evaluaciÓn in vitro del potencial antagÓnico de...

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

EVALUACIÓN in vitro DEL POTENCIAL ANTAGÓNICO DE Trichoderma spp.

SOBRE Fusarium oxysporum EN NOCHEBUENA DE INTERIOR

TESIS PROFESIONAL

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

B I O L O G O

P R E S E N T A:

LUCERO MARGORIET PATRICIO PAREDES

DIRECTOR

FELIPE DE JESÚS OSUNA CANIZALEZ

CUERNAVACA, MORELOS OCTUBRE, 2013

I

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a todas las personas e instituciones que colaboraron en la realización de esta

tesis.

Al proyecto Estudios Epidemiológicos de Enfermedades y Bioecología de Plagas en

Cultivos de Importancia Económica en el Estado de Morelos”, con clave: MOR-2010-CO1-

148902, por la beca proporcionada para apoyar el presente trabajo.

Al Dr. Felipe de Jesús Osuna Canizalez, por abrirme las puertas del Laboratorio de

Sustratos y darme la oportunidad de realizar este proyecto. Por su asesoría, apoyo y

disposición en todo momento.

A los miembros del comité tutorial, por sus observaciones, correcciones y el tiempo que me

dedicaron para terminar este proyecto: Dr. Jesús Telesforo Hernández Abarca, Dr. Sergio

Ramírez Rojas, Mtra. Adriana Gabriela Trejo Loyo, en especial al Dr. Edgar Martínez

Fernández por la asesoría y el apoyo brindado en la realización de la identificación

morfológica de Fusarium sp.

A la Ing. María Félix Moreno López por la ayuda y el apoyo brindado durante todo el

desarrollo del proyecto.

Al personal de los laboratorios de Micología de la UAEM y Fitopatología del INIFAP, por

su ayuda y compañerismo.

A mis amigas Mirna, Rebeca, Elizabeth, Magui, Tere, Natyelli y Cyndi por demostrarme

siempre su sinceridad, confianza y apoyo. A cada una, muchas gracias por su compañía

durante los buenos y malos momentos.

II

DEDICATORIA

A dios : Por protegerme, guiarme y darme la fuerza para superar las

dificultades que se presentaban. Por haber puesto en mi camino a

aquellas personas que han sido mi apoyo y compañía durante esta

etapa.

A mis padres: Juan Patricio y Alfreda Paredes, por su apoyo,

confianza, comprensión y el todo esfuerzo que hicieron para que terminara

mi carrera profesional. Por creer en mí, hoy pude alcanzar mi meta.

A mis Hermanos: Mayra Johana y Juan

Francisco, por estar siempre presentes y apoyarme en

todo momento.

Porque son mi motivo para seguir adelante, les dedico esta tesis con cariño.

III

CONTENIDO

ÍNDICE DE CUADROS ...................................................................................................... VI

ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................VII

RESUMEN ........................................................................................................................... IX

1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 1

2. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................... 3

2.1. Generalidades de la nochebuena ..................................................................................... 3

2.1.1. Importancia económica del cultivo de la nochebuena .......................................... 3

2.1.2. Problemas fitosanitarios ........................................................................................ 5

2.2. Enfermedades de la nochebuena ..................................................................................... 6

2.2.1. Pudrición de la raíz ................................................................................................ 6

2.3. Generalidades de Fusarium sp. ....................................................................................... 6

2.3.1. Clasificación taxonómica (Barnett y Hunter, 1978).............................................. 7

2.3.2. Biología de Fusarium sp. ...................................................................................... 7

2.3.2.1. Micelio ......................................................................................................... 7

2.3.2.2. Macroconidios .............................................................................................. 8

2.3.2.3. Microconidios............................................................................................... 8

2.3.2.4. Clamidosporas .............................................................................................. 8

2.4. Control químico ............................................................................................................... 9

2.5. Control biológico ............................................................................................................. 9

2.6. Trichoderma spp. ........................................................................................................... 10

2.6.1. Generalidades de Trichoderma spp. .................................................................... 10

2.6.2. Clasificación taxonómica (Samuels y Chaverri, 2003). ...................................... 10

2.6.3. Biología de Trichoderma spp. ............................................................................. 11

2.6.3.1. Conidióforo ................................................................................................ 11

2.6.3.2. Fiálides ....................................................................................................... 11

2.6.3.3. Conidios ..................................................................................................... 11

2.6.3.4. Micelio ....................................................................................................... 11

2.7. Mecanismos de acción ................................................................................................... 12

2.7.1. Competencia por nutrientes y sustrato ................................................................ 13

IV

2.7.2. Antibiosis ............................................................................................................ 13

2.7.3. Micoparasitismo .................................................................................................. 14

2.7.3.1. Crecimiento quimiotrófico .......................................................................... 14

2.7.3.2. Reconocimiento ........................................................................................... 14

2.7.3.3. Adhesión y enrollamiento ........................................................................... 14

2.7.3.4. Actividad lítica ............................................................................................ 14

2.8. Usos y aplicaciones ....................................................................................................... 16

2.8.1. Trichoderma spp., como agente de control biológico ......................................... 16

3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................. 18

4. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 19

4.1. Objetivo general ............................................................................................................ 19

4.2. Objetivos particulares .................................................................................................... 19

5. HIPÓTESIS ...................................................................................................................... 19

6. MATERIALES Y MÉTODOS......................................................................................... 20

6.1. Ubicación del área de estudio ........................................................................................ 20

6.1.1. Obtención de muestras ........................................................................................ 20

6.2. Aislamiento e identificación de Trichoderma spp. ........................................................ 21

6.3. Aislamiento de Fusarium sp., de la raíz de nochebuena de interior .............................. 22

6.3.1. Cultivos monospóricos de Trichoderma spp. y Fusarium sp. ............................ 23

6.3.2. Identificación morfológica de las cepas nativas de Fusarium sp. ....................... 24

6.4. Selección de cepas nativas de Trichoderma spp. .......................................................... 25

6.5. Pruebas de antagonismo in vitro .................................................................................... 26

6.6. Cinética de crecimiento de Trichoderma spp. y Fusarium sp. en cultivos duales ........ 27

6.7. Selección de cepas nativas de Trichoderma spp., con mayor potencial antagónico ..... 28

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 29

7.1. Aislamiento de Trichoderma spp. ................................................................................. 29

7.1.1. Identificación de Trichoderma spp. .................................................................... 30

7.2. Aislamientos de Fusarium sp. ....................................................................................... 32

7.2.1. Identificación morfológica de Fusarium sp. ....................................................... 34

V

7.3. Selección de cepas nativas de Trichoderma spp. y Fusarium sp., para las pruebas de

antagonismo .......................................................................................................................... 36

7.3.1. Trichoderma spp. ................................................................................................ 36

7.3.2. Fusarium oxysporum. .......................................................................................... 38

7.4. Pruebas de antagonismo ................................................................................................ 39

7.4.1. Determinación del porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR). ...... 39

7.5. Cinética de crecimiento ................................................................................................. 41

7.5.1. Trichoderma spp. vs Fusarium sp. (cepa A3A). ................................................. 41

7.5.2. Trichoderma spp. vs Fusarium sp. (cepa B1A). ................................................. 42

7.5.3. Trichoderma spp. vs Fusarium sp. (cepa C2C). ................................................. 43

7.5.4. Trichoderma spp. vs Fusarium sp. (cepa X3B). ................................................. 50

7.5.5. Trichoderma spp. vs Fusarium sp. (cepa C2B). ................................................. 50

7.6. Micoparasitismo ............................................................................................................ 56

7.7. Antibiosis ....................................................................................................................... 63

7.8. Selección de cepas nativas de Trichoderma spp., con mayor potencial antagónico. .... 63

8. CONCLUSIÓN ................................................................................................................ 65

9. PERSPECTIVAS ............................................................................................................. 66

10. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 67

VI

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Datos de producción de nochebuena en el estado de Morelos en 2011. .............. 4

Cuadro 2. Escala para determinar el grado de micoparasitismo de Trichoderma spp. sobre

Fusarium sp.. ........................................................................................................................ 27

Cuadro 3. Denominación y procedencia de los aislamientos de Trichoderma spp............. 29

Cuadro 4. Denominación y procedencia de los aislamientos de Fusarium sp. ................... 32

Cuadro 5. Crecimiento radial de los antagonistas al quinto de día evaluación. .................. 37

Cuadro 6. Crecimiento radial de los patógenos al quinto día de evaluación. ..................... 38

Cuadro 7. Tratamientos de interacción entre Trichoderma spp. vs Fusarium sp. .............. 39

Cuadro 8. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de las cepas A3A, B1A, C2C,

X3B y C2B por las cepas de Trichoderma spp. al quinto día de evaluación. ...................... 40

Cuadro 9. Grado de micoparasitismo de los tratamientos correspondientes a los cultivos

duales de Trichoderma spp. y Fusarium sp. al décimo día de evaluación. .......................... 56

VII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Flor de nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd.ex Klotzsch) ........................ 3

Figura 2. Necrosis de la raíz y hojas marchitas en la nochebuena. ....................................... 6

Figura 3. Micoparasitismo de Trichoderma spp.; enrrollamiento y penetración de las hifas

de Trichoderma spp. sobre el hongo fitopatógeno. .............................................................. 15

Figura 4. Localización del área de estudio, el Campo Experimental de “Zacatepec” del

INIFAP. ................................................................................................................................ 20

Figura 5. Peso de los materiales orgánicos y siembra en medio de cultivo PDA. .............. 21

Figura 6. Observación al microscopio para la identificación de Trichoderma spp. ............ 22

Figura 7. Obtención y siembra de raíces con síntomas de pudrición en medio de cultivo

PDA. ..................................................................................................................................... 23

Figura 8. a) Obtención de la solución para cultivos monospóricos, b) Ubicación de las

esporas individuales germinadas. ......................................................................................... 24

Figura 9. Resiembra en medios de cultivo: PDA, SNA y HCA para la identificación

morfológica de Fusarium sp. ................................................................................................ 25

Figura 10. a) Obtención de discos de micelio con la ayuda de un sacabocado, b)

Crecimiento radial de Trichoderma spp. .............................................................................. 26

Figura 11. a) Obtención de discos de micelio con la ayuda de un sacabocado, b) Discos de

micelio de Trichoderma spp. vs Fusarium sp. ..................................................................... 26

Figura 12. Características macroscópicas de las colonias de Trichoderma spp. en medio de

cultivo PDA con y sin rosa de bengala. ................................................................................ 31

Figura 13. Características microscópicas de Trichoderma spp.; a) Hifas hialinas y fiálides

en forma de matraz; b) Conidios elipsoidales, observados en un objetivo de 40 x. ............. 32

Figura 14. Características macroscópicas de las colonias de Fusarium sp. en medio de

cultivo PDA. ......................................................................................................................... 33

Figura 15. Características macroscópicas de las cepas A3A, B1A, C2B y X3B de

Fusarium sp. en los medios de cultivo PDA, SNA y HCA. ................................................. 35

Figura 16. Características morfológicas de Fusarium oxysporum, a) Clamidosporas, b)

Macroconidios con 3 septos observados en objetivo de 40x. ............................................... 36

VIII

Figura 17. Crecimiento radial de las nueve cepas de Trichoderma spp. en competencia con

la cepa A3A de Fusarium sp. ............................................................................................... 44


la cepa B1A de Fusarium sp................................................................................................. 46


la cepa C2C de Fusarium sp. ................................................................................................ 48


la cepa X3B de Fuarium sp. ................................................................................................. 52


la cepa C2B de Fusarium sp. ................................................................................................ 54

Figura 22. Cultivos duales de las 9 cepas de Trichoderma spp. sobre la cepa A3A de

Fusarium sp. ......................................................................................................................... 58

Figura 23. Cultivos duales de las 9 cepas de Trichoderma spp. sobre la cepa B1A de

Fusarium sp. ......................................................................................................................... 59

Figura 24. Cultivos duales de las 9 cepas de Trichoderma spp. sobre la cepa de C2C de

Fusarium sp. ......................................................................................................................... 60

Figura 25. Cultivos duales de las 9 cepas de Trichoderma spp. sobre la cepa X3B de

Fusarium sp. ......................................................................................................................... 61

Figura 26. Cultivos duales de las 9 cepas de Trichoderma spp. sobre la cepa C2B de

Fusarium sp. ......................................................................................................................... 62

Figura 27. Antibiosis en la cepa Trich20 frente a las cinco cepas de Fusarium sp............. 63

IX

RESUMEN

Palabras clave: Euphorbia pulcherrima, Trichoderma spp., Biocontrol, Mecanismos de acción, Fusarium sp.

El cultivo de la nochebuena en Morelos tiene como principal problema fitosanitario a la

pudrición de la raíz, causado por Fusarium sp. El cual se presenta durante cualquier etapa

del ciclo biológico de la planta y hasta el momento solamente se controla con fungicidas

sintéticos.

En el presente trabajo se evaluó en condiciones in vitro, el potencial antagónico de

diferentes cepas de Trichoderma spp., aisladas de diferentes materiales orgánicos locales,

sobre Fusarium sp., aislado de la raíz de la nochebuena de interior.

Se obtuvieron 18 aislamientos de Trichoderma spp., provenientes de tres municipios del

estado de Morelos: Mazatepec, Zacatepec y Tetela del Monte. De los nueve aislamientos de

Fusarium sp., se identificaron cuatro cepas (A3A, B1A, X3B y C2B) que corresponden a la

especie Fusarium oxysporum.

La selección de las cepas nativas de Trichoderma spp., se basó en los valores de las

pendientes de las curvas en los modelos de regresión, el PICR (Porcentaje de inhibición del

crecimiento radial) y el grado de micoparasitismo sobre Fusarium sp. El crecimiento de las

diferentes cepas de Trichoderma spp., se explicó con el modelo de regresión: a*b(1/x)

*xc, con

alto nivel de ajuste (r² ≥0.92); en el caso de las cepas de Fusarium sp. el modelo de

regresión fue: (a*b+c*xd) / (b+x

d) con nivel de ajuste (r² ≥0.96).

Se seleccionaron 7 cepas de Trichoderma spp., incluida la cepa comercial; con mayor

potencial antagónico: Trich21, Trich24, Trich25 por presentar los mayores porcentajes de

inhibición (41 a 54 %). Mientras que las cepas Trich11, Trich16, Trich18 y Trich20 por

alcanzar grados de micoparasitismo 1, 2, 3 y 4 y antibiosis para esta última. Estas cepas

ofrecen una alternativa eficaz para el control biológico de la pudrición de la raíz en

nochebuena de interior causada por Fusarium sp.

1

1. INTRODUCCIÓN

La nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd.ex Klotzsch) es una planta de origen

mexicano, su nombre en náhuatl es Cuetlaxochitl que significa: "flor de pétalos resistentes

como el cuero" o "flor que se marchita¨. El cultivo de la nochebuena tiene una gran

relevancia en época decembrina, ya que es una de las especies de plantas ornamentales que

más se cultiva en maceta. A nivel nacional, en 2011 se reportó una producción de 20

millones de plantas terminadas con un valor de 700 millones de pesos. Los principales

estados productores son: Morelos, Michoacán, Distrito Federal, Puebla y el Estado de

México (SAGARPA, 2011; Vázquez et al., 2012).

México ocupa el cuarto lugar a nivel mundial en superficie cultivada, con 320 hectáreas, y

ha registrado un incremento de 40 por ciento en los últimos cinco años; el estado de

Morelos, ocupa el primer lugar a nivel nacional en producción de nochebuena. Las zonas

con mayor producción se ubican en Cuautla, Jiutepec, Cuernavaca, Emiliano Zapata,

Tepoztlán y Puente de Ixtla (SAGARPA, 2011; Vázquez et al., 2012). Existe una gran

diversidad de variedades como: Freedom Red, Subjibi Red, Sonora White, Freedom

Marble, Sonora Pink, Monet, entre otros, con diversos colores y tonalidades disponibles en

el mercado (Cabrera et al., 2006; Osuna et al., 2011).

Sin embargo, uno de los principales problemas fitosanitarios a los que se enfrentan los

productores son las enfermedades producidas por hongos fitopatógenos. Dentro de ellos, se

encuentran los géneros Pythium, Rhizoctonia, Phytophtora y Fusarium (Benítez et al.,

2004). Investigaciones previas permitieron identificar al hongo Fusarium sp., como el

principal agente causal de la pudrición de raíz de nochebuena en Morelos (García et al.,

2009). Estos hongos se encuentran naturalmente en el suelo y están relacionados con

pudriciones de raíz y tallos de muchas plantas (Figueroa-Rivera et al., 2010). En el estado

de Morelos, uno de los principales problemas fitosanitarios en el cultivo de la nochebuena,

es la marchitez de la planta causada por la pudrición de la raíz (Osuna et al., 2011). De

manera tradicional, esta enfermedad se controla con productos químicos, pero el uso

irracional de estos, genera altos costos de producción, afectaciones a la salud humana y la

acumulación de residuos en el medio ambiente (Jiménez, 1998; Molina, 2006). En este

entorno, se ha implementado la búsqueda de métodos alternativos, ecológicos, fáciles y

2

económicamente sustentables que permitan disminuir o controlar las poblaciones de hongos

fitopatógenos presentes en los cultivos ornamentales (García et al., 2009).

El control biológico de fitopatógenos constituye una alternativa eficaz, ya que regula el

número de microorganismos perjudiciales por medio de enemigos naturales (Riquelme,

2006). Dentro de los microorganismos más utilizados, están los del género Trichoderma;

este hongo se encuentra en el suelo, sobre la madera en descomposición y ecosistemas de

raíz (Zimand et al., 1996). Este género presenta diferentes mecanismos de acción, que le

permite atacar directamente al hongo, degradarlo y asimilarlo. Este potencial antagónico

involucra mecanismos de acción, como la competencia por sustrato y nutrientes,

micoparasitismo, producción de antibióticos y enzimas hidrolíticas que alteran la integridad

de las paredes celulares de los hongos; además de la producción de sustancias promotoras

del crecimiento vegetal (Harman, 2000; Howell, 2003).

El género ha sido motivo de estudio frente un amplio rango de hongos fitopatógenos de

gran importancia agrícola, tales como: Sclerotium, Rhizoctonia, Phytophthora, Pythium y

Fusarium (Papavizas, 1985). En este contexto, el presente trabajo evaluará bajo

condiciones in vitro, el potencial antagónico de diferentes cepas de Trichoderma spp.,

aisladas de diferentes materiales orgánicos locales, sobre el hongo fitopatógeno Fusarium

sp. Los resultados de esta investigación ayudarán a la selección de cepas de Trichoderma

spp., con alto potencial antagónico contra Fusarium sp., las cuales serán evaluadas in vivo

en una investigación posterior.

3

2. MARCO TEÓRICO

2.1. Generalidades de la nochebuena

La nochebuena es una de las especies del género Euphorbia más cultivadas en macetas a

nivel mundial, debido a su alta demanda, sobre todo en las fiestas decembrina. En estado

silvestre, la planta de nochebuena alcanza alturas de hasta 3 m, presenta hojas lanceoladas u

ovaladas-elípticas, pandurada, entera a dentada lobulada, estípite largo; brácteas parecidas a

una hoja escarlata; glándulas amarillas. Muchas de la variedades presentan tallos

comúnmente largos; brácteas pequeñas, estrechas planas y arrugadas en colores rojo,

blanco, rosa (Cabrera et al., 2006) (Figura 1).

Por su parte la nochebuena de interior se cultiva en contenedores o macetas de diversas

capacidades. Los sustratos más empleados incluyen como componente orgánico a la¨

tierra de hoja¨ y al ¨ocochal¨, en mezcla con componentes inorgánicos como el tezontle,

el tepojal y la agrolita. Existe una gran diversidad de variedades, como: Freedom Red,

Subjibi Red, Sonora White, Freedom Marble, Sonora Pink, Monet, entre otros, con

distintos colores y tonalidades disponibles en el mercado (Cabrera et al., 2006; Osuna et

al., 2011).

2.1.1. Importancia económica del cultivo de la nochebuena

La nochebuena representa un producto rentable y exclusivo en flores en temporada

navideña, por lo que su demanda es muy alta. A nivel nacional, de acuerdo con información

Figura 1. Flor de nochebuena

(Euphorbia pulcherrima Willd. ex. Klotzsch).

4

de SAGARPA (2010) la nochebuena se cultiva en 320 hectáreas, la mayoría en

invernaderos, generando 3200 empleos directos y alrededor de 9600 indirectos. A nivel

nacional, se estimó una producción de más de 20 millones de plantas terminadas en sus

diferentes presentaciones, adquiriendo un valor de 700 millones de pesos (SAGARPA,

2011).

México ocupa el cuarto lugar a nivel mundial en superficie cultivada, con 320 hectáreas, y

ha registrado un incremento de 40 por ciento en los últimos cinco años (SAGARPA, 2011).

El 90% de la producción y consumo de la nochebuena corresponde a variedades con

brácteas de color rojo, el 5% son de color blanco o amarillo y el resto son de color rosa,

moradas o marmoleadas; todas en diferentes presentaciones (SAGARPA, 2011).

Morelos ocupa el primer lugar nacional en producción de nochebuena. Se cultivan más de5

millones de plantas terminadas en diferentes presentaciones y colores, así como alrededor

de 10 millones de esquejes o plántulas, tallos de la planta con finalidades reproductivas,

para el abasto de los mercados internacionales de Estados Unidos, Canadá, China, Kenia,

Japón, Holanda, Vietnam, Francia, Alemania y Suecia (Vázquez et al., 2012). Las zonas

con mayor producción se ubican en Cuautla, Jiutepec, Cuernavaca, Emiliano Zapata,

Tepoztlán y Puente de Ixtla (SIAP, 2011) (Cuadro. 1).

SIAP, 2013.

Municipio

Producción de

Plantas

Valor Producción

(Miles de Pesos)

Cuautla 690,000.00 17,250.00

Cuernavaca 1,806,000.00 50,568.00

Emiliano Zapata 372,000.00 9,300.00

Jiutepec 330,500.00 8,593.00

Puente de Ixtla 376,200.00 10,533.60

Tepoztlán 979,200.00 29,376.00

Yautepec 1,240,000.00 34,720.00

Totales 5,793,900.00 160,340.60

Cuadro 1. Datos de producción de nochebuena en el estado de Morelos en

2011.

5

Las variedades de mayor importancia en México y para Morelos son Freedom y Subjibi,

seguidas de otras variedades como: Festival, Monet twligth, Marble, Prestige, Joypink, Red

Angel y Nutcracker, con variedades que van desde el tradicional rojo, pasando por el rosa,

amarillo, guinda, salmón y veteadas (Vázquez et al., 2012). El Sistema producto

ornamentales y SAGARPA (2011) impulsaron un plan promocional, para institucionalizar

el 8 de diciembre como ¨Día Nacional de la nochebuena ¨Cuetlaxochitl¨.

2.1.2. Problemas fitosanitarios

Para el productor, la calidad de la flor incluye la cantidad de hojas, tamaño de las flores,

obtención de colores fijos y un buen desarrollo del sistema radical. El cultivo de la

nochebuena se ha convertido en una actividad importante, debido a esto, es necesario

verificar los factores que intervienen en su producción, tales como la selección de un buen

sustrato y la fertilización, que influyen en la nutrición de la planta. Sin embargo, uno de los

principales problemas a los que se enfrentan los productores, son las enfermedades

producidas por hongos fitopatógenos (Pineda-Pineda et al., 2008).

Continuamente, la producción del sector ornamental se ve afectado por enfermedades del

sistema radicular, limitando la producción de plantas. Entre los agentes causales, se

encuentran las bacterias, nematodos, insectos y hongos fitopatógenos. Dentro de estos

últimos, diversas especies de Pythium sp., Rhizoctonia sp., Phytophtora sp. y Fusarium sp.,

logran afectar a las plantas durante su propagación, proceso productivo e incluso en la

postcosecha, afectando así la calidad del producto (Benítez et al., 2004).

En el estado de Morelos, uno de los problemas fitosanitarios más importantes en el cultivo

de la nochebuena, es la marchitez de la planta causada por la pudrición de la raíz (Osuna et

al., 2011). Esta enfermedad se presenta en cualquier etapa del ciclo de desarrollo, al inicio

del proceso de pigmentación o en etapas más avanzadas. Investigaciones anteriores

permitieron identificar a Fusarium sp., como la principal causa de la pudrición de la raíz de

nochebuena (García et al., 2009).

6

2.2. Enfermedades de la nochebuena

2.2.1. Pudrición de la raíz

La enfermedad causada por Fusarium sp., origina una necrosis en las raíces, las cuales se

tornan oscuras y la planta empieza a marchitarse hasta que muere (Figura 2). Los síntomas

pueden presentarse en cualquier etapa de su desarrollo, desde la colocación de la planta en

la maceta definitiva, hasta en la etapa de pigmentación; en este periodo se logra observar

que el follaje se empieza a marchitar. Las hojas o partes infectadas pierden turgencia,

comienzan a debilitarse y obtienen un tono que va del verde claro al amarillo verdoso. Las

hojas marchitas pueden extenderse o enrollarse, mientras que los retoños tiernos o jóvenes

también se marchitan y mueren (García et al., 2009).

Fusarium sp. se mantiene latente en el suelo en forma de micelio, y se propaga de varias

formas, con mayor frecuencia mediante clamidosporas. Esta propagación puede darse a

cortas distancias, a través del agua o el equipo agrícola contaminado, mientras que a largas

distancias, se da principalmente por plántulas infectadas o por el suelo que va unido a ellos

(García et al., 2009).

2.3. Generalidades de Fusarium sp.

Es un hongo saprofito, que se encuentran naturalmente en el suelo. Está relacionado con

pudrición de raíz y tallo de muchas plantas (Figueroa-Rivera et al., 2010).

Figura 2. Necrosis de la raíz y hojas marchitas en la nochebuena.

7

2.3.1. Clasificación taxonómica (Barnett y Hunter, 1978).

Reino: Fungi

División: Eumycota

Clase: Deuteromycetes

Orden: Moniliales

Familia: Moniliaceae

Género: Fusarium

Especie: F. oxysporum

El género Fusarium fue descrito por Link en 1809; desde entonces la taxonomía ha sido

muy complicada. Se considera que este género exhibe un grado de variación con respecto a

la morfología microscópica y a sus características fisiológicas, debido a su gran habilidad

para colonizar diversos hábitats ecológicos (Nelson et al., 1994).

La correcta identificación de las especies de Fusarium requiere de una observación

detallada del cultivo, ya que el género se caracteriza por una gran variabilidad morfológica

bajo diferentes condiciones de cultivo. Las características que permiten la identificación del

género Fusarium se determinan macroscópicamente y microscópicamente. Estas son

agrupadas en características primarias y secundarias, utilizadas para separar las especies.

Las características primarias incluyen: la forma de los macroconidios, origen y forma de los

microconidios, tipo de conidióforo, y la presencia o ausencia de clamidosporas, mientras

que en las secundarias se encuentran: la presencia o ausencia de esporodoquios, así como

morfología y pigmentación de la colonia (Nelson et al., 1994; Figueroa-Rivera et al., 2010).

2.3.2. Biología de Fusarium sp.

2.3.2.1. Micelio

Las colonias de las distintas especies de Fusarium crecen moderada a profusamente, tienen

diversos colores (blanco, rosado pálido, rojo, anaranjado, púrpura, celeste, verde aceituna),

especialmente en el reverso de la colonia. El micelio es ralo o denso, ya sea algodonoso,

como un fieltro o zona central de funículos, pero en algunos casos es limoso. Los

pigmentos que se difunden en el agar suelen variar de color o tono conforme al pH.

8

Algunas especies presentan zonas concéntricas de distinta morfología macroscópica debido

a la secuencia luz–oscuridad (Seifert, 2002).

2.3.2.2. Macroconidios

Hialinos, fusiformes, a veces pedicelados, con una célula apical más o menos puntiaguda y

una célula basal en forma de pie que constituye la base para la identificación; presenta entre

1-7 septos. Es la estructura más importante para la identificación de especies de Fusarium.

(Leslie y Summerell, 2006).

2.3.2.3. Microconidios

No son producidos por todas las especies de Fusarium; debido a esto, su presencia también

representa un carácter muy importante. Comúnmente unicelulares, elipsoidales, fusiformes,

piriformes o subglobosos (Mendoza y Pinto, 1985).

2.3.2.4. Clamidosporas

La presencia de clamidosporas también es un carácter muy importante en la descripción de

varias especies de Fusarium. Pueden ser sencillas, dobles, en masas o cadenas. Las

clamidosporas pueden encontrarse en el micelio aéreo (Leslie y Summerell, 2006).

El conidióforo es una parte de la hifa que soporta a la célula conidiogena, que puede ser

monofialides o polifialides, ramificados o simples; en ocasiones formando grupos de

esporodoquios (Mendoza y Pinto, 1985). Su crecimiento y reproducción en el suelo se da a

temperaturas entre 27-29°C; generalmente las plantas mueren de 2-4 semanas después de la

infección. Existen diferentes condiciones que favorecen su desarrollo, tales como: una alta

humedad en el suelo o el sustrato y alto contenido de nitrógeno combinado con un bajo

contenido en potasio. El inóculo se propaga a través del suelo contaminado, agua de lluvia,

implementos agrícolas, trasplantes y en ciertas ocasiones por la semilla (Mendoza y Pinto,

1985).

Fusarium se comporta como fitopatógeno al penetrar las diferentes capas de la corteza de la

raíz, hasta encontrar el sistema vascular. Una vez establecido, la colonización de la planta

es llevaba a cabo rápidamente a través del xilema que conlleva a la sintomatología de la

9

marchitez (Agrios, 1998). Estos hongos generalmente provocan necrosis o muerte a los

tejidos de las plantas; los síntomas más frecuentes son la pudrición basal del tallo, cánceres,

roña, tizón y pudriciones de la raíz, entre otros (Mendoza y Pinto, 1985). Para contrarrestar

estos problemas, se ha recurrido al uso de productos químicos en los cultivos de

ornamentales (Molina, 2006).

2.4. Control químico

De manera tradicional, se emplea el uso de productos químicos en el cultivo de plantas

ornamentales. El control de esta enfermedad, se basa en la aplicación de fungicidas

comerciales como Captan, Phyton 27, Folpan, Ridomil, Terrazan, Cercobin y Previcur N,

solos o mezclados en dosis de 1 a 4 ml/L de agua, cada 8 días (García et al., 2009). Estos

productos incrementan el costo de producción y también afectan la salud humana de

quienes los aplican. Además, generan resistencia de especies inmunes a la acción de estos

productos, dan origen a nuevos organismos secundarios que provocan la eliminación de los

enemigos naturales, generan acumulaciones de residuos en el medio ambiente, causan la

destrucción de la flora y fauna, entre otros efectos colaterales negativos (Jiménez, 1998).

En este conjunto de circunstancias, se ha promovido la búsqueda de nuevas alternativas

sencillas, ecológicas y económicamente sustentables que disminuyan el uso irracional de

plaguicidas; este enfoque se ha dirigido hacia la investigación de diversos

microorganismos, que pueden ser utilizados como agentes de control biológico de hongos

fitopatógenos (Pineda- Pineda et al., 2008).

2.5. Control biológico

Se define como el control de una enfermedad o plaga mediante el uso de microorganismos

u otros componentes naturales del medio. Consiste en la regulación del número de

microorganismos perjudiciales por medio de enemigos naturales (Riquelme, 2006). Los

agentes de control biológico interfieren en el ciclo biológico del patógeno (por una

destrucción directa o por competencia al utilizar sus recursos vitales para sobrevivir)

favoreciendo la creación de barreras físico-químicas, las cuales alcanzan niveles suficientes

para retrasar o disminuir el desarrollo del patógeno (Riquelme, 2006). El control biológico

mediante el uso de organismos antagónicos representa una importante herramienta para la

protección de cultivos contra hongos fitopatógenos. Para ello, es necesario conocer a los

10

organismos benéficos, identificar la función que tienen para regular las poblaciones de

patógenos y reducir el uso de plaguicidas (Michael-Aceves et al., 2009).

Dentro de los microorganismos más utilizados en el control biológico están los hongos del

género Trichoderma, que aún siguen siendo objeto de investigación en muchos países.

Muchas especies de este género, se han reportado como hiperparásitos de un amplio

número de hongos fitopatógenos, produciendo lisis celular. Los resultados de Lima y

colaboradores (1997), demostraron la acción de una quitinasa en la pared celular de

Sclerotium rolfsii y de Rhizoctonia solani. La efectividad para el control de un hongo

fitopatógeno puede variar en un aislamiento del antagonista, en la medida de sus

características de adaptación a condiciones bióticas y abióticas específicas (Dennis y

Webster, 1971).

2.6. Trichoderma spp.

2.6.1. Generalidades de Trichoderma spp.

Constituye un grupo diverso de hongos saprofitos, generalmente establecidos en el suelo,

sobre la madera en descomposición y ecosistemas de raíz. Las diferentes especies de

Trichoderma, se destacan por tener un crecimiento micelial rápido, producción abundante

de esporas y su facilidad de colonizar varios tipos de sustratos (Zimand et al., 1996).

2.6.2. Clasificación taxonómica (Samuels y Chaverri, 2003).

Reino: Fungi

División: Eumycota

Subdivisión: Ascomycotina

Clase: Euascomycetes

Orden: Hypocreales

Familia: Hypocraceae

Género: Trichoderma

Especie: T. harzianum, T. hamatum, T. viride, entre otras.

El género Trichoderma, fue propuesto por Pearson; para su identificación y caracterización

a nivel género se emplean diversas pruebas bioquímicas, técnicas moleculares, métodos que

11

se basan en su morfología y su actividad fúngica (Bisset et al., 2003). Este género tiene una

gran variabilidad genética, lo que le permite a cada especie tener características diferentes;

debido a esto, la taxonomía de este género es aun confusa, ya que las primeras

clasificaciones se basaron fundamentalmente en las características morfológicas de las

especies como: velocidad de crecimiento, características de la esporulación, así como

características de los conidios y conidióforos. Actualmente, se han realizado análisis de

isoenzimas, secuenciación de DNA, técnicas bioquímicas y fisiológicas, con el fin de

aclarar la clasificación taxonómica del género (Bisset et al., 2003; Samuels, 1996).

2.6.3. Biología de Trichoderma spp.

Microscópicamente, la morfología que presenta este género son conidióforos, hifas hialinas

septadas, fialides y conidios (Kubicek y Harman, 1998).

2.6.3.1. Conidióforo

Son hialinos, generalmente ramificados, la formación de las hifas se da en un ángulo de 90º

y en ocasiones llegan a tener una disposición en forma piramidal (Kubicek y Harman,

1998).

2.6.3.2. Fiálides

Son hialinas, en forma de matraz, se adhieren a los conidióforos por la parte más amplia,

pueden ser solitarias o dispuestas en racimos, produciendo los conidios en el extremo

(Kubicek y Harman, 1998).

2.6.3.3. Conidios

Son unicelulares de forma elipsoidal con aproximadamente 3 µm de diámetro, son de color

verde (Kubicek y Harman, 1998).

2.6.3.4. Micelio

En el medio de cultivo PDA, Trichoderma spp., presenta un crecimiento y desarrollo

colonial rápido de 5 días. En este medio las colonias tienen un aspecto algodonoso que se

van compactando conforme pasa el tiempo. Cuando su desarrollo es alternado en periodos

de luz y oscuridad, se logran apreciar las zonas de crecimiento correspondiente a cada

12

periodo. En ausencia de luz se puede apreciar un micelio algodonoso de color blanco y en

presencia de luz se observa la esporulación con tonalidades verdosas, dando un aspecto de

anillos en forma concéntrica. Al reverso de la caja, se puede ver un color pálido y en

ocasiones adquiere una coloración amarilla (Windham et al., 1986). Algunas especies de

Trichoderma sp., cuando se desarrollan en medios de cultivo que presentan condiciones

restringidas de pH, humedad, fuente de carbono o nutrimentos, son capaces de producir

clamidosporas (Kubicek y Harman, 1998).

Las condiciones de crecimiento para este hongo son:

Temperatura (ºC): su desarrollo y crecimiento se da en un intervalo de 15 a 35ºC,

siendo 25ºC la óptima.

Humedad relativa (HR): capaz de crecer entre el 20% y 80%, siendo el 70% la

excelente.

pH: entre 6 a 6.5, se consideran valores adecuados para su desarrollo, pero también

puede sobrevivir a valores mayores, debido a su capacidad de acidificar el medio en

el que se encuentra.

Carbono(C): la fuente principal que asimila es la celulosa (Kubicek y Harman,

1998).

Trichoderma spp., presenta características satisfactorias como agente de control biológico

sobre hongos fitopatógenos, al tener la capacidad de competir por nutrientes o producir

compuestos que resultan tóxicos para este tipo de hongos (Michael-Aceves et al., 2009).

2.7. Mecanismos de acción

Los principales mecanismos que ejercen las especies del género Trichoderma, para llevar a

cabo su antagonismo contra hongos fitopatógenos incluyen desde la degradación y

consecuente asimilación de estos. Este potencial antagónico involucra el micoparasitismo,

competencia por sustrato y nutrientes, la producción de antibióticos y enzimas hidrolíticas

que alteran la integridad de las paredes celulares de los hongos; además de la producción de

sustancias promotoras del crecimiento vegetal. Tales mecanismos pueden operar de manera

independiente o simultáneamente en las interacciones microbianas (Howell, 2003).

13

Diferentes especies de Trichoderma, promueven el crecimiento radical y desarrollo de las

plantas, tolerancia al estrés, inducción de resistencia, solubilización de nutrientes orgánicos

e inactivación de las enzimas de los hongos fitopatógenos (Harman, 2000).

2.7.1. Competencia por nutrientes y sustrato

La competencia es un mecanismo antagónico importante; se define como el

comportamiento desigual de dos o más organismos ante un mismo requerimiento (sustrato

o nutrientes), siempre y cuando la utilización de este, por uno de los organismos, reduzca la

cantidad o espacio disponible para los demás (Infante et al., 2009).

Trichoderma spp., es un hongo saprófito que al competir con otros microorganismos,

impide que se desarrollen; una manera de lograrlo es a través de la excreción de moléculas

denominadas sideróforos, que son quelantes del hierro en el medio ambiente; este

micronutrimento es necesario para la viabilidad de diversos hongos filamentosos, y al ser

quelatado por los sideróforos se reduce su disponibilidad para el hongo fitopatógeno,

disminuyendo de esta manera su desarrollo (Chet y Inbar, 1994).

2.7.2. Antibiosis

Es el mecanismo en el cual un hongo antagonista inhibe o destruye a un organismo a través

de la producción metabólica de compuestos difusibles de bajo peso molecular o

antibióticos. Las especies de este género tienen la capacidad de producir metabolitos

tóxicos volátiles o no volátiles, enzimas líticas, que desintegran los polímeros estructurales

como la quitina y β-1-3 glucanos de la pared celular de la mayoría de los hongos

fitopatógenos, reduciendo su desarrollo y crecimiento (Michael-Aceves et al., 2005).

Entre las enzimas líticas que producen las especies de Trichoderma., se encuentran

quitinasas, glucanasas, proteasas y celulasas. Entre los metabolitos están el ácido

harziánico, tricholinas, peptaiboiles; antibióticos como la viridina, gliotoxina,

glisosperonas, se relacionan con el mecanismo de antibiosis y micoparasitismo al participar

en la degradación de la pared celular del hongo fitopatógeno (Michael-Aceves et al., 2005).

Algunas de las especies de este género se caracterizan por presentar una gran producción de

sustancias volátiles de naturaleza antibiótica con un característico olor a coco (Stefanova et

al., 1999). Los antibióticos volátiles ejercen un efecto fungistático, debilitando al patógeno

14

y lo vuelven más sensible a los antibióticos no volátiles, conocido como un

hiperparasitismo de origen enzimático (Infante et al., 2009).

2.7.3. Micoparasitismo

Es definido como una simbiosis antagónica entre organismos, en donde están implicadas

enzimas extracelulares (Infante et al., 2009). Es un mecanismo complejo que involucra

varias etapas consecutivas. Inicia con el crecimiento quimiotrófico, reconocimiento,

adhesión y enrollamiento, y muerte del hongo fitopatógeno (Benítez et al., 2004).

2.7.3.1. Crecimiento quimiotrófico

El quimiotropismo es el crecimiento directo hacia un estímulo químico. En esta primera

etapa, Trichoderma spp., ha demostrado que puede detectar la localización de su

hospedante a distancia y sus hifas crecen en dirección al hongo como resultado de un

estímulo químico (Infante et al., 2009).

2.7.3.2. Reconocimiento

Se efectúa a través de interacciones lectinas-carbohidratos. Trichoderma spp., se adhiere

con carbohidratos que se unen a lectinas en la pared celular del hongo fitopatógeno

(Howell, 2003).

2.7.3.3. Adhesión y enrollamiento

Las hifas de Trichoderma spp., se adhieren al hospedante mediante la formación de

ganchos. Se enrolla al patógeno y forma estructuras denominadas apresorios (Howell,

2003) (Figura 3).

2.7.3.4. Actividad lítica

La lisis celular es el mecanismo en donde intervienen las enzimas hidrolíticas producidas

por los antagonistas. En esta etapa, la producción de enzimas líticas degrada las paredes

celulares del hospedante y facilita la penetración de las hifas del antagonista. (Haram et al.,

1996). Trichoderma spp., produce muchas enzimas (celulosas, glucanasas, lipasas,

proteasas y quitinasas) que participan en la lisis de la pared celular de las hifas del

hospedante, permitiendo la inserción de estructuras especializadas (gancho y apresorios)

15

que absorben el contenido de la pared celular del hongo fitopatógeno. El contenido restante

queda principalmente rodeado de hifas invasoras, mostrando signos de dispersión y

disminución de la actividad patogénica del hongo (Benítez et al., 2004).

.

La producción metabólica de los aislamientos de Trichoderma spp., al igual que el

micoparasitismo, presenta una determinada especificidad. Samuels (1996), detalla un grupo

de cepas de Trichoderma spp., denominadas ¨Q¨, que produjeron gliotoxina y lograron ser

efectivas contra R. solani, pero no fueron efectivas a Pythium ultimum Trow; mientras que

otro grupo de cepas¨ P¨, que produjeron gliotoxina mostraron resultados opuestos.

Martínez y colaboradores (2008), observaron que al evaluar la competencia por el sustrato,

micoparasitismo y antibiosis en 59 aislamientos de Trichoderma spp., se logró determinar

al menos un tipo de interacción hifal definida y algunos de ellos presentaron hasta cuatro

tipos de interacción sobre R. solani (Infante et al., 2009).

Los mecanismos mencionados anteriormente, pueden actuar de manera independiente o

sinérgica en el control de hongos fitopatógenos, aunque la importancia de cada uno de ellos

va a depender de la interacción planta-patógeno-antagonista y de las condiciones

ambientales que prevalezcan (Harman, 2000).

Figura 3. Micoparasitismo de Trichoderma spp.; enrrollamiento y

penetración de las hifas de Trichoderma spp. sobre el hongo

fitopatógeno.

16

Por otra parte, se conoce que el género induce resistencia a la planta, incrementando la

respuesta de crecimiento y la tolerancia al estrés, que son ocasionados por factores

adversos, en este caso, la presencia de hongos fitopatógenos. Al inducir resistencia en la

planta, se estimulan los mecanismos naturales de defensa, como la producción de

hormonas, peroxidasas y compuestos fenólicos que provocan cambios bioquímicos y la

formación de barreras físicas (Harman, 2000; Howell, 2003).

2.8. Usos y aplicaciones

Las propiedades de este género, lo han convertido de mayor importancia económica para la

industria, como biofungicida comercial, también se usa para la degradación de xenobioticos

y como estimulante del crecimiento vegetal (Howell, 2003; Hanson y Howell, 2004).

2.8.1. Trichoderma spp., como agente de control biológico

El potencial antagónico de Trichoderma spp., fue descubierto desde 1930 y hasta la fecha

se usa para el control de enfermedades de las plantas; sin embargo, el empleo a nivel

comercial de este género es reciente. El género ha sido motivo de estudio frente un amplio

rango de hongos fitopatógenos de gran importancia agrícola, principalmente, contra los

géneros de Sclerotium, Rhizoctonia, Phytophthora, Pythium y Fusarium (Papavizas, 1985).

Los primeros estudios a nivel mundial sobre la producción de metabolitos tóxicos

producidos por Trichoderma spp., proceden del año 1934, cuando Weindling, al realizar

filtrados de cultivos de T. lignorum, aisló un metabolito orgánico de forma cristalina que

resultó ser tóxico en altas diluciones sobre R. solani. Este metabolito recibió el nombre

común de Gliotoxina. Posteriormente, se reportaron otros metabolitos secundarios

producidos por Trichoderma, como Viridina por T. viride, y Trichodermin en T. viride y T.

polysporum (Dennis y Wester, 1971). Posteriores investigaciones, demuestran que cepas

nativas de Trichoderma spp., son eficientes en el control in vitro de las dos especies de

Fusarium asociados con la ¨escoba de bruja¨ del mango (Michael-Aceves et al., 2001;

Michael-Aceves et al., 2005).

Es el microorganismo más utilizado como agente de control biológico, debido a que es

tolerante a la aplicación de agroquímicos, ayudando a la reducción de plaguicidas que

generan un efecto negativo en el medio ambiente y la salud humana (Vinale et al., 2008).

17

Por lo anterior, el control biológico de hongos fitopatógenos y el uso de Trichoderma spp.,

es una alternativa utilizada en diferentes partes del mundo; sin embargo, el uso de cepas

comerciales llega a presentar dificultades con su persistencia en el suelo, debido a factores

como la variabilidad genética de los aislamientos, las condiciones del medio ambiente, y

otros. Debido a esto, es importante seleccionar aislamientos nativos, que estarán mejor

adaptados a las condiciones climáticas de la zona donde serán utilizados (González et al.,

1999).

18

3. JUSTIFICACIÓN

Durante varias décadas se ha utilizado la aplicación de productos químicos en el control de

enfermedades del sector ornamental. Los residuos liberados de estos productos atentan

contra la salud humana y promueven el deterioro del medio ambiente. Ante la necesidad de

reducir el uso irracional de estos productos, se ha implementado la búsqueda de fuentes

alternativas que minimicen estos problemas. El control biológico se presenta como una

alternativa económica, fácil y eficaz contra los numerosos problemas generados por hongos

fitopatógenos. Los agentes de control biológico más empleados pertenecen al género

Trichoderma.

Este hongo ofrece buenas posibilidades como antagonista de hongos fitopatógenos, al

presentar diversos mecanismos de acción que le permiten controlar o inhibir el crecimiento

de diferentes especies de hongos fitopatógenos. Su facilidad de aislamiento y cultivo, se

debe al rápido crecimiento que presenta en diferentes sustratos. Este género promueve el

continuo desarrollo de investigaciones básicas y aplicadas al control biológico de

enfermedades en plantas.

En este contexto, en el presente trabajo se evaluó bajo condiciones in vitro, el potencial

antagónico de diferentes cepas de Trichoderma spp., aisladas de diferentes materiales

orgánicos locales, sobre el hongo fitopatógeno Fusarium, en nochebuena de interior. Los

resultados de esta investigación ayudarón a la selección preliminar de cepas de

Trichoderma spp., con alto potencial antagónico contra Fusarium sp., las cuales se

evaluarón in vivo en una investigación posterior.

19

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Seleccionar cepas nativas de Trichoderma spp., con alto potencial antagónico para el

control biológico de Fusarium sp., en nochebuena de interior.

4.2. Objetivos particulares

a) Aislar e identificar cepas nativas de Trichoderma spp. a partir de diferentes

sustratos.

b) Aislar el hongo fitopatógeno Fusarium sp. de la raíz de la nochebuena de interior.

c) Realizar pruebas de antagonismo entre las cepas nativas seleccionadas de

Trichoderma spp. hacia los aislamientos de Fusarium sp. nativas.

d) Seleccionar las cepas de Trichoderma spp., con mayor potencial antagónico.

5. HIPÓTESIS

El crecimiento micelial de Fusarium sp., se verá afectado por el potencial antagónico de las

cepas nativas de Trichoderma spp.

20

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Ubicación del área de estudio

El presente trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Sustratos del Campo

Experimental “Zacatepec”, perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales

Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), ubicado en el Km. 0.5 carretera Zacatepec-Galeana

(Figura 4).

.

6.1.1. Obtención de muestras

Se tomaron muestras de materiales orgánicos de origen diverso, utilizados en la preparación

de sustratos para el cultivo de nochebuena, como los siguientes: “ocochal”; lixiviados del

proceso de lombricompostaje de estiércol vacuno + residuos vegetales, lombricomposta de

estiércol de ganado vacuno + 50% de residuos vegetales, así como de un sustrato común en

nochebuena compuesto por 70% de ocochal–tierra de hoja + 30% tepojal (V/V).

Figura 4. Localización del área de estudio, el Campo Experimental de

“Zacatepec” del INIFAP.

21

6.2. Aislamiento e identificación de Trichoderma spp.

Para realizar los aislamientos, se utilizó la técnica de dilución en placa, en donde se pesaron

10 g de cada muestra y fueron depositados en un matraz erlenmeyer con 90 mL de agua

destilada estéril (10-¹), enseguida se agitaron en un vortex por 20 minutos. Después se tomó

una alícuota de 1 mL del matraz y se depositó en un tubo de ensaye que contenía 9 mL de

agua destilada estéril (10-2

), se volvió a tomar una alícuota de 1 mL de ese tubo y se colocó

en otro tubo de ensaye (10-3

); se repitió el mismo procedimiento hasta obtener diluciones de

(10-5

). De las tres últimas diluciones se tomó una alícuota de 0.1 mL que fue plaqueada de

manera homogénea sobre una caja petri (9.0 cm de diámetro) que contenía medio de cultivo

agar papa dextrosa (PDA), rosa de bengala y ácido láctico al 10%; las cantidades de cada

componente por litro de medio de cultivo fueron 39 g de PDA, 0.5 g de rosa de bengala y

10 mL de ácido láctico al 10% (Figura 5). El aislamiento se realizó en una cámara de flujo

laminar en condiciones asépticas. Las cajas sembradas se incubaron a 24°C ± 1°C durante

5-7 días en la oscuridad.

Posteriormente, se realizaron montajes temporales con azul de lactofenol bajo el

microscopio compuesto, para identificar la presencia del hongo Trichoderma spp.,

basándose en las descripciones de Barnet y Hunter (1978) (Figura 6).

Figura 5. Peso de los materiales orgánicos y siembra en medio

de cultivo PDA.

22

En los ensayos se incluyó una cepa comercial de Trichoderma spp. (Fithan), que ha

mostrado buena capacidad antagónica contra hongos fitopatógenos que causan secadera de

plántulas de jitomate de invernadero en Morelos (Osuna et al., 2010). Se utilizó la misma

metodología descrita anteriormente para preparar diluciones del producto comercial de 10-1

hasta 10-5

.

6.3. Aislamiento de Fusarium sp., de la raíz de nochebuena de interior

Se realizó una colecta de plantas de nochebuena de interior que presentaron los síntomas de

pudrición de raíz descritos por Cabrera et al., (2006). Las plantas colectadas se trasladaron

al laboratorio para su posterior procesamiento.

Primero se cortaron las raíces con la ayuda de un bisturí para ser retiradas de la planta, se

lavaron con agua de la llave para retirar restos de sustrato. Enseguida se desinfectaron

mediante inmersión por un minuto en una solución de hipoclorito de sodio comercial al 2%,

posteriormente, se lavaron con agua destilada estéril y se dejaron secar en papel filtro. Las

muestras de raíces obtenidas fueron sembradas en cajas petri (9 cm de diámetro) con medio

de cultivo PDA adicionado con ácido láctico al 10%; las cantidades de cada componente

por litro de medio de cultivo fueron 39 g de PDA y 10 mL de ácido láctico al 10% (Figura

7). El aislamiento se realizó en una cámara de flujo laminar en condiciones asépticas. Las

cajas sembradas fueron incubadas a 24°C ± 1°C durante 5-7 días en la oscuridad.

Figura 6. Observación al microscopio para la

identificación de Trichoderma spp.

23

Para la identificación de los hongos fitopatógenos, se tomaron en cuenta las características

macroscópicas de la colonia en base a claves de Barnet y Hunter (1978).

6.3.1. Cultivos monospóricos de Trichoderma spp. y Fusarium sp.

Para la obtención de cultivos monospóricos se sembró una asada de esporas de los

aislamientos puros de Trichoderma spp. y de Fusarium sp.

Se colocaron 10 mL de agua estéril sobre el aislamiento puro y se realizaron pequeños

movimientos circulares a la caja petri para poder dispersar los conidios, enseguida se tomó

una alícuota de 10 µl (microlitros) de esa solución y fueron plaqueados de manera

homogénea en una caja petri con medio de cultivo PDA, rosa de bengala y ácido láctico en

las proporciones indicadas en el apartado 6.2 para Trichoderma spp. y las mismas

proporciones de PDA y ácido láctico, en las proporciones indicadas en el apartado 6.3 pero

sin rosa de bengala, para el caso de Fusarium sp. Las cajas sembradas se incubaron por 24

horas a 24ºC en la oscuridad.

Pasadas las 24 horas, los aislamientos se observaron al microscopio compuesto para poder

ubicar esporas individuales germinadas, se inició marcando el sitio utilizando un micro

gancho sobre el agar. Posteriormente se transfirió un fragmento de agar con la espora

seleccionada a una nueva caja petri con PDA, rosa de bengala y ácido láctico al 10% para

Trichoderma spp., en el caso de Fusarium sp., el medio de cultivo no lleva rosa de bengala

(Figura 8).Los aislamientos se realizaron en la cámara de flujo laminar en condiciones

asépticas. Las cajas sembradas se incubaron a 24°C ± 1°C durante 5-7 días en la oscuridad.

Figura 7. Obtención y siembra de raíces con síntomas de pudrición en

medio de cultivo PDA.

24

6.3.2. Identificación morfológica de las cepas nativas de Fusarium sp.

La identificación se realizó en el laboratorio del Dr. Edgar Martínez Fernández,

investigador en Micología en el Centro de Investigaciones Biológicas de la Universidad

Autónoma del Estado de Morelos (CIB-UAEM). Para la identificación, se emplearon tres

medios de cultivo:

*Medio Agar papa dextrosa (PDA) y ácido láctico. Tal como se describe en el apartado

6.2.

*Medio Spezieller Nährstoffmmarmer Agar (SNA). Este medio de crecimiento contiene

los siguientes ingredientes L-1

: 0.1 g KH2PO4, 1.0 g KNO3, 0.5 g Mg SO4.7H2O, 0.5 g KCl

0.2 g, Glucosa, 0.2 g Sacarosa, y 2.0 g agar bacteriológico. El medio se vació en cajas petri

y se dejó gelificar.

*Medio Agar hojas de clavel (HCA). Se preparó de manera similar al PDA solo que antes

de vaciar el medio, se agregaron piezas de hoja de clavel (esterilizadas por radiación gama)

en las cajas petri.

La resiembra en estos medios se realizó a partir de los cultivos monospóricos obtenidos de

Fusarium sp. Se tomó un fragmento de micelio que se transfirió con la ayuda de un micro

gancho en cajas petri que contenían los diferentes medios de cultivo. Se realizó una réplica

para cada cepa en cada medio de cultivo (Figura 9). Las resiembras se realizaron en una

Figura 8. a) Obtención de la solución para cultivos monospóricos,

b) Ubicación de las esporas individuales germinadas.

25

cámara de flujo laminar en condiciones asépticas, las cuales se incubaron a 23-26°C en

condiciones de luz diaria, durante 7-8 días.

Posteriormente, se realizaron montajes temporales con lactofenol + azul de algodón bajo el

microscopio compuesto en un objetivo de 40x, la identificación de las especies de

Fusarium se basó en las claves de Booth (1971), y Leslie y Summerell (2006).

6.4. Selección de cepas nativas de Trichoderma spp.

Antes de proceder a realizar las pruebas de antagonismo, se escogieron las cepas nativas de

Trichoderma spp., y Fusarium sp., con mayor crecimiento radial (mm), para lo cual se

procedió de la siguiente manera: con la ayuda de un sacabocado, se colocó un disco de

micelio de 5 mm a 1cm del borde de la caja petri (9 cm de diámetro) con medio PDA, rosa

de bengala y ácido láctico al 10% para Trichoderma spp., en las proporciones indicadas en

el apartado 6.2; para el caso de Fusarium sp., el medio de cultivo no incluyó rosa de

bengala (Figura 10). Las cajas sembradas fueron incubadas a 24°C ± 1°C durante 5 días en

la oscuridad. Se tomaron lecturas cada 24 horas por 5 días con la ayuda de un vernier

digital. Para cada cepa se tuvieron tres repeticiones.

Figura 9. Resiembra en medios de cultivo: PDA,

SNA y HCA para la identificación morfológica de

Fusarium sp.

26

Las cepas nativas de Trichoderma spp. y Fusarium sp., que presentaron mayor crecimiento

radial (mm) fueron empleadas para las pruebas de antagonismo posteriores.

6.5. Pruebas de antagonismo in vitro

Se realizaron confrontaciones mediante cultivos duales de ambos organismos en cajas petri

(9 cm de diámetro) con medio de cultivo PDA y ácido láctico al 10% (apartado 6.3),

empleando la metodología utilizada por Bell et al. (1982). Para esto, se tomaron discos de

micelio de 5 mm de diámetro tanto del antagonista como del fitopatógeno, los cuales se

colocaron a 1 cm del borde de la caja petri, con una distancia de aproximadamente 6 cm

uno de otro, incubándolos a 24 ± 1°C durante 3-5 días en condiciones de oscuridad (Figura

11). Para cada tratamiento se tuvieron 5 repeticiones con sus respectivos testigos

(antagonista y patógeno cultivados individualmente). Con la ayuda de un vernier digital se

midió el crecimiento radial (mm) de las colonias cada 24 horas.

Figura 10. a) Obtención de discos de micelio con la ayuda de

un sacabocado, b) Crecimiento radial de Trichoderma spp.

Figura 11. a) Obtención de discos de micelio con la ayuda de un

sacabocado, b) Discos de micelio de Trichoderma spp. vs

Fusarium sp.

27

La inhibición del crecimiento radial de Fusarium sp. se calculó mediante la fórmula:

PICR = (R1 – R2) / R1 x 100

En donde:

PICR = Porcentaje de inhibición del crecimiento radial.

R1= Radio mayor (radio de la colonia del patógeno en el testigo, en mm).

R2=Radio menor (radio de la colonia del patógeno en enfrentamiento con el antagonista en

mm).

Para evaluar el grado de micoparasitismo de la cepas seleccionadas de Trichoderma spp.,

sobre Fusarium sp., los diferentes cultivos duales se evaluaron 10 días después de la

siembra. Se determinó el grado de micoparasitismo con base en la escala propuesta por

Ezziyyani et al., (2004) (Cuadro 2).

6.6. Cinética de crecimiento de Trichoderma spp. y Fusarium sp. en cultivos duales

Se utilizaron los datos de crecimiento radial registrados durante los cinco días de

evaluación en los cultivos duales (Trichoderma spp., contra Fusarium sp., en PDA), a los

Escala Grado de micoparasitismo

0 Ninguna invasión de la superficie de la colonia del

hongo patógeno.

1 Invasión de ¼ de la superficie de la colonia del hongo

patógeno.

2 Invasión de ½ de la superficie de la colonia hongo

patógeno.

3 Invasión total de la superficie de la colonia del hongo

patógeno.

4 Invasión total de la superficie de la colonia del hongo patógeno y

esporulación sobre ella.

Cuadro 2. Escala para determinar el grado de micoparasitismo de Trichoderma spp.

sobre Fusarium sp.

28

cuales se les sumaron dos días adicionales de evaluación (días 6 y 7). Los valores de

crecimiento radial (variable dependiente) a través del tiempo (variable independiente) de

cada antagonista y fitopatógeno durante los siete días, se analizaron en el programa Curve

Expert Professional®, para obtener el modelo de regresión que explicara mejor la respuesta

en crecimiento de la colonia a lo largo del periodo de evaluación; los parámetros

considerados fueron el mayor valor de r2 y menor cuadrado medio del error del modelo. Las

curvas de crecimiento de las colonias de ambos microorganismos se realizaron con el

programa G-numeric Spreadsheet.

6.7. Selección de cepas nativas de Trichoderma spp., con mayor potencial antagónico

Para la selección de las cepas nativas de Trichoderma spp., se tomaron en cuenta los

valores de las pendientes de las curvas en los modelos de regresión, el PICR (Porcentaje de

inhibición del crecimiento radial) sobre el hongo Fusarium sp., y el grado de

micoparasitismo de Trichoderma spp., en cada confrontación antagonista-patógeno.

29

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1. Aislamiento de Trichoderma spp.

Del total de muestras de materiales orgánicos utilizados en la preparación de sustratos para

el cultivo de la nochebuena de interior, se obtuvieron 18 aislamientos de Trichoderma spp.,

provenientes de tres municipios del estado de Morelos: Mazatepec, Zacatepec y Tetela del

Monte. Las muestras y sitios de procedencia se presentan en el Cuadro 3.

Denominación Muestra Procedencia

Trich11 100% Ocochal Zacatepec**

Trich12 100% Ocochal Zacatepec






Trich18 Producto comercial *

Trich19 Producto comercial *

Trich20 Lixiviado de Lombricomposta estiércol ganado

vacuno +50% residuos vegetales. Mazatepec

Trich21 Lombricomposta estiércol ganado vacuno +50%

residuos vegetales. Mazatepec













Trich28 70% Ocochal + 30% tepojal. Tetela del

Monte

Cuadro 3. Denominación y procedencia de los aislamientos de Trichoderma spp.

* Producto comercial: Fithan **Colectada en el Campo experimental Zacatepec del INIFAP, pero

proveniente de Villa del Carbón, Estado de México.

de Villa del Carbón, Estado de México

30

Del total de muestras, ocho aislamientos (Trich20, Trich21, Trich22, Trich23, Trich24,

Trich25, Trich26, Trich27) provinieron del municipio de Mazatepec, siete aislamientos

(Trich11, Trich12, Trich13, Trich14, Trich15, Trich16, Trich17) del Campo Experimental

“Zacatepec” del INIFAP y un aislamiento (T28) de Tetela del Monte.

Guilcapi (2009), menciona que Trichoderma spp. es un hongo que se encuentra en diversos

suelos agrícolas, especialmente los que contienen una mayor cantidad de materia orgánica o

desechos vegetales en descomposición, donde su desarrollo se ve favorecido por la

presencia de grandes densidades de raíces, las cuales son colonizadas rápidamente por estos

hongos. En el presente estudio, todas las muestras se aislaron de materiales orgánicos que

presentaron alto contenido de carbono. Al respecto, Cholango (2009), mencionan que

Trichoderma spp., es capaz de utilizar fuentes de carbono y nitrógeno que le permiten

colonizar diversos sustratos.

7.1.1. Identificación de Trichoderma spp.

Los aislamientos que crecieron en medio de cultivo PDA, presentaron un micelio

algodonoso de color blanco que fue adquiriendo tonalidades verdosas, y en ocasiones un

aspecto de anillos en forma concéntrica.

Las características macroscópicas de las colonias de los diferentes aislamientos se muestran

enseguida en la Figura 12, agrupadas por características similares.

Grupo 1. Trich11 y Trich14. Se caracterizaron por la producción de un micelio algodonoso

de color blanco que adquirió una tonalidad verde en el centro.

Grupo 2. Trich12 y Trich13. Presentaron micelio con tonalidades verdes en toda la colonia.

Grupo 3. Trich15 y Trich17. Presentaron micelio algodonoso de color blanco.

Grupo 4. Trich16 y Trich20. Mostraron un micelio algodonoso de color blanco.

Grupo 5. Trich18 y Trich19. El micelio adquirió tonalidades verdes.

31

Grupo 6. Trich21, Trich22, Trich23, Trich24 y Trich25. El micelio adquirió tonalidades

verdes y dando un aspecto de anillos en forma concéntrica.

De cada aislado de Trichoderma spp., se prepararon muestras de micelio sobre un

portaobjetos con una gota de azul de lactonefol y se observaron al microscopio con una

resolución de 40x. Se pudieron apreciar hifas hialinas, fiálides en forma de matraz y

conidios de diversas formas con tonalidades verdes (Figura 13). Todas las características

macroscópicas y microscópicas mencionadas, concuerdan con lo descrito por Barnet y

Hunter (1978) para el género Trichoderma.

Figura 12. Características macroscópicas de las colonias de Trichoderma spp. en medio de

cultivo PDA con y sin rosa de bengala.

32

7.2. Aislamientos de Fusarium sp.

Se obtuvieron nueve aislamientos de Fusarium sp., del tejido de raíz de plantas de

nochebuena con síntomas de pudrición atribuida al ataque de Fusarium sp. (García et al.

2009), provenientes de diferentes viveros del Campo Experimental de “Zacatepec”. Los

detalles se presentan en el (Cuadro 4).

Denominación Procedencia

A3A Zacatepec

A3B Zacatepec

B1A Zacatepec

B1B Zacatepec

C2A Zacatepec

C2B Zacatepec

C2C Zacatepec

X3A Zacatepec

X3B Zacatepec

Cuadro 4. Denominación y procedencia de

los aislamientos de Fusarium sp.

Figura 13. Características microscópicas de Trichoderma spp.;

a) Hifas hialinas y fiálides en forma de matraz; b) Conidios

elipsoidales, observados en un objetivo de 40 x.

33

Los aislamientos que crecieron en medio de cultivo PDA presentaron las siguientes

características macroscópicas: tonalidades que van de blanco, rosado pálido, anaranjado,

púrpura y micelio algodonoso, pero en algunos casos limoso (Figura 14).

Los aislamientos se agruparon en función de las características similares que presentaron.

Grupo 1. En el aislamiento A3A y A3B se observó un micelio algodonoso con una

coloración rosa y púrpura al centro.

Grupo 2. B1A y la B1B presentaron un micelio algodonoso de color púrpura.

Grupo 3. C2A presentó un micelio color rosa pálido.

Grupo 4. C2B y la C2C un micelio limoso color rosa.

Grupo 5. X3A y X3B el micelio fue limoso y adquirió tonalidades rosa pálido.

Figura 14. Características macroscópicas de las colonias de Fusarium sp. en medio de

cultivo PDA.

34

Estas características macroscópicas concuerdan con lo descrito por Seifert (2002), para

colonias de Fusarium sp.

De cada uno de los aislamientos se obtuvieron cultivos monospóricos siguiendo el

procedimiento descrito en el apartado (6.3.1) del capítulo de Materiales y Métodos.

7.2.1. Identificación morfológica de Fusarium sp.

De las nueve cepas de Fusarium sp. descritas en el apartado (7.3.2), se seleccionaron cuatro

(A3A, B1A, X3B y C2B) para su identificación morfológica; las primeras tres se eligieron

en función del crecimiento radial (mm) presentado, mientras que la última se seleccionó en

base a la alta patogenicidad, detectada en bioensayos paralelos.

Las cuatro cepas seleccionadas que fueron resembradas en los tres medios de cultivo

descritos en materiales y métodos (apartado 6.3.1), presentaron las siguientes características

macroscópicas en los diferentes medios de cultivo (Figura 15).

PDA. (Agar papa dextrosa). Las cepas A3A, B1A, X3B presentaron una tonalidad rosa y

violeta al centro, mientras que la C2B mostró una coloración rosa. En este medio de cultivo

fue muy notable la intensidad de pigmentación del micelio de todas las cepas.

SNA. (Medio Spezieller Nährstoffmmarmer Agar). Las cuatro cepas presentaron un micelio

algodonoso sin coloración.

HCA. (Agar hoja clavel). Las cuatro cepas también presentaron un micelio algodonoso sin

coloración.

35

En cuanto a las características microscópicas, en las cuatro cepas se presentaron

macroconidios de diferente tamaño en el medio de cultivo SNA, en comparación con lo

observado en el medio de cultivo HCA, en donde se apreciaron macroconidios más

uniformes, así como la presencia de 3 septos y clamidosporas (Figura 16).

En PDA, solo se observó la pigmentación que adquiere el medio de cultivo. El micelio fue

abundante con una pigmentación de rosa a violeta.

Con base en estas observaciones se determinó que las cuatro cepas (A3A, B1A, C2B y

X3B) corresponden a la especie de Fusarium oxysporum. Las características macroscópicas

Figura 15. Características macroscópicas de las cepas A3A, B1A, C2B y X3B de Fusarium sp. en

los medios de cultivo PDA, SNA y HCA.

36

y microscópicas descritas, concuerdan con las claves de Booth (1971), y Leslie y

Summerell (2006), para la identificación de las especies de Fusarium.

.

En relación con lo anterior, López y López (2004), demostraron que la mejor expresión de

los caracteres morfológicos útiles para la identificación de las especies de Fusarium, se

logra en el medio HCA ya que se observa una mayor producción de clamidosporas y

macroconidios bien definidos; seguido del SNA donde se aprecian macroconidios

diferentes en longitud, y con poca diferenciación en la célula basal y apical en comparación

con el medio HCA. Finalmente, en el medio de cultivo PDA resulta más adecuado el

estudio de caracteres culturales.

7.3. Selección de cepas nativas de Trichoderma spp. y Fusarium sp., para las pruebas

de antagonismo

7.3.1. Trichoderma spp.

Se seleccionaron nueve cepas de Trichoderma spp., de las 18 obtenidas, tomando como

base las que presentaron mayor crecimiento radial (mm) (Cuadro. 5).

Figura 16. Características morfológicas de Fusarium oxysporum, a)

Clamidosporas, b) Macroconidios con 3 septos observados en

objetivo de 40x.

37

Cepa Crecimiento radial (mm)

*Trich24 8.48

*Trich21 8.44

*Trich20 8.28

*Trich11 8.21

*Trich16 8.19

*Trich28 8.11

*Trich25 7.81

*Trich12 7.75

**Trich18 (producto comercial) 7.61

Trich22 7.46

Trich23 7.34

Trich14 7.23

Trich26 6.8

Trich27 6.73

Trich17 6.09

Trich13 3.61

Trich15 3.61

** Trich19 (producto comercial) 0.21

Todas la cepas de Trichoderma spp. tuvieron radios de crecimiento superior al de los

aislamientos del patógeno, a excepción de la Trich19 (cepa comercial) que presentó un

valor de 0.21 mm. Sin embargo, las cepas Trich 24, Trich21, Trich20, Trich11, Trich16,

Trich28, Trich25, Trich12, Trich18 fueron las que presentaron un mayor crecimiento radial

(mm) con valores de 8.48, 8.44, 8.28, 8.21, 8.19, 8.11, 7.81, 7.75, respectivamente.

Se seleccionaron tres cepas (Trich11, Trich12, Trich16) provenientes del Campo

Experimental “Zacatepec”, cuatro cepas (Trich20, Trich21, Trich24, Trich25) provenientes

de Mazatepec y una cepa (Trich28) de Tetela del Monte.

Cabe resaltar que no hubo diferencias entre las medias de las cepas seleccionadas de

Trichoderma spp, ya que la selección se dio en un rango de 8.48 y 7.61 mm., debido a que

*Cepas seleccionadas **Producto comercial (Fithan®

)

Cuadro 5. Crecimiento radial de los antagonistas al quinto de día

evaluación.

38

la mayoría de las cepas de Trichoderma spp., mostraron un crecimiento micelial radial

rápido.

7.3.2. Fusarium oxysporum.

Inicialmente se seleccionaron cuatro cepas que presentaron mayor crecimiento radial (mm),

pero después se incluyó la cepa C2B, ya que se detectó alta patogenicidad en bioensayos

paralelos.

Todas las cepas del patógeno presentaron radios de crecimiento inferiores al de los

aislamientos de los antagonistas, a excepción de la cepa C2A que presentó un valor

significativo de 0.95 mm, mayor al de la cepa Trich19 (producto comercial) que creció 0.21

mm radialmente (Cuadro 6).

*Cepas seleccionadas **Cepa incluida por mostrar alta patogenicidad en bioensayos paralelos.

Cabe resaltar que no hubo muchas diferencias significativas entre la media de cada cepa de

Fusarium sp., ya que la selección se dio en un rango de 2.80 a 1.88 mm, debido al lento

crecimiento que presenta Fusarium sp.

Cepa Crecimiento radial (mm)

*X3B 2.8

*A3A 2.65

*B1A 2.4

*C2C 1.98

**C2B 1.88

A3B 1.84

B1B 1.41

X3A 1.3

C2A 0.95

Cuadro 6. Crecimiento radial de los patógenos al quinto día de evaluación.

39

7.4. Pruebas de antagonismo

Los tratamientos que corresponden a las confrontaciones entre las nueve cepas de

Trichoderma spp. contra las cinco cepas de Fusarium sp. se muestran en el Cuadro 7.

7.4.1. Determinación del porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR).

El porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) en las cinco cepas de Fusarium

oxysporum fue diferente en cada combinación con las cepas antagonistas (Cuadro 8). En la

cepa A3A vario de un 17.5 a 47.1%, en la cepa B1A de un 20.9 a 55%, para la cepa C2C de

19 a 53.8%, en la X3B de un 14.1 a 52.6% y para la C2B de un 15.1 a 44.2%.

Tratamiento Trichoderma spp. Fusarium sp. Tratamiento Trichoderma spp. Fusarium sp.

1 Trich11 A3A 24 Trich21 C2C




5 Trich20 A3A 28 Trich11 X3B





10 Trich11 B1A 33 Trich21 X3B




14 Trich20 B1A 37 Trich11 C2B





19 Trich11 C2C 42 Trich21 C2B




23 Trich20 C2C

Cuadro 7. Tratamientos de interacción entre Trichoderma spp. vs Fusarium sp.

40

Día 5 de evaluación

A3A B1A C2C X3B C2B

Trat.* (%)** Trat. (%) Trat. (%) Trat. (%) Trat. (%)

8 47.1 16 55 25 53.8 33 52.6 43 44.2

7 41.9 17 51 24 47.4 29 38.2 42 41.7

5 41 13 46.8 23 43.6 34 37.5 41 40

4 32.4 14 44.8 26 41.4 35 35.3 38 33.7

6 27.2 11 43.2 20 27.2 32 30.4 39 32.7

2 27.1 15 40 21 26.6 28 28.9 44 30.3

3 24.9 10 26.5 22 24.8 36 20.3 37 29.8

9 19.2 12 24.3 27 22.3 30 18 40 27.1

1 17.5 18 20.9 19 19 31 14.1 45 15.1

Media 30.9 39.2 34.1 30.6 32.7

* Tratamiento **Porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR).

Los mayores porcentajes de inhibición en el crecimiento radial (mm) en la cepa A3A, se

obtuvieron con la cepa Trich25 (tratamiento 8) con 47.1% y la Trich24 (tratamiento 7) con

41.9%. Para la cepa B1A, la Trich24 (tratamiento 16) con 55% y la cepa Trich25

(tratamiento 17) con 51%. En la cepa C2C nuevamente se presenta la Trich24 (tratamiento

25) alcanzando 53.8% y la Trich21 (tratamiento 24) con un 47.4%. En la X3B, la Trich21

(tratamiento 33) con 52.6%. Finalmente en la C2B, la Trich 24 alcanzo un porcentaje del

44.2% (tratamiento 43) y en la cepa Trich21 (tratamiento 42) alcanzó un 41.7%.

Las cepas Trich21, Trich24 y la Trich25 sobresalieron en cada confrontación, ya que

lograron inhibir de 41.7 a 55% en el crecimiento radial (mm) de las cepas de Fusarium sp.

(A3A, B1A, C2B, X3B y C2B). En un trabajo similar, Michael-Aceves y colaboradores

(2009), reportan porcentajes que varían de 5.3 a 42% para Fusarium subglutinans y de 41.9

a 62.9% en Fusarium oxysporum. Las diferencias entre ambos estudios pueden deberse, a la

especie de Trichoderma al sitio de procedencia y a la capacidad de inhibir el crecimiento

del fitopatógeno.

Cuadro 8. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de las cepas A3A, B1A, C2C,

X3B y C2B por las cepas de Trichoderma spp. al quinto día de evaluación.

41

En relación a la capacidad de inhibir, esta habilidad se debe a la excreción de metabolitos al

medio de cultivo, siendo diferente en cada especie de Trichoderma spp. Cooneg y

colaboradores (1997), señalan que cada cepa en particular, puede producir diferentes

metabolitos con efectos fungistáticos y enzimas líticas que le permite al antagonista

delimitar el crecimiento del fitopatógeno. Entre mayor sea la cantidad de producción de

metabolitos o enzimas líticas por las cepas de Trichoderma, se incrementa de la posibilidad

de inhibir el crecimiento del micelio de las cepas de Fusarium sp. En el caso de las cepas

Trich21, Trich24, Trich 25, la producción fue mayor en comparación con las otras cepas de

Trichoderma spp. que presentaron porcentajes menores. En la mayoría de los tratamientos

se pudo observar un tipo de halo que limita el crecimiento del hongo fitopatógeno.

El promedio de los PICR de todas la cepas de Trichoderma spp., frente a cada cepa de

Fusarium sp. correspondiente, arrojó datos que demostraron que la X3B fue la menos

inhibida con 30.6%, seguido de la A3A con 30.9% y finalmente la cepa C2B con 32.7%. La

última cepa mostró alta patogenicidad en bioensayos paralelos y este resultado demuestra

que también fue de las menos inhibidas. Estos resultados pudieran deberse a que en la pared

de Fusarium, se encuentra una capa externa de glicoproteínas que cubren a la capa interna,

compuesta de quitina y glucanos; de esta forma es un poco más resistente a la actividad de

las quitinasas de Trichoderma (Shoffelmeer et al.,1999).

7.5. Cinética de crecimiento

A través del análisis de regresión se obtuvieron modelos con alto grado de ajuste. El

análisis de regresión permitió proyectar la ecuación más confiable. Los parámetros

considerados fueron el valor de r2 y cuadrado medio del error del modelo (CME). El

coeficiente de determinación (r2) calculado a partir de la regresión, indica la respuesta del

crecimiento de la colonia a lo largo del periodo. A medida que el r2 se acercó a 1 y el CME

fue más pequeño, la ecuación fue más confiable.

7.5.1. Trichoderma spp. vs Fusarium sp. (cepa A3A).

Todas las cepas de Trichoderma spp., y la cepa de Fusarium sp., mostraron un r2

≥0.92,

indicando que la respuesta en crecimiento es explicada en gran medida por el tiempo de

incubación; demostrando que estas ecuaciones son confiables para cada antagonista y el

42

fitopatógeno. La ecuación que se presentó para todas las cepas de Trichoderma spp. fue:

a*bx*x

c mientras que para la cepa de Fusarium sp. fue: (a*b+c*x

d) / (b+x

d). En la Figura 17

se muestra la velocidad de crecimiento de Trichoderma spp., en presencia de la cepa A3A

de Fusarium sp.

Las nueve cepas de Trichoderma spp., presentaron un crecimiento exponencial desde el día

1, en comparación con la cepa A3A, que mostró un crecimiento lento, con datos inferiores a

los obtenidos por las cepas de Trichoderma spp. La dispersión de los datos fue diferente en

cada cepa de Trichoderma spp., durante los siete días de evaluación; en la Trich11,

Trich16, Trich18 y Trich20 fue en los últimos tres días, ya que el crecimiento del

fitopatógeno aumentó significativamente en dirección hacia las cepas de Trichoderma spp.

En las cepas Trich21, Trich24 y Trich25 se presenta una mayor dispersión de los datos

entre el día 4 y 5 de evaluación; se observó un incremento en el desarrollo de estas cepas en

dirección hacia el fitopatógeno. Este acelerado crecimiento, influyó en el crecimiento de la

A3A; disminuyendo su desarrollo en comparación con las otras cepas de Trichoderma spp.;

este mismo resultado también lo presentó la cepa Trich12. El mayor crecimiento de la A3A

lo alcanzó en la cepa Trich28; esta cepa mostró un crecimiento lento en comparación con la

otras cepas de Trichoderma spp., lo que permitió un mayor desarrollo del fitopatógeno a los

obtenidos frente a todas la cepas de Trichoderma spp.

7.5.2. Trichoderma spp. vs Fusarium sp. (cepa B1A).

Al igual que en el enfrentamiento de Trichoderma spp., contra la A3A, todas las cepas de

Trichoderma spp., y la de Fusarium sp., mostraron un r2

≥0.92, probando que la varianza

del crecimiento es explicada por el tiempo de incubación y demostrando la confiabilidad de

la ecuación. Para las cepas de Trichoderma spp., la ecuación más sobresaliente fue:

a*b(1/x)

*xc; mientras que para B1A fue: (a*b+c*x

d) / (b+x

d). En la Figura 18 se muestra la

velocidad de crecimiento de Trichoderma spp., en presencia de la cepa B1A de Fusarium

sp.

Todas las cepas de Trichoderma spp., presentaron un crecimiento exponencial desde el

primer día de evaluación, en comparación con la cepa B1A de Fusarium sp., que mostro un

crecimiento lento con datos menores a los alcanzados por las cepas de Trichoderma spp.,

43

durante los siete días de evaluación en los cultivos duales. La dispersión de los datos fue

diferente en cada cepa de Trichoderma spp., durante los siete días de evaluación. Fue

mayor en los últimos tres días para la Trich16, ya que el crecimiento del fitopatógeno

aumentó significativamente en dirección hacia las cepas de Trichoderma spp., y en la

Trich24 y Trich28 durante los primeros días. El mayor crecimiento de la B1A lo alcanzo en

la Trich28; esta cepa mostro un crecimiento lento en comparación con la otras cepas de

Trichoderma spp., lo que permitió un mayor desarrollo del fitopatógeno a los obtenidos

frente a todas la cepas de Trichoderma spp.

7.5.3. Trichoderma spp. vs Fusarium sp. (cepa C2C).

Como en los enfrentamientos anteriores, las cepas de Trichoderma spp. y la de Fusarium

sp., mostraron un r2

≥0.92, indicando que la varianza del crecimiento es explicada por el

tiempo de incubación; demostrando que estas ecuaciones son confiables para cada

antagonista y el fitopatógeno. La ecuación más destacada en Trichoderma spp., fue:

a*b(1/x)

*xc, mientras que la C2C fue: (a*b+c*x

d) / (b+x

d). En la Figura 19 se muestra la

velocidad de crecimiento de Trichoderma spp., en presencia de la cepa C2C de Fusarium

sp.

Todas las cepas del antagonista presentaron un crecimiento exponencial desde el día 1 en

que fueron incubadas, en comparación con la C2C que mostró un crecimiento lento durante

la evaluación. La dispersión de los datos fue diferente en cada cepa de Trichoderma spp. En

las cepas Trich11, Trich20, Trich21, Trich24 y Trich25 la dispersión de los datos fue menor

y el crecimiento del fitopatógeno aumentó significativamente en dirección hacia las cepas

de Trichoderma spp. En la Trich12 y Trich18 se empezó a mostrar una menor dispersión a

partir del cuarto día. En la Trich16 la dispersión aumento desde el día 3. El mayor

crecimiento de la C2C fue nuevamente frente a Trich28.

44

Figura 17. Crecimiento radial de las nueve cepas de Trichoderma spp. en competencia con la

cepa A3A de Fusarium sp.

45

Continuación de Figura 17.

46


cepa B1A de Fusarium sp.

47

Continuacion de Figura 18.

48


cepa C2C de Fusarium sp.

49

Continuacion de Figura 19.

50

7.5.4. Trichoderma spp. vs Fusarium sp. (cepa X3B).

Las nueve cepas de Trichoderma spp., y la de Fusarium sp. (X3B) mostraron un r2

≥0.92,

indicando que la varianza del crecimiento es explicada por el tiempo de incubación y

señalando que estas ecuaciones son confiables para cada antagonista y el fitopatógeno. La

ecuación más sobresaliente para Trichoderma spp., fue: a*b(1/x)

*xc, mientras que para la

X3B fue: 1/(a+b*xc). En la Figura 20 se muestra la velocidad de crecimiento de

Trichoderma spp., en presencia de la cepa X3B de Fusarium sp.

Todas las cepas de Trichoderma spp., presentaron un crecimiento exponencial desde el

primer día de evaluación, a diferencia de la X3B, al mostrar un crecimiento lento durante

toda la evaluación. La dispersión de los datos fue diferente en cada cepa de Trichoderma

spp. Las cepas Trich12, Trich20, Trich21, Trich24 y Trich25 presentan un mayor

crecimiento radial (mm) a partir del segundo día. Mientras que la X3B de Fusarium sp.,

obtuvo un mayor crecimiento en la Trich28, a partir de ahí su crecimiento aumento

significativamente en comparación con la otras cepas de Trichoderma spp.

7.5.5. Trichoderma spp. vs Fusarium sp. (cepa C2B).

En esta cepa, el crecimiento radial (mm) se evaluó durante cinco días. De la misma forma

que en los enfrentamientos anteriores, todas las cepas de Trichoderma spp. y la de

Fusarium sp., mostraron un r2≥0.92, indicando que la varianza del crecimiento es explicada

por el tiempo de incubación; demostrando que estas ecuaciones son confiables para cada

antagonista y el fitopatógeno. La ecuación más sobresaliente para Trichoderma spp., fue:

a*bx*x

c y para la C2B fueron: (a*b+c*x

d) / (b+x

d) y a*exp (b/x). En la Figura 21 se muestra

la velocidad de crecimiento de Trichoderma spp., en presencia de la cepa C2B de Fusarium

sp.

Todas las cepas del antagonista presentaron un crecimiento exponencial desde el primer

día, en comparación con la C2B en los cultivos duales. La dispersión de los datos fue

diferente en cada cepa de Trichoderma spp., durante los cinco días de evaluación. En las

cepas Trich18 y Trich28 la dispersión es mayor desde el segundo día, los datos son

menores a medida que pasa el tiempo, a diferencia de las otras cepas. Las demás cepas

(Trich11, Trich12, Trich16, Trich20, Trich21, Trich24 y la Trich25) muestran menor

51

dispersión en sus datos y el crecimiento de la cepa C2B en cada una de ellas aumenta de

manera significativa.

De manera general, el análisis de regresión demostró que la ecuación más sobresaliente

para Trichoderma spp. fue: a*b(1/x)

*xc con un r

2≥0.92 y para Fusarium sp., fue: (a*b+c*x

d) /

(b+xd) con un r

2≥0.96. Los diferentes modelos que presentaron tanto Trichoderma spp.

como Fusarium sp., se le puede atribuir al diferente crecimiento de cada cepa del

antagonista frente a los fitopatógenos y viceversa. Se puede observar que el crecimiento

radial (mm) aumenta a medida que pasa el tiempo de evaluación, dicho aumento, va

acompañado de la destrucción del micelio del fitopatógeno y la producción de esporas.

La actividad de los antagonistas frente a las cepas de Fusarium (A3A, B1A, C2C, X3B y

C2B) es el resultado de la competencia por sustrato y nutrientes que impiden el desarrollo

de los fitopatógenos. La presencia de otro hongo frente a Trichoderma spp., en algunas

ocasiones, acelera su crecimiento, como en el caso de las cepas Trich12, Trich21, Trich24 y

Trich25. Este aceleramiento probablemente se debe a la estimulación que recibe el

antagonista al reconocer las lectinas unidas al fitopatógeno (Rocha-Ramírez et al., 2002).

52


cepa X3B de Fuarium sp.

53


54


cepa C2B de Fusarium sp.

55


56

7.6. Micoparasitismo

Las cepas de Trichoderma spp., fueron clasificadas de acuerdo al grado de micoparasitismo

que obtuvieron a los 10 días después de la siembra frente a las cepas de Fusarium sp.

(A3A, B1A, C2C, X3B y C2B) en los cultivos duales (Cuadro 9).

*Tratamiento

Se utilizó la escala de Ezziyyani et al., (2004), que establece el grado de micoparasitismo

de Trichoderma spp. sobre Fusarium sp. Se determinó que la cepa comercial Trich18

(tratamientos 4, 13, 22, 31 y 40) obtuvo el grado de micoparasitismo 4, el más alto, frente a

las cinco cepas de Fusarium sp., al igual que la cepa Trich20 (tratamiento 32 y 41) frente a

las cepa X3B y C2B. Estas cepas cubrieron totalmente la superficie del micelio de

Fusarium sp. y además esporulan sobre él. Entre las cepas que alcanzaron el grado de

micoparasitismo 3, se encuentran la cepa Trich20 (tratamiento 5,14 y 23) frente A3A, B1A

y C2C; al igual que la cepa Trich16 (tratamiento 21, 28 y 37) frente a la C2C, X3B y C2B.

Estas cepas lograron cubrir la superficie del hongo, pero no esporular sobre él. Solo dos

cepas (Trich11 y Trich16) lograron presentar un grado de micoparasitismo 2 (tratamiento 1

y 3) sobre la A3A, al cubrir la mitad de la superficie. Las cepas que presentaron grado de

micoparasitismo 1 fueron la cepa Trich11 (tratamiento 10 y 19) frente a B1A y C2C; al

Día 10 de evaluación

A3A B1A C2C X3B C2B

Trat.* Escala Trat. Escala Trat. Escala Trat. Escala Trat. Escala

4 4 13 4 22 4 31 4 40 4

5 3 14 3 21 3 32 4 41 4

1 2 10 1 23 3 28 3 37 3

3 2 11 1 19 1 30 3 39 3

2 0 12 0 20 0 29 1 45 1

6 0 15 0 24 0 36 1 38 0

7 0 16 0 25 0 33 0 42 0

8 0 17 0 26 0 34 0 43 0

9 0 18 0 27 0 35 0 44 0

Cuadro 9. Grado de micoparasitismo de los tratamientos correspondientes a los cultivos

duales de Trichoderma spp. y Fusarium sp. al décimo día de evaluación.

57

igual que la cepa Trich12 (tratamiento 11 y 29) frente a B1A y X3B y la cepa Trich28

(Tratamiento 36 y 45) frente a C2B y X3B. Estas cepas llegaron a cubrir el 25% de la

superficie de Fusarium sp. (Figura 22 a la 26).

Los resultados obtenidos demostraron que la cepa comercial Trich18 presentó un grado de

micoparasitismo 4 frente a todas las cepas de Fusarium sp. (A3A, B1A, C2C, X3B y C2B),

pero la Trich20 obtuvo grados de micoparasitismo 4 y 3 frente a todas las cepas de

Fusarium sp. La cepa Trich16 alcanzó diferentes grados de micoparasitismo 1, 2, 3 contra

todas las cepas de Fusarium sp., al igual que la cepa Trich11. Resultados similares son

reportados por Solano (2004), al evaluar 3 cepas de Trichoderma spp. en cultivos duales

contra Fusarium oxysporum y Fusarium subglutinans; en ambas evaluaciones se obtuvo un

grado de micoparasitismo 2, mientras que Michael-Aceves et al.,(2001), reportaron

diferentes grados de micoparasitismo 1, 2 y 3 en estas dos especies con buenas perspectivas

para ser utilizados en campo.

De esta manera se observó el proceso de control de cada cepa de Trichoderma spp., sobre el

desarrollo de las cinco cepas de Fusarium sp. Con el transcurso del tiempo se observó un

ataque del antagonista al fitopatógeno. Las cepas de Trichoderma spp., continuaron

creciendo hasta invadir totalmente la superficie del fitopatógeno e incluso esporular sobre

él; estos efectos pueden estar relacionados con la abundante producción de enzimas como

quitinasas, glucanasas, celulasas y proteasas por parte de las cepas de Trichoderma, y que

son un componente importante en el proceso del micoparasitismo (De la Cruz et al., 1992;

Goldman et al., 1994).

58

Figura 22. Cultivos duales de las 9 cepas de Trichoderma spp. sobre la cepa A3A de Fusarium sp.

59

.

Figura 23. Cultivos duales de las 9 cepas de Trichoderma spp. sobre la cepa B1A de Fusarium sp.

60

Figura 24. Cultivos duales de las 9 cepas de Trichoderma spp. sobre la cepa de C2C de Fusarium sp.

61

Figura 25. Cultivos duales de las 9 cepas de Trichoderma spp. sobre la cepa X3B de Fusarium sp.

62

Figura 26. Cultivos duales de las 9 cepas de Trichoderma spp. sobre la cepa C2B de Fusarium sp.

63

7.7. Antibiosis

Trichoderma spp., secreta metabolitos secundarios que al entrar en contacto con Fusarium

sp. detienen su crecimiento. Este mecanismo se pudo observar en la cepa Trich20 frente a

las cinco cepas de Fusarium sp. (A3A, B1A, C2C, X3B y C2B), observándose un cambio

de pigmentación del medio de cultivo PDA por un color amarillento (Figura 27). Elad y

Kapat (1999), y Fravel (1998), señalan que algunos metabolitos producidos por

Trichoderma spp. son la viridina o gliotoxina; estos degradan la pared celular del

fitopatógeno y disminuyen los niveles de enfermedad.

7.8. Selección de cepas nativas de Trichoderma spp., con mayor potencial antagónico.

Como se observó anteriormente en la cinética de crecimiento de Trichoderma spp., las

nueve cepas mostraron un crecimiento radial (mm) rápido durante los siete días de

evaluación en cultivos duales. Las cepas Trich12, Trich21, Trich24 y Trich25 mostraron un

acelerado crecimiento radial (mm) frente a las 5 cepas del fitopatógeno (A3A, B1A, C2C,

X3B y C2B); estas tres últimas que pertenecen al municipio de Mazatepec, fueron capaces

de inhibir de un 41 a 54% el crecimiento del micelio de las cinco cepas de Fusarium., pero

mostraron grado 0 de micoparasitismo al décimo día de evaluación, al no cubrir la

superficie del fitopatógeno. Si bien no logran crecer sobre el fitopatógeno, consiguen

Figura 27. Antibiosis en la cepa Trich20 frente a las cinco

cepas de Fusarium sp.

64

disminuir su desarrollo con respecto a las demás cepas de Trichoderma spp. La

competencia por sustrato y nutrientes, es una manera de ejercer biocontrol, al reducir o

detener completamente el desarrollo del micelio (Dennis y Webster, 1971).

Las cepas Trich11, Trich16, Trich18, Trich20 mostraron un crecimiento normal durante los

siete días de evaluación, de esta forma los porcentajes de inhibición que presentaron fueron

regulares. La cepa comercial Trich18 presentó un grado de micoparasitismo 4 frente a todas

las cepas de Fusarium sp. (A3A, B1A, C2B, C2C y X3B) pero la cepa Trich20,

proveniente del municipio de Mazatepec obtuvo 4 y 3 grados de micoparasitismo frente a

todas las cepas de Fusarium sp; además de presentarse la antibiosis en ella. La cepa

Trich16 alcanza grados de micoparasitismo 1, 2, 3 contra todas las cepas de Fusarium sp.,

al igual que la cepa Trich11. Estas dos últimas cepas provienen del Campo Experimental

“Zacatepec” del INIFAP. Finalmente, la cepa Trich28 presentó un crecimiento lento en

comparación con las demás cepas de Trichoderma spp; esto produjo un menor porcentaje

de inhibición radial (mm), y solo alcanzó el grado de micoparasitismo 1 frente a 2 cepas

(C2B y X3B), el resto presento grado 0 de micoparasitismo frente a las cepas de Fusarium

sp. restantes. En estas confrontaciones, el fitopatógeno creció un poco más con respecto a

las otras cepas de Trichoderma spp., determinando que el uso de esta cepa no es adecuada

como agente de biocontrol.

La habilidad de Trichoderma spp. para reducir los daños generados por hongos

fitopatógenos, está relacionada con su capacidad de competencia, de antibiosis y

micoparasitismo. Las enzimas líticas producidas por las cepas de Trichoderma spp. son las

responsables de la inhibición in vitro; la producción de estas enzimas, también participan en

el micoparasitismo y contribuyen al control biológico (Dennis y Webster, 1971; Michael-

Aceves et al., 2005). En base a esto, las cepas seleccionadas fueron la Trich21, Trich24 y la

Trich 25, por presentar los mayores porcentajes de inhibición. Mientras que las cepas

Trich11, Trich16, Trich18 y Trich20 alcanzaron grados de micoparasitismo 1, 2, 3 y 4 y

antibiosis en esta última.

65

8. CONCLUSIÓN

Se obtuvieron 18 cepas nativas de Trichoderma spp., aisladas de componentes orgánicos

pertenecientes a tres municipios del estado de Morelos.

De los nueve aislamientos de Fusarium sp., se identificaron 4 cepas (A3A, B1A, C2B y

X3B) que corresponden a la especie Fusarium oxysporum.

El crecimiento de las diferentes cepas de Trichoderma spp. se explicaron con el modelo de

regresión: a*b(1/x)

*xc ,con alto nivel de ajuste (r² ≥0.92), en el caso de las cepas de Fusarium

sp. el modelo de regresión fue :(a*b+c*xd) / (b+x

d) con un nivel de ajuste (r² ≥0.96).

Se seleccionaron 6 cepas (Trich11, Trich16, Trich20, Trich21, Trich24 y Trich25), además

de la comercial (Trich18) de Trichoderma spp., con mayor potencial antagónico, al

presentarse los mecanismos de acción: competencia por sustrato y nutrientes, antibiosis y

micoparasitismo, los cuales actúan de manera sinérgica. Estos resultados in vitro indican

que las cepas de Trichoderma spp., son una importante alternativa para el control biológico

de la pudrición de la raíz de nochebuena.

66

9. PERSPECTIVAS

Es necesario realizar estudios in vivo para evaluar el comportamiento de las cepas de

Trichoderma spp., frente a las condiciones ambientales y determinar si dichos mecanismos

continúan operando. De esta manera constituirían una alternativa para el control biológico

de la pudrición de la raíz de nochebuena.

Realizar el análisis molecular para la identificación de las cepas seleccionadas (Trich11,

Trich16, Trich20, Trich21, Trich24, Trich25, y Trich18).

67

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