por mitgenos (MAPK, del ingls mitogen activated protein kinases) y fosfo-inositol 3 quinasa (PI3K).

KRas juega un papel crtico en la transmisin de seal inducida por diversos re-ceptores de crecimiento, y su activacin constitutiva hara innecesaria la sealiza-cin mediada por factores de crecimiento, ya que las vas reguladas por KRas se encontraran activadas independientemente de la presencia de estos (ver figura 2). Mutaciones activadoras de KRas son comunes en muchos tipos de cncer, y mutaciones activadoras en el gen KRAS constituyen la alteracin oncognica ms comn en cncer de pulmn de clulas no pequeas (Cooper, Lam et al. 2013). Las mutaciones en KRAS son especialmente comunes en adenocarcinomas de pases occidentales, y resultan ms frecuentes en varones y en fumadores. Por el contrario, son extremadamente raras en cncer de pulmn de clulas pequeas.


Es interesante resaltar que otra de las mutaciones ms comunes en cncer de pul-mn, la del oncogen que codifica para el receptor del factor de crecimiento epi-drmico (EGFR, del ingls epidermal growth factor receptor) nunca se presenta en pacientes con mutaciones en KRAS, por lo que ambas mutaciones se consideran mutuamente excluyentes. La terapia con inhibidores de tirosina quinasa (TKIs, del ingls tirosine-kinase inhibitors), como erlotinib, actan sobre el receptor EGFR y resultan efectivas en el cncer de pulmn de pacientes con mutaciones en el gen que lo codifica, pero los pacientes con mutaciones en KRAS no responden a estos tratamientos (Cardarella and Johnson 2013). En general, la alta frecuencia de mutaciones en KRAS que presenta el cncer de pulmn abre la posibilidad de que KRas sea una diana teraputica til en el tratamiento de la enfermedad, pero desafortunadamente los ensayos clnicos de productos enfocados a inhibir esta protena han resultado decepcionantes hasta el da de hoy.

FIGURA 02. Efecto de KRAS. La figura refleja cmo los inhibidores de EGFR no resultan tiles en los casos en los que KRAS cuenta con mutaciones que provocan la activacin constitutiva de KRas. KRas se encuentra por debajo de EGFR en la va de sealizacin que comparten, y por tanto su activacin constitutiva hace que la va est activada incluso en ausencia de las seales activadoras mediadas por EGFR.


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1.4. EL CICLO CELULAR

Se denomina ciclo celular al conjunto de sucesos altamente regulado por el que una clula origina dos clulas hijas. Este ciclo, que comprende el periodo entre dos divisiones mitticas, incluye los procesos durante los cuales la clula aumenta su tamao, duplica su material gentico y finalmente se divide en dos clulas independientes. El ciclo celular se puede considerar un proceso dividido en las di-ferentes etapas representadas en la figura 3, que conforman la interfase (conjunto de etapas por las que pasa una nueva la clula hasta que est lista para una nueva divisin) y la fase de divisin (en la que la clula se divide en dos clulas hijas).

Concretamente, la interfase se puede subdividir en las siguientes etapas:

Fase G1: Periodo comprendido entre el fin de la divisin anterior y el inicio de la duplicacin del material gentico celular. Durante esta fase, tambin llamada primera fase de crecimiento, la clula sintetiza nuevo material citoplasmtico, especialmente protenas y ARN, en preparacin para el inicio de la siguiente etapa del ciclo en la que ten-dr que sintetizar otra copia de su ADN.

Fase G0: En clulas no proliferantes (la inmensa mayora de las clulas sanas de un organismo adulto), las clulas entran en un estado de quiescencia en el que el ciclo celular no avanza hacia nuevas duplicaciones. Esta fase recibe el nombre de fase G0, que indica que la clula se encuentra detenida ya que no est programada para continuar dividindose. Algunas clulas, como las clulas madre adultas, entran en fase G0 de manera reversible, y bajo estmu-los fisiolgicos normales pueden volver a entrar en la fase G1, continuando hacia las siguientes fases del ciclo celular y convirtindose as de nuevo en una clula proliferante. En clulas de mamfero completamente diferencia-das, en cambio, as como en clulas senescentes, la entrada en la fase G0 se considera prcticamente irreversible, aunque bajo estmulos excepcionales (entre los que se cuentan la inhibicin de los supresores de tumores p53 y RB) tanto las clulas senescentes como las terminalmente diferenciadas son tambin capaces de reentrar en el ciclo celular (Cheung and Rando 2013).

Fase S: La fase S (tambin llamada fase de sntesis) es aquella en la que la clula sintetiza una segunda copia completa de su ADN. Cuando acaba la fase S, la clula cuenta con el doble de cromosomas que al inicio de la misma (4n, ya que las clulas humanas son diploides y normalmente cuentan con un nmero de cromosomas igual a 2n, siendo n el nmero de cromosomas aportado por cada uno de los progenitores del organismo).


Fase G2: La ltima etapa de preparacin antes de la divisin celular. Tambin recibe el nombre de segunda fase de crecimiento, y durante la misma contina la sntesis de ARN y protenas mientras la clula se prepara para su entrada en la fase de mitosis. A medida que se acerca el final de esta etapa, el ADN empieza a condensarse y los cromosomas se hacen visibles al microscopio.

La fase de divisin, por otro lado, se divide entre las etapas de Mitosis, durante la cual se produce el reparto equitativo del material gentico en la formacin de dos ncleos celulares, y Citocinesis, el proceso final de separacin fsica del citoplasma que concluye con la generacin de dos clulas separadas e indepen-dientes, cada una de las cuales contendr una copia idntica de ADN. La fase de divisin recibe tambin el nombre de fase M.

El ciclo celular es un proceso estrechamente controlado mediante seales de diferentes vas reguladoras del crecimiento. En su regulacin juegan un papel clave las protenas quinasas dependientes de ciclinas (CDKs, del ingls cyclin dependent kinases) que, como su propio nombre indica, dependen de subuni-dades reguladoras llamadas ciclinas. Les CDKs actan de forma secuencial, siendo activadas por sus ciclinas correspondientes en las distintas etapas del ciclo celular a medida que este avanza. As, durante la fase G1, se activan los complejos ciclina D-CDK4/6 y ciclina E-CDK2 para conducir a la clula a la fase S a travs del punto de restriccin R, mientras que la fase S es la ciclina A la que forma complejos con CDK1 y CDK2 para promover la finalizacin de la fase S y posteriormente son las ciclinas A y B las que se asocian con CDK1 para progresar a travs de la fase G2 y entrar en la fase M (Gallorini, Cataldi et al. 2012). Debido al papel central que juegan en el control del crecimiento y la proliferacin celulares, los mecanismos que controlan el ciclo celular se en-cuentran alterados con mucha frecuencia en el cncer y constituyen las dianas de diferentes terapias contra la enfermedad (Chan, Koh et al. 2012; Salmela and Kallio 2013; Gorjanacz 2014). Para abandonar la fase de quiescencia del ciclo celular (fase G0), las clulas sanas necesitan no solo de una serie de estmu-los mitticos regulados por factores de crecimiento, adhesiones clula-clula o distintos componentes de la matriz extracelular, sino tambin de la inhibicin de distintas seales antiproliferativas que bloquean el crecimiento mantenien-do el ciclo celular en un estado continuado de reposo. Dos de las principales caractersticas del cncer descritas por Hanahan y Weinberg, sin embargo, son precisamente la autosuficiencia de seales de crecimiento y la insensibilidad ante seales antiproliferativas que presentan las clulas tumorales.


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La autosuficiencia de seales de crecimiento es adquirida por las clulas tu-morales de maneras diferentes. Hay clulas tumorales capaces de sintetizar y liberar factores de crecimiento a los que ellas mismas responden, en un proceso denominado autoestimulacin autocrina. Otras responden de manera especialmente intensa a seales inductoras de la proliferacin que provienen de clulas de su microentorno, que son capaces de liberar factores de cre-cimiento como TGF-, EGF y molculas como Wnt2(Cheng, Chytil et al. 2008; Ostman and Augsten 2009; Fu, Zhang et al. 2011). La sobreexpresin de receptores de factores de crecimiento en las clulas tumorales, que las hace hipersensibles a las concentraciones de ligando presentes en su entorno ms cercano, contribuye a este fenmeno. Algunos de los receptores de factores de crecimiento presentes en clulas tumorales son capaces, incluso, de transmitir seales promitticas en ausencia total de ligando, y en otros casos son las vas intracelulares de transduccin de seal, que normalmente slo se activan al recibir la seal correspondiente de los receptores de membrana, las que estn activadas de manera constitutiva en las clulas tumorales. En este ltimo caso, la mayora de las veces el punto clave lo constituyen protenas de la familia Ras, cuya mutacin mantiene activadas de forma constante las cascadas de sealizacin Ras/Raf/MEK/ERK y Ras/PI3K/mTor, que favorecen tanto la proliferacin como la supervivencia celular (Miller, Yeager et al. 2009). Como hemos visto, este es el caso en muchos cnceres de pulmn que cuentan con mutaciones activadoras en el gen que codifica para la protena KRas, con lo que las vas reguladas por esta protena se encuentran activadas sin necesidad de recibir la seal correspondiente de los receptores de membrana.

Las seales antiproliferativas, por otra parte, suelen englobar distintas pro-tenas que regulan el ciclo celular induciendo la entrada en fase de quies-cencia G0 o bien impidiendo que se superen los checkpoints del mismo. Los checkpoints son puntos de control entre las diferentes fases del ciclo celu-lar que slo pueden ser superados cuando la fase previa al checkpoint se ha completado de manera correcta. En general, son mecanismos en los que se detecta si el ADN ha sufrido algn tipo de dao, impidiendo la suplicacin de la clula si este no puede ser reparado (Kastan and Bartek 2004). Los chec-kpoints actan a travs de molculas inhibidoras de CDKs y de ciclinas, que se engloban en dos grandes grupos: protenas INK4 (como INK4A, INK4B, INK4C e INK4D) y las familias Cip y Kip (compuestas por los inhibidores de ciclinas y CDKs p21, p27 y p57) (Malumbres and Barbacid 2009). Las molculas que ejercen este tipo de controles negativos sobre la progresin del ciclo celular tienen una funcin muy importante en la prevencin de la tumorignesis, y por ello es comn que se encuentren desreguladas en el cncer (Diaz-Moralli, Tarrado-Castellarnau et al. 2013).


1.5. LA APOPTOSIS

La apoptosis es un mecanismo de muerte celular programada mediante el cual el organismo elimina de manera controlada las clulas sobrantes, daadas o que puedan representar un peligro para el organismo. A diferencia de los pro-cesos necrticos, que se caracterizan por una disolucin de los orgnulos y una prdida de la permeabilidad de las membranas celulares con la consiguiente liberacin al espacio extracelular de hidrolasas que generan inflamacin, la

FIGURA 03. El Ciclo Celular. Esquema simplificado del Ciclo Celular. Tras la fase M la clula se divide en dos clulas hijas que pasan a estar en fase G1. Distintos mecanismos de control, llamados checkpoints, controlan el paso de una fase a la siguiente. Las clulas pueden entrar en un estado quiescente (fase G0) en el que no se reproducen.


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apoptosis implica el desmantelamiento completo de las principales estructuras celulares de forma controlada, de tal manera que no se producen efectos ad-versos en clulas o tejidos contiguos.

Para asegurar el grado de control necesario, la apoptosis es un proceso al-tamente regulado que consta de diversas fases que se suceden siguiendo un orden establecido. Inicialmente, distintos mediadores genticos y bioqumicos se activan en un intento de reparar los daos que pueda tener la clula, mo-mento en el que el proceso apopttico es an reversible. Si estos mecanismos fallan, sin embargo, se inicia la llamada fase de ejecucin, a partir de la cual el proceso es ya irreversible. En la fase de ejecucin la clula sufre una serie de cambios estructurales que incluyen la condensacin de la cromatina y la for-macin de los llamados cuerpos apoptticos, que estn constituidos por restos de componentes citoplasmticos y nucleares rodeados por membrana celular. Estos cuerpos, en los que se acaba descomponiendo la totalidad de la clula, son eliminados del entorno extracelular por clulas fagocitarias, lo que impide la inflamacin del tejido circundante.

La regulacin de todos estos pasos est asociada a la activacin de un con-junto de protenas denominadas caspasas, cuya desregulacin tiene por tan-to una importante influencia en el cncer (McIlwain, Berger et al. 2013; Yan, Li et al. 2013). Las vas de activacin de la apoptosis en las que estn involucradas las caspasas representan un paradigma particular en el mbito de la transduccin de seal, ya que esta es transmitida al realizarse cortes especficos en la estructura de las caspasas, que son los que producen la activacin de las mismas. As, las caspasas iniciadoras provocan cortes en las caspasas ejecutoras, activando a estas ltimas para que puedan hidrolizar enlaces especficos de sus sustratos diana.

La apoptosis puede ser activada por diversos estmulos, como el cambio en la disponibilidad de hormonas, el estrs oxidativo, el dao en el ADN o la radia-cin. Como se ve en la figura 4, Hay dos vas distintas por las que los estmulos pueden activar la apoptosis: la va intrnseca y la va extrnseca. La va extrn-seca est ligada a seales externas transmitidas por receptores transmembrana llamados receptores de muerte (DR, del ingls death receptors). La unin a estos receptores de ligandos proapoptticos provoca la trimerizacin del receptor y el consiguiente reclutamiento de la protena adaptadora de dominio de muerte asociada a Fas (FADD, del ingls Fas associated death domain) y de las caspa-sas 8 y 10, que se unen al dominio citoplasmtico del receptor para formar un complejo sealizador inductor de muerte celular (DISC, del ingls death-in-ducing signal complex). Las caspasas 8 y 10 son llamadas caspasas iniciadoras,


ya que su activacin es necesaria para que se inicie el proceso apopttico. Su activacin autocataltica en el DISC les permite activar a las caspasas 3, 6 y/o 7, llamadas caspasas efectoras, que acaban convergiendo en la va intrnseca de la apoptosis. La activacin de la caspasa 8 tambin puede provocar la ruptura de la protena pro-apopttica BID, cuya forma truncada promueve la formacin de oligmeros de las protenas BAK y BAX, que activan la va intrnseca en lo que constituye otro punto de convergencia de ambas vas (Khan, Blanco-Codesido et al. 2014). La va intrnseca, por otro lado, se induce intracelularmente, concre-tamente desde la mitocondria. Esta va se activa en respuesta a seales de estrs celular, que se pueden originar por dao en el ADN, hipoxia, fallos en el ciclo celular o prdida de factores de supervivencia celular. En esta va, tambin lla-mada va mitocondrial, la permeabilizacin de la mitocondria hace que se libere Citocromo c, una protena que forma junto a las protenas Apaf-1 y pro-caspasa 9 el complejo llamado apoptosoma. Este complejo es capaz, a su vez, de desen-cadenar la cascada proteoltica apopttica a travs de las caspasas efectoras 3, 6 y 7. La va intrnseca est estrechamente regulada por un equilibrio de protenas de la familia Bcl-2, que tienen funciones pro y anti apoptticas. Las protenas anti apoptticas de la familia Bcl-2, como Bcl-XL y MCL-1, tienen como funcin mantener la integridad de la membrana mitocondrial externa. Las protenas pro apoptticas de la familia Bcl-2, como BAD y BMF, adems de otras protenas pro apoptticas como PUMA o NOXA, se ven activadas por seales de estrs celular de manera que inhiben la accin de las protenas anti apoptticas men-cionadas (Ren, Tu et al. 2010). Otro subgrupo de protenas pro-apoptticas, que incluye a Bid y a BIM, son capaces de activar las protenas efectoras BAK y BAX (Kuwana, Mackey et al. 2002), que oligomerizan formando poros en la membrana mitocondrial externa, permeabilizndola y provocando que libere al citosol las protenas citocromo c (que junto con Apaf-1 y pro-caspasa 9 forma el complejo llamado apoptosoma) y Smac/DIABLO (que se une a inhibidores de ptotenas apoptticas llamados IAPs, impidiendo que ejerzan su funcin). El apoptosoma activa por protelisis la caspasa 9, que a su vez desencadena la cascada proteoltica apopttica a travs de las caspasas efectoras 3, 6 y 7 (Elkholi, Floros et al. 2011; Khan, Blanco-Codesido et al. 2014).

La correcta regulacin del proceso apopttico se ve alterada con mucha fre-cuencia en las clulas de cncer, y de hecho una de las caractersticas comunes de las clulas tumorales, descritas por Hanahan y Weinberg, consiste en la capacidad de evadir la muerte celular. La inmensa mayora de clulas tumo-rales presentan diversas mutaciones de genes o inactivaciones funcionales de protenas relacionadas con la apoptosis, haciendo que incluso en situaciones de dao en el ADN o estrs celular las clulas sobrevivan evadiendo todos estos mecanismos de control.


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1.6. MTODOS PARA LA EVALUACIN DEL CICLO CELULAR Y LA APOPTOSIS

En su sentido ms amplio, la citometra define el anlisis de las caractersticas de las clulas. La citometra de flujo, por su parte, es una tcnica de anlisis celular que mide las caractersticas de clulas en suspensin mediante el paso de las mismas, una a una, por un sistema ptico consistente en lseres que iluminan a las clulas junto con distintos filtros que dirigen las seales pticas que estas producen al interaccionar con el lser al detector correspondiente.

FIGURA 04. La apoptosis. Esquema simplificado del proceso apopttico, y de las dos vas por las que este puede ser iniciado. La va extrnseca est mediada por la unin de ligandos de muerte a receptores transmembrana. La va intrnseca, en cambio, desencadenada habitualmente por estrs celular o dao en el ADN, se induce intracelularmente a partir de la liberacin mitocondrial de citocromo C.


La clasificacin de clulas activadas por fluorescencia (FACS, del ingls fluorescence activated cell sorting) es un tipo particular de citometra de flujo. Mediante esta tcnica, las clulas en suspensin se hacen pasar por un haz de luz con una de-terminada longitud de onda, momento en el que un detector mide la dispersin de luz y la intensidad de fluorescencia que presentan cada una de las clulas que son procesadas en el anlisis. Podemos marcar distintas molculas de la clula de manera que, cuando esta interaccione con el lser emitido por el citmetro, emita fluorescencias determinadas que nos pueden dar informacin acerca de la presencia y concentracin de las molculas marcadas en las clulas analizadas. As, mediante la eleccin de los marcadores fluorescentes adecuados, se pueden estu-diar mltiples caractersticas celulares, midiendo as diferentes estados fenotpicos. Algunos ejemplos incluyen la deteccin de la fase del ciclo celular en la que se en-cuentra la clula, o si en la misma se est llevando a cabo un proceso apopttico.

El estudio del ciclo celular mediante FACS se puede realizar previo marcaje de las clulas con ioduro de propidio. El ioduro de propidio (IP) es un agente intercalante de cidos nucleicos que se une al ADN celular. As, tras impermea-bilizar las clulas (para permitir que el IP acceda al ncleo celular) y aplicar este marcaje, la cantidad de IP que contenga una clula, detectable por FACS ya que emite fluorescencia a una longitud de onda de 617 nm, ser proporcional a la cantidad de ADN de la misma (Nunez 2001). Como hemos visto anteriormente, en la fase G1 la cantidad de ADN de la clula es de 2n, mientras que en la fase G2 esta cantidad se ha duplicado. As, midiendo la intensidad de la fluorescen-cia a 617 nm de clulas marcadas con ioduro de propidio, podremos deducir si una clula analizada se encuentra en fase G1/G0 (cantidad de ADN: 2n), en fase G2/M (cantidad de ADN: 4n) o en fase S (en la que el ADN est en proceso de duplicacin, y por tanto en una cantidad intermedia entre 2n y 4n).

La deteccin de la apoptosis mediante FACS, por otra parte, se basa en uno de los cambios morfolgicos que sufre la clula durante las primeras fases del proceso apopttico. En la primera etapa de la apoptosis se produce una prdida de la asi-metra de la membrana plasmtica, con lo que la fosfatidilserina, que normalmen-te se encuentra anclada nicamente a la parte interna de la membrana (de manera que queda expuesta al citoplasma celular), se externaliza, entrando as en contacto con el exterior de la clula (Fadok, Voelker et al. 1992). La anexina V es capaz de unirse a la fosfatidilserina, por lo que aadiendo a la suspensin celular un conju-gado de anexina V unida a FITC (isotiocianato de fluorescena, un fluorocromo capaz de emitir fluorescencia tras ser excitado a una determinada longitud de onda) veremos marcaje nicamente en aquellas clulas que tienen externalizada la fosfatidilserina, que son aquellas en las que se est produciendo un proceso apop-ttico (Hammill, Uhr et al. 1999). En el estudio de la apoptosis se suele utilizar


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tambin IP, que solo accede al material gentico en los casos en que la clula ha perdido la integridad de sus membranas. As, como se puede observar en la figura 5, se considera que las clulas que estn marcadas con IP se encuentran en un pro-ceso apopttico tardo (en comparacin con las clulas que solo estn marcadas con FITC, que son las que se encuentran en un proceso apopttico temprano).

1.7. FACTORES DE TRANSCRIPCIN FOXO Y SU RELACIN CON EL CNCER

La familia de factores de transcripcin FOXO (Forkhead Box O) juega un rele-vante papel en mltiples procesos relacionados con la proliferacin y supervi-vencia celulares (ver figura 6). Los factores FOXO, que regulan la transcripcin de gran variedad de genes, estn implicados en diferentes procesos celulares in-volucrados en el crecimiento, la diferenciacin o la longevidad (Watroba, Mas-linska et al. 2012; Eijkelenboom and Burgering 2013).

FIGURA 05. Deteccin de apoptosis por FACS. En una clula normal, la fosfatifdilserina (PS) se encuentra nica-mente en la cara interna de la membrana. Al iniciarse el proceso apopttico, la PS pasa a la cara externa, con lo que se une al complejo Anexina V-FITC, que marca a la clula con fluorescencia verde. En las ltimas etapas del proceso apopttico las membranas celulares pierden su integridad, con lo que el IP accede al ncleo marcando a las clulas tambin con fluorescencia roja. Figura adaptada de http://www.imgenex.com


Se ha demostrado que la delecin de FOXO promueve la aparicin de tumores (Zhang, Gan et al. 2011) y que la expresin constitutiva de FOXO promueve la muerte celular en distintos tipos de tejidos mediante induccin de apoptosis (Zhang, Tang et al. 2011; Zhang, Zhao et al. 2013). Adems, la expresin de FOXO en c-lulas proliferantes es capaz de provocar una parada del ciclo celular en los distintos checkpoints que controlan el paso de una fase del ciclo celular a la siguiente, mediante diferentes mecanismos como la promocin de los inhibidores del ciclo celular p21 y p27 (Seoane, Le et al. 2004; Roy, Srivastava et al. 2010), la inhibicin de los activa-dores del ciclo celular ciclina D1 y ciclina D2 (Schmidt, Fernandez de Mattos et al. 2002; Ganapathy, Chen et al. 2010) o la promocin de la expresin de bloqueantes del ciclo celular como la ciclina G2, un tipoparticular de ciclina que, en vez de promover la progresin en el ciclo celular, acta bloqueando la entrada al mismo (Martinez-Gac, Marques et al. 2004; Fu and Peng 2011). La parada o ralentizacin del ciclo celular puede hacer que la clula tenga el tiempo que necesita para reparar al ADN daado, y de manera consecuente los factores FOXO tambin promocio-nan la expresin de diversos genes relacionados con la detoxificacin de sustancias reactivas de oxgeno (ROS, del ingls reactive oxygen species) y la reparacin de ADN (Greer and Brunet 2005; Klagge, Weidinger et al. 2011). Por ltimo, los factores de transcripcin FOXO tambin juegan un importante papel en la sobre-expresin de distintos genes que regulan el metabolismo, y especialmente el metabolismo de la glucosa (Gross, Wan et al. 2009; Kousteni 2012; Kim, Zhang et al. 2013).

Todas estas funciones proapoptticas y antiproliferativas han hecho que los factores FOXO sean considerados supresores de tumores que tienen la funcin de mantener la homeostasis celular (Paik, Kollipara et al. 2007; Dansen and Burgering 2008; Ei-jkelenboom and Burgering 2013; Webb and Brunet 2014). Existen mltiples eviden-cias del papel que estos factores juegan en el cncer, ya que la expresin de FOXO reduce la proliferacin celular y la generacin de tumores y su inhibicin induce la formacin espontnea de los mismos en distintos modelos (Kikuno, Shiina et al. 2007; Cornforth, Davis et al. 2008; Shukla, Bhaskaran et al. 2013). Aunque el efecto de los factores FOXO como supresores de tumores est bien documentado, y aun-que existen estudios que indican que existe una delecin de FOXO en adenocarci-nomas de pulmn (Blake, Mikse et al. 2010; Mikse, Blake et al. 2010), la inactivacin gentica de FOXO no es comn en las clulas tumorales. En cambio su inactivacin post-transcripcional, normalmente causada por mutaciones en la va Ras, s es habi-tual en distintos tipos de tumores (Dansen and Burgering 2008).

Todas estas evidencias insinan que la reactivacin de FOXO puede ser una estrate-gia prometedora en la terapia contra el cncer. Los factores de transcripcin de esta familia pueden ser regulados mediante distintas modificaciones post-traducciona-les, incluyendo fosforilacin, acetilacin y ubiquitinacin (Daitoku, Sakamaki et


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al. 2011; Xie, Chen et al. 2012), aunque la fosforilacin por AKT es comnmente considerada la va clave de regulacin de FOXO. AKT fosforila FOXO permitiendo que este se una a la protena 14-3-3, formndose un complejo que es traslocado des-de el ncleo hasta el citoplasma celular, localizacin en la que FOXO ya no puede ejercer sus funciones antiproliferativas ni proapoptticas (Tzivion, Dobson et al. 2011). La defosforliacin de FOXO, a su vez, provoca la disociacin del complejo, permitiendo la relocalizacin de FOXO en el ncleo celular en el que s podr llevar a cabo su funcin como supresor de tumores (Zhang, Tang et al. 2011).

As, es habitual que procesos tumorignicos impliquen la fosforilacin de FOXO y su consiguiente acumulacin en el citoplasma, lo que acaba conllevando su degra-dacin y la inhibicin general de su actividad transcripcional (Hu, Lee et al. 2004; Huang, Regan et al. 2005; Yang, Zong et al. 2008; Lam, Brosens et al. 2013). La des-fosforilacin de FOXO y su consiguiente restauracin en el ncleo celular, lo que implicara la activacin de sus funciones reguladoras de la apoptosis, el ciclo celular

FIGURA 06. Funciones de FOXO. Representacin esquemtica de algunos de los genes diana de los factores de transcripcin de la familia FOXO, y de los procesos en los que estos estn implicados. En general, FOXO promueve la transcripcin de numerosos genes relacionados con inhibir la proliferacin, activar la apoptosis, resistir el estrs celular y controlar el metabolismo, por lo que es considerado un gen supresor de tumores. Figura adaptada con permiso de Elsevier de Stressing the role of FoxO proteins in lifespan and disease, Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 440-450.


y la proteccin contra el estrs oxidativo, puede resultar por tanto una estrategia in-teresante para combatir la proliferacin descontrolada en distintos tipos de tumores.

1.8. EVALUACIN DE LA LOCALIZACIN INTRACELULAR DE FOXO

Como se ha descrito anteriormente, FOXO es un factor de transcripcin que ejerce su funcin en el ncleo celular y que se desplaza al citoplasma cuando es inactivado por fosforilacin, por lo que el estudio de la localizacin intracelular de FOXO es un mtodo til para evaluar su estado de activacin. Una manera de estudiar la localizacin de FOXO consiste en introducir una protena estable FOXO-protena verde fluorescente (GFP, del ingls fluorescent green protein) en las clulas a evaluar. As, mediante un simple anlisis por microscopa confocal se puede evaluar si la fluorescencia verde, indicadora de la presencia de FOXO, se

FIGURA 07. Transfeccin celular. La figura ilustra de manera esquemtica en qu consiste la tcnica de transfeccin celu-lar. El ADN de inters es introducido a la clula con la ayuda de liposomas como agentes transfectantes, que atraviesan la membrana celular mediante un proceso de endocitosis. Una vez en el citoplasma, el endosoma se descompone liberando el ADN, que se integrar en el ncleo de las clulas hijas tras el proceso de divisin celular. Con ello conseguimos que la clula exprese las protenas para las que codifica el plsmido introducido. Figura adaptada de http://www.biontex.com


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concentra principalmente en el ncleo o en el citoplasma celular. La fluorescencia verde se concentrar en el ncleo cuando FOXO est activado, mientras que cuan-do FOXO est desactivado la fluorescencia verde se concentrar en el citoplasma.

Para generar una lnea celular capaz de expresar una protena quimrica FOXO-GFP hay que someter a la lnea modelo a un proceso de transfeccin con un plsmido de FOXO-GFP. En el proceso de transfeccin, el material gentico con-tenido en el plsmido (en este caso, ADN que codifica para la protena quimrica FOXO-GFP) es incorporado al material gentico celular gracias a la ayuda de un agente transfectante, normalmente un liposoma, que sea capaz de fusionarse con la membrana celular introduciendo en ella su contenido (ver figura 7).

Una vez finalizado el proceso de transfeccin, la clula incluir en su material gentico ADN que codifica para la protena quimrica, y por tanto expresar FOXO-GFP cuya localizacin puede ser detectada fcilmente gracias a la fluo-rescencia que la GFP emite al ser excitada a una longitud de onda determinada (Zanella, Rosado et al. 2008).

1.9. METALOFRMACOS EN QUIMIOTERAPIA

Desde el descubrimiento hace ms de 40 aos de la actividad biolgica del cis-dia-minedichloroplatinum(II), [cis-(NH3)2PtCl2], el cisplatino (nombre genrico que recibe el compuesto) ha supuesto un enorme impacto en el tratamiento de muchos tipos de cncer (Kelland 2007). An hoy, el cisplatino y dos de sus deri-vados (carboplatino y oxaliplatino) se usan en ms del 50% de los tratamientos quimioteraputicos de cncer existentes (Gasser, Ott et al. 2011). Actualmente slo estos tres frmacos han sido comercializados a nivel global, mientras que compuestos como el nedaplatino, el heptaplatino y el lobaplatino se comerciali-zan nicamente en Japn, Corea y China, respectivamente (ver figura 8).

Sin embargo, y a pesar de la utilidad del cisplatino en el tratamiento de muchos tipos de tumores, el compuesto presenta mltiples desventajas que hacen que su utilidad se vea reducida. De entre estas desventajas destacan, por su importancia, los efectos secundarios del cisplatino y la resistencia al mismo de las clulas tumorales.

La resistencia al cisplatino es a veces intrnseca de determinados tipos de tumores, como por ejemplo algunos tumores de mama, colon o prstata, que resultan re-sistentes al compuesto desde el primer tratamiento (Kelland 2007). En cualquier caso, incluso cuando las clulas cancerosas son inicialmente sensibles al compues-


to, es comn que con los sucesivos ciclos de tratamiento se generen resistencias adquiridas (Abu-Surrah and Kettunen 2006). La evidencia experimental acerca del mecanismo de accin del cisplatino indica que este se une covalentemente al ADN celular formando aductos y provocando una distorsin en la estructura del material gentico, lo que activa diversas vas de sealizacin relacionadas con la reparacin del dao gentico, la proliferacin, el ciclo celular y la apoptosis que acaban desembocando en una muerte celular programada (Kelland 2007). Una de las causas ms comunes de resistencia al cisplatino se da cuando este no llega a en-trar en contacto con el DNA celular en una concentracin suficiente, debido prin-cipalmente a una baja acumulacin del compuesto (Kelland, Mistry et al. 1992) o a su detoxificacin por glutatin o metalotionenas (Mistry, Kelland et al. 1991; Holford, Beale et al. 2000). En ocasiones se presentan resistencias incluso aunque la concentracin del cisplatino en contacto con el ADN sea lo suficientemente alta, ya sea porque las clulas tienen una tolerancia elevada al dao en su ADN o porque cuentan con mecanismos de reparacin del mismo lo suficientemente efectivos (Johnson, Swiggard et al. 1994).

Por otra parte, los efectos secundarios del cisplatino son severos y constituyen una importante desventaja de su uso teraputico. El hecho de que la diana del

FIGURA 08. Metalofrmacos de platino. Estructura qumica de los complejos de platino que se comercializan en la actualidad como frmacos antitumorales.


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cisplatino sea ubicua (todas las clulas del organismo tienen ADN) hace que la interaccin con el mismo no sea especfica de las clulas cancerosas. El efecto secundario ms problemtico del cisplatino es su elevada nefrotoxicidad, pero tambin provoca otras alteraciones de gravedad variable como nauseas, vmitos, neuropata perifrica, mielotoxicidad y toxicidad en el tracto gastrointestinal (Abu-Surrah and Kettunen 2006).

Todos estos inconvenientes hacen necesario el descubrimiento de nuevos compuestos mejorados que presenten una mayor actividad biolgica y una disminucin de los efectos secundarios. Compuestos como el carboplatino, un derivado del cisplatino, han pasado a formar parte de los tratamientos qui-mioteraputicos convencionales. Pero aunque en muchos casos presentan to-xicidades inferiores y, por tanto, efectos secundarios menos severos, en general no suponen un aumento espectacular de la actividad biolgica del cisplatino ni una solucin a sus problemas de resistencia, ya sea sta intrnseca o adquiri-da durante el tratamiento. Ciertos avances en el rea de la resistencia intrnseca se han obtenido con la utilizacin del oxaliplatino, en el que los ligandos NH3 se han sustituido por el ligando (1R, 2R)-cyclohexano-1,2-diamino (R,R-dach). El oxaliplatino es eficaz en cncer de colon resistente al cisplatino debido a que forma diferentes aductos con el DNA evitando la unin de protenas re-paradoras del mismo. En cualquier caso, y aunque tras el descubrimiento del cisplatino se sintetizaron y evaluaron gran cantidad de compuestos derivados del mismo con la esperanza de encontrar un tratamiento ms efectivo y se-guro, en los aos posteriores el ritmo de aparicin de nuevos avances en este campo disminuy notablemente. En los ltimos aos, sin embargo, el inters por la sntesis y evaluacin de nuevas generaciones de compuestos de platino se ha revitalizado, debido sobre todo a los descubrimientos acerca de los me-canismos que regulan la resistencia a este tipo de tratamientos.

La investigacin de nuevos compuestos metlicos en la bsqueda de terapias ms efectivas contra el cncer no se limita a compuestos con platino, sino que se ha visto ampliada para incluir molculas con tomos de paladio, hierro, oro, rutenio o iridio, entre otros. Una gran variedad de compuestos organomet-licos, definidos como aquellos complejos metlicos que cuentan con al me-nos un enlace covalente directo carbono-metal, se han revelado recientemente como molculas con una prometedora accin antitumoral. Los compuestos organometlicos cuentan con una enorme variedad estructural y estequiom-trica, son cinticamente estables, relativamente lipoflicos y a menudo pre-sentan una carga neutra y un bajo estado de oxidacin de su tomo metlico. Adems, un diseo racional de sus ligandos permite controlar propiedades clave de los compuestos, como por ejemplo su facilidad de hidrlisis.


1.9.1. Compuestos cicloplatinados de siete miembros

Los compuestos ciclometalados con diferentes metales han demostrado en el pasado prometedoras actividades antitumorales (Gasser, Ott et al. 2011). Resulta digno de mencin el hecho de que la presencia de un enlace carbono-metal parece incrementar la estabilidad de los complejos, lo que hace que aumente la probabilidad de que los complejos ciclometalados alcancen su diana biolgica con su estructura intacta (Edwards, Black et al. 2005).

Los compuestos ciclometalados cuyas actividades biolgicas han sido publica-das hasta ahora constan de ciclos planos de cinco miembros. Por otro lado, exis-ten estudios con diaminas queladas en los que los complejos con anillos de siete miembros presentan una mayor actividad antiproliferativa que los complejos de 5 o de 6 miembros (Moradell, Lorenzo et al. 2003).

Por todo ello, la actividad biolgica de los compuestos cicloplatinados de siete miembros, as como la comparacin de la misma con la de compuestos simila-res con anillos de cinco miembros, resulta de especial inters en la bsqueda de nuevos compuestos con actividad antitumoral.

1.9.2. Compuestos de platino con iminas polifuncionalizadas

La unin del cisplatino al ADN celular provoca una distorsin de su estructura heli-coidal causando la inhibicin de su replicacin y su transcripcin, lo que acaba pro-vocando el arresto del ciclo celular y la activacin de la apoptosis de la clula afectada. La alterada estructura del ADN que resulta de la unin del mismo al cisplatino, sin embargo, se convierte en un nuevo sitio de unin de protenas, como por ejemplo histonas, factores de transcripcin, o protenas reparadoras del ADN. Estas protenas capaces de unirse al ADN distorsionado tienen la capacidad de modular la efectividad del cisplatino o la resistencia al mismo (Wang and Lippard 2005; Jung and Lippard 2007). As, una de las estrategias principales para desarrollar nuevos compuestos con capacidad antiproliferativa es la de disear compuestos que se unan al ADN celular de manera diferente al cisplatino. Una posible manera de generar estos compuestos consiste en usar ligandos que exhiban tomos de N con capacidad donadora de electrones, como ocurre en las iminas. Estudios sobre la relacin estructura-actividad de este tipo de compuestos pueden proporcionar interesante informacin acerca de cmo la actividad biolgica de los mismos se ve alterada por factores como los to-mos donadores del ligando, su modo de unin al metal, el tamao del quelato, la presencia de sustituyentes o la naturaleza de los ligandos auxiliares adicionales.


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1.9.3. Compuestos de platino y paladio derivados del pirazol

En la bsqueda de nuevos ligandos N-donadores para la sntesis de compuestos organometlicos optimizados, los azoles suponen una alternativa interesante a las iminas. Los azoles heterociclos son reactivos muy valiosos en la qumica de coordinacin, y se sabe que su unin a un in metlico afecta a sus propiedades y a su actividad (Budzisz, Lorenz et al. 2008). En la actualidad apenas existe informacin acerca del potencial antitumoral de compuestos con ligandos de pirazol, con lo que resulta interesante la evaluacin de la actividad biolgica de nuevos compuestos organometlicos derivados del pirazol, y del efecto que ejercen los sustituyentes del heterociclo, el tipo de enlace del ligando o incluso el tipo de metal del complejo sobre su actividad biolgica antiproliferativa.

1.9.4. Compuestos derivados del ferroceno

En la ltima dcada, compuestos derivados del ferroceno han adquirido un gran inters debido a su actividad biolgica y a sus aplicaciones en biome-dicina. Las propiedades nicas del ferroceno, como su aromaticidad, estabi-lidad en medio acuoso y potencial redox, hacen que resulte especialmente interesante investigar su efecto en la actividad biolgica de nuevos com-puestos antitumorales, aunque los estudios sobre su actividad antiprolife-rativa siguen siendo escasos. Adems, el uso de derivados del ferroceno en compuestos organometlicos, con distintos tomos donadores de electrones capaces de exhibir diferentes modos de unin al metal o de crear ismeros variados, no ha sido estudiado a fondo. Por ello, los efectos derivados del tipo de enlace al metal o de la orientacin espacial de los ligandos sobre la potencial actividad antitumoral de estos productos permanecen relativamen-te inexplorados, y su investigacin resulta de especial inters

Por otro lado, varios frmacos antitumorales, como el paclitaxel, se caracteri-zan por modular el ensamblaje de microtbulos mediante la inhibicin de la polimerizacin de la tubulina. Muchos inhibidores de la polimerizacin de la tubulina se caracterizan por la presencia de un ncleo indlico, y existen estu-dios sobre derivados del indol que demuestran su capacidad antiproliferativa en lneas celulares humanas de cncer de mama (Pojarova, Kaufmann et al. 2007). A tenor de todo ello, la caracterizacin de la actividad de nuevos hbridos fe-rroceno-indol, y la comparacin de la misma con respecto a la de sus anlogos puramente orgnicos, resulta tambin especialmente atractiva en la bsqueda de nuevas estructuras organometlicas con potencial antitumoral.


1.10. EL METABOLISMO TUMORAL

El metabolismo es, en su sentido ms amplio, el conjunto de transformaciones qu-micas que ocurren en una clula u organismo. Las reacciones metablicas son la base de la vida a escala molecular, y gracias a ellas los organismos pueden crecer, repro-ducirse, construir (y mantener) sus estructuras bsicas y adaptarse a las condiciones cambiantes del entorno en el que viven. El metabolismo se suele clasificar en dos procesos opuestos pero complementarios: el anabolismo y el catabolismo. El cata-bolismo engloba los procesos mediante los que molculas complejas son degradadas a otras ms sencillas para obtener energa, mientras que el anabolismo consiste en la formacin de sustancias complejas a partir de otras ms simples con la intencin de sintetizar diversos componentes celulares, lo que necesita un aporte energtico.

El metaboloma, por otra parte, se define como el conjunto de metabolitos o molculas pequeas presentes en un organismo como producto final de la acti-vidad proteica. El resto de omas (genoma, transcriptoma, proteoma) tambin definen la funcin celular, pero es el metaboloma el que refleja de manera ms fiel el fenotipo celular en un momento dado, ya que de l depende el estado

FIGURA 09. Complejos metlicos. Ejemplos de algunas estructuras organometlicas cuya actividad antiproliferativa resulta de inters evaluar. A: Compuestos cicloplatinados de 7 miembros, B: compuestos de platino (II) con ligandos imnicos, C: complejos metlicos derivados del pirazol, D: compuestos ciclometalados de platino (II) y ferroceno, E: complejos hbridos ferroceno-indlicos.


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fisiolgico final de la clula. Histricamente se ha considerado que la relacin entre los distintos omas era de naturaleza jerrquica: a partir del genoma se generaba el transcriptoma y este defina el proteoma, que a su vez era el encar-gado de procesar los metabolitos controlando as el estado del metaboloma. En la actualidad, sin embargo, existe la evidencia de que las relaciones entre todos estos niveles de organizacin celular no son unidireccionales, ya que cada oma es capaz de regular a (y susceptible de ser regulado por) todos los dems (ver figura 10). As, el metaboloma no es nicamente un resultado pasivo del es-tado del proteoma, el transcriptoma o el genoma, sino que tambin es capaz de controlar recprocamente estos estados regulatorios (Oltvai and Barabasi 2002).

FIGURA 10. Regulacin cruzada entre -omas. El genoma, conjunto de todos los genes del organismo, est formado por secuencias de ADN que al transcribirse generan el transcriptoma. Los trnscritos se traducen dando lugar a las pro-tenas que conforman el proteoma, y stas regulan la sntesis y degradacin de los metabolitos del organismo, definien-do as el metaboloma. Pero existe una interaccin recproca entre todos los estados del sistema, con lo que cada estrato organizativo es influenciado por el resto de estratos, al tiempo que ejerce su influencia sobre los mismos.


La proliferacin cellular descontrolada que acontece en los procesos tumorales necesita una reprogramacin del metabolismo energtico que permita acelerar el crecimiento y la divisin celulares. Por ello, la alteracin del metabolismo energtico es una rasgo tan definitorio del cncer como la evasin de los meca-nismos de muerte celular o la insensibilidad ante seales antiproliferativas, y ha sido definida como una de las caractersticas generales del cncer, necesaria para la proliferacin tumoral (Hanahan and Weinberg 2011).

1.10.1. La gluclisis y el efecto Warburg

Las clulas sanas degradan la glucosa hasta formar piruvato por la va de la Gluclisis. En condiciones de presencia de oxgeno, el piruvato entra en la mi-tocondria y se incorpora al ciclo de Krebs, donde ser oxidado en un proceso conocido como fosforilacin oxidativa para producir energa en forma de ATP. As, a partir de glucosa y oxgeno, la clula acaba produciendo CO2 y agua, obteniendo energa, regulando el potencial redox de la clula (a travs de la generacin de molculas como NADH y NADPH) y generando adems los pre-cursores metablicos a partir de los cuales la clula sintetizar las molculas que necesita para su correcto funcionamiento (como ARN y protenas).

En condiciones anaerbicas, en cambio, la ausencia de oxgeno imposibilita la obtencin de ATP mediante este proceso de fosforilacin oxidativa, por lo que las clulas optan por una va alternativa en la que el piruvato proveniente de la glucosa es transformado en lactato. Este mecanismo, conocido con el nombre de gluclisis anaerbica, no slo es ineficiente como mtodo de obtencin de energa (se obtienen nicamente 2 molculas de ATP por molcula de glucosa, en vez de las 36 generadas en la fosforilacin oxidativa), sino que conlleva el problema aadido de la acumulacin de lactato, que a diferencia del CO2 o el agua puede resultar txico para las clulas.

La primera caracterstica metablica diferencial que fue descrita para las clulas tumorales, hace ya ms de 70 aos, recibe el nombre de efecto Warburg. Segn este efecto, en las clulas de cncer el mecanismo de degradacin de la glucosa se encuentra alterado de modo que, incluso en condiciones aerbicas, la clula favorece la sntesis de lactato por encima de la entrada de piruvato al Ciclo de Krebs, en un proceso conocido como gluclisis aerbica. El fenmeno result inicialmente difcil de explicar, dado que es lgico pensar que las clulas proli-ferantes tienen unas necesidades energticas mayores que las clulas sanas, y en cambio la degradacin de glucosa a lactato tiene, como ya hemos visto, un ren-


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dimiento energtico muy inferior al de la fosforilacin oxidativa. Sin embargo, y a pesar de esta ineficiencia energtica, el efecto Warburg concede a las clulas cancerosas una serie de ventajas que resultan cruciales en el particular microen-torno que se genera alrededor de un tumor (Hitosugi and Chen 2013).

En primer lugar hay que considerar que un tumor genera, al crecer y expandirse, una masa celular que cada vez est ms alejada de los vasos sanguneos, con lo que la difusin de oxgeno desde estos hacia las clulas se ve dificultada. Esto provoca un descenso en la disponibilidad de oxgeno de las clulas tumorales, situacin en la que slo proliferarn las clulas con el metabolismo mejor adap-tado a una situacin hipxica.

Adems, se ha descrito que la cantidad de energa adicional necesaria para produ-cir una nueva clula es, asumiendo que la glucosa es el principal sustrato energti-co, nicamente el 50% de la energa basal necesaria para mantener la homeostasis celular (Kilburn, Lilly et al. 1969). Esto demuestra que la cantidad de ATP nece-saria no es dramticamente superior en el proceso de proliferacin, con lo que la verdadera clave del mismo es la acumulacin de biomasa y la replicacin de ADN. La sntesis continua de nuevas biomolculas, adems, implica requerimientos adi-cionales a la energa proporcionada por el ATP. Por ejemplo, una nica molcula de glucosa es capaz de proporcionar 5 veces la cantidad de energa necesaria para sintetizar una molcula de palmitato, mientras que el NADPH necesario en esta misma sntesis requiere la metabolizacin de 7 molculas de glucosa. De manera anloga, tambin la sntesis de aminocidos y nucletidos requiere de ms equi-valentes de carbono y NADPH que de ATP. Todo ello implica que, para que una clula prolifere, no puede dedicar toda su glucosa a la produccin de ATP, lo que adems generara un desequilibrio en el ratio ATP/ADP que podra inhibir el flujo a travs de los intermediarios glucolticos, limitando an ms la produccin de acetil-CoA y NADPH requerida en la sntesis de macromolculas. As, se ha pro-puesto que el efecto Warburg podra suponer un mtodo especialmente efectivo para aumentar las tasas biosintticas de las clulas tumorales, lo que a la hora de mantener un ritmo de duplicacin acelerado confiere una ventaja ms importante que la puramente energtica (Vander Heiden, Cantley et al. 2009)Go.

La acidificacin resultante de la produccin de cido lctico a partir del lactato, que supone un problema en tejidos sanos, puede resultar beneficiosa para el desarrollo de un tumor (Gillies, Robey et al. 2008; Bailey, Wojtkowiak et al. 2012; Honasoge and Sontheimer 2013). Esto es as porque esta acidificacin induce la muerte de las clulas sanas que rodean el tumor, con lo que las seales inhibidoras de la proliferacin que genera el contacto con estas clulas sanas se ven disminuidas, facilitndose as el crecimiento tumoral. La acidosis tambin


provoca que fibroblastos y macrfagos liberen enzimas proteolticas que degra-dan la matriz extracelular facilitando la invasividad y la metstasis, fenmeno que se ve adems potenciado por el hecho de que la acidosis tambin provoca la secrecin de factores activadores de la angiognesis (como VEGF).

Teniendo en cuenta que la mitocondria juega un importante papel en la genera-cin de especies reactivas de oxgeno (ROS), y dado que est demostrado que estas son capaces de activar la apoptosis, la reduccin de la entrada de piruvato en la mitocondria provoca que su actividad metablica disminuya, con la consiguiente reduccin de los niveles de ROS e inhibicin de la apoptosis que ello conlleva.

Adicionalmente, se ha descrito que el lactato producido por las clulas hipxicas de un tumor puede ser utilizado como sustrato energtico por las clulas aer-bicas que lo rodean, ms cercanas a los vasos sanguneos. Al utilizar el lactato como fuente de energa estas clulas aerbicas prescinden de la glucosa, aumen-tando su disponibilidad para las clulas hipxicas tumorales. De este modo se crea una sinergia entre las diferentes subpoblaciones tumorales que beneficia el crecimiento del tumor (Semenza 2008; Kennedy and Dewhirst 2010; Ratti-gan, Patel et al. 2012). De hecho, la inhibicin de la lactato deshidrogenasa A (LDHA) y de los transportadores de lactato se ha propuesto como estrategia teraputica en distintos tipos de cncer (Doherty and Cleveland 2013).

Otra caracterstica diferencial de la gluclisis tumoral la constituye la expresin preferencial de PKM2, la isoforma M2 de la piruvato quinasa, frente a PKM1, que es la isoforma predominante en la gran mayora de tejidos diferenciados. Sorprendentemente, PKM2 tiene menos actividad enzimtica que PKM1, y adems es, al contrario que esta, sensible a la inhibicin por la sealizacin proveniente de receptores de factores de crecimiento. Al parecer, la actividad reducida de esta isoforma provoca la acumulacin de intermediarios glucol-ticos, que son derivados a las vas anablicas de sntesis de biomolculas que parten de los mismos, como la de la sntesis de bases nitrogenadas a partir de la va de las pentosas fosfato. Este fenmeno refuerza la idea de que las clu-las proliferantes priorizan las vas anablicas de sntesis de biomolculas por encima de las de generacin de energa en forma de ATP (Christofk, Vander Heiden et al. 2008; Hitosugi, Kang et al. 2009; Ward and Thompson 2012).

Por ltimo, aunque la eficiencia energtica de la gluclisis aerbica es menor que la de la fosforilacin oxidativa, las clulas tumorales cuentan con un mecanismo compensatorio gracias a la sobreexpresin de transportadores de glucosa que per-miten aumentar la tasa de incorporacin de la misma (Jones and Thompson 2009; Ortega, Sanchez-Arago et al. 2009; Adekola, Rosen et al. 2012; McCracken and


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Edinger 2013; Szablewski 2013). Adems, la velocidad de sntesis de ATP por glu-clisis aerbica es mayor que por fosforilacin oxidativa, lo que proporciona una ventaja importante en condiciones de competencia por la obtencin de glucosa.

Todas estas evidencias sealan que el efecto Warburg confiere importantes ven-tajas a las clulas proliferantes de un tumor, lo que refuerza la teora de que la reprogramacin metablica tumoral no es nicamente una consecuencia pasiva de los cambios genticos en las clulas cancerosas, sino que constituye un reque-rimiento esencial para la progresin de la enfermedad, y por lo tanto una diana teraputica con una excelente potencialidad para combatirla.

1.10.2. La glutaminlisis

La glucosa es el sustrato energtico principal de las clulas del organismo, pero no es el nico. Para mantener su elevada tasa de proliferacin, las clulas tu-morales recurren tambin a la glutamina, el aminocido ms abundante en el plasma. El proceso por el que la glutamina es catabolizada para generar lactato y ATP se conoce como glutaminlisis, una va metablica que se encuentra so-breactivada en muchos tipos de tumores.

A da de hoy no existe un consenso cientfico acerca del destino metablico final de la glutamina consumida por las clulas tumorales, probablemente por-que dependa del tipo celular en estudio y de sus necesidades en cada momen-to. En general, la derivacin de glutamina a lactato se puede utilizar para ge-nerar poder reductor (en forma de NADPH) necesario en procesos anablicos como la sntesis de nucletidos o la de cidos grasos (DeBerardinis, Mancuso et al. 2007; Wise, DeBerardinis et al. 2008), para generar una fuente de nitr-geno con la que sintetizar aminocidos y protenas y nucletidos (Meng, Chen et al. 2010; Hensley, Wasti et al. 2013) o simplemente para obtener energa en forma de ATP y conservar la homeostasis redox celular (Gao, Tchernyshyov et al. 2009), aunque tambin se ha descrito que la glutamina tiene un papel regu-lador de distintas vas de sealizacin que promueven el crecimiento celular (Daye and Wellen 2012; Duran, Oppliger et al. 2012).

El metabolismo de la glutamina comienza por su transformacin a glutamato, en una reaccin catalizada por la enzima glutaminasa, de la que existen distintas isoformas codificadas por los genes GLS y GLS2. La expresin de las isoformas codificadas por GLS correlaciona con el ratio de proliferacin y la malignidad en distintos modelos biolgicos (Lobo, Ruiz-Bellido et al. 2000; Gao, Tchernyshyov


et al. 2009; Wang, Erickson et al. 2010; Cheng, Sudderth et al. 2011). El papel de GLS2 en el desarrollo tumoral, en cambio, es mucho menos claro, y aunque se ha descrito que su expresin est aumentada en algunos neuroblastomas, en los que contribuye a la supervivencia celular (Qing, Li et al. 2012), en otros tejidos GL2 se comporta como un supresor de tumores diana de p53 (Suzuki, Tanaka et al. 2010).

En cualquier caso, las clulas de cncer consumen una cantidad de glutamina mucho mayor que las clulas sanas y, como ocurre con los transportadores de glucosa, las clulas tumorales inducen una activacin de los transportadores de glutamina, lo que se ve reflejado en el descenso en los niveles de glutamina circu-lante que puede ser observado en pacientes de cncer (Chen, Espat et al. 1993).

1.10.3. La sntesis de cidos grasos.

Como ya hemos visto, la proliferacin acelerada y descontrolada propia de las clulas tumorales no requiere nicamente una mayor produccin de energa, sino que tambin hace indispensable un mayor aporte de los materiales bsi-cos con los que generar nuevas clulas de manera continua. Estos materiales incluyen a los fosfolpidos, imprescindibles para formar las membranas de clulas y orgnulos de nueva sntesis.

Cuando la clula necesita sintetizar nuevos lpidos, el citrato mitocondrial es expor-tado al citosol y convertido, por accin de la enzima ATP-citrato liasa (ACLY), en oxalacetato y acetil-CoA. El oxalacetato puede ser transformado en piruvato por la enzima mlica (ME, del ingls malic enzyme) generando adems NADPH, que resul-ta necesario en la sntesis de lpidos. Por otro lado, la enzima acetil-CoA carboxilasa (ACC) transforma el aCoA en malonil-CoA, y la enzima cido graso sintasa (FAS, del ingls fatty acid synthase) acopla un grupo acetilo y 7 grupos malonilo para generar cido palmtico, a partir del cual se generan el resto de cidos grasos.

Las enzimas que controlan la lipognesis, y especialmente la FAS, se encuen-tran sobreexpresadas en cncer (Menendez and Lupu 2007), y en general los tumores presentan un metabolismo de cidos grasos sobreactivado con respec-to al de las clulas normales (Biswas, Lunec et al. 2012). Resulta especialmente interesante resaltar que metabolitos derivados del metabolismo de la glucosa como la misma glucosa, la glucosa-6-fosfato o la xilulosa-5-fosfato, activan la expresin de los genes que codifican para enzimas como ACC o FASN a travs de la protena de unin al elemento de respuesta a carbohidratos (ChREBP, del ingls carbohydrate response element binding protein), lo que pone


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de relieve la estrecha relacin existente entre metabolismo de la glucosa y la sntesis de cidos grasos (Kabashima, Kawaguchi et al. 2003; Mitro, Mak et al. 2007) . Finalmente, vale la pena sealar que la lipognesis est regulada por distintas vas de sealizacin que suelen encontrarse alteradas en el cncer, como aquellas relacionadas con la protena de unin al elemento de respuesta a esteroles (SREBP, del ingls sterol regulatory element binding protein).

FIGURA 11. Vas del metabolismo central. Representacin de las rutas metablicas del metabolismo central. Las vas sea-ladas (gluclisis, ruta de las pentosas fosfato, ciclo de Krebs, sntesis de cidos grasos y sntesis/degradacin de aminocidos) se encuentran con frecuencia alteradas en clulas tumorales debido a cambios en la expresin de las enzimas que las regulan, a la regulacin post-transcripcional de su actividad o a mecanismos de splicing alternativo que generan distintas isoformas de las mismas. Hay metabolitos, relacionados con flechas discontinuas, que forman parte de rutas metablicas diferentes. G6P: glucosa-6-fosfato, F6P: fructusa-6-fosfato, DHAP: dihidroxiacetona-fosfato, G3P: gliceraldehdo-3-fosfato, Ru5P: ribulo-sa-5-fosfato, X5P: xilulosa-5-fosfato, R5P: ribosa-5-fosfato, S7P: sedoheptulosa-7-fosfato, E4P: eritrosa-4-fosfato, Pyr: piruvato, Lac: Lactato, Cit: citrato, Isocit: isocitrato, -KG: -cetoglutarato, SuCoA: succinil-coenzima A, Succ: succinato, Fum: fuma-rato, Mal: malato, OAA: oxalacetato, BN: bases nitrogenadas, aa: aminocidos, FA: cidos grasos, ATP: adenosintrifosfato, NADPH: nicotin-adenin-dinucletido-fosfato reducido, ARN: cido ribonucleico, ADN: cido desoxidibonucleico.


1.10.4. La ruta de las pentosas fosfato.

La formacin, a partir de una clula precursora, de dos clulas hijas que conten-gan la misma dotacin gentica que aquella, implica necesariamente la duplica-cin del ADN celular. Por ello, la ruta biosinttica que desemboque en la forma-cin de nucletidos, los monmeros del material gentico, tiene necesariamente una importancia capital para mantener el crecimiento tumoral.

La ribosa-5-fosfato (R5P), sustrato inicial para la sntesis de ADN y ARN, se sin-tetiza a travs de la ruta de las pentosas fosfato (PPP, del ingls pentose phosphate pathway). Esta ruta mantiene tambin una estrecha relacin con la sntesis de cidos grasos, ya que no solo genera xilulosa-5-fosfato (X5P), capaz tambin de regular la expresin de enzimas lipognicos a travs de ChBREP, sino que ade-ms constituye uno de los mecanismos de generacin de NADPH, que resulta imprescindible para la lipognesis.

La ruta de las pentosas fosfato ha sido clsicamente dividida en dos ramas diferentes: la rama oxidativa y la rama no oxidativa. La rama oxidativa, irre-versible, transforma la glucosa-6-fosfato (G6P) en ribulosa-5-fosfato (Ru5P) a travs de tres reacciones consecutivas que generan dos equivalentes de NA-DPH. La Ru5P se puede convertir por isomerizacin en xilulosa-5-fosfato y en ribosa-5-fosfato, que ser la unidad usada para la sntesis de ADN y ARN. La enzima G6PDH, que cataliza el primer paso de esta va oxidativa, es con-siderada la controladora del flujo metablico a travs de la misma (Boren, Montoya et al. 2002).

La rama no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato es, a diferencia de la oxidativa, reversible. A travs de ella, por tanto, es posible no solo generar R5P desde la va de la gluclisis, sino tambin reciclar el exceso de pentosas produ-cido en la va oxidativa hacia esta. En la rama no oxidativa de la PPP, la ribo-sa-5-fosfato y la xilulosa-5-fosfato generadas en la va oxidativa se intercambian dos unidades de carbono gracias a la accin de la enzima transcetolasa (TKT), lo que genera Gliceraldehdo-3-fosfato (G3P) y sedoheptulosa-7-fosfato (S7P). Es-tas dos molculas generan, a su vez, fructosa-6-fosfato (F6P) y eritrosa-4-fosfato (E4P) en una reaccin catalizada por la enzima transaldolasa (TA). Finalmente, de nuevo la TKT es capaz de catalizar la transferencia de un fragmento de dos carbonos entre una segunda unidad de xilulosa-5-fosfato y la eritrosa-4-fosfato, generando fructosa-6-fosfato (F6P) y gliceraldehdo-3-fosfato (G3P), que sern metabolizados siguiendo la va glucoltica o bien reintroducidos en la va de las pentosas fosfato, ya sea a travs de su rama oxidativa o a travs de la rama no oxidativa en el orden inverso al que acabamos de describir (ver figura 12).


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La va de las pentosas fosfato est regulada por algunos de los ms importantes proto-oncogenes y genes supresores de tumores. Se ha descrito que los cnceres con mutaciones en KRAS presentan un incremento simultneo de los niveles de G6PD, PK y LDH (de Atauri, Benito et al. 2011), lo que hace que tanto la glu-clisis como la va de la

evaluación de la actividad antitumoral de nuevos...

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