etude des effets du filtrat filtré d’ascochyta rabiei (pass.) lab....

Mémoire

Pour l’obtention du Diplôme

De Magister en Biologie

Option : Microbiologie

Intitulé : l’utilisation des outils de la biotechnologie pour la sélection

Des plantes résistantes

Etude des effets du filtrat filtré d’Ascochyta rabiei (Pass.) Lab. sur des cals de pois chiche Cicer arietinum L .

Présenté par : Melle ADDI Nesrine

Devant la commission d’examen : Soutenu le Président : Mr HADJADJ AOUL Seghir Professeur à l’Université d’Oran

Examinateur : Mr BELAHCENE Miloud Professeur à l’Université de Mostaganem

Examinateur : Mme IGHILHARIZ Zohra Maitre de conférences à l’Université d’Oran

Encadreur : Melle BOUABDALAH Louiza Maitre de conférences à l’Université d’Oran

RRRRRRRReeeeeeeemmmmmmmmeeeeeeeerrrrrrrrcccccccciiiiiiiieeeeeeeemmmmmmmmeeeeeeeennnnnnnnttttttttssssssss

Ce travail a été réalisé au laboratoire de Microbiologie ainsi qu’au Ce travail a été réalisé au laboratoire de Microbiologie ainsi qu’au Ce travail a été réalisé au laboratoire de Microbiologie ainsi qu’au Ce travail a été réalisé au laboratoire de Microbiologie ainsi qu’au

laboratoire de biologie végétale (Département de biologie, faculté des laboratoire de biologie végétale (Département de biologie, faculté des laboratoire de biologie végétale (Département de biologie, faculté des laboratoire de biologie végétale (Département de biologie, faculté des

sciences, Université d’Oran Essciences, Université d’Oran Essciences, Université d’Oran Essciences, Université d’Oran Es----Senia) sous la direction du Docteur Senia) sous la direction du Docteur Senia) sous la direction du Docteur Senia) sous la direction du Docteur

BOUABDALBOUABDALBOUABDALBOUABDALLLLLAH Louiza (Maitre de conférences à l’Université d’Oran EsAH Louiza (Maitre de conférences à l’Université d’Oran EsAH Louiza (Maitre de conférences à l’Université d’Oran EsAH Louiza (Maitre de conférences à l’Université d’Oran Es----

Senia), à qui j’exprime mes sincères remerciements pourSenia), à qui j’exprime mes sincères remerciements pourSenia), à qui j’exprime mes sincères remerciements pourSenia), à qui j’exprime mes sincères remerciements pour son dévouement et son dévouement et son dévouement et son dévouement et

les conseils éclairés, les conseils éclairés, les conseils éclairés, les conseils éclairés, les eles eles eles encouragements qu’elle n’a cesséncouragements qu’elle n’a cesséncouragements qu’elle n’a cesséncouragements qu’elle n’a cessé de me prodiguer tout de me prodiguer tout de me prodiguer tout de me prodiguer tout

au long de ce travail.au long de ce travail.au long de ce travail.au long de ce travail. Je la rJe la rJe la rJe la remercie également pour tout le savoir qu’elle m’a emercie également pour tout le savoir qu’elle m’a emercie également pour tout le savoir qu’elle m’a emercie également pour tout le savoir qu’elle m’a

apporté durant ce magister.apporté durant ce magister.apporté durant ce magister.apporté durant ce magister.

Je remercie vivement Mme IGHILHARIZ ZohraJe remercie vivement Mme IGHILHARIZ ZohraJe remercie vivement Mme IGHILHARIZ ZohraJe remercie vivement Mme IGHILHARIZ Zohra (Maitre de conférences à (Maitre de conférences à (Maitre de conférences à (Maitre de conférences à

l’Université d’Oran) l’Université d’Oran) l’Université d’Oran) l’Université d’Oran) pour m’avoir permis de travailler au sein de son pour m’avoir permis de travailler au sein de son pour m’avoir permis de travailler au sein de son pour m’avoir permis de travailler au sein de son

laboratoire ainsi que pour tous ses laboratoire ainsi que pour tous ses laboratoire ainsi que pour tous ses laboratoire ainsi que pour tous ses pppprécieux récieux récieux récieux conseils avisés et l’orientation conseils avisés et l’orientation conseils avisés et l’orientation conseils avisés et l’orientation

qu’elle m’a qu’elle m’a qu’elle m’a qu’elle m’a apportéeapportéeapportéeapportée. . . . Je la remercie également pour avoir bien voulu Je la remercie également pour avoir bien voulu Je la remercie également pour avoir bien voulu Je la remercie également pour avoir bien voulu

examiner mon travail.examiner mon travail.examiner mon travail.examiner mon travail.

Il m’est agréable d’exprimer mes vifs remerciements à Monsieur Il m’est agréable d’exprimer mes vifs remerciements à Monsieur Il m’est agréable d’exprimer mes vifs remerciements à Monsieur Il m’est agréable d’exprimer mes vifs remerciements à Monsieur le le le le

Professeur HADJADJ AOUL SeghirProfesseur HADJADJ AOUL SeghirProfesseur HADJADJ AOUL SeghirProfesseur HADJADJ AOUL Seghir qui qui qui qui m’m’m’m’aaaa fait l’honneur de présider le fait l’honneur de présider le fait l’honneur de présider le fait l’honneur de présider le

jury.jury.jury.jury.

Je voudraiJe voudraiJe voudraiJe voudrai également remercier également remercier également remercier également remercier Monsieur le Professeur BELAHCENE Monsieur le Professeur BELAHCENE Monsieur le Professeur BELAHCENE Monsieur le Professeur BELAHCENE

MiloudMiloudMiloudMiloud pour sa participation au jury en examinant mon travail.pour sa participation au jury en examinant mon travail.pour sa participation au jury en examinant mon travail.pour sa participation au jury en examinant mon travail.

Mes Mes Mes Mes sincères remerciements àsincères remerciements àsincères remerciements àsincères remerciements à Mme Mme Mme Mme BENBAIR ZOUBIDA pour sa BENBAIR ZOUBIDA pour sa BENBAIR ZOUBIDA pour sa BENBAIR ZOUBIDA pour sa

mobilisation et toute l’mobilisation et toute l’mobilisation et toute l’mobilisation et toute l’’’’’aide aide aide aide et le soutient qu’elle m’a apporté tout au long de et le soutient qu’elle m’a apporté tout au long de et le soutient qu’elle m’a apporté tout au long de et le soutient qu’elle m’a apporté tout au long de

ce travail.ce travail.ce travail.ce travail.

Je tiens aussi à remercier Monsieur MAAROUF ABDERREZAKJe tiens aussi à remercier Monsieur MAAROUF ABDERREZAKJe tiens aussi à remercier Monsieur MAAROUF ABDERREZAKJe tiens aussi à remercier Monsieur MAAROUF ABDERREZAK pour pour pour pour

mmmm’avoir aussi permis de travailler’avoir aussi permis de travailler’avoir aussi permis de travailler’avoir aussi permis de travailler au sein de son laboratoire.au sein de son laboratoire.au sein de son laboratoire.au sein de son laboratoire.

Mes remerciements à tous mes camarades de magisterMes remerciements à tous mes camarades de magisterMes remerciements à tous mes camarades de magisterMes remerciements à tous mes camarades de magister : Djediai Souad, : Djediai Souad, : Djediai Souad, : Djediai Souad,

KKKKadiri Amina, Chakroun Chahinez et Ouzzani Houda.adiri Amina, Chakroun Chahinez et Ouzzani Houda.adiri Amina, Chakroun Chahinez et Ouzzani Houda.adiri Amina, Chakroun Chahinez et Ouzzani Houda.

Mes profonds remerciements vont aussi aux techniciens de laboratoireMes profonds remerciements vont aussi aux techniciens de laboratoireMes profonds remerciements vont aussi aux techniciens de laboratoireMes profonds remerciements vont aussi aux techniciens de laboratoire : : : :

Fatima (laboraFatima (laboraFatima (laboraFatima (laboratoire de biologie végétale), toire de biologie végétale), toire de biologie végétale), toire de biologie végétale), Faiza (laboratoire de BiocFaiza (laboratoire de BiocFaiza (laboratoire de BiocFaiza (laboratoire de Biochimie himie himie himie

appliquée) et Hanane (laboratoire de physiologie animale et appliquée) et Hanane (laboratoire de physiologie animale et appliquée) et Hanane (laboratoire de physiologie animale et appliquée) et Hanane (laboratoire de physiologie animale et nutrition).nutrition).nutrition).nutrition).

Je tiens à adresser un hommage à la mémoire de Mme KHOUAIDJIA Je tiens à adresser un hommage à la mémoire de Mme KHOUAIDJIA Je tiens à adresser un hommage à la mémoire de Mme KHOUAIDJIA Je tiens à adresser un hommage à la mémoire de Mme KHOUAIDJIA

MALIKA enseignante à l’université d’Oran.MALIKA enseignante à l’université d’Oran.MALIKA enseignante à l’université d’Oran.MALIKA enseignante à l’université d’Oran.

C’est C’est C’est C’est grâcegrâcegrâcegrâce a Dieu le tout puissant qui m’a donné le a Dieu le tout puissant qui m’a donné le a Dieu le tout puissant qui m’a donné le a Dieu le tout puissant qui m’a donné le couragecouragecouragecourage

et la volonté et la volonté et la volonté et la volonté d’d’d’d’achever ce modeste travail que Je dédieachever ce modeste travail que Je dédieachever ce modeste travail que Je dédieachever ce modeste travail que Je dédie ::::

A Mes tendres parents que j’adoreA Mes tendres parents que j’adoreA Mes tendres parents que j’adoreA Mes tendres parents que j’adore

Mon adorable petite sœur IKRAMMon adorable petite sœur IKRAMMon adorable petite sœur IKRAMMon adorable petite sœur IKRAM

Mes grands parents et mes cousinsMes grands parents et mes cousinsMes grands parents et mes cousinsMes grands parents et mes cousins

Ainsi qu’à Ainsi qu’à Ainsi qu’à Ainsi qu’à tous ceux qui me sont cherstous ceux qui me sont cherstous ceux qui me sont cherstous ceux qui me sont chers

Nesrine ADDINesrine ADDINesrine ADDINesrine ADDI

Résumé

L’anthracnose due à Ascochyta rabiei est une maladie du pois chiche. Elle peut

affecter toutes les parties aériennes de la plante et entrainer une perte totale de la récolte. Les

moyens de lutte utilisés sont peu efficaces pour son éradication. La recherche d’un autre

moyen de lutte est impérative. Elle se base sur l’étude des interactions hôte-pathogène pour

déterminer les mécanismes de défense de l’hôte. En général, le contact plante hôte-pathogène

induit une production de phytoalexines constituées de phénols. Elle est plus abondante chez

les génotypes résistants. Le but de notre travail est l’étude des interactions Cicer arietinum-

Ascochyta rabiei par l’utilisation des outils de la biotechnologie. Des cals de Cicer arietinum

sont confrontés au filtrat d’Ascochyta rabiei pour mettre en évidence la production des

phénols.

Les cals sont produits à partir d’entre nœuds et de folioles des génotypes INRA

199 et FLIP 84-92C (résistants), Twist et FLIP 82-150C (sensibles) de C. arietinum. Les

balances hormonales employées sont : N1 (3mg/l 2,4D et 1mg /l BAP), N2 (2mg/l 2,4D),

Ma (2mg/l 2,4D et 4mg/l Kinétine) et M8 (2mg/l 2,4D, 4mg/l NAA et 1mg/l Kinétine). Les

cals sont confrontés au filtrat filtré des isolats H1 et E2 d’A. rabiei. L’extraction des phénols

se fait sous reflux, leur estimation quantitative par spectrophotométrie et leur détermination

qualitative par chromatographie sur couches minces.

Les résultats de la callogenèse sont influencés par le génotype, l’organe (tiges ou

folioles) et la balance hormonale (nature et concentration). Une importante callogenèse de

tiges et de folioles des quatre génotypes est enregistrée sur le milieu N1. Un autre milieu N2

s’est révélé très favorable à la callogenèse des tiges du génotype INRA 199.

Les résultats relatifs à l’interaction cals de Cicer arietinum et filtrat filtré d’Ascochyta

rabiei montrent qu’il y’a production de phénols. Les cals confrontés produisent plus de

phénols que les cals non traités. Les quantités produites par les cals de tiges et de folioles du

génotype résistant INRA 199 sont les plus élevées en présence des isolats (H1 et E2). Les cals

de folioles et de tiges du génotype Twist (sensible) présentent moins de phénols que le

génotype INRA 199 confrontés aux deux isolats.

L’analyse qualitative confirme la présence de phénols et de flavonoïdes, produits

probablement en réponse au contenu (enzymes et toxines) du filtrat filtré d’Ascochyta rabiei.

Mots clefs : Ascochyta rabiei, Cicer arietinum, anthracnose, cal, Filtrat filtré, Polyphénols.

Abstract

Ascochyta blight of chickpea is a disease caused by Ascochyta rabiei. It can affect all

aerial parts of the plant and cause a total loss of harvest. The control methods used are not

very effective in its eradication. Looking for another means of control is imperative. It is

based on the study of host-pathogen interactions to determine the mechanisms of host

defense. In general, the contact host plant-pathogen induces production of phytoalexins

composed of phenols. It is more abundant in resistant genotypes. The aim of our work is the

study of interactions Cicer arietinum- Ascochyta rabiei by the use of biotechnology tools.

Cicer arietinum calluses are bring face to face with the filtrate of Ascochyta rabiei to

dismantle the production of phenols.

The calluses were produced from internodes and leaflets of genotypes INRA 199 and

FLIP 84-92C (resistant), Twist and FLIP 82-150C (susceptible) of C. arietinum. Hormonal

balances are used: N1 (3mg/l 2,4D and 1mg/l BAP), N2 (2mg/l 2,4D), Ma

(2mg/l 2,4D and 4 mg/l Kinetin) and M8 (2mg/l of 2,4D, 4 mg/l NAA and

1mg/l kinetin). The calluses are facing the filtered filtrate of isolates H1 and E2 of A. rabiei.

The phenol extraction was done under reflux, their quantitative estimation by

spectrophotometry and qualitative determination by thin layer chromatography.

The results of callogenesis are influenced by genotype, body (stems or leaflets) and the

hormonal balance (type and concentration). A large callogenesis of stems and leaflets of all

genotypes is recorded on the medium N1. Another medium N2 has been very favorable to

callogenesis of stems of genotype INRA 199.

The results for the interaction of Cicer arietinum calluses and filtered filtrate of

Ascochyta rabiei show that there's production of phenols. Treated Calluses produce more

phenols than untreated ones. The quantities produced by the calluses of stems and leaflets of

the resistant genotype INRA 199 are the highest in the presence of isolates (H1 and E2). The

quantities produced by calluses of leaflets and stems of genotype Twist (sensitive) are less

than genotype INRA 199 faced with the two isolates.

The qualitative analysis confirms the presence of phenols and flavonoids, probably

produced in response to content (enzymes and toxins) of the filtered

filtrate of Ascochyta rabiei.

Keywords: Ascochyta rabiei, Cicer arietinum, anthracnose, callus, filtrated Filtrate,

Polyphenols.

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.ا��A"�ل ،,*�Aۃ ا��اba ، دCicer arietinum ، Ascochyta rabiei ، `�a : ا��= آ�� ت

Etude bibliographique

1

Chapitre I

Etude

bibliographique


2

Introduction

Le pois chiche est une légumineuse destinée à la consommation humaine. Elle est

riche en protéines, amidon, matières grasses et sels minéraux. La consommation de pois

chiche est très favorisée dans certains pays où il permet de combler le déficit en protéines

animales. C’est aussi une source d’énergie pour les animaux, plus précisément pour les

ruminants et les monogastriques. Cicer arietinum est aussi bénéfique pour la restauration de la

fertilité des sols par la symbiose Rhizobium - cicer en réduisant ainsi l’utilisation des engrais

et protégeant l’environnement. Son utilisation s’étend même au domaine médical où

l’exsudat acide des feuilles de pois chiche est employé pour traiter la constipation et la

dysenterie.

La demande en cette denrée est donc importante mais elle n’est pas satisfaite et ceci

est dû à une faiblesse de rendement qui est le résultat d’un ensemble de facteurs :

- La maîtrise de la culture.

- Les conditions climatiques (température, sécheresse) et édaphiques (salinité et pH).

- Les ravageurs et ennemis (insectes et maladies).

L’anthracnose due à Ascochyta rabiei représente la principale maladie fongique

dévastatrice du pois chiche. Elle peut affecter toutes les parties aériennes de la plante et

entrainer sa mort. Ainsi, dans certaines conditions de température et d’humidité favorables au

développement du champignon ; une perte totale de la récolte peut se faire.

Plusieurs moyens peuvent être envisagés afin de lutter contre cette pathologie. Ils

regroupent la rotation des cultures, l’utilisation des fongicides, la lutte biologique et la

sélection génétique par les méthodes traditionnelles. Toutes ces méthodes utilisées jusqu'à

présent n’ont pas permis d’éliminer totalement le pathogène. Elles présentent toutes des

inconvénients plus ou moins insurmontables :

- L’emploi des produits chimiques ne permet pas d’éradiquer la maladie car le champignon

peut développer de nouvelles races physiologiques. Cette méthode contribue à la pollution de

l’environnement, est parfois toxique pour le consommateur et présente un coût économique

élevé.


3

- La lutte biologique vis-à-vis d’Ascochyta rabiei est à ses débuts, et n’est pas encore

transmise aux champs mais il est à signaler que des essais de confrontation avec des bactéries

et des champignons ont fait l’objet d’études au laboratoire.

- La sélection génétique par les méthodes traditionnelles met beaucoup de temps afin

d’obtenir des génotypes résistants. Il n’est pas possible de sélectionner des génotypes

totalement résistants au champignon car ce dernier développe de nouveaux pathotypes.

Tous les moyens de lutte envisagés n’ont pas permis d’avoir une résistance complète a

Ascochyta rabiei ; elle est généralement partielle ou incomplète (Jayakumar et al., 2005). Le

recours à d’autres méthodes de création de génotypes complètement résistants est impératif.

L’emploi d’une nouvelle voie de sélection par les techniques de la biotechnologie est

à envisager. La callogenèse peut induire une variation somaclonale qui pourrait être à

l’origine d’une résistance. Dans ce cas, des cals de pois chiche peuvent subir une variation

génétique qui peut concerner une résistance à Ascochyta rabiei. Cette sélection peut être

orientée par l’utilisation d’un agent de pression de sélection tel que le champignon (mycélium

et spores) ou les produits de son filtrat (enzymes et toxines). L’expression de la résistance à

un agent pathogène se fait généralement par la production d’enzymes et de polyphénols qui

sont les constituants des phytoalexines.

Le but de notre mémoire est une mise en évidence de ces polyphénols lors des

interactions cal- filtrat d’Ascochyta rabiei.

La première partie du travail consiste à réunir les conditions favorables pour

l’obtention de cals à partir de tiges et de feuilles de Cicer arietinum sur des milieux de

cultures contenant des régulateurs de croissance.

La deuxième partie est relative à une confrontation filtrat filtré d’Ascochyta rabiei –

cal de Cicer arietinum. Elle concerne la mise en évidence des phénols et leur dosage

quantitatif et qualitatif par spectrophotométrie et chromatographie sur couches minces

(CCM).


4

I. 1. Etude de Cicer arietinum

I.1. 1. Description botanique et systématique

Cicer arietinum est une légumineuse annuelle, dicotylédone, diploïde (2n=16) et

présente un port herbacé (fig.1 a). Elle comporte :

a. Une tige : de 20 à 40 cm de hauteur, d’aspect velu et glanduleux. Habituellement

quadrangulaire (fig.1 b), elle se ramifie dés la base en 2 ou 3 rameaux secondaires et porte

des stipules incisées et dentées.

b. Des feuilles : velues, elles sont composées imparipennées avec 6 à 8 paires de folioles

crénelées-dentées. Leur couleur varie du vert olive au vert foncé et elles présentent à leur

base des stipules (fig.1 c).

c. Un système racinaire : il se développe dans les deux sens, latéral et pivotant et peut

dépasser 1 mètre de profondeur. On distingue sur le système racinaire des nodosités

fixatrices d’azote atmosphérique. Ces dernières sont le résultat d’une infestation par une

bactérie appelée « Rhizobium ». Cette association « plante-bactérie » est très spécifique

et seul un groupe particulier de Rhizobium appelé Rhizobium ciceris peut infester les

racines du pois chiche.

d. Des fleurs : hermaphrodites, violettes ou pourpres et parfois blanches. Elles sont isolées

sur des pédoncules courts, avec une corolle dépassant à peine le calice (7 à 9 mm). Le

pétale postérieur est très important : c’est l’étendard, il recouvre les deux pétales latéraux,

qui recouvrent eux même ceux de la carène donnant ainsi une forme de papillon ce qui est

une caractéristique de la famille des papilionacées (fig.1 d, e, f). Le calice est composé de

cinq dents égales, plus longues que le tube et les étamines sont diadelphes (9-1).

e. Un fruit : c’est une gousse globuleuse, ovoïde, renflée, mure jaunâtre ou non mure verte

(fig.1g). Elle contient une à deux graines velues et mesure 15 à 30 mm de longueur et 2 à

15mm de largeur.

f. Des graines : exalbuminées ou avec très peu d’albumen, elles ont une couleur qui varie

du blanchâtre au noir foncé (fig.1 h) et une surface ridée ou lisse. La longueur des graines

varie de 4 à 12mm et leur largueur de 4 à 8 mm. Le poids est d’environ 0,10 à 0,75g.

Selon la couleur et la taille des graines à maturité, on distingue deux types de pois chiche

cultivés :


5

- Le type « Kabuli» : caractérisé par des graines plus larges (plus de 20g pour 100 graines),

principalement rondes, de couleur beige (fig.1 h, A). Les plantes sont grandes et les feuilles

larges. Les fleurs sont généralement blanches avec absence d’anthocyanines sur les tiges.

- Le type « Desi»: se caractérise par de petites graines (100 graines pèsent 10 à 20g), d’une

couleur variant du jaune au noir foncé, d’un aspect angulaire avec la présence éminente

d’un bec (fig.1 h, B). Les plantes et les feuilles sont petites avec présence d’anthocyanines

qui pigmentent les tiges. Les fleurs sont pourpres.

Figure 1: Description botanique(www.cilr.uq.edu), b : Aspect velu et quadrangulaire de la tige (Markell feuilles (www.farine.us), d :blanche , g : Gousse non mure verte, génotype « Desi ».

a

c

e

g


6

Description botanique de Cicer arietinum L. a : Port herbacé de Aspect velu et quadrangulaire de la tige (Markell et al.,

: Fleur bleue, e : fleur pourpre (www.virtualsciencefair.orgGousse non mure verte, h, A : Graines du génotype « Kabuli

A

b

d

h

f


Port herbacé de Cicer arietinum L. et al., 2008), c : Aspect des

(www.virtualsciencefair.org), f : Fleur Kabuli », h, B : Graines du

B


7

Systématique

• Embranchement : Angiospermes,

• Classe : Eudicots ou Eudicotylédones

• Sous classe : Eurosidées

• Ordre : Fabales

• Famille : Fabacées ou Papilionacée

• Sous-famille : Papilionoideae

• Genre : Cicer

• Espèce : arietinum

I.1.2. Importance de l’hôte Cicer arietinum

I.1.2.1. Intérêt alimentaire

Le pois chiche est une légumineuse alimentaire riche en protéines et acides aminés

ainsi qu’en carbohydrates. Il constitue une source très importante de protéines végétales

pouvant corriger le déficit en protéines animales (Tableaux 1, 2). C’est une excellente source

d’énergie, ainsi, 100g de pois chiche apporte une valeur énergétique d’environ 357 calories

(Muehlbauer et Tullu, 1997). Les protéines du pois chiche ont une meilleure digestibilité

comparée à celles des autres légumes (Saxena, 1990). Cet aliment est aussi une excellente

source de sels minéraux (Tableau 3). Il apporte également une quantité considérable de

matières grasses essentielles à l’homme et représente un excellent hypo-cholesterolémique

grâce à sa teneur en acide linoléique et linolénique. La présence de vitamine B est également

notée (Tableau 4).

Le pois chiche est considéré comme une source de graines et de fourrage offrant

protéines et énergie aux monogastriques et ruminants.


8

Tableau 1 : Composition alimentaire moyenne du pois chiche (Muehlbauer et Tullu, 1997).

Composants Quantités (g/100g)

Protéines 14,9 – 24,6

Matières grasses 0,8 – 6,4

Carbohydrates 38 - 59

Fibres (Cellulose et Hémicellulose) 2,1 -11,7

Huile de pois chiche 4,8 – 5,5

Tableau 2 : Composition moyenne en sucres du pois chiche (Alajaji et El-Adawy, 2006).

Sucres Quantités (℅)

Sucres réducteurs 0,97

Sucrose 1,89

Raffinose 1,45

Amidon 36,91

Tableau 3 : Composition moyenne du pois chiche en minéraux (Alajaji et El-Adawy, 2006).

Macroéléments (℅) Microéléments (℅)

Na K Ca Mg P Mn Zn Cu Fe

0,120 0,870 0,176 0,176 0,226 0,0021 0,0043 0,0011 0,0077

Tableau 4: Composition moyenne en vitamines B du pois chiche (µg/ 100g) (Alajaji et El-Adawy, 2006).

Riboflavines Thiamines Niacines Pyrodoxines

173,33 453,33 1602,67 466,33


9

I.1.2.2. Intérêt écologique et agronomique

Sur le plan écologique et agronomique, Cicer arietinum est bénéfique pour la

restauration de la fertilité des sols grâce à sa capacité à fixer l’azote. Cette plante annuelle

réduit ainsi l’utilisation des fertilisants, permet la protection de l’environnement et la baisse

du cout économique. Les exsudats acides des feuilles, tiges et gousses inhibent les insectes

ravageurs offrant ainsi une protection naturelle à la plante et limitant l’utilisation des

insecticides. Cicer arietinum contribue aussi à la diversification des céréales basée sur la

rotation des légumes.

I.1.2.3. intérêt économique

Le pois chiche est la troisième légumineuse la plus importante au monde après les

haricots (Phaseous vulgaris L.) et les pois (Pisum sativum L.). Il occupe plus de 10 millions

d’hectares de terres agricoles (Singh et Diwakar, 1995) et l’Inde fournit 75℅ de la

production mondiale. Les principaux pays producteurs sont l’Inde, la Turquie, le Pakistan et

l’Iran.

Le pois chiche occupe une place importante dans l’agriculture du bassin

méditerranéen. La Turquie fournit 50℅ de la production totale de la région. En Algérie, en

dépit de l’incitation des services agricoles, la production est insuffisante. L’importation

s’estime à 55 537 tonnes alors que la production est de seulement 15 000 tonnes (fig.2)

(FAO, 2007).

La sécheresse est le principal facteur limitant le rendement, la culture étant semée

généralement au printemps. Les semis d’hiver ouvrent de nouvelles perspectives pour

l’augmentation de la production du pois chiche. L’anthracnose due à Ascochyta rabiei et le

flétrissement dû au Fusarium oxysporum restent, en Algérie, les pathologies majeures

limitant la production du pois chiche.

25 140

18 000 19 102

50 766

60 450

50 000

22 850

0

10 000

20 000

30 000

40 000

50 000

60 000

70 000

Figure 2 : Histogramme desréservées à la production du pois chiche en Algérie (1987 in Singh et Diwakar, 1995;

L’histogramme (fig.2)

chiche est insuffisante en Algérie .Le

besoins .La surface des terres agricoles réservées à la production a nettement di

60 450 ha à 21 252 ha.

I.1.3. Maladies du pois chiche

Cicer arietinum peut être affectée par plus de 50 malad

différentes. Les conditions climatiques hivernales caractérisées par une hygrométrie relative

élevée de l’ordre de 93℅

développement des maladies très redoutables

- L’anthracnose due à Ascochyta rabiei

- Les pourritures dues au

pour les variétés sensibles du

- Le flétrissement provoqué par

- Le noircissement des tiges


10

19 10216 367

13 727 15 000

50 76648 713 47 432

12 706

55 537

22 850 23 079 23 348 23 34821 252

Production (tonnes)

Importation (tonnes)

Surface des terres agricoles

(ha)

Histogramme des Productions, importations et surface des terres agricoles production du pois chiche en Algérie (1987 – 2007) (Labdi, 1990

Singh et Diwakar, 1995; FAO, 2007).

(fig.2) montre d’une façon très évidente que la production du pois

nte en Algérie .Le recours à l’importation s’impose

a surface des terres agricoles réservées à la production a nettement di

du pois chiche

peut être affectée par plus de 50 maladies de variétés étiologiques

. Les conditions climatiques hivernales caractérisées par une hygrométrie relative

℅ et des températures variant de 9 à 18,5 °C favorisent le

développement des maladies très redoutables. Parmi ces maladies :

Ascochyta rabiei,

Botrytis cinerea, Fusarium solani, Rhizoctonia

variétés sensibles du pois chiche.

provoqué par Fusarium oxysporum

ssement des tiges provoqué par Phoma medicaginis.


Production (tonnes)

Importation (tonnes)

Surface des terres agricoles

Productions, importations et surface des terres agricoles 2007) (Labdi, 1990 ; FAO, 1992

montre d’une façon très évidente que la production du pois

s’impose pour satisfaire les

a surface des terres agricoles réservées à la production a nettement diminué de

ies de variétés étiologiques

. Les conditions climatiques hivernales caractérisées par une hygrométrie relative

variant de 9 à 18,5 °C favorisent le

Rhizoctonia bataticola, surtout


11

Elle peut être infectée par des virus qui causent le jaunissement et les nécroses. Le pois

chiche peut aussi être dévasté par environ 50 espèces d’insectes dont Liriomyza cicerna qui

est présent dans toutes les zones de culture du pois chiche, et par des nématodes tel que

Meloidogyne incognita et Pratylenchus thornei.

L’anthracnose due a Ascochyta rabiei reste la maladie la plus contraignante à la

production du pois chiche dans le monde (Kaiser,1972 in Vir et al.,1975 ; Singh et Reddy,

1983 ; Singh et al.,1984 ; Crino, 1990 ; Navas Cortes et al.,1995 ; Khouaidjia, 2000 ; Santra

et al.,2000 ; Toker et Çanci, 2003 ; Nene, 1984 in Cobos et al.,2006 ; Davidson et Kimber,

2007 ; Markell et al.,2008 ; Taleei et al.,2009). Elle peut causer la perte totale de la récolte

de pois chiche.


12

I.2. Etude de l’agent de l’anthracnose Ascochyta rabiei

I.2.1. Description et systématique

A) Description macroscopique

Les colonies mycéliennes se développent lentement. Elles sont d’abord crémeuses,

puis prennent des teintes extrêmement variées selon les souches et les milieux (vert clair, vert

foncé, brun.. etc.). Elles présentent généralement des stries concentriques très caractéristiques

(fig.3 a).

B) Description microscopique

a) Phase asexuée du champignon

a. Les pycnides : Les carpophores de ce genre sont des pycnides. Ils sont globuleux et

forment toujours une véritable cavité (fig.3 b). Leur couleur varie du pale au brun foncé et

leur diamètre est d’environ 65 à 245 µm. Les pycnides sont disposés en cercles

concentriques et munies d’un ostiole (fig.3 b) qui mesure 30 à 50 µm de diamètre.

Leur paroi interne est nommée « peridium ». Elle est formée de tissus

pseudoparenchymatiques. Les pycnides sont toujours agrégés d’une façon dense, ce qui

confère un aspect rugueux aux taches nécrotiques formées sur les tissus de l’hôte. Ils

renferment des conidies.

b. les pycnidiospores : ou conidies sortent à maturité en masse des pycnides engluées dans

un mucus. Elles sont hyalines, cylindriques ou ellipsoïdales et ovales à oblongues. Les

extrémités des conidies sont étroites ou légèrement incurvées et arrondies (fig.3 c).

Certaines sont bicellulaires présentant une cloison excentrique qui provient des parois

latérales (fig.3 d), mais la plupart sont unicellulaires et mesurent environ 8,2 à 10 x 4,2 à

4,5 µm.

c. Le mycélium : Les thalles sont filamenteux, développés et cloisonnés (fig.3 e, f).

b) Phase sexuée du champignon

La phase sexuée du champignon « Didymella rabiei » est hétérothallique à système

d’incompatibilité bipolaire entre deux types de thalles qui sont MAT1-1 et MAT1-2. Cette

forme produit :


13

a. Des pseudothèques : Elles sont de couleur marron à noir, présentant des ostioles bien

apparents et renferment des asques (fig.3 g). La taille des pseudothèces est d’environ 76 à

152 x 250 µm.

b. Les asques : sont disposés parallèlement (fig.3 h). Ils sont cylindriques, pédicellés et

étroits (fig.3 h). La taille des asques est d’environ 48 à 50 x 10 à 12 µm. Ils renferment

des ascospores.

c. Les ascospores : sont disposés d’une façon linéaire. Chacun d’entre eux est divisé en

cellules uninuclées par une cloison apparente au centre (fig.3 i). Les ascospores mesurent

environ 13,5 à 17,25 x 6 à 6,75µm.

Figure 3: Description d’Ascochyta rabieid’Ascochyta rabiei sur milieu pois chiche

après coloration au bleu coton (x400

d’Ascochyta rabiei après coloration au bleu coton (x1000)

microscopiques de mycéliums d’

coton, g : observation microscopique Observation microscopique d’asques et ascospores de

a

c

e

g


14

d’Ascochyta rabiei (Pass.) Lab. a : Aspect macroscopique d’une colonie

sur milieu pois chiche, b : Observation microscopique d’un pycnide d’

coton (x400), flèche : ostiole, c,d : Observations microscopique

après coloration au bleu coton (x1000), flèche : spore bicellulaire

de mycéliums d’Ascochyta rabiei (x1000), e : sans coloration, f : microscopique d’une pseudotèque de Didymella rabiei (x400) (Rha

asques et ascospores de Didymella rabiei (Armstrong et al.,

b

d

f

h


Aspect macroscopique d’une colonie

Observation microscopique d’un pycnide d’Ascochyta rabiei

microscopiques de spores

: spore bicellulaire, e,f : Observations

après coloration au bleu

(x400) (Rhaiem et al.,2006). h : et al., 2001).


15

Systématique

• Classe : Adelomycetes

• Ordre : sphaeropsidales

• Famille : sphaeropsidacées

• Sous famille : sphaerioidacées – hyalodidymées

• Genre : Ascochyta

• Espèce : rabiei.

I.2.2. Cycle de vie du pathogène

Ascochyta rabiei est introduit dans le sol par les semences et s’y conserve par les

débris des végétaux (fig.4 B). Navas-Cortes et al., 1995 ont rapporté que la phase sexuée du

champignon « Didymella rabiei » peut survivre à un minimum de deux ans dans les débris de

pois chiche.

L’infection initiale provient des graines qui apportent l’inoculât, des résidus de plantes

infectées, des ascospores répandues par le vent et des conidies dispersées par l’eau ainsi que

par des plantes volontaires.

Didymella rabiei pousse en saprophyte en fin d’hiver sur les tiges et les gousses du

pois chiche infecté. Il forme des pycnides et des pseudothèces (fig.4 B). La production de

spores sexuées (ascospores) matures se fait par les pseudothèces à une température d’environ

15 °C.

Les ascospores sont produits au printemps dans les champs. Leur dispersion se fait par

le vent. Les ascospores peuvent se déplacer sur de grandes distances, ce qui permet à la

maladie d’atteindre rapidement de nouveaux champs. Ils se déposent sur les feuilles (fig.4A)

et les tiges du pois chiche et germent lorsque les conditions d’humidité sont favorables. Ils ont

besoin pour cela d’un minimum de deux heures de rosée.

L’apparition des symptômes se fait plusieurs jours après infection lorsque les pycnides

sont formés sur les lésions. Ils donnent des spores asexuées (conidies) qui vont être dispersées

par la pluie contaminant ainsi les plantes voisines. La figure 4 représente le cycle de vie

d’Ascochyta rabiei.

Plante infectée Conidies

Plantule

Malade Malade Gousse infectée

Ascospores

Printemps

Figure 4: Cycle de vie d’Ascochyta rabieiDidymella rabiei. Plante maladeinfectés (www.cropgenebank.sgrp.cgiar.org(www.cropgenebank.sgrp.cgiar.org(Rhaiem et al.,2006), plante infectée (Markell


16

Conidies pycnides

A

Graine

Malade Malade Gousse infectée

B

Asques Pseudothèque

Fin d’hivers

Ascochyta rabiei (Pass.) Lab. A : cycle d’Ascochyta rabiei. Plante malade (www.dpi.qld.gov.au), gousse infectée (www.dpi.qld.gov.au)

www.cropgenebank.sgrp.cgiar.org), conidies (www.cropgenebank.sgrp.cgiar.org)www.cropgenebank.sgrp.cgiar.org). Ascospores (Armstrong et al., 2001). Asques, pseudothèques

2006), plante infectée (Markell et al.,2008).

Le sol


Une plante malade

Débris infectés

Fin d’hivers

Ascochyta rabiei, B : cycle de (www.dpi.qld.gov.au), débris

www.cropgenebank.sgrp.cgiar.org), pycnide ). Asques, pseudothèques


17

I.2.3. Mécanismes d’infection d’Ascochyta rabiei

Les spores d’Ascochyta rabiei pénètrent la plante généralement à travers la cuticule

des feuilles. L’élongation des tubes germinatifs et la formation des appressoriums se fait par

la suite. La pénétration se fait ainsi par la paroi des cellules épidermiques. Le pathogène

envahit la plante en empruntant les espaces intercellulaires du parenchyme palissadique et

épidermique. Ascochyta rabiei traverse de cette façon les tissus parenchymateux pour se

déplacer des feuilles vers les tiges. Le pathogène peut aussi intégrer les tiges d’une façon

directe à travers leurs cuticules. Il se déplace ainsi à travers le phloème mais les dommages

extensifs apparaissent au niveau des tissus parenchymateux. Il se forme des nécroses et des

gaines nécrotiques autour des tiges.

Les tubes germinatifs d’Ascochyta rabiei sécrètent des exsudats qui provoquent

l’infection et protègent les tubes germinatifs des dessiccations. La pénétration des cuticules

est accompagnée d’une production d’enzymes lytiques des parois cellulaires. Le pathogène

produit des cutinases (Tenhaken et Barz, 1991 ; Tenhaken et al., 1997 ), xylanases, et des

exopolygalacturonases ainsi que des pectinases ( Tenhaken et Barz, 1991; Hussain et

Barz,1997 ; Khouaidjia, 2000; Fallahi et al, 2007) .

Ascochyta rabiei est reconnu pour sa grande variabilité pathogénique qui se traduit

par la diversité d’enzymes produites par les souches géographiquement différentes .Elle est le

résultat d’une variabilité génétique (Elbiari et Dron, 1995). Le polymorphisme est attribué à

la reproduction sexuée du champignon qui est hétérothallique. Il en résulte des descendants

hétérozygotes au sein d’une même population du pathogène. Ceci peut mener à l’obtention de

nouvelles combinaisons génétiques de la virulence favorisant l’apparition de nouveaux

pathotypes.

Un autre facteur de virulence important, est la production de phytotoxines. Ces

dernières provoquent la nécrose des tissus de l’hôte. Le pathogène produit ainsi trois types de

phytotoxines : les solanapyrones (A, B, C), la cytochalasine D et une phytotoxine protéique.


18

La présence des toxines dans le fluide germinatif des spores est observée, ce qui

indique un éventuel rôle dans le développement de la maladie. Les solanapyrones « A » sont

les plus toxiques. Elles causent des cassements de tiges, des déformations et apparitions de

zones colorées sur les feuilles. L’absence de leur détection dans les tissus des plantes au coté

de celle des solanapyrones « B » peut être due a leur rapide métabolisation ou leur faible

concentration in vivo (Jayakumar et al., 2005).

Le pathogène possède également un mécanisme de dégradation des isoflavones

antimicrobiens et des ptérocarpans, qui sont des phytoalexines produites par le pois chiche.

Toute fois, ce mécanisme reste mal connu jusqu’à ce jour (Jayakumar et al., 2005).

I.2. 4. Symptômes de l’anthracnose du pois chiche

L’anthracnose se manifeste par des lésions sur les différentes parties aériennes de la

plante :

a. Sur les feuilles : Il apparait des taches humides et grises sur les feuilles. Ces taches se

transforment rapidement en lésions creuses et allongées ou ovoïdes de couleur marron avec

des contours noirs. Elles atteignent 3 à 4 cm de diamètre (fig.5 a). De petits points circulaires

bruns et noirs correspondant aux pycnides se développent au centre des lésions .Les pycnides

sont fréquemment disposées en cercles concentriques (fig.5 b). Ces derniers sont larges et

relativement faciles à identifier. Ils représentent le diagnostic caractéristique de l’anthracnose

(Markell et al., 2008). Les folioles atteintes jaunissent et tombent sur le sol.

b. Sur les tiges : Les tiges infectées développent les mêmes taches observées sur les feuilles.

Il peut se former des gaines nécrotiques autour des tiges (fig.5 c) qui finissent par s’affaiblir

et se casser (fig.5 d).

c. Sur les gousses : Les gousses développent aussi des taches nécrotiques (fig.5 e) et leur

infection conduit à celle des graines.

d. Sur les graines : Il y’a apparition de symptômes visibles tels que la régression de leur

taille, les rides, un dessèchement et une décoloration (fig.5 f).

Les différents débris de la plante présentent tous des taches nécrotiques (fig.5 g, h).

Figure 5 : Symptômes de l’et al., 2008), b : tache nécrotique avec cercles concentriques, al.,2008), d : cassure de la tige(www.topcropmanager.com), symptômes sur les débris.

a

c

e

g


19

ymptômes de l’anthracnose du pois chiche. a : symptômes sur les feuillestache nécrotique avec cercles concentriques, c : symptômes sur les tiges

cassure de la tige (flèche) (www.dpi.qld.gov.au), e : symptômes sur les gousses, f : symptômes sur les graines (www.cropgenebank.sgrp.cgiar.org)

b

d

f

h


symptômes sur les feuilles (Markell symptômes sur les tiges (Markell et

symptômes sur les gousses (www.cropgenebank.sgrp.cgiar.org), g, h :


20

I.3. Culture in vitro

Les méthodes de culture in vitro sont de plus en plus employées pour assurer la

propagation et le clonage de certaines espèces intéressantes. Le but étant de satisfaire les

besoins en agriculture et en horticulture. La culture in vitro est un outil très efficace au service

de la recherche biologique et physiologique. Elle vise la régénération de plantes entières à

partir de cellules ou de tissus en milieu nutritif et dans un environnement de température,

d’humidité et de luminosité contrôlés. La culture in vitro présente trois aspects : la

rhizogenèse (néoformation de racines), la callogenèse (néoformation de bourgeons) et

l’embryogenèse (Margara, 1984).

I.3.1. Avantages de la culture in vitro

- La conservation des génotypes dans des conditions idéales de protection contre les

intempéries, les agressions des ravageurs et agents pathogènes.

- La possibilité de stocker des génotypes divers dans un espace peu important car il suffit de

quelques individus pour assurer la reproduction d’une grande quantité de plantes.

- La maintenance permanente d’un stock suffisant d’individus pour assurer la fourniture

régulière d’une variété couramment commercialisée.

- La multiplication se fait d’une manière accélérée.

I.3.2. Inconvénients de la culture in vitro

- L’organogenèse indirecte n’offre pas toujours une garantie au niveau génétique. Elle est

limitée aux espèces pour lesquelles l’organogenèse directe n’est pas possible.

- Il faut du temps pour obtenir une variété résistante pouvant être commercialisée.

- Le cout économique.

I.3.3. Culture in vitro chez le pois chiche

Le pois chiche a fait l’objet de beaucoup de travaux de culture in vitro. De nombreux

auteurs se sont intéressés à la callogenèse et à la régénération. Cette dernière se fait soit par

embryogenèse somatique ou par néoformation de pousses. Cette méthode peut induire des

variations somaclonales qui engendrent un nouveau fonctionnement de la cellule.

Les changements apportés se révèlent intéressants lorsqu’ils permettent de maintenir


21

un nouveau caractère de résistance au stress biotique, et de le transmettre aux plantes

régénérées (fig.6).

Les travaux de Kumar et al., 1994 ont abouti à une formation de cals à partir de

folioles de Cicer arietinum suivie de leur régénération par embryogenèse somatique. Sagar et

al., 1993 ont produit des cals d’un autre organe, les cotylédons de Cicer arietinum et ont

également effectué une régénération par embryons. Huda et al., 2000 signalent une

néoformation de pousses à partir de cals d’entre nœuds de pois chiche. Les travaux de Huda et

al.,2003 a et Huda et al.,2003 b ont également abouti à une néoformation de pousses mais de

cals de cotylédons. Une régénération de cals de nœuds cotylédonaires est aussi notée par

Mirakabad et al., 2010.

Organogenèse indirecte induisant

des changements génétiques au niveau des cellules

Confrontation à un éliciteur afin de provoquer

une réaction de résistance

Sélection d’une variété résistante

(produisant le plus de phénols ou d’enzymes de résistances)

Multiplier et commercialiser cette variété

Figure 6: Schéma montrant le but de l’utilisation de l’organogenèse indirecte.

Une régénération peut également être induite directement par les organes présentant

des tissus méristématiques. Certains auteurs se sont intéressés à cette méthode directe. Naz et

al., 2007 ont induit une formation de pousses à partir de nœuds et de bourgeons de Cicer

arietinum. Yousefiara et al., 2008 ont également induit une formation de pousses mais en

utilisant des embryons. Anwar et al., 2009 ont réalisé une organogenèse directe de nœuds

cotylédonaires de Cicer arietinum.


22

La rhizogenèse du pois chiche est induite sur milieu MS additionné d’IBA (Indole

Butyric Acid). Plusieurs travaux ont mentionné la formation de racines sur ce milieu

(Riazuddine et al., 1988 ; Huda et al., 2000 ; Chaturvedi et Chand, 2001 ; Anwar et

al.,2009 ; Mirakabad et al.,2010). Chaturvedi et Chand, 2001 ont précisé qu’une meilleure

rhizogenèse est obtenu sur milieu MS liquide réduit de moitié et contenant des hormones.

La transgenèse est aussi décrite chez le pois chiche. Elle permet d’introduire

plusieurs gènes d’intérêt, notamment pour la résistance vis-à-vis des parasites et insectes.

Agrobacterium est utilisé comme vecteur du gène dans le génome de la cellule végétale. Lawo

et al., 2008 ont utilisé un gène de Bacillus thuringiensis (bactérie du sol) pour introduire

l’expression d’une protéine de défense chez le pois chiche. Cette protéine inhibe la croissance

d’un insecte ravageur: Helicoverpa asmigere. Goel et al., 2002 ont inoculé le pois chiche par

Pseudomonas spp. Cette bactérie est antagoniste aux champignons pathogènes tels que

Aspergillus, Fusarium oxysporum f.sp.ciceri et Pythium aphanidermatum. Leurs résultats ont

démontré que cette inoculation est favorable à la croissance des cellules de l’hôte. Ils ont

également réalisé une coinoculation avec Mesorhizobium/ Pseudomonas qui s’est révélée très

bénéfique.

I.4. Mécanismes de résistance de l’hôte

Le contact d’un pathogène avec son hôte va définir le type de relation (sensibilité ou

résistance). Deux principaux cas sont envisageables :

- La relation compatible : elle correspond à une multiplication active du pathogène et à une

colonisation de l’hôte ou d’une partie de ce dernier.

- La relation incompatible : elle correspond à un arrêt précoce de croissance du parasite et

de la colonisation de l’hôte. La réaction d’hypersensibilité est une relation incompatible.

Elle est observée chez les génotypes résistants et correspond à un blocage de l’infection.

La résistance de la plante est classée en deux catégories : la première met en place des

structures agissant comme barrières physiques ralentissant la croissance du pathogène. La

seconde est une production de substances toxiques pour l’agent pathogène.


23

A) Cas de formation de barrières de défense

Il s’agit de papilles, ce sont des barrières entreposées entre la membrane cellulaire et la

paroi de l’hôte. Leur rôle est d’empêcher l’invasion par le pathogène. Elles sont constituées de

cellulose et de lignines qui augmentent la rigidité des parois.

B) Cas de production de substances toxiques de défense

Ce sont des composés de faibles poids moléculaires nommés phytoalexines. Ils font

parti des métabolites secondaires et sont synthétisées en réponse à un stress. Ils procèdent un

pouvoir inhibiteur à l’égard d’un large éventail de microorganismes. Leur toxicité vis-à-vis

des champignons a été démontrée.

La structure des phytoalexines (isoflavonoïdes, flavonoïdes, coumarines…) varie selon

la position taxonomique des plantes considérées. Chez les légumineuses, on retrouve les

isoflavonoïdes qui sont des composés phénoliques.

La synthèse des phytoalexines passe par plusieurs étapes :

- Reconnaissance de l’éliciteur. - Mise en place d’un signal de transduction de la membrane vers le noyau. - Mise en place de facteurs de transcription nucléaire.

- Transcription des gènes qui codent pour la synthèse des enzymes du métabolisme des

phénols (PAL).

- Traduction des ARNm au niveau du cytoplasme, permettant ainsi la synthèse des enzymes

du métabolisme des phénols.

- Biosynthèse des phytoalexines.

Résistance chez le pois chiche

Chez les génotypes résistants du pois chiche, les sites d’infection brunissent

rapidement, se transforment en nécroses et la croissance du pathogène s’arrête. Les hyphes

envahissent les espaces intercellulaires des génotypes sensibles conduisant à la perte de la

forme des cellules. Les sites de colonisation du pathogène sont restreints chez les génotypes

résistants, et les tissus lignifiés ne sont pas envahis.


24

L’étude histologique du pois chiche a démontré que le développement des

champignons se fait de la même façon dans les espaces intercellulaires des génotypes

résistants et sensibles. Toute fois, la structure et l’organisation des génotypes résistants

limitent la croissance du pathogène. Ces génotypes se caractérisent par des parois épaisses et

des parenchymes larges.

Il y’a également accumulation de métabolites secondaires antimicrobiens chez Cicer

arietinum, plus précisément les isoflavones de type Biochanine A (5,7- dihydroxy-4`-

methoxyisoflavone) et Formononetine (7-hydroxy-4`-methoxyisoflavone). Ce sont les

principaux composés phénoliques antimicrobiens. Initialement, les aglycones (7-O-

glucosides et 7-O- glucoside 6``- malonates) sont conjugués en isoflavones au niveau du

cortex et des couches sub-épidèrmales du pois chiche. Une mise en réserve s’effectue dans les

vacuoles.

La pénétration du pathogène provoque une libération massive de ptérocarpans

(medicarpines et maakianines).Ces composés sont le résultat de la transformation des

isoflavones. Les cellules non infectées ne contiennent pas ces composés. La concentration de

ces composés est élevée au niveau des cellules qui entourent les taches nécrotiques. Elle est

supérieure chez les génotypes résistants.

Le pois chiche se caractérise aussi par la production des protéines PR dans le cadre de

la résistance. L’infection se déclenche ainsi par l’accumulation d’un nombre de protéines sur

les sites d’interactions au niveau des feuilles. Ces protéines sont les chitinases, les β-1,3-

glucanases et les thaumatin-like proteins. Leur rôle est de détruire les parois cellulaires du

pathogène.

Il est aussi à signaler que Cicer arietinum produit des enzymes de détoxification des

toxines. Ce sont les glutathiones 5-transferases (GSTs). On les retrouve en grandes quantités

chez les génotypes très peu sensibles aux solanapyrones A, ce qui indique leur implication

dans le mécanisme de résistance.

Matériel et Méthodes

25

Chapitre II

Matériel

Et

Méthodes


26

II. Matériel

II.1. Matériel végétal

L’échantillon végétal qui a fait l’objet de cette étude est Cicer arietinum. Les

génotypes étudiés sont : INRA 199 (∆1), Twist (∆2), FLIP 84-92C (∆3), FLIP 82-150C

(∆4). Les graines des deux premières espèces ont été fournit par le laboratoire de

microbiologie à l’université d’Oran. Celles des deux dernières espèces proviennent de

l’ICADRA.

II.1.2. Matériel fongique

Le champignon qui a fait l’objet de cette étude est Ascochyta rabiei. Les isolats

utilisés sont : H1 et E2. Ils ont été obtenus par isolement à partir d’explants de plantes de pois

chiche malades récoltées par Mme Khouadjia. La récolte s’est effectuée au niveau de la

région de Hammam Bouhdjar pour le premier isolat et d’Ain Témouchent pour le second.

II.2. Méthodes

II.2.1. Culture in vitro du pois chiche

II.2.1.1. Désinfection des graines et obtention de plantes

Les graines sont stérilisées par passage dans une solution d’hypochlorite de sodium

(NaClO) à 5℅ pendant 1 mn puis rincées trois fois avec l’eau distillée stérile. Les graines sont

ensuite mises à germer dans des pots remplis de terreau stérilisé et imbibé d’eau distillée

stérile. La culture est menée dans une serre (abri vitré) et les plantes sont arrosées tous les

trois jours avec de l’eau distillée stérile. Les explants utilisés proviennent de plantes âgées de

trois semaines.

II.2.1.2. Préparation des Milieux de culture

Le milieu de culture le plus utilisé est celui de Murashige et Skoog (1962) (MS). Il est

enrichi en hormones de croissance ANA (acide naphtalène-acétique) et 2,4D

(2-4dichlorophenoxy acétique) comme auxines et la Kinétine ainsi que le BAP (6-benzyl-

aminopurine) comme cytokinines, à des concentrations différentes.


27

Le milieu MS est additionné de 12g d’agar, de 100mg d’inositol, 30g de saccharose et

de 1ml de vitamines. L’autoclavage des milieux se fait à 120°C pendant 20 minutes après

ajustement du pH à 5,8.

II.2.1.3. Induction de la callogenèse

Les tiges et les feuilles sont séparées soigneusement, les tiges sont découpées en

fragments d’environ 5 mm dépourvus de nœuds. Les feuilles sont utilisées après

sectionnement des nœuds. La désinfection des explants avant leur mise en culture est réalisée

sous hotte stérilisée par rayons UV (ultrat violet), selon le protocole suivant :

� Trempage dans une solution d’hypochlorite de sodium à 5℅ durant 3 minutes

� Trempage dans une solution d’éthanol à 70℅ pendant 30 secondes � Rinçage 3 fois à l’eau distillée stérile � Séchage avec du papier filtre stérilisé

Les explants sont ensuite repiqués à raison de 40 explants par milieu d’initiation de la

callogenèse. Les cals sont ainsi initiés sur le milieu MS enrichi de régulateurs de croissance

(Tableau 5). Ces différentes hormones sont choisies pour leur aptitude à stimuler la

croissance cellulaire et à favoriser une prolifération cellulaire de type cal.

Le travail est réalisé sous hotte stérilisée aux UV, les boites sont ensuite placées en

chambre de culture sous une photopériode de 16 heures et à 25°C.

Tableau 5: Composition hormonale des différents milieux d’initiation de la callogenèse

Hormones ANA (mg/ml)

BAP (mg/ml)

KIN (mg/ml)

2-4D (mg/ml)

Ma - - 4 2

M8 4 - 1 2

N1 - 1 - 3

N2 - - - 2


28

II.2.2. Culture du pathogène

Pour l’entretien d’Ascochyta rabiei, des repiquages successifs du champignon (espacés

de 15 jours) sont réalisés à partir des jeunes spores. Ces dernières sont prélevées des cercles

les plus externes des colonies des différents isolats.

Le pathogène est maintenu en culture sous une température de 22 °C et une

photopériode de 12 heures. Cette culture se fait sur milieu pois chiche solide (Tableau 6) dont

l’utilisation est préconisée pour l’obtention d’une croissance et sporulation abondante.

Tableau 6 : Composition du milieu pois chiche solide

Composants Quantités

Farine de pois chiche 50 g

Glucose 20 g

Agar 12 g

Eau distillée 1000 ml

Le milieu est ajusté à pH 5,8 et stérilisé à 120°C durant 20 minutes, puis coulé dans

des boites de pétri à raison de 10 ml/boite.

Obtention du filtrat filtré

Après culture de 15 jours sur milieu pois chiche solide, deux disques d’environ 1 cm

de diamètre de chaque isolat sont repiqués sur 100ml de milieu « Czapeck » modifié. La

culture est placée sous photopériode de 12h et à une température de 22 °C.

Au bout de 15 jours, la culture du champignon obtenue sur milieu liquide est filtrée

par passage sur papier Whatman n° 1, puis sur un filtre millipore de 0,45µm de diamètre. Les

mycéliums sont récupérés, mis dans des boites de pétris en verre stériles .Ils sont placés à

l’étuve sous une température de 40 °C durant 8 jours avant d’être pesés. La pesée sert à

déterminer le poids sec du mycélium dans 100ml de milieu «Czapeck».


29

II.3. Confrontation

Le filtrat est mélangé au milieu de culture Murashige et Skoog (1962) sans hormones

et diminué de saccharose et de macroéléments, à raison de 50℅ de filtrat et 50℅ de milieu

MS. Le milieu obtenu est coulé dans des boites de pétri sous conditions d’asepsie.

Les cals des différents génotypes sont repiqués sur ce milieu de confrontation et

reportés sous photopériode de 16h à une température de 22 °C. Les cals témoins sont repiqués

sur milieu MS mélangé à 50℅ d’eau distillée stérile. Ils sont reportés sous les mêmes

conditions de culture que les précédents.

L’évolution macroscopique des cals est suivie tous les jours et un prélèvement est

effectué au bout de 72h afin de doser les phénols totaux produits par ces cals.

II.3.1. Extraction des phénols

Les cals prélevés sont pesés puis broyés dans un mortier et portés à ébullition à 60°C

dans le méthanol (MeOH), à raison de 10ml de MeOH pour 100mg de cal.

Deux ébullitions sont effectuées. La première se fait durant 5 min et la seconde durant

3 min. Les extraits obtenus sont ensuite filtrés et les débris lavés avec du MeOH acidifié à

80℅ (avec du HCl à 1℅). Une évaporation est réalisée sous rota vapeur à 40 °C par la suite.

II.3.2. Préparation des échantillons

Tous les échantillons sont préparés à une concentration de 0.1 g/ml (1g de poudre de

cal dans 10ml de MeOH), puis homogénéisés par agitation. La conservation se fait dans des

tubes hermétiques au réfrigérateur.


30

II.3.3. Dosage quantitatif des phénols totaux

A) Principe

Les composés phénoliques sont oxydés par les acides phosphotungstique et

phosphomolybdique. Ceux-ci sont réduits en oxyde bleu de tungstate et de molybdène. La

coloration bleu développée présente un maximum d’absorbance à 760 ηm.

B) Dosage

L’analyse quantitative des phénols totaux est réalisée par le dosage

spectrophotométrique selon la méthode de Folin Ciocalteu (Singleton et al., 1999 ; Heilerova

et al., 2003).

Dans des tubes à essais, une quantité de 50 µl d’extrait aqueux (dissous dans le

MeOH, à une concentration de 0.1 g/ml) est additionnée à 50 µl de MeOH (dilution 2 fois) et

500 µl de Folin Ciocalteu (Merck) (1/10 dissout dans de l’eau distillée). Une agitation est

effectuée et les échantillons sont mis à l’obscurité pendant 5 min à température ambiante.

Une autre quantité de 1,5 ml d’une solution de Na2CO3 saturée (2℅, dissout dans de l’eau

distillée) est ajoutée à l’ensemble. Une seconde agitation est effectuée. Les échantillons sont

ainsi mis à l’obscurité pendant 1 heure à température ambiante. La couleur jaune du réactif

vire au bleu. Les dosages sont réalisés en triplicata. Les densités optiques sont lues au

spectrophotomètre UV-Visible à 760 ηm en utilisant des cuves en verre (volume 1 ml).

La quantification des phénols se fait au moyen d’une courbe d’étalonnage. Cette

dernière est réalisée à l’aide de différentes concentrations d’acide gallique (Fluka) dissout

dans de l’eau distillée (0.025 - 0.03 – 0.035 – 0.04 – 0.045 – 0.05 – 0.055 – 0.06 mg/ml,

concentrations initiales). Les prélèvements sont faits à partir d’une solution mère de 1 mg/ ml.

Cette courbe est réalisée dans les mêmes conditions opératoires que les échantillons et la

courbe de tendance obtenue dans ce cas (Excel 2007) est y = 83.5x + 0.0766 (R2 = 0.991).

Les résultats sont exprimés en milligrammes d’équivalent d’acide gallique par gramme

d’extrait de cal. Ils représentent la moyenne de 2 à 3 répétitions.

Le blanc est préparé en remplaçant la quantité de l’extrait aqueux par l’eau distillée,

dans les mêmes conditions.

NB : Les échantillons sont dilués 2 fois afin de baisser les valeurs de l’absorbance

qui furent élevées initialement.


31

II. 3.4. Dosage qualitatif des phénols

L’analyse qualitative des phénols totaux se fait par chromatographie sur couches

minces (CCM), sur des plaques de silice. Des dépôts des différents échantillons sont effectués

sur les plaques de CCM à l’aide de pipettes Pasteur. Quinze dépôts sont réalisés pour chaque

échantillon et un séchage est effectué à la fin de chaque dépôt. Les plaques sont ensuite mises

dans une cuve contenant un système d’élution qui permet de séparer les composés des

différents extraits. Le système utilisé est : Toluène – Ethyle acétate – Acide formique

(10 : 4 : 1) car il permet une meilleure séparation des phytoconstituants. Après séchage, une

observation sous lampes UV (CN- 15LC, VILBERT LOURMAT) est effectuée à 243 ηm puis

à 354 ηm respectivement. Les couleurs obtenues sont enregistrées et leurs « RF » également.

L’utilisation de réactifs chimiques en solution, vaporisés sur les CCM, permet de

compléter les observations faites visuellement sous les lampes UV à 254 ηm (extinction de la

fluorescence) et à 365 ηm (fluorescence propre). Un choix adapté de réactifs permet de mettre

en évidence des constituants présents dans un extrait (criblage général). Il offre également

une méthode simple et rapide pour localiser un composé particulier dans un mélange. De ce

fait, une révélation est réalisée au réactif de Noeu (2 amino- ethyl- diphényle borinate à 1℅,

PEG à 5℅). Ce dernier permet une mise en évidence maximale des flavonoïdes recherchés

dans notre cas (Wagner et Bladt, 1996).

Résultats et discussion

32

Chapitre III

Résultats

Et

Discussion


33

III.1. Résultats

III.1.1. Culture du pathogène Ascochyta rabiei

A) Caractères morphologiques

a) Caractères macroscopiques

Sous les conditions déjà cités, les résultats obtenus sur milieu pois chiche nous

permettent de noter des différences macroscopiques entre les deux isolats. Selon les isolats,

l’aspect des cultures est variable par la couleur des colonies, par l’abondance du mycélium et

la vitesse de croissance. L’isolat H1 présente des colonies plus cotonneuses que l’isolat E2. Il

est de couleur brune et se développe à ras du milieu (fig.7) avec une vitesse de croissance

supérieure à celle de l’isolat E2. Alors que ce dernier présente des colonies de couleur vert

olive. Il se développe à ras du milieu (fig.7) avec une vitesse inférieure. Nous avons

également remarqué une très nette zonation chez les deux isolats.

b) Caractères microscopiques

Les deux isolats d’Ascochyta rabiei sont comparés grâce à des critères

microscopiques. Ces critères concernent les pycnides, les pycnidiospores et le mycélium. Les

différences révélées sont représentées par le tableau 7 et les figures qui suivent.

Tableau 7: Caractéristiques microscopiques des isolats H1 et E2 d’Ascochyta rabiei

Isolats couleur des

pycnides

forme des

pycnides

sporulation forme des

spores

mycéliums

H1 brun foncé forme

sphérique et

forme conique

++ extrémités

arrondies

cloisonné

E2 brun foncé forme

sphérique

++ extrémités

arrondies

cloisonné


34

B) Aspect du filtrat obtenu

Le filtrat obtenu est de couleur marron et contient une à deux colonies du

champignon. Après filtration grossière sur papier filtre, les mycéliums des deux isolats

sont récupérés et pesés. Le tableau 8 donne leurs poids respectifs.

Un passage sur papier Whatman puis sur filtre millipore est effectué. Le filtrat

obtenu est limpide, homogène et sa texture est légère (Fig.13).

Tableau 8: Poids des mycéliums des isolats H1 et E2 contenus dans 100 ml de milieu « Czapek »

L’isolat

Le poids du mycélium (g)

H1

1,542

E2

2,333

Figure 7 : Aspect macroscopique des colonies des isolats

Figure 8 : Observations microscopiques des pycnides de l’isolat coton (x 400). B: observation neutre montrant laC: observation neutre montrant la couleur et

A

H1

E2


35

Aspect macroscopique des colonies des isolats H1 et

Observations microscopiques des pycnides de l’isolat H1. A : observation neutre montrant la couleur et la forme sphérique

neutre montrant la couleur et la forme conique des pycnides (x 400

B C

H1

E2


et E2.

: observation au bleu forme sphérique des pycnides (x 400).

x 400).

Figure 9 : Observations microscopiques des pycnides de l’isolat coton (x 400). B : observation

Figure 10: Observations microscopiquecoton (x 1000), flèche : spore bicellulaire.

A


36

Observations microscopiques des pycnides de l’isolat E2. ation neutre montrant la couleur des pycnides (x 400

microscopiques des spores de l’isolat H1. A : : spore bicellulaire. B : spores non colorées de l’isolat H1

B

A

B


E2. A : observation au bleu x 400).

: après coloration au bleu H1 (x 1000).

Figure 11: Observations microscopiquecoton (x 400). B : spores colorées au bleu coton

Figure 12: Observations microscopiques des A : mycélium de l’isolat H1 colcoton (x 400).

Figure 13: Aspect du filtrat de culture utilisé pour la confrontation

A

A


37

microscopiques des spores de l’isolat E2. A : sporescolorées au bleu coton (x 1000), flèche : spore bicellulaire.

microscopiques des mycéliums d’Ascochyta rabieicoloré au bleu coton (x 400). B : mycélium de l’

Aspect du filtrat de culture utilisé pour la confrontation

B

B


spores colorées au bleu : spore bicellulaire.

Ascochyta rabiei (Pass.) Lab. mycélium de l’isolat E2 coloré au bleu

Aspect du filtrat de culture utilisé pour la confrontation

III.1.2. Culture in vitro

Les observations effectuées au bout de quelques jours montrent un début de

modification des explants. Les folioles se recourbent

A, B, C). La formation des cals se fait

obtenus varient selon les génotype

(fig. 18, 19, 20, 21).

Figure 14: Début de gonflement des tiges Ma, flèche : gonflement, B : génotype ∆2, sur le milieu flèche : recourbement.

A

C


38

vitro de l’hôte Cicer arietinum

observations effectuées au bout de quelques jours montrent un début de

modification des explants. Les folioles se recourbent (fig.14 D) et les tiges gonflent

formation des cals se fait au bout d’un mois (fig.15, 16, 17

génotypes de pois chiche, les types d’explants et le milieu de

ébut de gonflement des tiges et des feuilles. A : tiges du génotype tiges du génotype ∆3 sur le milieu N1, flèche : gonflement

milieu N1, flèche : gonflement. D : feuilles du génotype

B

D


observations effectuées au bout de quelques jours montrent un début de

et les tiges gonflent (fig.14

fig.15, 16, 17). Les pourcentages

xplants et le milieu de culture

tiges du génotype ∆1 sur milieu : gonflement. C : tiges du

feuilles du génotype ∆2 sur milieu N1,

Figure 15: Cals de tiges du génotype (flèche) de tiges sur milieu N2.

Planche 16 : Cals de feuilles et de tiges du génotype cals de tiges.

Figure 17

A

A


39

als de tiges du génotype ∆1. A : Cals (flèche) de tiges sur milieuN2.

als de feuilles et de tiges du génotype ∆2 sur milieu N1.

17: Cals de tiges du génotype ∆4 sur milieu M8

B

B


sur milieu N1, B : Cals

N1. A: cal de feuille, B:

M8.

Figure 18 : Histogramme

L’histogramme (fig.18

fonction des milieux (N1, N2

Les résultats varient selon la composition hormonale

nature (2,4D, NAA, Kinétine et BAP) et concentration

On observe que les

(MS + 2,4D 2mg/l + Kinétine 4mg/l)

sur le milieu Ma, qui se caractérise par un rapport auxine

le pourcentage est de 93,61

sont donc proches (97,5℅,

d’une auxine seule. Il est aussi

des divisions cellulaires.

D’autres pourcentages appréciables de 81,63

M8 (MS + 2,4D 2mg/l + NAA 4mg/l + Kinétine

respectivement. Le milieu

est une combinaison de deux hormones seulement (une auxine

BAP). Ces résultats permettent de déduire que l’association de deux auxines à une cytokinine

permet l’obtention de cals.

0

20

40

60

80

100

N1


40

Histogramme des Pourcentages de cals du génotype

(fig.18) donne les pourcentages de cals de tiges

N2, Ma et M8).

varient selon la composition hormonale du milieu et ceci

nature (2,4D, NAA, Kinétine et BAP) et concentration.

tiges expriment des pourcentages de cals élevés sur les milieux

Kinétine 4mg/l) et N2 (MS + 2,4D 2mg/l). Ce pourcentage est de

, qui se caractérise par un rapport auxine /cytokinine de

le pourcentage est de 93,61℅. Ce milieu ne contient qu’une auxine forte.

, 93,61℅.). Il est ainsi possible de produire des cals en présence

aussi à signaler que les auxines sont responsables

D’autres pourcentages appréciables de 81,63℅ et 70℅ sont obtenus sur les milieux

NAA 4mg/l + Kinétine 1mg/l) et N1 (MS +2,4D 3mg/l

respectivement. Le milieu M8 associe deux auxines à une cytokinine alors que le milieu

est une combinaison de deux hormones seulement (une auxine : 2,4D et une cytokinine


N2 Ma M8


génotype ∆1.

tiges et de folioles en

et ceci du point de vue

tiges expriment des pourcentages de cals élevés sur les milieux Ma

Ce pourcentage est de 97,5℅

/cytokinine de 1/2. Sur le milieu N2,

. Ce milieu ne contient qu’une auxine forte. Les deux valeurs

possible de produire des cals en présence

responsables du déclanchement

sont obtenus sur les milieux

+2,4D 3mg/l+BAP 1mg/l)

alors que le milieu N1

: 2,4D et une cytokinine :


℅ tiges

℅ feuilles

Les feuilles donnent

changent selon la composition hormonale

est signalée sur le milieu N1

est remplacée par le BAP. Une

Il est donc à signaler que le changement des cytokinines influent sur la formation de cals.

résultats permettent de noter que

callogenèse.


La figure 19 permet d’observer

56,75℅ sur le milieu N1 et le double de ce dernier

combine une forte auxine (2,

pourcentage important de cals

assez bas (7,5℅) est signalé

(2,4D). L’absence de la cytokinine semble

n’est pas le cas des tiges.

0

20

40

60

80

100

℅ tiges


41

donnent des pourcentages variant de 28 à 100

changent selon la composition hormonale du milieu. Une valeur maximale de

N1 avec un rapport auxine/cytokinine de 3. Sur ce milieu la Kinétine

Une autre valeur importante de 94℅ est observée sur le milieu

e changement des cytokinines influent sur la formation de cals.

résultats permettent de noter que le remplacement de la Kinétine par le BAP


permet d’observer un pourcentage de cals de tiges

et le double de ce dernier (92,3℅) sur le milieu

une forte auxine (2,4D) à une cytokinine (BAP). Les folioles produisent un

cals (62,5%) sur ce même milieu (N1). Un taux de cals de foliole

gnalé sur le milieu N2. Ce dernier renferme uniquement une auxine

L’absence de la cytokinine semble donc affecter la callogenèse des folioles,

℅ tiges ℅ feuilles


pourcentages variant de 28 à 100℅. Ces pourcentages

Une valeur maximale de 100℅ de cals

cytokinine de 3. Sur ce milieu la Kinétine

observée sur le milieu Ma.

e changement des cytokinines influent sur la formation de cals. Nos

Kinétine par le BAP favorise la

génotype ∆2

de tiges du génotype ∆2 de

sur le milieu N2. Le milieu N1

. Les folioles produisent un

Un taux de cals de folioles

uniquement une auxine

er la callogenèse des folioles, ce qui

N1

N2


L’histogramme (fig.

97,96℅ et 77,27% pour les tiges et les feuilles sont obtenus sur le milieu

pourcentages se rapprochant de la moitié, pour les tiges, sont observés sur les milieux

N2. On note une valeur de 66,66

Kinétine 1mg/l) et une autre valeur de 45

Un taux de callogenès

2mg/l et Kinétine 4mg/l). Alors que, les milieux

Ces résultats permettent de déduire que l’utilisation de la combinaison (2,4D/BAP) est

meilleure que celle de (NAA/ Kinétine). Il est aussi à signaler que l’association auxines/

cytokinines est favorable à l’obtention

l’auxine seule est mois satisfaisante.

folioles.

0

20

40

60

80

100

N1


42


fig.20) montre que les pourcentages de callogenèse

77,27% pour les tiges et les feuilles sont obtenus sur le milieu

pourcentages se rapprochant de la moitié, pour les tiges, sont observés sur les milieux

note une valeur de 66,66℅ sur le milieu M8 (MS + 2,4D 2mg/l +

Kinétine 1mg/l) et une autre valeur de 45℅ sur le milieu N2 (MS + 2,4D 2mg/l)

Un taux de callogenèse de folioles de 10℅ est relevé sur le milieu

. Alors que, les milieux N2 et M8 ne donnent pas de cals de folioles.


que celle de (NAA/ Kinétine). Il est aussi à signaler que l’association auxines/

cytokinines est favorable à l’obtention de cals de tiges et de folioles, alors que l’utilisation de

l’auxine seule est mois satisfaisante. Cette dernière ne permet pas la production de cals de

N2 Ma M8


génotype ∆3.

callogenèse les plus élevés

77,27% pour les tiges et les feuilles sont obtenus sur le milieu N1. Des

pourcentages se rapprochant de la moitié, pour les tiges, sont observés sur les milieux M8 et

D 2mg/l + NAA 4mg/l +

2,4D 2mg/l).

sur le milieu Ma (MS+2,4D

ne donnent pas de cals de folioles.


que celle de (NAA/ Kinétine). Il est aussi à signaler que l’association auxines/

, alors que l’utilisation de

Cette dernière ne permet pas la production de cals de

℅ tiges

℅ feuilles

Figure 21 : Histogramm

On observe à travers

20% à 86,21%). Les tiges donnent des taux de cals proches

milieux N2, M8 et Ma respectivement. Ces taux sont

révèlent des valeurs de 40℅

milieu N1 ou le pourcentage de cals

Le premier repiquage

quelques cals est observé. Les cals bruni

de charbon actif. Le charbon adsorbe les phénols responsables du

de la callogenèse est observée au bout de 8 jours

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

N1


43


observe à travers l’histogramme (fig.21) que les pourcenta

%). Les tiges donnent des taux de cals proches (59℅, 58

respectivement. Ces taux sont supérieurs à ceux des folioles

℅, 36,66℅ et 20℅ sur les milieux M8, Ma et

ou le pourcentage de cals de folioles est le plus élevé (86,21%)

premier repiquage des cals est réalisé sur le milieu N1. U

Les cals brunis sont repiqués sur le milieu N1

Le charbon adsorbe les phénols responsables du brunissement.

est observée au bout de 8 jours (fig.22, 23, 24, 25).

N2 Ma M8


génotype ∆4

que les pourcentages de cals varient de

℅, 58℅ et 57℅) sur les

supérieurs à ceux des folioles, qui

et N2, à l’exception du

lioles est le plus élevé (86,21%).

. Un brunissement de

N1 (MS 1/2) additionné

brunissement. Une reprise

℅ tiges

℅ feuilles

Aspect des cals obtenu

Figure 22: Cals du génotype feuilles, C, D : cals de tiges. Flèches


A

C

A

C


44

cals obtenus après repiquage sur les nouveaux

als du génotype ∆1 après repiquage sur le nouveau milieuFlèches : cals.

als du génotype ∆2 après repiquage sur le nouveau milieu Flèches : cals.

B

D

B

D


après repiquage sur les nouveaux milieux N1

après repiquage sur le nouveau milieu N1. A, B : cals de



Figure 25: Cals du génotype feuilles, C, D : cals de tiges.

A

C

A

C


45

als du génotype ∆3 après repiquage sur le nouveau milieu Flèches : cals.

als du génotype ∆4 après repiquage sur le nouveau milieu

B

D

B

D




III. 1.3. Confrontation

L’évolution des cals confrontés est observée d’une manière suivie et comparée à

celle des cals témoins. Aucun changement n’est remarqué

confrontation (fig.26).

génotypes est observé. A

29, 30).

Après huit jours de confrontation, tous les cals sont devenus bruns foncés par

rapport aux témoins, ce qui indique une accumulation de phénols.

Figure 26: Aspect de quconfrontation. F : feuilles, H1 : isolat H1 d’Ascochyta rabiei.


46

Confrontation


celle des cals témoins. Aucun changement n’est remarqué durant les 24h suivant la

Au bout de 72h, un brunissement des cals

est observé. Aucun changement n’est signalé au niveau des témoins


ce qui indique une accumulation de phénols.

spect de quelques cals confrontés et de leurs témoins après 24h T : tiges, ∆1 : génotype INRA 199, ∆4 : génotype FLIP

rabiei. Tm : témoin.

F/Δ1/H1

T/Δ1/ H1

F/Δ1/ Tm

T/ Δ1/ Tm

T/Δ4/H1 T/Δ4/Tm



durant les 24h suivant la

bout de 72h, un brunissement des cals au sein de tous les

ucun changement n’est signalé au niveau des témoins (fig.27, 28,


leurs témoins après 24h de génotype FLIP 82-150C,

F/Δ1/ Tm

Δ1/ Tm

T/Δ4/Tm

Figure 27: Aspect des calsde confrontation. F : feuilles, rabiei. Tm : témoin. Flèches

Figure 28: Aspect des cals du génotype T : tiges, ∆2 : génotype Twistbrunissement.


47

Aspect des cals du génotype ∆1 et de leurs témoins après 72feuilles, T : tiges, ∆1 : génotype INRA 199, H1 :

: brunissement.

Aspect des cals du génotype ∆2 et de leurs témoins après 72génotype Twist, E2 : isolat E2 d’Ascochyta rabiei. Tm

F/Δ1/H1 F/Δ1/Tm

T/Δ1/H1 T/Δ1/Tm

T/Δ2/E2 T/Δ2/Tm


et de leurs témoins après 72h : isolat H1 d’Ascochyta

et de leurs témoins après 72h de confrontation. Tm : témoin. Flèches :

F/Δ1/Tm

T/Δ2/Tm

Figure 29 : Aspect des cals du génotype confrontation. F : feuilles, TTm : témoin. Flèches : brunissement.

Figure 30 : Aspect des cals du F : feuilles, T : tiges, ∆4 : génotype FLIP d’Ascochyta rabiei Tm : témoin.


48

Aspect des cals du génotype ∆3 et de leurs témoins après 72h de T : tiges, ∆3 : génotype FLIP 84-92C, E2 : isolat E2

brunissement.

Aspect des cals du génotype ∆4 et de leurs témoins après 72génotype FLIP 82-150C, E2 : isolat E2 d’Ascochyta

témoin. Flèches : brunissement.

F/Δ4/H1

T/Δ3/E2 T/ Δ3/Tm

F/Δ3/E2 F/Δ3/Tm

T/Δ4/E2 T/Δ4/Tm

F/Δ4/Tm


et de leurs témoins après 72h de isolat E2 d’Ascochyta rabiei.

et de leurs témoins après 72h de confrontation. Ascochyta rabiei. H1 : isolat H1

Δ3/Tm

F/Δ3/Tm

T/Δ4/Tm

F/Δ4/Tm


49

III.1.3.1. Dosage quantitatif des phénols totaux

A) Courbe d’étalonnage

La teneur des polyphénols est obtenue à partir d’une courbe d’étalonnage établie avec

des concentrations croissantes en acide gallique (fig.31). Elle est exprimée en milligrammes

d’acide gallique par gramme d’extrait (mg AG/g).

Figure 31 : Courbe étalon de l’acide gallique.

B) Détermination de la teneur des phénols totaux

L’étude quantitative des extraits méthanoliques des différents échantillons a pour but

de déterminer la teneur des phénols totaux produits par les différents cals. Les mesures des

densités sont réalisées à 760ηm. Les quantités de phénols correspondantes sont rapportées en

milligrammes d’équivalent de l’étalon utilisé par gramme de poudre de cal frais (mg EAG/g).

Elles sont déterminées par equation de régression de type : y = ax + b. La figure 32 donne les

différentes valeurs obtenues.

y = 83,5x + 0,076

R² = 0,991

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 0,001 0,002 0,003

Abs

orba

nce

à 76

0 nm

Concentration de l'acide gallique mg/ ml


50

Figure 32 : Histogramme des teneurs de phénols des cals (tiges et folioles) des génotypes (∆1, ∆2, ∆3) de pois chiche confrontés aux deux isolats (H1etE2) d’Ascochyta rabiei.

Les cals témoins produisent des phénols dont les teneurs varient de 0.53mg/g à

0,72mg/g. Les quantités de phénols produites par les témoins sont inférieures à celles issues

des cals traités au filtrat filtré d’Ascochyta rabiei. Il est à signaler deux cas où les teneurs de

phénols des témoins sont légèrement supérieures à celles des cals confrontés. Les cals de tiges

témoins du génotype ∆2 présentent une quantité de 1.77mg/g alors que les cals confrontés

donnent une valeur de 1.38mg/g. Les cals des tiges témoins du génotype ∆3 produisent une

quantité de 0.98mg/g. Cette dernière est supérieure à celle produite par les cals de tiges

confrontés à l’isolat H1 qui est de 0.58mg/g.

Les valeurs maximales sont obtenues au niveau du génotype ∆1 et ceci par les explants

de feuilles. Une valeur de 3.85mg/g est observée chez les explants confrontés à l’isolat H1.

Cette dernière est le double de ceux confrontés à l’isolat E2 (1.84mg/g).

0,535

1,453

1,775

1,49

0,988

0,72

1,36

1,84

1,3851,144 1,141

3,85

1,689

0,585

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

tige Δ1 feuille Δ1 tige Δ2 feuille Δ2 tige Δ3 feuille Δ3

Témoin

confronté/E2

confronté/H1


51

Les cals de tiges du génotype ∆2 confrontés à l’isolat E2, produisent la même quantité

de phénols (1.38 mg/g) que celle des cals de tiges du génotype ∆1 confrontés à ce même

isolat. Les cals de feuilles témoins des deux génotypes produisent également la même

quantité de phénols (1.49mg/g). Les cals de folioles du génotype ∆2 confrontés à l’isolat H1

produisent une quantité inférieure (1.68 mg/g) à celle des cals de folioles du génotype ∆1

(3,85mg/g).

Les cals provenant des organes du génotype ∆3 donnent les teneurs de phénols les plus

faibles. Les cals de tiges confrontés à l’isolat E2 produisent une quantité s’estimant à

1.14mg/g. Cette dernière est le double de celle révélée par la confrontation à l’isolat H1

(0.58mg/g).

Les résultats obtenus montrent que le génotype ∆1 produit des quantités maximales de

phénols. Le génotype ∆2 produit des quantités de phénols inférieures. Les cals du génotype

∆3 donnent les teneurs les plus faibles. L’isolat H1 se révèle plus agressif par rapport aux

cals de folioles du génotype ∆1, car il suscite une production de phénols plus importante que

dans le cas de l’isolat E2. Les cals de tiges du génotype ∆3 confrontés donnent des résultats

contraires. C’est l’isolat E2 qui suscite une synthèse de phénols plus élevée.

III.1.3.2. Dosage qualitatif des phénols totaux (résultats de la CCM)

La lecture des plaques de CCM se fait avant et après révélation au réactif de Neu.

Les quinchings (Q) sont notés à 254 ηm et les couleurs à 365 ηm avant et après révélation

au réactif de Neu (fig.33).

Les couleurs des spots obtenues pour chaque échantillon ainsi que les rapports des

distances de migration (RF) sont donnés par les tableaux (9, 10, 11).

Avant révélation

Figure 33: Observations des plaques de la chromatographierévélation respectivement. Les couleurs sont observées à 365témoin du génotype ∆1, B : feuillefeuille témoin ∆3. 1 : tige ∆1 confrontfeuille ∆1 confronté à l’isolat H1, tige ∆2 confronté à l’isolat E2, 7∆3 confronté à l’isolat E2, 10 : feuille

A B C D E F

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11

Avant révélation

Avant révélation


52

Quinching

bservations des plaques de la chromatographie sous lampe UV, avant et après Les couleurs sont observées à 365ηm et les quinchings à 254

feuille témoin ∆1, C : tige témoin ∆2, D : feuille témoin ∆1 confronté à l’isolat H1 d’Ascochyta rabiei, 2 : tige ∆1 confront

é à l’isolat H1, 4 : feuille ∆1 confronté à l’isolat E2, 5 : tige ∆2 confront7 : feuille ∆2 confronté à l’isolat H1, 8 : tige ∆3 confrontfeuille ∆3 confronté à l’isolat H1, 11 : feuille ∆3 confront

A B C D E F A B C D E F A B C D E F

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 7 8 9 10 11

Avant révélation Quinching

Avant révélation Quinching Après révélation

1 2 3 4 5 6


Après révélation

sous lampe UV, avant et après quinchings à 254 ηm. A : tige

∆2, E : tige témoin ∆3, F : ∆1 confronté à l’isolat E2, 3 : ∆2 confronté à l’isolat H1, 6 :

3 confronté à l’isolat H1, 9 : tige 3 confronté à l’isolat E2.

A B C D E F

7 8 9 10 11

Après révélation

Quinching Après révélation

1 2 3 4 5 6


53

Il y’a apparition de nouvelles bandes colorées après pulvérisation du réactif de Neu

sur les plaques de CCM. Les couleurs des bandes déjà présentes avant la révélation

s’intensifient après cette dernière. C’est une réaction au réactif de Neu. Cette dernière indique

la nature phénolique des composés. Plusieurs bandes donnent des quinchings à 254ηm et

certaines d’entre elles donnent une couleur après révélation. Ces bandes représentent des

flavonoïdes, ce qui peut confirmer l’implication de ces composés phénoliques dans la

résistance. Il est aussi à signaler que les bandes apparues diffèrent d’un génotype à un autre et

d’un explant à un autre.

Les tableaux (9, 10, 11) mentionnent que le nombre de spots apparus est différent

selon les génotypes, le type d’explant et le type d’isolat auquel sont confrontés les cals. La

nature des composés phénoliques produits est aussi différente selon ces mêmes critères. Les

composés phénoliques produits sont donc différents d’un génotype à un autre.

Ces observations mettent en évidence une production de composés phénoliques et de

flavonoïdes au sein de tous les génotypes de Cicer arietinum. La production de flavonoïdes se

fait en réponse à un stress et elle est notée au niveau des cals confrontés et non confrontés. La

présence des composés phénoliques chez les cals non confrontés peut être due au stress de la

culture in vitro.


54

Tableau 9 : Les couleurs et les « RF » de la chromatographie du génotype ∆1 de Cicer arietinum.

Couleur

RF

Tige ∆1 témoin

Tige ∆1 / H1

Tige ∆1 /E2

Feuille ∆1 témoin

Feuille ∆1 / H1

Feuille ∆1 / E2

Jaune clair 0,18 0,36 0,71

- - -

- - -

- + -

+ + -

- - -

- - +

Jaune vert 0,76

+

-

-

+

-

-

Jaune fluorescent (Apparu après révélation)

0,44 0,65

+ -

+ -

- +

+ +

- -

- +

Vert clair (Apparu après révélation)

Bleu violet 0,31 0,58 1

+ - +

- + +

- + +

- + +

- + +

- + +

Beige (Apparu après révélation)

0,38 0,51

- -

- -

- -

- +

- -

+ -

Blanc 0,13 0,65

- -

- -

+ +

- -

- -

- -


55


Couleur

RF

Tige ∆2 témoin

Tige ∆2 / H1

Tige ∆2 /E2

Feuille ∆2 témoin

Feuille ∆2 / H1

Jaune clair

0,17 0,33

+ +

- -

- -

+ -

- -

Jaune vert

0,74

+

-

-

+

-

Jaune fluorescent (Apparu après révélation)

0,45 0,69

+ -

+ -

+ -

+ -

+ +

Vert clair (Apparu après révélation)

0,37 0,71

- -

+ -

+ -

- -

- +

Bleu violet

0,23 0,60 1

- + +

- - +

- - +

- + +

+ + +

Beige (Apparu après révélation)

0,52

+

-

-

+

-

Blanc

0,12 0,64

- -

- +

- +

- -

+ -


56


Couleur

RF

Tige ∆3

témoin

Tige ∆3 /

H1

Tige ∆3

/E2

Feuille

∆3

témoin

Feuille

∆3 / H1

Feuille

∆3 / E2

Jaune clair

0,30

+

-

-

+

+

-

Jaune vert

0,75

+

-

-

+

-

-

Jaune

fluorescent

(Apparu

après

révélation)

0,12

0,44

0,70

- + -

-

-

-

-

-

-

-

+ +

-

-

-

+ - +

Vert clair

(Apparu

après

révélation)

0,41

0,65

-

-

+

-

+

-

-

-

-

-

+ +

Bleu violet

0,27 0,60

1

+

+

+

- + +

-

+

+

-

+

+

-

-

+

+ + +

Beige (Apparu

après

révélation)

0,16

0,46

-

+

-

-

-

-

+ +

-

-

-

-

Blanc

0,11

-

-

+

-

-

-


57

III.2. Discussion des résultats

III.2.1. Cas de la culture in vitro

Nos travaux indiquent que l’induction de la callogenèse se fait au bout de dix à

quatorze jours. Tous les auteurs obtiennent un début de callogenèse dans ces mêmes délais.

La callogenèse de Cicer arietinum est influencée par les combinaisons hormonales

(nature et concentrations), la nature de l’explant (tiges ou folioles) et le génotype. Les folioles

de Cicer arietinum des génotypes 6153 et C235, ont donné des taux de callogenèse sur le

milieu MS additionné d’auxines et de cytokinines (Riazuddin et al., 1988 ; Barna et

Wakhulu, 1994). Les travaux de Morjane et Harrabi, 1993 effectués sur les racines de Cicer

arietinum cv.Amdoun, signalent que le milieu MS contenant des cytokinines associées à des

auxines donne des cals. Par ailleurs, Bouabdallah, 1986 a signalé l’initiation de la callogenèse

en présence d’auxines et de cytokinines. Ses travaux sont effectués sur le melon (Cucumis

melo).

Une importante callogenèse de folioles et de tiges a été initiée en présence de

2,4D (3mg/l) et de BAP (1mg/l) avec un rapport auxine/cytokinine égal à 3. Les travaux de

Huda et al,. 2003a et Huda et al., 2003b utilisant des cotylédons de Cicer arietinum, ont

permis d’obtenir un taux de callogenèse très élevé en présence de cette même combinaison

hormonale.

Sagare et al., 1993 ont obtenu de bons taux de callogenèse de segments

cotylédonaires de Cicer arietinum (C235) avec la même composition hormonale, mais en

utilisant des concentrations différentes (3mg/l de 2,4D et 0,1mg/l de BAP) . Naz et al., 2008a

ont également observé de bons pourcentages de cals de cotylédons et de folioles de pois

chiche (génotypes : CV, CM72) sur cette combinaison hormonale.

Le remplacement du BAP par la kinétine et le 2,4D par le NAA est favorable à la

production de cals d’entre nœuds et de folioles. Kumar et al., 1994 ont utilisé la balance

hormonale 2,4D/ Kinétine. Ils ont obtenu des cals de folioles de Cicer arietinum (C235). Par

ailleurs, Huda et al., 2000 ont initié une callogenèse d’entre nœuds de tiges de pois chiche en

remplaçant le 2,4D par le NAA . Ils ont obtenu des cals sur le milieu

MS + NAA (3mg /l) + BAP (3mg/l). Il est aussi à signaler que Huda et al., 2001 ont observé

une bonne callogenèse d’anthères de Cicer arirtinum (génotype Nabin) sur le milieu MS

additionné de NAA (2mg/l) et de BAP (2mg/l).


58

Un autre taux de callogenèse appréciable est observé pour le génotype ICCL 83105, sur le

milieu MS additionné de NAA (2mg/l) et de BAP (1mg/l). Arora et Chawla, 2005 ont

également initié une callogenèse sur ce même milieu. Un pourcentage maximal de cals de

cotylédons de Cicer arirtinum (génotypes : Pusa 256 et PG 186) est noté.

Une callogenèse appréciable de tiges des génotypes testés est signalée en présence de

2,4D seul. Singh et al., 1999 ont obtenu des cals chez Cicer arietinum en utilisant 2mg/l de

2,4D. Huda et al., 2003a ont signalé que le 2,4D sans cytokinines induit une callogenèse. Il

est à signaler que l’utilisation de l’auxine seule permet d’initier une callogenèse de folioles de

Cicer arietinum (C235). L’emploi du 2,4D seule est meilleur que celui du NAA (Barna et

Wakhulu, 1993 ; Barna et Wakhulu, 1994). Morjane et Harrabi, 1993 ont observé une

callogenèse sur le milieu MS additionné de 2,4D seul. Des explants de racines de Cicer

arietinum (cv.Amdoun) ont ainsi donné des cals sur le milieu MS contenant du 2,4D (1 mg/l)

et (2 mg/l).

La combinaison regroupant trois hormones telles que deux auxines et une cytokinine

(2,4D, NAA et Kinétine) a permit une callogenèse moyenne. Naz et al., 2008b ont utilisé la

même balance hormonale, sauf que la Kinétine est remplacée par le BAP. Ils ont obtenu des

cals de cotylédons et de folioles de pois chiche.


59

III.2.2. Cas de la confrontation

Le contact plante- pathogène induit une réaction d’hypersensibilité. Elle se caractérise

par une nécrose pigmentée. La réaction est également accompagnée d’une stimulation de

production intense de phytoalexines. La synthèse de ces dernières se fait suite à un stress

(Rouxel, 1989; Solecka, 1997) et leur accumulation permet de limiter la croissance du

pathogène. Au niveau des plantes résistantes, la défense est basée sur l’accumulation des

phytoalexines sur le site d’infection (Chérif et al., 2007). Les phytoalexines caractéristiques

des légumineuses sont les flavonoïdes (composés phénoliques).

Dans le but d’étudier les interactions hôte-pathogène, nous avons confronté des cals de

Cicer arietinum au filtrat filtré d’Ascochyta rabiei et tenter d’estimer la quantité de phénols

produite par les cals traités et non traités. Des travaux concernant l’interaction cals de Cicer

arietinum- filtrat filtré d’Ascochyta rabiei et la production de phénols ne sont pas signalés par

la bibliographie. Singh et al., 1999 ont confronté les cals de Cicer arietinum au filtrat

d’Ascochya rabiei . Ils se sont intéressés à la croissance des cals après confrontation.

Les observations montrent un brunissement des cals correspondant à une production

de phénols. Cette production est variable selon les cals témoins et confrontés, mais aussi

selon le génotype (résistant ou tolérant) et l’isolat. De nombreux travaux ont signalé la

production des phénols qui se manifeste par un brunissement ou des nécroses lors des

interactions filtrat-pathogène.

Khouaidjia, 2000 a confronté le filtrat filtré d’Ascochyta rabiei aux semences et

plantules de Cicer arietinum. L’apparition de zones brunâtres et de nécroses sur les graines,

les tiges et les pétioles des génotypes sensibles est observée. Par contre, aucune anomalie

n’est enregistrée chez les génotypes résistants.

Singh et al., 2003 ont confronté les cals de Cicer arietinum au filtrat filtré du

Fusarium oxysporum f.sp. ciceri. Ils ont estimé la quantité de phénols des cals. Les

génotypes résistants produisent des valeurs maximales. Parkash et al., 1994 ont également

confronté les cals de Cicer arietinum au filtrat de culture du Fusarium oxysporum f.sp. ciceri.

Leurs résultats démontrent que la teneur des phénols est plus importante chez les génotypes

résistants.


60

Vogelsang et al., 1994 ont mis en contact le filtrat d’Ascochyta rabiei à une

suspension cellulaire de pois chiche. Ils ont ainsi observé un brunissement des cellules du

génotype résistant. Le brunissement est du à la production d’isoflavonoïdes. Un test au bleu

de toluidine indique l’accumulation des composés phénoliques dans les parois cellulaires des

génotypes résistants. Ces résultats ne sont pas observés au niveau des génotypes sensibles.

Kessmann et Barz, 1986 ont traité les cotylédons de Cicer arietinum à un éliciteur

obtenu à partir du milieu de croissance d’Ascochyta rabiei. Une augmentation d’isoflavones

est signalée. Par ailleurs, Kessmann et Barz, 1987 ont démontré que la production des phénols

augmente après élicitation et que les quantités varient selon le génotype. Ces résultats ont été

confirmés au niveau des plantes et des cultures cellulaires de Cicer arietinum, après utilisation

d’éliciteurs d’Ascochyta rabiei. Daniel et al., 1990 ont noté la production élevée de

phytoalexines par les génotypes résistants de Cicer arietinum. Ceci est observé après

confrontation de suspensions cellulaires de Cicer arietinum à un polysaccharide d’Ascochyta

rabiei. Hinderer et al., 1987 ont également signalé une accumulation de phytoalexines chez

les cellules de Cicer arietinum. Cette accumulation se fait après confrontation des suspensions

cellulaires du pois chiche à une préparation enzymatique d’hydrolases.

Khan et al., 2005 ont inoculé les racines de Cicer arietinum au filtrat de culture du

Fusarium oxysporum f.sp. ciceri. L’estimation de la quantité des phénols s’est faite avant et

après traitement. Elle a pu révéler une augmentation de production de phénols suite au

traitement. Il est aussi à signaler que les génotypes résistants produisent des quantités

supérieures par rapport aux sensibles.

Saikia et al., 2006 ont étudié les couples hôte-pathogène : Cicer arietinum- Fusarium

f.sp. ciceri et Cicer arietinum- Macrophomina phaseolina. Leur travail consiste à traiter les

graines aux protéines de la paroi cellulaire du pathogène. Un dosage de phénols est effectué

par la suite. Ils ont signalé une augmentation de la synthèse des phénols après confrontation.

L’étude de Khan et al., 2010 sur l’interaction : suspension cellulaire de pois

chiche-filtrat de Candida albicans, a démontré la production de phénols dans le cadre de la

résistance.


61

Koike et al., 1992 ont étudié l’interaction filtrat du Verticillium Albo-atrum-cal

d’Alfalfa. Leurs résultats soulignent la production de phytoalexines à des concentrations plus

élevées chez les génotypes résistants.

Il est aussi à signaler que Ahiahonu, 2003 a obtenu des phytoalexines à partir de

génotypes résistants de céréales. Pour cela, il a confronté des plantes à un éliciteur.

Par ailleurs, les travaux de Nyance et al., 1993 ont également abouti à une nécrose des

cals de cafier (Coffea arabica) confrontés au filtrat du champignon Colletotrichum coffeanum.

.

Conclusion

62

Conclusion

Conclusion

63

Une callogenèse est initiée chez le pois chiche Cicer arietinum. Les résultats obtenus

sont influencés par le génotype, l’organe (tiges ou folioles) et la balance hormonale (nature et

concentration). Une importante callogenèse est enregistrée sur le milieu MS additionné de

3mg/l de 2,4D et 1mg/l de BAP (N1) chez les tiges et folioles des génotypes de pois chiche.

Le milieu N2 renfermant uniquement une auxine (2mg/l de 2,4D), s’est montré très

favorable à la callogenèse des tiges du génotype INRA 199. Les résultats sont moyens pour

les autres génotypes. Les deux autres milieux Ma (2mg/l de 2,4D et 4mg/l de Kinétine) et M8

(2mg/l de 2,4D, 4mg/l de NAA et 1mg/l de Kinétine), ont donné une bonne callogenèse de

tiges du génotype INRA 199. Des résultats moyens sont obtenus chez les autres génotypes.

Les résultats obtenus montrent qu’il y’a production de phénols lors de l’interaction

cals de Cicer arietinum et filtrat filtré d’Ascochyta rabiei. Elle est influencée par la

provenance du cal (génotype résistant ou sensible), l’organe (tiges ou folioles) et l’isolat

(H1ou E2).

Les cals confrontés produisent plus de phénols que les cals non traités. Les quantités

produites par les cals de tiges et de folioles du génotype résistant INRA 199 sont les plus

élevées en présence des isolats (H1 et E2).

Les cals de folioles et de tiges du génotype Twist (sensible), présentent moins de

phénols que le génotype INRA 199 confrontés aux deux isolats. Chez ce même génotype, les

cals de folioles produisent plus de phénols en présence de l’isolat H1.

L’analyse qualitative des extraits permet de confirmer que les substances dosées sont

des phénols et des flavonoïdes. Ces derniers sont les composés caractéristiques des

phytoalexines chez le pois chiche (légumineuses). Elles sont produites probablement en

réponse au contenu (enzymes et toxines) du filtrat filtré d’Ascochyta rabiei.

Cette étude a probablement démontré l’implication des phytoalexines dans le

phénomène de résistance des cals de pois chiche à l’agent de l’anthracnose Ascochyta rabiei.

Bibliographie

64

Références

Bibliographiques

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Annexes

74

Annexes

Annexes

75

Pourcentages de callogenèse

Tableau 1 : Pourcentages de cals du génotype INRA 199 sur les différents milieux de culture

Pourcentage

de cals de

tiges (℅)

Pourcentage

de cals de

folioles (℅)

milieu 2,4D (mg/l) BAP (mg/l) Kinétine

(mg/l)

NAA (mg/l)

70 100 N1 3 1 / /

93,61 35 N2 2 / / /

97,5 94 Ma 2 / 4 /

81,63 28 M8 2 / 1 4

Tableau 2 : Pourcentages de cals du génotype Twist sur les différents milieux de culture

Pourcentage

de cals de

tiges (℅)

Pourcentage

de cals de

folioles (℅)


(mg/l)

NAA (mg/l)

92,30 62,5 N1 3 1 / /

56,75 7,5 N2 2 / / /

Tableau 3 : Pourcentages de cals du génotype FLIP 84-92C sur les différents milieux de culture

Pourcentage

de cals de

tiges (℅)

Pourcentage

de cals de

folioles (℅)


(mg/l)

NAA (mg/l)

97,96 77,27 N1 3 1 / /

45 0 N2 2 / / /

/ 10 Ma 2 / 4 /

66,66 0 M8 2 / 1 4

Tableau 4 : Pourcentages de cals du génotype FLIP 82-150C sur les différents milieux de culture

Pourcentage

de cals de

tiges (℅)

Pourcentage

de cals de

folioles (℅)


(mg/l)

NAA (mg/l)

61,29 86,21 N1 3 1 / /

59 20 N2 2 / / /

57 40 Ma 2 / 4 /

58 36,66 M8 2 / 1 4

Annexes

76

Expression des résultats des phénols totaux

On prend l’exemple : feuilles du génotype INRA 199 de Cicer arietinum, confrontées

à l’isolat H1 d’Ascochyta rabiei. Il présente une première DO de 0,857 et une deuxième DO

de 0,827.

- Pour la première valeur de DO :

D’après la courbe d’étalonnage, l’équation est la suivante :

y = 83,5x + 0,076 x = (y + 0,076) / 83,5 avec y = DO

x = (0,857 + 0,076) / 83,5

x = 0,009 mg/ml.

On multiplie x par 21 qui est le facteur de dilution de notre échantillon. Car, le volume

déposé de l’échantillon est de 100 µl, et le volume réactionnel est de 2100 µl. Ainsi,

100 µl/ 2100 µl = 1/ 21.

Donc x´ = x × 21 = 0,009 × 21 = 0,196 mg/l.

La solution mère des échantillons est à une concentration de 0,1 g/ml.

On a donc : 0,196 mg/ml 0,1 g/ml.

x´´ 1000mg (1g).

Ainsi, x´´ = (0,196 × 1×103) / 0,1

x´´ = 1,96 mg

On multiplie 1,96 par 2, car nous avons prélevé 50 µl d’échantillon. Ainsi,

l’échantillon fut dilué 2 fois.

Donc: x´´ = 1,96 × 2 = 3,925 mg.

- Pour la seconde valeur de DO soit 0,827:

D’après la courbe d’étalonnage l’équation est la suivante :

y = 83,5x + 0,076 x = (y + 0,076) / 83,5 avec y = DO

x = (0,827 + 0,076) / 83,5

x = 0,009 mg/ml.

Annexes

77

On multiplie x par 21 qui est le facteur de dilution de notre échantillon. Car, le volume

déposé de l’échantillon est de 100 µl, et le volume réactionnel est de 2100 µl. Ainsi,

100 µl/ 2100 µl = 1/ 21.

Donc x´ = x × 21 = 0,009 × 21 = 0,189 mg/l.

La solution mère des échantillons est à une concentration de 0,1 g/ml.

On a donc 0,189 mg/ml 0,1 g/ml

x´´ 1000mg (1g).

Ainsi, x´´ = (0,189 × 1×103) / 0,1

x´´ = 1,89 mg

On multiplie 1,89 par 2, car nous avons prélevé 50 µl d’échantillon. Ainsi,

l’échantillon fut dilué 2 fois.

Donc x´´ = 1,89 × 2 = 3,774 mg.

On établie une moyenne entre les deux teneurs de polyphénols obtenues. Elle est de

3,85 mg. Ainsi, les feuilles du génotype INRA 199 produisent une quantité de 3,85 mg par g

de cal.

Ecarts types des dosages quantitatifs de phénols

Tableau 4 : Teneurs et écarts types des témoins

Témoins

Teneur des phénols (mg/g) Ecart type

Tm tige Δ1 0,535 0,06 Tm feuille ∆1 1,453 0,016

Tm tige ∆2 1,775 0,084 Tm feuille ∆2 1,49 0,06 Tm tige ∆3 0,988 0,036 Tm feuille ∆3 0,72 /

Annexes

78

Tableau 5: Teneurs et écarts types des cals confrontés à l’isolat E2

Confronté/E2 Teneur des phénols (mg/g) Ecart type

tige Δ1/E2 1,36 0,06 feuille ∆1/ E2 1,84 0,034 tige ∆2/E2 1,385 0,036 tige ∆3/E2 1,144 0,004 feuille ∆3/ E2 1,141 0,201

Tableau 6: Teneurs et écarts types des cals confrontés à l’isolat H1

Confronté/H1

Teneur des phénols (mg/g) Ecart type

feuille ∆1/ H1 3,85 0,053 feuille ∆2/ H1 1,689 / tige ∆3/ H1 0,585 0,004

Calcul des RF

C’est le rapport de la distance de migration du composé par le seuil de migration du

solvant.

Exemple :

• Le seuil de migration du solvant est de 10 cm.

• La distance de migration du composé est de 5 cm.

RF = 5/10 = 0,50.

etude des effets du filtrat filtré d’ascochyta rabiei (pass.) lab....

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