estudo da interferência de fármacos, que atuam via receptores … · gaba no metabolismo do t....

FLAacuteVIA SILVA DAMASCENO

Estudo da interferecircncia de faacutermacos que atuam via

receptores eou transportadores de GABA e Glutamato

no ciclo de vida do Trypanosoma cruzi

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-

Graduaccedilatildeo em Biologia da Relaccedilatildeo Patoacutegeno-

Hospedeiro do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da

Universidade de Satildeo Paulo para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo

de Mestre em Ciecircncias

Satildeo Paulo

2013










Aacuterea de concentraccedilatildeo Biologia da Relaccedilatildeo

Patoacutegeno-Hospedeiro

Orientador Prof Dr Ariel Mariano Silber

Versatildeo corrigida A versatildeo original eletrocircnica

encontra-se disponiacutevel tanto na Biblioteca do ICB

quanto na Biblioteca Digital de Teses e Dissertaccedilotildees

da USP (BDTD)

Satildeo Paulo

2013

Trabalho realizado com auxiacutelios financeiros

concedido pela Fundaccedilatildeo de Amparo a

Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo

(FAPESP) Instituto Nacional de

Biotecnologia Estrutural e Quiacutemica

Medicinal em Doenccedilas Infecciosas

(INBEQMeDI) e Conselho Nacional de

Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico

(CNPq)

Aos meus Pais Flamarion e Maria Nasareacute pelo

apoio amor e compreensatildeo incondicionais

AGRADECIMENTOS

Ao Prof Dr Ariel Mariano Silber pela grande oportunidade que me concedeu pela

orientaccedilatildeo paciecircncia apoio e amizade Obrigada por tudo

Agrave Elizabeth Pral teacutecnica do laboratoacuterio pelo apoio amizade ajuda e todo o suporte teacutecnico

Agrave minha amiga Mariacutea Julia Bariacuteson pela amizade apoio ajuda nos experimentos e nas

discussotildees dos resultados

Agrave minha famiacutelia meus pais Flamarion e Maria Nasareacute meus irmatildeos(atildes) Gilberto Gilmar

Gilson Gilsa Gildo Gildete e Jacoacute meus sobrinhos(as) Mariane Mateus Gisely Ceciacutelia

Nataacutelia Isabele Laviacutenia Maria e Venacircncio pelo apoio compreensatildeo e incentivo em todos os

momentos

Agrave minha amiga Valnia Pita por me fazer acreditar que era possiacutevel a realizaccedilatildeo desse sonho e

pelo apoio e estiacutemulo nessa caminhada

Aos meus amigos(as) do laboratoacuterio Raiacutessa Melo Marcell Crispim Sandra Carla Higo

Fernando Inga Eva Jean Douglas Carolina Manchola Ludmila Nakamura Brian Suarez

Rossana Duque e Letiacutecia Marchese pelo apoio ajuda e amizade

Ao Prof Dr Carsten Wrenger e seu grupo Flaacutevia Zimbres Kamila Meissner Jasmin

Lindner Thales Kronenberger

A Dra Lisvane Paes pelo apoio amizade e colaboraccedilatildeo nesse trabalho

Ao Prof Dr Joseacute Roberto Meyer-Fernandes (UFRJ) e aos integrantes do seu laboratoacuterio pela

disponibilidade e ajuda em alguns experimentos

Agrave Profa Dra Alicia J Kowaltowski do Instituto de Quiacutemica e aos integrantes do seu

laboratoacuterio pela disponibilidade do uso de equipamentos

Ao Prof Dr Gerhard Wunderlich e integrantes do seu laboratoacuterio em especial ao doutorando

Wesley Fotoran pela disponibilidade do uso de equipamentos e ajuda em alguns

experimentos

Agrave Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) pelo suporte

financeiro

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) pelo suporte

financeiro no primeiro ano desse trabalho

Agrave todos os professores funcionaacuterios e colegas do Departamento de Parasitologia (ICB-USP)

pelo apoio e convivecircncia

ldquoNunca deixe que lhe digam

que natildeo vale a pena

acreditar no sonho que se tem

ou que seus planos nunca vatildeo dar certo

ou que vocecirc nunca vai ser algueacutem ()

Confie em si mesmordquo

Renato Russo e Flaacutevio Venturini 1987

RESUMO

Damasceno FS Estudo da interferecircncia de faacutermacos que atuam via receptores eou

transportadores de GABA e Glutamato no ciclo de vida do Trypanosoma cruzi [dissertaccedilatildeo

(Mestrado em Biologia da Relaccedilatildeo Patoacutegeno-Hospedeiro)] Satildeo Paulo Instituto de Ciecircncias

Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo 2013

A doenccedila de Chagas tambeacutem conhecida como tripanossomiacutease americana eacute causada pelo

protozoaacuterio flagelado Trypanosoma cruzi e afeta aproximadamente 10 milhotildees de pessoas em

aacutereas endecircmicas do Meacutexico Ameacuterica central e do Sul A quimioterapia disponiacutevel atualmente

limita-se a dois compostos Nifurtimox e o Benzonidazol Ambos os faacutermacos reduzem os

sintomas da doenccedila e a mortalidade das pessoas infectadas quando utilizadas na fase aguda

mas sua eficaacutecia na fase crocircnica eacute controversa Aleacutem do mais apresentam vaacuterios efeitos

colaterais O T cruzi eacute capaz de utilizar carboidratos e aminoaacutecidos como fonte de energia e

carbono O nosso grupo tem estudado o envolvimento do glutamato na resistecircncia do parasita

ao estresse teacutermico oxidativo e metaboacutelico como tambeacutem a importacircncia do aminoaacutecido

GABA no metabolismo do T cruzi visto que este tambeacutem eacute transportado pelo parasita Nesse

contexto o objetivo desse trabalho foi avaliar a interferecircncia de faacutermacos que atuam via

receptores ou transportadores de GABA e glutamato no ciclo de vida do T cruzi Os

faacutermacos selecionados foram Vigabatrina Pregabalina MK-801 MTEP e Memantina Os

resultados demonstram que apenas Memantina apresentou um melhor efeito tripanocida

Inibiu a proliferaccedilatildeo de formas epimastigotas interferiu na metaciclogecircnese como tambeacutem

afetou o metabolismo energeacutetico do parasita com a diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de ATP aleacutem de

desencadear mecanismos que levam a apoptose das formas epimastigotas Memantina

tambeacutem interferiu no ciclo intracelular do parasita mais especificamente no estaacutegio

amastigota Interessantemente as fases do ciclo do parasita que satildeo mais afetadas satildeo as fases

que requerem mais energia estaacutegios replicativos (amastigota e epimastigota) como tambeacutem

os processos de diferenciaccedilatildeo e invasatildeo celular Apesar de apresentar valores de IC50 que

podem ser considerados altos em relaccedilatildeo aos valores descritos para formas epimastigotas

tratadas com Benzonidazol esses resultados mostram perspectivas promissoras visto que o

Memantina poderaacute ser utilizado como composto liacuteder para o desenho de derivados com

atividade tripanocida otimizada

Palavras-chave Trypanosoma cruzi Memantina Receptor de glutamato

ABSTRACT

Damasceno FS Study of interference of drugs that act via receptors andor transport of

GABA and glutamate in the life cycle of Trypanosoma cruzi [Masters thesis (Host-Pathogen

Relationship Biology)] Satildeo Paulo Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo

Paulo 2013

Chagas disease also known as American trypanosomiasis is caused by the flagellate

protozoan Trypanosoma cruzi and affects approximately 10 million people in endemic areas

of Mexico Central America and South America with about 25 million people living in areas

at risk of infection The currently available chemotherapy is limited to two compounds which

are Nifurtimox and Benznidazole Both drugs reduce symptoms of the disease and mortality

of infected people when used in the acute phase but its efficacy in chronic phase (phase in

which the majority of cases are diagnosed) is still controversial Moreover these drugs have

several side effects T cruzi is able to utilize carbohydrate and amino acids as carbon and

energy source Our group has studied the involvement of glutamate in parasite resistance to

thermal oxidative and metabolic stress as well as the importance of the amino acid GABA

metabolism in T cruzi The aim of this study was to evaluate the interference of drugs that

act in GABA and glutamate transporters or receptors in the life cycle of T cruzi The drugs

selected were vigabatrin pregabalin MK-801 memantine and MTEP The results showed

that only memantine has a better trypanocidal effect Memantine inhibited the proliferation of

epimastigotes interfered in metacyclogenesis and affected the energy metabolism of the

parasite with decreased levels of ATP and trigger mechanisms that lead to apoptosis of

epimastigotes Moreover interferes with intracellular cycle of the parasite specifically in

amastigote stage Interesting that stages of the parasite that require more energy are more

affected replicative stages (epimastigote and amastigote) as well as the processes of

differentiation and cell invasion IC50 value is more than that described to epimastigotes

treateds with Benznidazole but Memantine could be used as leader compound for the design

of drugs with optimized trypanocidal activity

Keywords Trypanosoma cruzi Memantine Glutamate receptor

LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES

Figura 1 - Esquema do ciclo de vida do Trypanosoma cruzi 19

Figura 2 - Estruturas quiacutemicas do Benzonidazol e Nifurtimox 24

Figura 3 - Estruturas quiacutemicas dos faacutermacos com accedilatildeo GABAeacutergica 28

Figura 4 - Estruturas quiacutemicas dos faacutermacos com accedilatildeo glutamateacutergica 29

Figura 5 - Curvas de crescimento de T cruzi estaacutegio epimastigota tratados com os

faacutermacos de interesse 40

Figura 6 - Curvas dose-resposta do T cruzi estaacutegio epimastigota para os

tratamentos com MK-801 ou Memantina 41

Figura 7 - Curvas de crescimento do T cruzi estaacutegio epimastigota submetidos ao

estresse teacutermico e oxidativo e tratados com MK-801 ou Memantina 42

Figura 8 - Curvas dose-resposta do crescimento de T cruzi estaacutegio epimastigota

submetidos ao estresse teacutermico ou oxidativo 44

Figura 9 - Resposta do Tcruzi estaacutegio epimastigota ao estresse nutricional na

presenccedila do Memantina 45

Figura 10 - Efeito da Memantina na metaciclogecircnese 46

Figura 11 - Representaccedilatildeo da anaacutelise por citometria de fluxo para detecccedilatildeo do tipo

de morte celular 48

Figura 12 - Representaccedilatildeo graacutefica da quantificaccedilatildeo de H2O2 49

Figura 13 - Representaccedilatildeo graacutefica da concentraccedilatildeo intracelular de Ca2+

50

Figura 14 - Formas epimastigotas de T cruzi 51

Figura 15 - Efeito da Memantina no ciclo intracelular do T cruzi 53

Figura 16 - Curvas dose-resposta da toxicidade em ceacutelulas CHO-K1 infectividade

de formas tripomastigostas e tratamento da infecccedilatildeo apoacutes a invasatildeo

celular 54

LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA Anaacutelise de variacircncia

ATP Adenosina trifosfato

CHO-K1 Chinese Hamster Ovary (linhagem celular proveniente de ovaacuterio de

hamester chinecircs)

Ca2+

Caacutelcio

CO2 Dioacutexido de carbono

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

DO Densidade oacutetica

DTUs Discrete Typing Units

EGTA Aacutecido etilenoglicol-bis-aminoetiletertetraceacutetico

EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio

GABA Aminoaacutecido γ-aminobutiacuterico

GABA T Aminoaacutecido γ-aminobutiacuterico transaminase

GAPDH Gliceraldeiacutedo -3-fosfato desidrogenase

H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio

IC50 Metade da concentraccedilatildeo maacutexima inibitoacuteria

KCl Cloreto de potaacutessio

LIT Liver Infusion-Tryptose (Meio de cultura)

MCP Morte celular programada

mg Miligramas

mGluR Receptor metabotroacutepico de glutamato

MTT (3-(45-dimetiltiazol-2-il)-25 difenil bromo tetrazolio)

Na2HPO4 Fosfato de soacutedio monobaacutesico anidro

NaCl Cloreto de soacutedio

NaHCO3 Bicarbonato de soacutedio

NCCD Nomenclature Comittee on Cell Death (Comite de Nomeclatura de Morte

Celular)

NH4+

Ion amocircnio

NMDA N-metil-D-aspartato

OH Radical hidroxila

PBS Soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato

pH Potencial hidrogeniocircnico

RPMI Roswell Park Memorial Institute

SDS Soacutedio dodecil sulfat

SFB Soro fetal bovino

U Unidades

μg Micrograma

μl Microlitro

μm Microcircmetro

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 16

11 Aspectos gerais da doenccedila de chagas 16

12 Trypanosoma cruzi 18

13 Trypanosoma cruzi e o metabolismo de aminoaacutecidos 20

14 Morte celular em Trypanosoma cruzi 21

15 Terapia na doenccedila de Chagas 23

16 Perspectivas de novos faacutermacos 25

2 OBJETIVOS 30

21 Objetivo geral 30

22 Objetivos especiacuteficos 30

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS 31

31 Microorganismos utilizados no trabalho 31

311 Ceacutelulas hospedeiras 31


32 Manutenccedilatildeo das ceacutelulas hospedeiras 31

33 Obtenccedilatildeo dos parasitas 31

331 Epimastigotas 31

332 Curvas de crescimento de epimastigotas de T cruzi 31

333 Formas tripomastigotas 32

34 Resistecircncia a diferentes tipos de estresse 32

341 Ensaio de estresse teacutermico em formas epimastigotas 32

342 Avaliaccedilatildeo da interaccedilatildeo dos faacutermacos com o estresse metaboacutelico 33

3421 Avaliaccedilatildeo dos niacuteveis de ATP intracelular 33

343 Ensaio de estresse oxidativo em formas epimastigotas 33

35 Tipo de morte celular em parasitas tratados com Memantina 34

351 Avaliaccedilatildeo da exposiccedilatildeo de fosfatidilserina na membrana do parasita 34

352 Ensaio para quantificaccedilatildeo de Ca2+

intracelular em formas

epimastigotas 35

353 Ensaio para verificaccedilatildeo da geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio 35

36 Efeito sobre a metaciclogecircnese 35

37 Anaacutelise do efeito dos compostos no ciclo intracelular do T cruzi 36

371 Toxicidade dos faacutermacos em ceacutelulas de mamiacuteferos 36

372 Anaacutelise do efeito dos compostos na infectividade das formas tripomastigotas 36

373 Anaacutelise do efeito dos compostos apoacutes a invasatildeo celular pelas formas

tripomastigotas 37

374 Avaliaccedilatildeo da fase intracelular mais susceptiacutevel ao tratamento com os

compostos 37

38 Anaacutelises estatiacutesticas 38

4 RESULTADOS 39

41 Curvas de crescimento do T cruzi na presenccedila dos compostos 39

42 Interaccedilatildeo com condiccedilotildees de estresse 41

43 Efeito da Memantina na metaciclogecircnese 46

44 Tipo de morte celular sofrida pelo parasita tratado com Memantina 47

45 Efeito da Memantina no ciclo intracelular do T cruzi 52

5 DISCUSSAtildeO 55

6 CONCLUSOtildeES 59

REFEREcircNCIAS 61

16

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos gerais da doenccedila de chagas

A doenccedila de Chagas tambeacutem conhecida como tripanossomiacutease americana foi

descoberta pelo meacutedico brasileiro Carlos Chagas (Chagas 1909) Esta doenccedila eacute causada pelo


aacutereas endecircmicas do Meacutexico Ameacuterica Central e do Sul com cerca de 25 milhotildees de pessoas

vivendo em aacutereas de risco de infecccedilatildeo Ocorrem por ano aproximadamente 40 mil novos

casos e 12 mil mortes devido a complicaccedilotildees cardiacuteacas e digestivas (World Health

Organization 2012) Programas de controle do vetor desenvolvidos nos uacuteltimos 20 anos

como tambeacutem um maior controle nos bancos de sangue tem reduzido o nuacutemero de novos

casos da doenccedila de Chagas na Ameacuterica Latina (Rassi Marin-Neto 2010) Devido as intensas

migraccedilotildees de pessoas de paiacuteses endecircmicos o nuacutemero de casos de indiviacuteduos infectados tem

aumentado em aacutereas consideradas natildeo endecircmicas tais como Estados Unidos Canadaacute e

algumas regiotildees da Europa (Bern et al 2009 Maguire 2006 Schmunis 2007) A doenccedila eacute

uma zoonose que tem como reservatoacuterio natural do T cruzi uma ampla variedade de

mamiacuteferos do continente americano (Urbina Docampo 2003) Eacute transmitida para os seres

humanos e para mais de 150 espeacutecies de animais domeacutesticos e animais selvagens

principalmente por insetos hematoacutefagos da famiacutelia Reduviidae Apesar de existirem mais de

130 espeacutecies de triatomiacuteneos satildeo trecircs as mais importantes na transmissatildeo do T cruzi para o

homem Triatoma infestans Rhodnius prolixus e Triatoma dimidiata (Rassi Marin-Neto

2010) O parasita tambeacutem pode ser transmitido por transfusatildeo de sangue congenitamente (de

matildees infectadas para receacutem-nascidos) por transplante de oacutergatildeos ou medula oacutessea Tambeacutem

pode ocorrer por acidentes em laboratoacuterios que trabalham com o parasita vivo via esta que

epidemiologicamente eacute pouco relevante Outra forma de transmissatildeo eacute por via oral atraveacutes de

alimentos contaminados essa via vecircm sendo considerada como relevante na manutenccedilatildeo do

ciclo de transmissatildeo natural (Pereira et al 2009 Rassi Marin-Neto 2010)

A evoluccedilatildeo cliacutenica da doenccedila de Chagas pode ser dividida em duas fases aguda e

crocircnica A fase aguda normalmente eacute assintomaacutetica ou apresenta sintomatologia discreta que

na maioria dos casos passa despercebida pelo paciente Os sintomas quando aparecem o

fazem uma ou duas semanas apoacutes a exposiccedilatildeo ao triatomiacuteneo infectado ou poucos meses apoacutes

a transfusatildeo com sangue contaminado (Rassi Marin-Neto 2010) Os sintomas mais

frequentemente apresentados pelos pacientes agudos satildeo febre prolongada mal-estar

17

distensatildeo do fiacutegado baccedilo e linfonodos Pode haver tambeacutem edema subcutacircneo localizado ou

generalizado No caso particular de transmissatildeo vetorial o paciente pode apresentar um sinal

da porta de entrada do T cruzi na pele (chagoma) ou via mucosa ocular (sinal de Romantildea) As

manifestaccedilotildees da fase aguda se resolvem espontaneamente em aproximadamente 90 dos

indiviacuteduos infectados mesmo sem o tratamento com drogas tripanocidas Essa fase eacute

caracterizada pela alta parasitemia e ausecircncia de anticorpos especiacuteficos Nessa fase os

parasitas podem ser encontrados em praticamente todos os tecidos estando majoritariamente

presentes no sangue Por ser uma fase de curta duraccedilatildeo sem sintomatologia aparente ou com

sintomatologia pouco definida haacute um pequeno nuacutemero de casos detectados sendo portanto a

fase menos estudada (Rassi Marin-Neto 2010 Silber et al 2005b)

Logo apoacutes a fase aguda tem iniacutecio a fase crocircnica caracterizada pelos altos tiacutetulos de

anticorpos no sangue do paciente e pelo fato de que a parasitemia eacute inaparente O paciente

pode permanecer por vaacuterios anos ou ateacute mesmo pelo resto da vida sem apresentar sinais ou

sintomas Essa forma da fase crocircnica eacute chamada de indeterminada Aproximadamente 30-40

dos pacientes crocircnicos indeterminados desenvolvem a sintomatologia caracteriacutestica da

doenccedila evoluindo para a chamada fase crocircnica sintomaacutetica Nesta fase as trecircs principais

formas satildeo a cardiacuteaca a digestiva e a cardiodigestiva (Acquatella 2007 Marin-Neto et al

1999) Na forma cardiacuteaca o coraccedilatildeo eacute um dos primeiros oacutergatildeos afetados natildeo necessariamente

o uacutenico desenvolvendo hipertrofia e dilataccedilatildeo Na forma digestiva o trato digestivo apresenta

alteraccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes sendo a principal altereccedilatildeo a dilataccedilatildeo do

intestino e do esocircfago que podem apresentar aspecto de megaviacutescera (Marin-Neto et al

1999 Rassi et al 2000) revisado por (Boscardin et al 2009 Rassi Marin-Neto 2010)

18

12 Trypanosoma cruzi

Trypanosoma cruzi eacute um parasita intracelular obrigatoacuterio classicamente localizado na

ordem kinetoplastida gecircnero Trypanosoma que causa uma infecccedilatildeo crocircnica em humanos e

em grande nuacutemero de outras espeacutecies de mamiacuteferos (Hoare 1972) Recentemente devido agrave

alta variabilidade bioloacutegica bioquiacutemica e molecular a espeacutecie Trypanosoma cruzi foi

dividida em seis linhagens subsespeciacuteficas (Discrete Typing Units ndash DTUs) numerados de I a

VI Esta classificaccedilatildeo foi realizada com base em caracteriacutesticas geneacuteticas moleculares e

imunoloacutegicas com o objetivo de unificar a nomenclatura e facilitar a comunicaccedilatildeo dentro da

comunidade cientiacutefica (Zingales et al 2009)

O T cruzi tem um ciclo de vida complexo que alterna entre o inseto vetor e o

hospedeiro mamiacutefero O parasita apresenta diferentes formas correspondentes a diferentes

estaacutegios do seu ciclo de vida Estes diferentes estaacutegios tecircm sido descritos com base em

criteacuterios morfoloacutegicos como a forma fusiforme ou arredondados a regiatildeo onde emerge o

flagelo e a posiccedilatildeo do cinetoplasto (estrutura contendo o DNA da uacutenica mitococircndria presente

no parasita) em relaccedilatildeo ao nuacutecleo No hospedeiro mamiacutefero foram descritas as formas

amastigota epimastigota intracelular e tripomastigota sanguiacutecola A forma amastigota eacute um

estaacutegio replicativo e infectivo Satildeo ceacutelulas arredondadas medindo de 2-6 microm de diacircmetro

encontradas no citoplasma das ceacutelulas infectadas Os epimastigotas intracelulares

(epimastigote-like) satildeo formas replicativas intermediaacuterias entre amastigotas e tripomastigotas

tambeacutem encontrados dentro das ceacutelulas medindo aproximadamente 54 microm Essas formas satildeo

menores que as formas epimastigotas encontradas no inseto vetor poreacutem compartilha com as

mesmas padrotildees morfomeacutetricos e diversas caracteriacutesticas bioquiacutemicas e bioloacutegicas (Almeida-

De-Faria et al 1999) O tripomastigota sanguiacutecola eacute um estaacutegio flagelado infectivo natildeo

replicativo encontrado principalmente na corrente sanguiacutenea do hospedeiro mamiacutefero Mede

aproximadamente 18 microm de comprimento incluindo um extremo livre do flagelo de

aproximadamente 6 microm e 2-3 microm de largura

No inseto vetor encontram-se predominantemente as formas epimastigota e

tripomastigota metaciacuteclico Epimastigota eacute uma forma flagelada replicativa e natildeo infectiva

Mede aproximadamente 20-40 microm de comprimento e 2-5 microm de largura essas formas estatildeo

presentes tipicamente na porccedilatildeo meacutedia do intestino do hospedeiro invertebrado

Tripomastigota metaciacuteclico eacute uma forma infectiva natildeo replicativa encontrada na porccedilatildeo final

do intestino do inseto vetor (Brener 1971) revisado por (Silber et al 2005a Tyler Engman

2001)

19

O ciclo de vida do T cruzi inicia-se quando os parasitas presentes na corrente

sanguiacutenea do hospedeiro vertebrado infectado passam ao inseto vetor durante o repasto

sanguiacuteneo No intestino do inseto estas formas se diferenciam em formas epimastigotas (De

Souza et al 2002) que apoacutes multiplicaccedilatildeo por fissatildeo binaacuteria colonizam a porccedilatildeo terminal do

intestino e se diferenciam novamente em tripomastigotas metaciacuteclicos Quando o inseto

infectado pica o hospedeiro vertebrado e inicia o repasto sanguiacuteneo concomitantemente

elimina as formas tripomastigotas metaciacuteclicos junto com as fezes e urina Uma vez em

contato com a pele ou mucosas do hospedeiro mamiacutefero os tripomastigotas satildeo internalizados

atraveacutes de pequenas lesotildees na pele causadas pelo proacuteprio hospedeiro (Alves Colli 2008) Os

tripomastigotas invadem as ceacutelulas do hospedeiro mamiacutefero e se diferenciam em formas

replicativas denominadas amastigotas estabelecendo assim a infecccedilatildeo Apoacutes

aproximadamente 96 horas os amastigotas comeccedilam a se diferenciar em tripomastigotas

passando pela forma intermediaacuteria epimastigota intracelular Estas formas tripomastigotas satildeo

liberadas na corrente sanguiacutenea podendo invadir novas ceacutelulas ou serem ingeridas pelo inseto

vetor em um novo repasto sanguiacuteneo fechando assim o seu ciclo de vida O esquema do ciclo

de vida do Trypanosoma cruzi estaacute representado na Figura 1

Figura 1 - Esquema do ciclo de vida do Trypanosoma cruzi

20

13 Trypanosoma cruzi e o metabolismo de aminoaacutecidos

T cruzi eacute capaz de utilizar carboidratos e aminoaacutecidos como fonte de energia e

carbono As formas epimastigotas preferencialmente catabolizam glicose e apoacutes a exaustatildeo

do carboidrato ocorre uma mudanccedila para o metabolismo de aminoaacutecidos A prolina e a

glutamina satildeo os principais aminoaacutecidos metabolizados pelas formas epimastigotas visto que

satildeo abudantes na hemolinfa e nos fluiacutedos dos tecidos do inseto vetor Esse metabolismo

ocorre com produccedilatildeo de NH4+

(produto da deaminaccedilatildeo dos aminoaacutecidos) que eacute excretada para

o meio extracelular (Bringaud et al 2006 Cazzulo 1994) As formas tripomastigotas

utilizam principalmente a glicose que eacute abundante nos fluiacutedos de seus hospedeiros

vertebrados Jaacute as formas amastigotas encontradas no citoplasma das ceacutelulas do hospedeiro

mamiacutefero ambiente pobre em glicose livre usam os aminoaacutecidos como principal fonte de

carbono e energia apresentando maior quantidade de prolina intracelular do que as formas

tripomastigotas (Silber et al 2009)

Entre os aminoaacutecidos metabolizados pelas formas epimastigotas estatildeo prolina glicina

asparagina glutamina aspartato glutamato leucina e isoleucina (Mancilla et al 1967 Odaly

et al 1983 Silber et al 2005a Sylvester Krassner 1976 Zeledon 1960) Os aminoaacutecidos

estatildeo envolvidos tambeacutem em outros processos importantes do ciclo de vida do T cruzi O

aminoaacutecido L-prolina eacute essencial na diferenciaccedilatildeo das formas epimastigota intracelular para

tripomastigotas aleacutem de estarem envolvidos nos processos de osmorregulaccedilatildeo crescimento e

resistecircncia do parasita ao estresse oxidativo e nutricional (Homsy et al 1989 Magdaleno et

al 2009 Magdaleno et al 2011 Pereira et al 2002 Pereira et al 2003 Tonelli et al

2004) Glutamato prolina e aspartato satildeo importantes na metaciclogecircnese ou seja na

diferenciaccedilatildeo de formas epimastigotas para tripomastigotas metaciacuteclicos (Contreras et al

1985) Prolina glicina alanina e glutamato satildeo descritos como importantes nos processos de

osmorregulaccedilatildeo e controle do volume celular (Rohloff et al 2003 Rohloff et al 2004a)

Os aminoaacutecidos para que sejam metabolizados ou cumprirem outras funccedilotildees devem

ser obtidos a partir da degradaccedilatildeo de proteiacutenas sintetizados ou incorporados pelo parasita

atraveacutes de transportadores localizados na membrana (Silber et al 2005a) O primeiro

transportador de aminoaacutecidos em T cruzi foi descrito bioquimicamente em 1970 o

transportador de lisina (Hampton 1970) Outros aminoaacutecidos tambeacutem jaacute tiveram a sua

cineacutetica e seu mecanismo de transporte descrito para T cruzi A incorporaccedilatildeo de arginina

pelo parasita apresenta pelo menos dois sistemas de transporte sendo um de alta afinidade e

outro de baixa afinidade Esse transporte eacute regulado ao longo do ciclo de vida do parasita

21

(Canepa et al 2004 Pereira et al 1999) A prolina tambeacutem eacute incorporada atraveacutes de dois

sistemas de transporte O sistema ldquoArdquo de alta afinidade eacute dependente do gradiente de H+ e o

sistema ldquoBrdquo de baixa afinidade eacute dependente de ATP (Silber et al 2002) Jaacute o transporte de

glutamato ocorre atraveacutes do gradiente de H+

na membrana do parasita mas natildeo eacute dependente

da concentraccedilatildeo de soacutedio ou potaacutessio (Silber et al 2006) Recentemente o nosso grupo

descreveu uma atividade de transporte do aacutecido gamma-aminobutiacuterico (GABA) em T cruzi

aminoaacutecido que aleacutem de ser um conhecido neurotransmissor eacute um anaacutelogo estrutural do

glutamato (Rojas 2007) A existecircncia de um transportador de GABA pode indicar a

participaccedilatildeo deste aminoaacutecido em processos bioloacutegicos e no metabolismo do T cruzi

A caracterizaccedilatildeo molecular e bioquiacutemica de vias metaboacutelicas e transportadores de

aminoaacutecidos em tripanossomatiacutedeos satildeo de grande importacircncia pois tem revelado uma

variedade de rotas que permitem a siacutentese de novo de compostos cruciais para a sua

sobrevivecircncia Ou tambeacutem a sua incorporaccedilatildeo e aproveitamento a partir de compostos

sintetizados pelos organismos hospedeiros O estudo de diferentes vias metaboacutelicas de

aminoaacutecidos tambeacutem permite obter informaccedilotildees relevantes sobre a importacircncia de cada um

desses metaboacutelitos para a biologia do parasita Desta forma tem se identificado enzimas e

transportadores que podem ser alvos interessantes para a busca de novas drogas para novos

tratamentos contra a doenccedila de Chagas

14 Morte celular em Trypanosoma cruzi

O termo morte celular programada (MCP) foi introduzido em 1964 por Lockshin e

Williams (Lockshin 1964) Esse termo descreve eventos que de forma orquestrada e bem

definida em etapas controladas e natildeo acidentalmente levam a morte celular (Duszenko et al

2006) Durante muito tempo acreditou-se que esse processo ocorria somente em organismos

multicelulares com o objetivo de evitar malformaccedilotildees na embriogecircnese evitar doenccedilas

autoimunes durante a diferenciaccedilatildeo linfocitaacuteria ou para manter a integridade dos tecidos e

evitar o cacircncer

O Comitecirc de Nomeclatura de Morte Celular (Nomenclature Comittee on Cell Death ndash

NCCD) define os diferentes tipos de morte celular baseados em seus mecanismos (Kroemer et

al 2005) Os trecircs principais tipos satildeo apoptose necrose e autofagia

- Apoptose eacute caracterizada pelo arredondamento da ceacutelula retraccedilatildeo de pseudoacutepodes

reduccedilatildeo do volume celular ativaccedilatildeo das caspases condensaccedilatildeo da cromatima fragmentaccedilatildeo

22

do nuacutecleo manutenccedilatildeo da integridade da membrana celular ateacute os uacuteltimos estaacutegios do

processo

- Autofagia eacute o tipo de morte celular que ocorre sem condensaccedilatildeo da cromatina

acompanhada por vacuolizaccedilatildeo autofaacutegica do citoplasma Esses vacuacuteolos apresentam dupla

membrana e conteacutem organelas citoplasmaacuteticas em processo de degeneraccedilatildeo o que permite

que sejam destinguidas de outras vesiacuteculas como endossomos e lisossomos por microscopia

eletrocircnica

- Necrose eacute considerada um tipo de morte celular que natildeo apresenta sinais de

apoptose ou autofagia Caracteriza-se principalmente por ruptura da membrana celular e

dilataccedilatildeo de organelas citoplasmaacuteticas como mitococircndria retiacuteculo endoplasmaacutetico e

complexo de Golgi (Kroemer et al 2005)

Mais recentemente foram relatadas vaacuterias evidecircncias de MCP em eucariotos

unicelulares incluindo tripanossomatiacutedeos dos gecircneros Leishmania e Trypanosoma

(Debrabant et al 2003) Vaacuterias caracteriacutesticas de MCP encontradas em organismos

multicelulares tecircm sido relatadas para tripanossomatiacutedeos Estas caracteriacutesticas incluem

despolarizaccedilatildeo da membrana mitocondrial liberaccedilatildeo de citocromo C ativaccedilatildeo de proteases

exposiccedilatildeo de fosfatidilserina encolhimento ou arredondamento das ceacutelulas manutenccedilatildeo da

integridade da membrana e fragmentaccedilatildeo de DNA (Debrabant et al 2003 Duszenko et al

2006 Kaczanowski et al 2011) Tambeacutem foi observado que o uso de inibidores de caspases

bloqueia algumas caracteriacutesticas associadas com MCP em tripanossomatiacutedeos (Irigoin et al

2009)

Um estudo realizado por Ameisen e colaboradores demonstrou que formas

epimastigotas cultivadas por mais de uma semana no mesmo meio se diferenciavam para

metaciacuteclicos ou morriam apresentando caracteriacutesticas de apoptose (Ameisen et al 1995)

Muitas proteiacutenas descritas como participantes da apoptose em metazoaacuterios natildeo estatildeo presentes

em tripanossomatiacutedeos Haacute evidecircncias de que metacaspases um grupo de proteases com

estrutura similar agraves caspases mas com diferentes atividades enzimaacuteticas podem estar

envolvidas no processo de apoptose desses organismos (Smirlis Soteriadou 2011) Essas

proteiacutenas estatildeo envolvidas em fases importantes do ciclo de vida do parasita como progressatildeo

do ciclo celular proteccedilatildeo para que formas epimastigotas natildeo sofram morte celular e

diferenciem para tripomastigota metaciacuteclico (Laverriere et al 2012) O fato de que as

metacaspases natildeo estatildeo presentes em humanos e desempenham um importante papel em

tripanossomatiacutedeos faz com que apresentem perspectivas promissoras como potenciais alvos

terapecircuticos (Berg et al 2010) Alguns autores tecircm descrito a participaccedilatildeo da mitococircndria no

23

processo de apoptose em T cruzi Como acontece em metazoaacuterios a mitococircndria eacute a principal

organela envolvida nesse processo Mudanccedilas na funccedilatildeo mitocondrial principalmente quando

ocorre a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) foram identificadas como o

principal evento de sinalizaccedilatildeo e execuccedilatildeo desse processo (Irigoin et al 2009 Menna-

Barreto et al 2009 Smirlis Soteriadou 2011) A produccedilatildeo de EROs e a desregulaccedilatildeo da

homeostase de Ca2+

pode contribuir para a apoptose nessas ceacutelulas (Smirlis Soteriadou

2011) Os motivos pelos quais os tripanossomatiacutedeos sofrem MCP ainda natildeo estatildeo bem

esclarecidos mas alguns autores sugerem que apesar das ceacutelulas viverem de forma

independente competem por nutrientes e fatores de crescimento Este seria um mecanismo de

sobrevivecircncia relacionado com a regulaccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular aleacutem da manutenccedilatildeo de

uma infecccedilatildeo controlada e persistente afetando a resposta imunoloacutegica do hospedeiro Este

mecanismo tambeacutem poderia estar envolvido no controle da populaccedilatildeo de parasitas no

hospedeiro aumentando a sobrevivecircncia do mesmo e favorecendo a sua transmissatildeo para o

proacuteximo hospedeiro (Debrabant et al 2003 Duszenko et al 2006)

15 Terapia na doenccedila de Chagas

Nas uacuteltimas deacutecadas muitas medidas foram colocadas em praacutetica visando o controle da

transmissatildeo vetorial da doenccedila de Chagas Apesar de terem sido bem sucedidas os resultados

dessas medidas natildeo beneficiam diretamente os milhotildees de indiviacuteduos jaacute infectados tatildeo pouco

os pacientes chagaacutesicos com manifestaccedilotildees cliacutenicas da doenccedila (Coura et al 2002) Embora a

doenccedila tenha mais de um seacuteculo da sua descoberta a quimioterapia disponiacutevel atualmente

limita-se a dois compostos que comeccedilaram a ser utilizados em humanos na deacutecada de 1970

que satildeo Nifurtimox [3-methyl-4(5rsquo-nitrofurfurylideneamine) tetrahydro-4H-tiazine-11-

dioxide] fabricado pela Bayer com o nome comercial de Lampitreg

e o Benzonidazol (N-

benzyl-2-nitroimidazole acetamide) fabricado pela Roche com o nome comercial de

Rochaganreg

(Dias et al 2009 Senkovich et al 2005) As estruturas quiacutemicas desses

compostos estatildeo representadas na Figura 2

24

Figura 2 ndash Estruturas quiacutemicas do Benzonidazol e Nifurtimox

(1) Benzonidazol e (2) Nifurtimox

A dose recomendada na fase aguda eacute de 8-10 mgkgdia de Nifurtimox ou 5 mgkgdia

de Bezonidazol A meacutedia do tempo de tratamento eacute de 60 dias mas quando haacute uma reativaccedilatildeo

da fase crocircnica em pacientes imunocomprometidos por exemplo o tratamento pode durar

cinco meses ou mais Em casos da possibilidade de infecccedilatildeo como no caso de transfusatildeo com

sangue supostamente contaminado ou acidentes em laboratoacuterios eacute feito um tratamento

profilaacutetico com duraccedilatildeo de dez dias (Maya et al 2007 Rassi Marin-Neto 2010) O

mecanismo de accedilatildeo de ambos os compostos ainda natildeo estaacute bem claro mas acredita-se que

ocorra por meio da formaccedilatildeo de radicais livres como tambeacutem pela formaccedilatildeo de metaboacutelitos

eletrofiacutelicos

Ao radical hidroxila (OH) resultante do metabolismo desses faacutermacos eacute atribuiacutedo o

efeito tripanocida por mecanismos complexos que envolvem ligaccedilatildeo com lipiacutedeos proteiacutenas e

ao DNA do T cruzi Os metaboacutelitos eletrofiacutelicos formados pelo mecanismo de accedilatildeo de ambos

os compostos podem atuar tambeacutem em outros sistemas especialmente do hospedeiro humano

devido a sua alta reatividade (Dias et al 2009 Docampo 1990 Maya et al 2007 Urbina

2002)

Ambas as drogas reduzem os sintomas da doenccedila e a mortalidade das pessoas

infectadas quando utilizadas na fase aguda (Cancado 1999) mas sua eficaacutecia varia de acordo

com a duraccedilatildeo do tratamento como tambeacutem com a idade e distribuiccedilatildeo geograacutefica dos

pacientes provavelmente devido agrave susceptibilidade das diferentes cepas de T cruzi ao

tratamento (Dias et al 2009 Filardi Brener 1987) Eacute importante ressaltar que vaacuterios estudos

sugerem o tratamento com Benzonidazol de pacientes com a forma crocircnica da doenccedila de

Chagas Poreacutem nesta fase (em que a maioria dos casos satildeo diagnosticados) a eficaacutecia deste

tratamento eacute controversa (Boscardin et al 2009 Silber et al 2005b) Aleacutem do mais

25

apresentam vaacuterios efeitos colaterais como por exemplo anorexia nauacutesea vocircmito dor de

cabeccedila depressatildeo do sistema nervoso central parestesia dermatite entre outros sintomas e

requerem longo tempo de tratamento que pode durar ateacute 90 dias (Maya et al 2007 Urbina

Docampo 2003) Esse longo periacuteodo pode levar ao abandono do tratamento pelos pacientes o

que resulta na seleccedilatildeo (dentro da populaccedilatildeo tratada) de parasitas mais resistentes

O Benzonidazol o uacutenico tripanocida disponiacutevel no mercado brasileiro atualmente eacute

indicado nas seguintes situaccedilotildees infecccedilatildeo na fase aguda reativaccedilatildeo da infecccedilatildeo por drogas

imunossupressoras infecccedilotildees adquiridas recentemente e para pacientes com oacutergatildeos

transplantados procedentes de pacientes chagaacutesicos (Silber et al 2005b)

16 Perspectivas de novos faacutermacos

Eacute urgente a necessidade do desenvolvimento de drogas mais potentes e seguras para o

tratamento especiacutefico da doenccedila de Chagas (Urbina Docampo 2003) As pesquisas por novos

faacutermacos com atividade tripanocida tecircm evoluiacutedo sensivelmente nas uacuteltimas deacutecadas

principalmente apoacutes o sequenciamento dos genomas do T cruzi T brucei e Leishmania

(Moreira et al 2009) Mesmo assim ainda natildeo foi desenvolvido um faacutermaco seguro e eficaz

contra esses parasitas Atualmente alguns alvos macromoleculares com funccedilotildees bioloacutegicas

importantes para a viabilidade do T cruzi tecircm sido explorados para o desenvolvimento de

novos faacutermacos

Entre eles estatildeo

Via glicoliacutetica

As formas infectivas do parasita utilizam preferencialmente a glicose como fonte de

carbono e energia Esta via eacute importante para geraccedilatildeo de energia atraveacutes da produccedilatildeo de

ATP Trecircs enzimas dessa via tecircm sido bastante exploradas como alvos bioloacutegicos a

gliceraldeiacutedo-3-fosfato desidrogenase (GAPDH EC12112) a hexoquinase (EC 27111) e a

fosfofrutoquinase (EC 2711) (Dias et al 2009) Contudo haacute indiacutecios de que essa via natildeo

estaacute ativa no estaacutegio intracelular amastigota (Silber et al 2009) o que limitaria a utilizaccedilatildeo

desses alvos

26

Metabolismo dependente de grupos tioacuteis

O T cruzi natildeo apresenta as vias claacutessicas descritas para defesa contra o estresse

oxidativo jaacute que nenhuma catalase ou glutationa peroxidase eacute encontrada no parasita e a

atividade da superoacutexido dismutase eacute reduzida (Maya et al 2003) Desta forma o principal

mecanismo de defesa envolve os tioacuteis tripanotiona homotripanotiona glutationa e ovotiol

Uma reduccedilatildeo nos niacuteveis dos tioacuteis antioxidantes tornaria o parasita altamente vulneraacutevel aos

efeitos de radicais livres As enzimas que se destacam na via de biossiacutentese de tioacuteis satildeo

tripanotiona redutase (EC 18112) e tripanotiona sintase (EC 3619) A primeira eacute

responsaacutevel pela manutenccedilatildeo dos niacuteveis de tripanotiona reduzida e a segunda pela adiccedilatildeo do

composto glutationa ao substrato glutationil espermidina formando tripanotiona A enzima

triparedoxina peroxidase tambeacutem apresenta importacircncia consideraacutevel na exposiccedilatildeo do T cruzi

agraves espeacutecies reativas de oxigecircnio (Dias et al 2009 Urbina 2002 Wilkinson 2003)

Biossiacutentese de esteroacuteis

Os esteroacuteis satildeo componentes essenciais agraves membranas das ceacutelulas Em organismos

unicelulares os esteroacuteis satildeo essenciais ao crescimento celular T cruzi natildeo sintetiza colesterol

sintezando portanto o ergosterol (Urbina et al 1995) o qual eacute importante na proliferaccedilatildeo e

viabilidade celular (Maya et al 2007) Essa via tem sido um alvo atrativo para o

desenvolvimento de faacutermacos Inibidores de biossiacutentese de esteroacuteis satildeo os uacutenicos que

alcanccedilaram triagens cliacutenicas avanccediladas como candidatos a faacutermacos anti- T cruzi (Urbina

2010) Dentre os inibidores mais representativos estatildeo os derivados azoacutelicos inibidores da

esterol 14-demitilase cetoconazol fluconazol e itraconazol aleacutem do tipifarnib que eacute um

inibidor da farnesiltransferase (Dias et al 2009)

Proteases

Em T cruzi as proteases possuem muacuteltiplas funccedilotildees que envolvem desde a invasatildeo

celular ateacute o escape do parasita do sistema imune do hospedeiro A cruzipaiacutena (gp5157) eacute

responsaacutevel pela principal atividade proteoliacutetica em todos os estaacutegios do ciclo de vida desse

parasita (Urbina 2002) Dada a sua importacircncia algumas proteases tecircm sido selecionadas

como alvos para o desenvolvimento de novos agentes antichagaacutesicos Serinoproteases

27

metaloproteases cisteiacutenoproteases e treoninoproteases satildeo exemplos de proteases amplamente

estudadas (Duschak Couto 2007 Soeiro De Castro 2009)

Vias metaboacutelicas de aminoaacutecidos

O estudo das vias metaboacutelicas dos aminoaacutecidos em tripanosomatiacutedeos tambeacutem tem

revelado uma variedade de compostos cruciais para a sobrevivecircncia do T cruzi Assim

transportadores e enzimas relacionados ao seu metabolismo podem ser alvos interessantes

para o desenho de novos faacutermacos Jaacute foi descrito a importacircncia de muitos aminoaacutecidos no

ciclo de vida do T cruzi Como exemplo o glutamato estaacute envolvido em processos

importantes como metaciclogecircnese osmorregulaccedilatildeo e controle do volume celular (Contreras

et al 1985 Rohloff et al 2003 Rohloff et al 2004b)

O nosso grupo tem estudado o envolvimento do glutamato na resistecircncia do parasita

ao estresse teacutermico oxidativo e metaboacutelico (Magdaleno et al 2011) como tambeacutem iniciamos

estudos sobre a importacircncia do aminoaacutecido GABA no metabolismo do T cruzi visto que

este tambeacutem eacute transportado pelo parasita (Rojas 2007) Esses metaboacutelitos satildeo relatados na

literatura neurobioloacutegica como os principais neurotransmissores excitatoacuterio e inibitoacuterio

respectivamente em mamiacuteferos

Diante do exposto foi considerado relevante o estudo da possiacutevel atividade anti-T

cruzi de compostos com atuaccedilatildeo nas vias glutamateacutergica e GABAeacutergica do sistema nervoso

central jaacute disponiacuteveis para uso em seres humanos com o intuito de aproveitar o

conhecimento da sua farmacocineacutetica biodisponibilidade toxicidade efeitos secundaacuterios

dentre outros paracircmetros Existem no mercado alguns faacutermacos que atuam via receptores ou

transportadores de GABA e glutamato e que satildeo utilizados amplamente para o tratamento

cliacutenico de vaacuterias patologias de acometimento do sistema nervoso central Para este estudo

foram selecionados inicialmente dois faacutermacos com accedilatildeo sobre a via GABAeacutergica cujas

estruturas quiacutemicas estatildeo representadas na Figura 3 e estatildeo descritos a seguir

28

Figura 3 - Estruturas quiacutemicas dos faacutermacos com accedilatildeo GABAeacutergica

(1) Vigabatrina e (2) Pregabalina

A Vigabatrina eacute um inibidor irreversiacutevel do receptor GABA Transaminase (GABA T)

Esta inibiccedilatildeo foi demonstrada em um estudo realizado in vitro com neurocircnios e ceacutelulas da glia

(Gran Borchgrevink 1989) A ligaccedilatildeo da Vigabatrina ao receptor eacute irreversiacutevel soacute uma nova

siacutentese da enzima pode restabelecer a atividade de GABA T podendo tambeacutem bloquear o

transporte de GABA (Jung et al 1977)

Pregabalina eacute um anaacutelogo de GABA com uma substituiccedilatildeo na posiccedilatildeo C-3 (Gajcy et

al 2010) atua ligando-se a subunidade α2-δ do canal de Ca2+

controlado por voltagem A

potente inibiccedilatildeo desse siacutetio reduz o influxo de Ca2+

para os terminais nervosos preacute-sinaacutepticos

reduzindo assim a liberaccedilatildeo de alguns neurotransmissores como glutamato e noradrenalina

(Ha et al 2008)

Tambeacutem foram selecionados trecircs faacutermacos que atuam via receptores de glutamato

cujas estruturas quiacutemicas estatildeo representadas na Figura 4 e estatildeo descritos a seguir

(1) (2)

29

Figura 4 - Estruturas quiacutemicas dos faacutermacos com accedilatildeo glutamateacutergica

(1) MK-801 (2) (MTEP) e (3) Memantina

O MK-801 eacute um antagonista do receptor de glutamato N-metil-D-aspartato (NMDA)

(Liu et al 2009) Atua ligando-se no receptor impedindo o fluxo de iacuteons tais como Ca2+

(Coan et al 1987) O MTEP 3-((2-Metil-4-thiazolil) etinil)piridina atua como um

antagonista seletivo natildeo competitivo do receptor metabotroacutepico de glutamato mGluR5 (Iso et

al 2006) Uma caracterizaccedilatildeo in vivo e in vitro indicou que o MTEP eacute altamente seletivo

para mGluR5 e natildeo tem efeito significativo em outros subtipos mGluR Jaacute a Memantina eacute

uma amina triciacuteclica a primeira da classe de novos medicamentos para a doenccedila de

Alzheimer atuando no sistema glutamateacutergico com o bloqueio da atividade de receptores de

glutamato do tipo NMDA (Lipton 2005) Estes faacutermacos tanto os de accedilatildeo GABAeacutergica

quanto os de accedilatildeo glutamateacutergica jaacute satildeo utilizados em seres humanos Apresentam efeitos

terapecircuticos beneacuteficos em vaacuterias desordens neuroloacutegicas agudas e crocircnicas como

anticonvulsivantes e ateacute mesmo no tratamento da esquizofrenia Portanto satildeo faacutermacos jaacute

aprovados para uso em seres humanos com efeitos colaterais e toxicidade conhecidos como

tambeacutem a farmacocineacutetica e farmacodinacircmica

30

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral

Analisar as possiacuteveis interferecircncias de faacutermacos que atuam via receptores ou

transportadores de GABA e glutamato no ciclo de vida do T cruzi

22 Objetivos especiacuteficos

Avaliar o efeito dos faacutermacos selecionados sobre as curvas de crescimento da forma

epimastigota e sobre a diferenciaccedilatildeo de formas epimastigotas para tripomastigotas

(metaciclogecircnese)

Avaliar a resistecircncia da forma epimastigota a diferentes tipos de estresse (metaboacutelico

teacutermico e oxidativo) na presenccedila dos faacutermacos em estudo

Comparar os efeitos inibitoacuterios desses faacutermacos na progressatildeo do ciclo de vida nos

diferentes estaacutegios parasitaacuterios com ecircnfase nos estaacutegios correspondentes ao ciclo de

infecccedilatildeo em mamiacuteferos (amastigotas epimastigotas intracelular e tripomastigotas)

31

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Microorganismos utilizados no trabalho

311 Ceacutelulas hospedeiras

Ceacutelulas da linhagem CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary)


Cepa CL clone 14 (Brener Chiari 1963)

32 Manutenccedilatildeo das ceacutelulas hospedeiras

Ceacutelulas da linhagem CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary) foram cultivadas a 37 degC em

meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) acrescido com 10 de SFB (Soro Fetal

Bovino) 015 (mv) de NaHCO3 sob atmosfera uacutemida a 5 de CO2 (Tonelli et al 2004)

33 Obtenccedilatildeo dos parasitas

331 Epimastigotas

As formas epimastigotas extracelulares foram mantidas em fase exponencial de

crescimento por passagens sucessivas (cada 48 horas) em meio LIT (Liver Infusion-Tryptose)

que conteacutem infusatildeo de fiacutegado 50 gL Triptose 50 gL NaCl 40 gL KCL 04 gL

Na2HPO4 80 gL glicose 2 gL hemina 10 gL suplementado com 10 de SBF pH 72 a

28 ordmC (Camargo 1964)

332 Curvas de crescimento de epimastigotas de T cruzi

Foram utilizadas formas epimastigotas de T cruzi em fase de crescimento exponencial

(50 a 60 x 107 ceacutelulas mL

-1) As ceacutelulas foram tratadas com diferentes concentraccedilotildees dos

compostos ou natildeo (controle negativo) Como controle positivo de inibiccedilatildeo foi utilizado uma

combinaccedilatildeo de Rotenona (60 microM) e Antimicina (05 microM) As ceacutelulas (25 x 106 ceacutelulas mL

-1)

32

foram transferidas para placas de cultura de 96 poccedilos (200 microlpoccedilo) A placa foi mantida na

estufa a 28 degC A proliferaccedilatildeo celular foi estimada por leitura da absorbacircncia da densidade

oacutetica (DO) em λ 620 nm durante 8 dias A absorbacircncia foi transformada em valores de

densidade celular (ceacutelulasmL) usando uma equaccedilatildeo de regressatildeo linear que foi obtida

previamente sob as mesmas condiccedilotildees A concentraccedilatildeo do faacutermaco que inibiu 50 da

proliferaccedilatildeo dos parasitas (IC50) foi determinada na fase exponencial de crescimento (quinto

dia) mediante ajuste dos dados na curva dose-resposta com a equaccedilatildeo claacutessica sigmoacuteide

(Magdaleno et al 2009) Cada composto foi avaliado em quadruplicata em cada experimento

sendo que os resultados apresentados correspondem a trecircs experimentos independentes

333 Formas tripomastigotas

As ceacutelulas CHO-K1 foram infectadas com 30 x 107 tripomastigotas por garrafa (75

cm2) em meio RPMI 1640 contendo 10 de SFB Os parasitas ficaram em contato com as

ceacutelulas durante 4 horas mantidas a 37 degC sob atmosfera uacutemida com 5 de CO2 como

descrito por (Tonelli et al 2004) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com

PBS (Phosphate Buffered Saline) e acrescidas de meio RPMI 1640 contendo 10 de SFB e

incubadas a 37 degC Apoacutes 12 horas as ceacutelulas foram lavadas com PBS acrescidas de meio

RPMI 1640 (2 SFB) e incubadas a 33 degC Os parasitas foram coletados no quinto sexto e

seacutetimo dia poacutes-infecccedilatildeo contados na cacircmara de Neubauer e utilizados em experimentos

posteriores

34 Resistecircncia a diferentes tipos de estresse

341 Ensaio de estresse teacutermico em formas epimastigotas

Os ensaios foram realizados conforme descrito na seccedilatildeo 332 modificando-se apenas

a temperatura de incubaccedilatildeo As placas foram mantidas na estufa a 33 degC ou 37 degC

(Magdaleno et al 2009)

33

342 Avaliaccedilatildeo da interaccedilatildeo dos faacutermacos com o estresse metaboacutelico

Para avaliar a interaccedilatildeo entre os faacutermacos e o estresse metaboacutelico epimastigotas (50 x

106 ceacutelulas mL

-1) foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspendidos em meio LIT ou PBS

e tratados ou natildeo (controle negativo) com a concentraccedilatildeo correspondente ao seu IC50 As

ceacutelulas foram incubadas a 28 degC durante 30 horas e apoacutes esse periacuteodo foi avaliado o niacutevel de

ATP intracelular

3421 Avaliaccedilatildeo dos niacuteveis de ATP intracelular

Para avaliar os niacuteveis de ATP intracelular em formas epimastigotas de T cruzi

utilizamos o kit bioluminescente para ceacutelulas somaacuteticas comprado da Sigma-Alderich

(Sigma-Alderich Saint Louis MO USA) conforme instruccedilotildees do fabricante Brevemente 50

microL de PBS foi adicionado a 100 microL do reagente de lise e acrescentou-se 50 microL da suspensatildeo

de parasitas contendo 50 x 106 ceacutelulas mL

-1 tratadas ou natildeo (controle) A concentraccedilatildeo de

ATP foi determinada utilizando-se a curva padratildeo das diferentes concentraccedilotildees de ATP A

luminescecircncia foi obtida pela reaccedilatildeo entre a luciferase e o ATP que foi liberado apoacutes a lise

celular sendo determinada pela utilizaccedilatildeo do luminocircmetro Lumat LB 9507 utilizando-se um

λ 570 nm (Martins et al 2009)

343 Ensaio de estresse oxidativo em formas epimastigotas

Inicialmente foi determinado o valor de IC50 para H2O2 nas formas epimastigotas de T

cruzi o qual foi utilizado posteriormente para os ensaios de estresse oxidativo Para isso as

ceacutelulas (50 x 106

ceacutelulas mL-1

) foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas em PBS com

diferentes concentraccedilotildees de H2O2 (10 a 100 microM) durante 60 90 e 120 minutos a 28 degC Apoacutes

esse tempo as ceacutelulas foram centrifugadas ressuspensas em meio LIT e distribuiacutedas em placa

de 96 poccedilos A placa foi mantida na estufa a 28 degC A proliferaccedilatildeo celular foi estimada por

leitura da DO a λ 620 nm a cada 24 horas durante 6 dias A DO foi transformada em valores

de densidade celular (ceacutelulasmL) usando uma equaccedilatildeo de regressatildeo linear que foi obtida

previamente sob as mesmas condiccedilotildees A concentraccedilatildeo de H2O2 correspondente ao valor do

IC50 foi determinada na fase exponencial de crescimento (quinto dia) mediante ajuste dos

dados da curva dose-resposta com a equaccedilatildeo claacutessica sigmoacuteide

34

Para avaliar uma possiacutevel interaccedilatildeo entre os faacutermacos e o estresse oxidativo os

parasitas foram lavados duas vezes com PBS ressuspensos em PBS com a concentraccedilatildeo de

H2O2 correspondente ao IC50 determinado anteriormente e incubados por 1 hora a 28 degC Em

seguida foram centrifugadas ressuspensas em meio LIT e tratadas com diferentes

concentraccedilotildees dos faacutermacos ou natildeo (controle negativo) Como controle positivo de inibiccedilatildeo

foi utilizado uma combinaccedilatildeo de Rotenona (60 microM) e Antimicina (05 microM) Os parasitas

foram incubados em placas de cultura de 96 poccedilos em estufa (28 degC) A proliferaccedilatildeo celular

foi estimada por leitura da DO em λ 620 nm a cada 24 horas durante 8 dias A DO foi

transformada em valores de densidade celular (ceacutelulasmL) usando uma equaccedilatildeo de regressatildeo

linear que foi obtida previamente sob as mesmas condiccedilotildees A concentraccedilatildeo do faacutermaco que

inibiu 50 da proliferaccedilatildeo dos parasitas (IC50) foi determinada na fase exponencial de

crescimento (quinto dia) mediante ajuste dos dados da curva dose-resposta com a equaccedilatildeo

claacutessica sigmoacuteide Cada concentraccedilatildeo foi avaliada em quadruplicata sendo que os resultados

apresentados correspondem a trecircs experimentos independentes

35 Avaliaccedilatildeo do tipo de morte celular em parasitas tratados com Memantina

351 Avaliaccedilatildeo da exposiccedilatildeo de fosfatidilserina na membrana do parasita

Formas epimastigota (50 x 106 ceacutelulas mL

-1) foram cultivadas em meio LIT a 28 degC e

tratadas com a concentraccedilatildeo correspondente ao IC50 de cada composto determinado nas

curvas de crescimento dos parasitas ou natildeo (controle) Parasitas tratados com estaurosporina

(1microM) 24 horas antes da realizaccedilatildeo do ensaio foram utilizados como controle positivo para

apoptose O controle positivo para necrose foi realizado incubando os parasitas durante 30

minutos na presenccedila de 150 microM de digitonina e 1 microgmL de iodeto de propiacutedio No quarto dia

apoacutes o iniacutecio do tratamento 10 x 106 ceacutelulas mL

-1 de cada tratamento como tambeacutem dos

controles foram lavados uma vez com o tampatildeo de anexina (10 mM HEPES 140 mM NaCl e

25 mM CaCl2 pH 74) e ressuspensos em 50 microl do mesmo tampatildeo Os parasitas foram

incubados em gelo e protegidos da luz por 15 minutos na presenccedila de anexina-V FITC

Invitrogen (Invitrogen Eugene Oregon USA) conforme instruccedilotildees do fabricante e iodeto de

propiacutedio (1microgmL) Apoacutes esse periacuteodo adicionou-se 450 microl do tampatildeo de anexina e os

parasitas foram analisados por citometria de fluxo no equipamento Guava cytometer

(General Electric)(Jimenez et al 2008)

35


intracelular em formas epimastigotas

Parasitas foram cultivados em LIT tratados com a concentraccedilatildeo correspondente ao

IC50 de cada composto ou natildeo (controle) No quarto dia apoacutes o iniacutecio do tratamento 10 x 108

ceacutelulas foram incubadas na presenccedila de 5 microM de Fluo-4 AM (Invitrogen) por uma hora a 28

ordmC Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com o tampatildeo Hepes -glicose (50

mM Hepes (pH 74) 116 mM NaCl 54 mM KCl 08 mM MgSO4 55 mM glicose e 2 mM

CaCl2) ressuspensas no mesmo tampatildeo e distribuiacutedas em placa de 96 poccedilos (25 x 107 por

poccedilo) em triplicata A leitura foi realizada no fluoriacutemetro Spectra Max M3 Molecular

Devices utilizando-se λ excitaccedilatildeo 490 nm e λ emissatildeo 518 nm (Dolai et al 2009)

353 Ensaio para verificaccedilatildeo da geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio

Para quantificar a produccedilatildeo de H2O2 pelos parasitas formas epimastigotas (50 x 106

ceacutelulas mL-1

) foram cultivadas em meio LIT a 28 degC e tratadas com a concentraccedilatildeo

correspondente ao IC50 de cada composto determinado na curva de crescimento do parasita

ou natildeo (controle) Apoacutes 24 horas do iniacutecio do tratamento 10 x 107 ceacutelulas mL

-1 tratadas ou

natildeo foram lavadas por centrifugaccedilatildeo e ressuspensas em PBS (5 mM de succinato)

Adicionou-se 12 microM do reagente Amplex Red e 005 UmL de proxidase (Horseradish

Peroxidase) A leitura das amostras foi realizada no fluoriacutemetro Spectra Max M3 Molecular

Devices utilizando-se λ excitaccedilatildeo 563 nm e λ emissatildeo 587 nm

36 Efeito sobre a metaciclogecircnese

Formas epimastigotas (50 x 106 ceacutelulas mL

-1) foram cultivadas em meio LIT e apoacutes

trecircs dias foram lavadas duas vezes em PBS e transferidas para o meio Grace (Martins et al

2009) tratados ou natildeo (controle) com a concentraccedilatildeo correspondente ao IC50 determinado nas

curvas de crescimento das formas epimastigotas No sexto dia apoacutes a transferecircncia dos

parasitas para o meio Grace foi avaliado o efeito dos faacutermacos sobre a metaciclogecircnese Os

parasitas foram contados em cacircmara de Neubauer e a porcentagem de parasitas no estaacutegio

metaciacuteclico em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de parasitas (epimastigotas + formas metaciacuteclicas) foi

avaliado

36

37 Anaacutelises do efeito dos compostos no ciclo intracelular do T cruzi

371 Toxicidade dos faacutermacos em ceacutelulas de mamiacuteferos

A toxicidade dos faacutermacos em ceacutelulas de mamiacuteferos foi avaliada incubando ceacutelulas

CHO-K1 (50 x 105 ceacutelulas por poccedilo) em placas de 24 poccedilos em meio RPMI suplementado

com SFB (10) na presenccedila de diferentes concentraccedilotildees dos faacutermacos ou natildeo (controle) As

placas foram mantidas em estufa a 37 ordmC 5 de CO2 A viabilidade celular foi avaliada 48

horas apoacutes o iniacutecio do tratamento utilizando-se o meacutetodo de MTT (3-(45-dimetiltiazol-2-il)-

25-difenil tretazolio bromide) (Mosmann 1983) As ceacutelulas foram lavadas duas vezes com

PBS e adicionou-se em cada poccedilo 300 μl de PBS e 60 μl MTT (5mgmL) As placas foram

incubadas a 37 degC durante 3 horas (protegidas da luz) A reaccedilatildeo foi interrompida com a

adiccedilatildeo de 200 μl de SDS 10 A viabilidade das ceacutelulas foi observada mediante o

aparecimento da cor azul de formazan homogecircneo ldquothiazolidinrdquo As placas foram lidas em

espectofotocircmetro de placa utilizando-se λ 595 nm e como referecircncia λ 690 nm O IC50 foi

determinado pelo ajuste dos dados em uma equaccedilatildeo sigmoidal dose-resposta

372 Anaacutelise do efeito dos compostos na infectividade das formas tripomastigotas

Ceacutelulas CHO-K1 (50 x 104

por poccedilo) foram mantidas em placas de 24 poccedilos em meio

RPMI 10 SFB a 37 degC Apoacutes 24 horas quando jaacute estavam aderidas agrave placa as ceacutelulas foram

infectadas com formas tripomastigotas (25 x 106 por poccedilo) e tratadas com diferentes

concentraccedilotildees dos compostos Os parasitas ficaram em contato com as ceacutelulas por um periacuteodo

de quatro horas Apoacutes esse periacuteodo os parasitas que ainda estavam no sobrenadante foram

removidos juntamente com os compostos As ceacutelulas foram lavadas duas vezes com PBS e

acrescido meio RPMI 10 SFB A placa foi mantida na estufa a 37 ordmC por 16 horas Apoacutes

esse periacuteodo o meio RPMI 10 foi substituiacutedo por RPMI 2 de SFB e a temperatura alterada

de 37 ordmC para 33 ordmC A placa foi mantida a 33 ordmC e no quinto dia poacutes-infecccedilatildeo os

tripomastigotas que estavam no sobrenadante foram contados em cacircmara de Neubauer O IC50

foi determinado pelo ajuste dos dados em uma equaccedilatildeo sigmoidal dose-resposta

37

373 Anaacutelise do efeito dos compostos apoacutes a invasatildeo celular pelas formas tripomastigotas




infectadas com formas tripomastigotas (25 x 106 por poccedilo) Os parasitas ficaram em contato

com as ceacutelulas por um periacuteodo de quatro horas Apoacutes esse periacuteodo os parasitas que ainda

estavam no sobrenadante foram removidos As ceacutelulas foram lavadas duas vezes com PBS

adicionou-se meio RPMI 10 SFB e diferentes concentraccedilotildees dos compostos ou natildeo

(controle) A placa foi mantida na estufa a 37 ordmC por 16 horas Apoacutes esse periacuteodo o meio

RPMI 10 foi substituiacutedo por RPMI 2 de SFB e a temperatura alterada de 37 ordmC para 33

ordmC A placa foi mantida a 33 ordmC e no quinto dia poacutes-infecccedilatildeo os tripomastigotas que estavam

no sobrenadante foram contados em cacircmara de Neubauer O IC50 foi determinado pelo ajuste

dos dados em uma equaccedilatildeo sigmoidal dose-resposta

374 Avaliaccedilatildeo da fase intracelular mais susceptiacutevel ao tratamento com os compostos

Para verificarmos em qual fase do ciclo intracelular o parasita eacute mais susceptiacutevel ao

tratamento com o faacutermaco ceacutelulas CHO-K1 (50 x 104

por poccedilo) foram mantidas em placas de

24 poccedilos em meio RPMI 10 SFB a 37 degC Apoacutes 24 horas quando jaacute estavam aderidas agrave

placa as ceacutelulas foram infectadas com formas tripomastigotas (25 x 106 por poccedilo) Os

parasitas ficaram em contato com as ceacutelulas por um periacuteodo de quatro horas Apoacutes esse

periacuteodo os parasitas que ainda estavam no sobrenadante foram removidos as ceacutelulas foram

lavadas duas vezes com PBS e adicionou-se meio RPMI 10 SFB O tratamento foi realizado

em diferentes periacuteodos com a concentraccedilatildeo correspondente ao IC50 determinado

anteriormente Diferentes poccedilos foram tratados em diferentes periacuteodos do ciclo durante o

periacuteodo da invasatildeo celular pelos parasitas apoacutes 24 horas ateacute 60 horas (fase amastigota) e apoacutes

60 horas (fase epimastigota intracelular) No quinto dia poacutes-infecccedilatildeo os parasitas que estavam

no sobrenadante foram contados em cacircmara de Neubauer O nuacutemero de parasitas de cada

tratamento foi comparado com o controle ceacutelulas infectadas natildeo tratadas

38

38 Anaacutelises estatiacutesticas

O programa Excel 2007 foi utilizado para calcular meacutedia e desvio padratildeo das reacuteplicas

dos ensaios Os programas OriginPro8 e GraphPadPrism5 foram utilizados para construccedilatildeo

dos graacuteficos e ajustes dos mesmos o meacutetodo ANOVA de uma via seguido do teste Tukey foi

utilizado nas anaacutelises estatiacutesticas dos tratamentos em relaccedilatildeo ao controle Para anaacutelise de

diferenccedila entre grupos foi utilizado o teste T O valor de p lt 005 foi considerado

estatisticamente significativo

39

4 RESULTADOS

41 Curvas de crescimento do T cruzi na presenccedila dos compostos

Os faacutermacos selecionados para verificaccedilatildeo de uma possiacutevel atividade anti- T cruzi

foram avaliados inicialmente em parasitas no estaacutegio epimastigota como mostram as curvas de

crescimento na Figura 5 O faacutermaco Vigabatrina que eacute um inibidor irreversiacutevel do receptor

GABA T foi avaliado em diferentes concentraccedilotildees (50 microM a 1 mM) (Figura 5 (a)) Jaacute a

Pregabalina anaacutelogo de GABA foi avaliada nas concentraccedilotildees (01 a 1 mM) (Figura 5 (b))

Os dois faacutermacos natildeo apresentaram efeito inibitoacuterio na proliferaccedilatildeo das formas epimastigota O

MTEP 3-((2-metil-4-thiazolil) etinil)piridine que atua como um antagonista seletivo natildeo

competitivo do receptor metabotroacutepico de glutamato mGluR5 foi avaliado nas concentraccedilotildees

(01 a 1 mM) (Figura 5 (c)) Observa-se que apenas a concentraccedilatildeo 1 mM apresenta efeito

inibitoacuterio na proliferaccedilatildeo de formas epimastigotas visto que todas as outras concentraccedilotildees

utilizadas inibem menos que o controle realizado com DMSO solvente utilizado na diluiccedilatildeo do

composto O MK-801 antagonista do receptor de glutamato do tipo NMDA apresentou efeito

inibitoacuterio na proliferaccedilatildeo das formas epimastigotas do T cruzi Esse composto foi avaliado nas

concentraccedilotildees (01 a 1 mM) como observado na Figura 5 (d) O IC50 determinado para o

tratamento realizado a 28 degC pH 75 foi de 03 plusmn 0028 mM conforme Figura 6 (a) A

Memantina que atua no sistema glutamateacutergico bloqueando a atividade de receptores de

glutamato do tipo NMDA tambeacutem foi avaliada nas curvas de crescimento do T cruzi

utilizando-se as concentraccedilotildees (30 a 300 microM) como pode ser obeservado na Figura 5 (e) Esse

composto tambeacutem apresentou efeito anti-proliferativo no crescimento do parasita Conforme

observado na Figura 6 (b) o IC50 determinado a 28 degC pH 75 foi de 1726 plusmn 9 microM

Memantina foi o faacutermaco que apresentou melhor efeito inibitoacuterio nas curvas de crescimento das

formas epimastigotas

40


faacutermacos de interesse

(a) Vigabatrina (50 microM a 1 mM) (b) Pregabalina (01a 1 mM) (c) MTEP (01 a 1 mM) (d) MK-801 (01 a

1 mM) e (e) Memantina (30 a 300 microM) Os parasitas foram mantidos a 28degC cultivados em meio LIT pH 75 O

controle negativo (C-) foi realizado sem adiccedilatildeo de composto na cultura Para o controle de inibiccedilatildeo (C

+)

utilizamos uma combinaccedilatildeo de antimicina (05 microM) e rotenona (60 microM)

41

Figura 6 - Curvas dose-resposta do T cruzi estaacutegio epimastigota para os tratamentos

com MK-801 ou Memantina

(a) (b)

(a) parasitas tratados com MK-801 (01 a 1 mM) o IC50 determinado foi 03 plusmn 0028 mM (b) parasitas tratados

com Memantina (30 a 300 microM) o IC50 determinado foi 1726 plusmn 9 microM A anaacutelise foi realizada no quinto dia de

crescimento fase exponencial da cultura utilizando-se o programa OriginPro8

42 Interaccedilatildeo com condiccedilotildees de estresse

Estresse teacutermico e oxidativo

Baseados nos resultados apresentados anteriormente avaliamos um possiacutevel efeito

sineacutergico entre estresse teacutermico e o MK-801 e entre o estresse teacutermico ou oxidativo e a

Memantina (Figura 7) Como observado na Figura 7 (a) e (b) o MK-801 foi avaliado nas

concentraccedilotildees (01 a 045 mM) a 33 degC e a 37 degC respectivamente Jaacute a Memantina foi avaliada

nas concentraccedilotildees (100 a 500 microM) a 33 degC e (30 a 300 microM) a 37 degC conforme a Figura 7 (c) e

(d) respectivamente

A Memantina tambeacutem foi avaliada em parasitas estressados oxidativamente Os parasitas

foram tratados com o IC50 previamente estabelecido para H2O2 (726 microM) por uma hora Apoacutes

esse periacuteodo foram ressuspensos em LIT e tratados com diferentes concentraccedilotildees de Memantina

(30 a 300 microM) e cultivados a 28 degC como observado na Figura 7 (e)

0 100 200 300

0

50

100

d

e in

ibiccedil

ao

Memantina (uM)0 100 200 300

0

50

100

d

e inib

iccedilao

Memantina (uM)

42


estresse teacutermico e oxidativo e tratados com MK-801 ou Memantina

Os parasitas foram cultivados em meio LIT pH 75 em diferentes temperaturas e tratados com (a) MK-801 (01

a 045 mM) a 33 degC (b) MK-801 (01 a 045 mM) a 37 degC (c) Memantina (100 a 500 microM) a 33degC (d) Memantina (30 a

300 microM) a 37degC (e) tratados com 726 microM de H2O2 por 1 hora e com diferentes concentraccedilotildees de Memantina

(30 a 300 microM) a 28 degC O controle negativo (C-) foi realizado sem adiccedilatildeo de composto na cultura Para o

controle de inibiccedilatildeo (C+) utilizamos uma combinaccedilatildeo de antimicina (05 microM) e rotenona (60 microM)

43

Ao avaliarmos os resultados observamos que natildeo haacute um efeito sineacutergico entre o MK-

801 e diferentes temperaturas visto que o IC50 determinado a 33 degC foi de 036 plusmn 006 mM e a

37 degC foi de 029 plusmn 0025 mM conforme Figura 8 (a) e (b) respectivamente Enquanto que

o IC50 determinado em condiccedilotildees normais de cultivo (parasitas cultivados em LIT a 28 degC) foi

03 plusmn 0028 mM

A Memantina tambeacutem natildeo apresentou efeito sineacutergico com as diferentes temperaturas

ou estresse oxidativo visto que o IC50 determinado nessas condiccedilotildees eacute maior do que o IC50

determinado em condiccedilotildees normais de cultivo (parasitas cultivados em LIT a 28 degC) Para os

parasitas cultivados a 33 degC observou-se um IC50 de 402 plusmn 60 microM conforme observado na

Figura 8 (c) e a 37 degC o IC50 foi de 228 plusmn 8 microM como mostra a Figura 8 (d) Em relaccedilatildeo

ao parasitas submetidos ao estresse oxidativo quando avaliamos o efeito do tratamento

simultacircneo com a concentraccedilatildeo correspondente ao IC25 da Memantina (142 plusmn 8 microM) e o IC50

do H2O2 (726 microM) foi observado uma diminuiccedilatildeo na proliferaccedilatildeo dos parasitas de 63 plusmn

4 mostrando que natildeo haacute um efeito sineacutergico e sim uma soma dos efeitos dos tratamentos

44


submetidos ao estresse teacutermico

Os parasitas foram tratados com (a) MK-801 (01 a 045 mM) a 33 degC IC50 036 plusmn 006 mM (b) MK-801 (01 a 045

mM) a 37 degC IC50 029 plusmn 0025 mM (c) Memantina (100 a 500 microM) a 33 degC IC50 402 plusmn 60 microM (d) Memantina (30

a 300 microM) a 37 degC IC50 228 plusmn 8 microM A anaacutelise foi realizada no quinto dia de crescimento fase exponencial da

cultura utilizando-se o programa OriginPro8

45

O MK-801 e a Memantina apresentam o mesmo mecanismo de accedilatildeo por meio de

receptores de glutamato do tipo NMDA Devido o fato da Memantina ter apresentado melhor

efeito antiproliferativo em relaccedilatildeo ao MK-801 e quando administrado aos pacientes apresenta

pouco ou nenhum efeito colateral descrito decidimos escolher esse composto para prosseguir

os experimentos

Estresse metaboacutelico

Para verificar a resposta de epimastigotas ao estresse nutricional na presenccedila de 1726

microM de Memantina (IC50 determinado anteriormente) 50 x 106 ceacutelulas mL

-1 foram cultivadas

em LIT ou PBS e tratados ou natildeo (controle negativo) As ceacutelulas foram incubadas a 28 degC

durante 30 horas e apoacutes esse periacuteodo foi avaliado o niacutevel de ATP intracelular representado na

Figura 9 Observa-se uma diminuiccedilatildeo nos niacuteveis de ATP dos parasitas cultivados em LIT e

tratados com Memantina sugerindo que haacute uma interferecircncia no metabolismo energeacutetico do

parasita No entanto natildeo haacute um efeito sineacutergico entre o estresse metaboacutelico e o tratamento

visto que natildeo haacute diferenccedila estatisticamente significativa entre os parasitas que foram mantidos

em PBS e os parasitas que foram mantidos em PBS e tratados

Figura 9 - Resposta do Tcruzi estaacutegio epimastigota ao estresse nutricional na presenccedila

da Memantina

Parasitas submetidos ao estresse nutricional e ao tratamento com Memantina (1726 microM) IC50 determinado nas

curvas de crescimento Os parasitas foram incubados por 30 horas em LIT LIT+Memantina PBS

PBS+Memantina Apoacutes esse periacuteodo os niacuteveis de ATP intracelular foram avaliados Teste Tukey plt 005 MM

Memantina ns natildeo significativo

46

43 Efeito da Memantina na metaciclogecircnese

Avaliamos o efeito da Memantina na metaciclogecircnese utilizando parasitas no estaacutegio

epimastigota (50 x 106 ceacutelulas mL

-1) cultivadas em meio LIT transferidos para o meio Grace

e tratados ou natildeo (controle) com 1726 microM de Memantina (concentraccedilatildeo correspondente ao

IC50 determinado nas curvas de crescimento) No sexto dia apoacutes a transferecircncia para meio

Grace os parasitas foram contados em cacircmara de Neubauer e a porcentagem de parasitas no

estaacutegio metaciacuteclico em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de parasitas (epimastigotas + formas

metaciacuteclicas) foi avaliado Como demonstrado na Figura 10 Memantina interfere na

metaciclogecircnese pois foi observado que culturas de parasitas tratados apresentam uma

diminuiccedilatildeo na diferenciaccedilatildeo de aproximadamente 30 em relaccedilatildeo ao controle

Figura 10 - Efeito da Memantina na metaciclogecircnese

Os parasitas foram cultivados em meio LIT e transferidos para o meio Grace e tratados ou natildeo (controle) com

1726 microM No sexto dia apoacutes a transferecircncia os parasitas foram contados em cacircmara de Neubauer e a

porcentagem de parasitas no estaacutegio metaciacuteclico em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de parasitas (epimastigotas + formas

metaciacuteclicas) foi avaliado Resultado apresentado eacute a sobreposiccedilatildeo de trecircs ensaios independentes Meta

metaciacuteclico Epiepimastigota

47

44 Tipo de morte celular em parasitas tratados com Memantina

Avaliamos tambeacutem o tipo de morte celular dos parasitas submetidos ao tratamento

com Memantina Os parasitas foram incubados na presenccedila de anexina V-FITC para

avaliarmos a exposiccedilatildeo de fosfatidilserina na membrana caracteriacutestica de apoptose como

tambeacutem na presenccedila de iodeto de propiacutedio para verificarmos uma possiacutevel ruptura da

membrana do parasita caracteriacutestica de necrose conforme descrito em materiais e meacutetodos

Os parasitas foram avaliados por citometria de fluxo como mostra a Figura 11 Como

observado na Figura 11(a) os parasitas controle (parasitas natildeo tratados) apresentaram 10

de positividade para exposiccedilatildeo de fosfatidilserina enquanto que os parasitas tratados com

Memantina apresentaram 42 conforme Figura 11(b) Outra caracteriacutestica de apoptose

observada nesse experimento eacute a manutenccedilatildeo da integridade da membrana do parasita visto

que as ceacutelulas praticamente natildeo foram marcadas pelo iodeto de propiacutedio Como observado na

Figura 11 (a) e (b) o nuacutemero de ceacutelulas marcadas dentre as que foram tratadas com

Memantina e no controle foi 046 e 078 respectivamente Esses resultados sugerem que

os parasitas tratados com Memantina apresentam caracteriacutesticas de morte do tipo apoptose e

natildeo necrose

48

Figura 11 - Representaccedilatildeo da anaacutelise por citometria de fluxo para detecccedilatildeo do tipo de

morte celular

Os parasitas foram tratados com Memantina (1726 microM) ou natildeo (controle) durante 4 dias Apoacutes esse periacuteodo os

parasitas foram marcados com anexina V-FITC e Iodeto de Propiacutedio (PI) e avaliados (a) parasitas natildeo tratados

marcados com anexina e PI (b) parasitas tratados com Memantina marcados com anexina e PI (c) representaccedilatildeo

graacutefica de trecircs experimentos independentes Controles (d) parasitas natildeo tratados marcados apenas com anexina

(e) parasitas natildeo tratados marcados apenas com PI (f) controle positivo para necrose parasitas natildeo tratados

permeabilizados com digitonina e marcados com PI e (g) controle positivo para apoptose parasitas tratados com

estaurosporina 24 horas antes do ensaio e marcados com anexina

49

Baseados no resultado anterior avaliamos outras caracteriacutestas descritas para apoptose

em tripanossomatiacutedeos Tem sido descrito que o aumento da produccedilatildeo de EROs eacute o principal

evento de sinalizaccedilatildeo e execuccedilatildeo desse processo (Irigoin et al 2009 Menna-Barreto et al

2009 Smirlis Soteriadou 2011) Portanto avaliamos a produccedilatildeo de H2O2 em parasitas

tratados com Memantina Formas epimastigotas foram tratadas com a concentraccedilatildeo

correspondente ao IC50 (1726 microM) e apoacutes 24 horas de tratamento os parasitas foram

incubados na presenccedila de amplex red e peroxidase (horsedish peroxidase) conforme descrito

em materiais e meacutetodos Como obeserva-se na Figura 12 os parasitas tratados produzem

mais H2O2 que os parasitas do grupo controle

Figura 12 - Representaccedilatildeo graacutefica da quantificaccedilatildeo de H2O2

Formas epimastigotas foram tratadas com Memantina (1726 microM) ou natildeo (controle) durante 24 horas Apoacutes esse

periacuteodo os parasitas (10 x 107) foram lavados por centrifugaccedilatildeo ressuspensos em PBS (5mM de succinato) e

adicionou-se 25 microM de Amplex Red e 005 UmL de Horseradish Peroxidase As amostras foram analisadas no

fluoriacutemetro Spectra Max M3 Molecular Devices utilizando-se λ excitaccedilatildeo 563 nm e λ emissatildeo 587 nm Teste T

plt 005

50

Jaacute foi descrito que aleacutem da produccedilatildeo de EROs a desregulaccedilatildeo da homeostase de Ca2+

tambeacutem contribui para a apoptose em tripanossomatiacutedeos (Smirlis et al 2010) Portanto

avaliamos tambeacutem a concentraccedilatildeo intracelular desse caacutetion em formas epimastigotas expostas

ao tratamento com Memantina conforme descrito em materiais e meacutetodos Como se pode

observar na Figura 13 a exposiccedilatildeo dos parasitas ao tratamento com Memantina aumenta a

concentraccedilatildeo intracelular de Ca2+

quando comparados aos parasitas do grupo controle

sugerindo mais uma vez que o parasita estaacute sofrendo apoptose


Formas epimastigotas foram tratados com Memantina (1726 microM ) ou natildeo (controle) durante 4 dias Apoacutes esse

periacuteodo os parasitas (25 x 107) foram incubados com 5 microM de Fluo-4 AM por 1 hora a 28 ordmC lavadas duas

vezes em tampatildeo hepes-glicose e avaliadas no fluoriacutemetro Spectra Max M3 Molecular Devices utilizando-se λ

excitaccedilatildeo 490 nm e λ emissatildeo 518 nm Teste T plt 005

Observamos tambeacutem a morfologia dos parasitas tratados com Memantina em relaccedilatildeo

ao controle Comforme podemos observar na Figura 14 os parasitas tratados apresentam

mudanccedila na sua morfologia apresentando forma arredondada (Figura 14 (c) e (d)) em

relaccedilatildeo ao controle (parasitas que natildeo foram tratados) como mostra a Figura 14 (a) e (b)

Uma caracteriacutestica tambeacutem descrita para ceacutelulas apoptoacuteticas (Kaczanowski et al 2011

Smirlis et al 2010)

51

Figura 14 - Formas epimastigotas de T cruzi

Formas epimastigotas no quarto dia de crescimento (a) e (b) parasitas sem tratamento (controle) (c) e (d)

parasitas tratados com Memantina (1726 microM ) Coloraccedilatildeo Panoacutetico Resoluccedilatildeo (a) e (c) 40x (b) e (d) 100x

52

45 Efeito da Memantina no ciclo intracelular do T cruzi

Verificamos tambeacutem o efeito da Memantina no ciclo intracelular do parasita

conforme Figura 15 Inicialmente foi avaliada a toxicidade do composto em ceacutelulas CHO-K1

modelo de infecccedilatildeo utilizado por nosso grupo As ceacutelulas CHO-K1 foram incubadas por 48

horas na presenccedila de diferentes concentraccedilotildees (50 microM a 1 mM) ou natildeo (controle) conforme

descrito em materiais e meacutetodos Como se pode observar na Figura 15 (a) Memantina eacute bem

tolerada pelas ceacutelulas CHO-K1 pois nas concentraccedilotildees abaixo de 04 mM (valor acima do

IC50 determinado para o estaacutegio epimastigota) natildeo apresenta diferenccedila em relaccedilatildeo ao controle

Como observado na Figura 16 (a) o IC50 determinado foi 6245 plusmn 46 microM Com base neste

resultado realizamos os ensaios de infecccedilatildeo tratando com concentraccedilotildees de Memantina natildeo

toacutexicas para as ceacutelulas CHO-K1 em diferentes periacuteodos da infecccedilatildeo

Para verificarmos o efeito do faacutermaco na infectividade de formas tripomastigotas as

ceacutelulas foram infectadas como descrito em materiais e meacutetodos e tratadas ou natildeo (controle)

durante somente o momento da invasatildeo celular com diferentes concentraccedilotildees de Memantina

(50 a 400 microM) conforme representado na Figura 15 (b) O IC50 determinado nesse tratamento

foi de 2063 microM como pode ser observado na Figura 16 (b) Em todos os tratamentos foi

observada uma diminuiccedilatildeo estatisticamente significativa do nuacutemero de formas tripomastigotas

que eclodiram das ceacutelulas tratadas em relaccedilatildeo ao controle conforme Figura 15 (b)

Avaliamos tambeacutem o efeito no tratamento apoacutes a infecccedilatildeo pelo T cruzi Ceacutelulas CHO-

K1 foram infectadas com formas tripomastigotas e apoacutes a invasatildeo celular pelos parasitas

iniciamos o tratamento com diferentes concentraccedilotildees de Memantina (5 a 300 microM) conforme

descrito em materiais e meacutetodos Como observado na Figura 15 (c) todos os tratamentos

mostraram uma diminuiccedilatildeo estatisticamente significativa no nuacutemero de formas

tripomastigotas O IC50 determinado foi de 31 microM conforme Figura 16 (c)

Apoacutes a verificaccedilatildeo do efeito da Memantina durante a invasatildeo celular e apoacutes a

infecccedilatildeo consideramos relevante a avaliaccedilatildeo de qual fase do ciclo intracelular (amastigota ou

epimastigota intracelular) seria mais susceptiacutevel ao tratamento Neste experiemento como

descrito em materiais e meacutetodos o tratamento foi realizado em diferentes periacuteodos da

infecccedilatildeo com a concentraccedilatildeo correspondente ao IC50 (31 microM) O nuacutemero de parasitas de cada

periacuteodo de tratamento foi comparado com o controle ceacutelulas infectadas e natildeo tratadas Como

observado na Figura 15 (d) a fase mais susceptiacutevel ao tratamento eacute o estaacutegio amastigota

forma intracelular replicativa e infectiva

53

Figura 15 - Efeito da Memantina no ciclo intracelular do T cruzi

(a) Viabilidade das ceacutelulas CHO-K1 tratadas com diferentes concentraccedilotildees de Memantina (50 a 1 mM) As

ceacutelulas foram incubadas por 48 horas e a viabilidade celular foi avaliada utilizando-se o meacutetodo de MTT (b)

Efeito na infectividade de formas tripomastigotas Os parasitas foram tratados somente durante o periacuteodo da

infecccedilatildeo (c) Efeito no tratamento apoacutes a invasatildeo dos parasitas nas ceacutelulas CHO-K1 (d) Avaliaccedilatildeo de qual fase

do ciclo intracelular do T cruzi eacute mais susceptiacutevel ao tratamento com Memantina As ceacutelulas foram tratadas em

diferentes periacuteodos com a concentraccedilatildeo correspondente ao IC50 determinado anteriormente (31 microM) T

tripomastigota A amastigota EI epimastigota Em todos os experimentos foi avaliada a eclosatildeo de formas

tripomastigotas no quinto dia poacutes-infecccedilatildeo por contagem dos parasitas que se encontravam no sobrenadante em

cacircmara de Neubauer Teste Tukey plt 005

54

Figura 16 - Curvas dose-resposta da toxicidade em ceacutelulas CHO-K1 infectividade de

formas tripomastigostas e tratamento da infecccedilatildeo apoacutes a invasatildeo celular

(a) Resposta das ceacutelulas CHO-k1 ao tratamento com diferentes concentraccedilotildees do Memantina (50 microM a 1 mM)

durante 48 horas e avaliados pelo ensaio de MTT IC50 6245 plusmn 46 microM (b) tratamento de parasitas no estaacutegio

tripomastigota durante o periacuteodo da invasatildeo celular com diferentes concentraccedilotildees de Memantina (50 a 400 microM)

IC50 2063 microM (c) tratamento da infecccedilatildeo apoacutes a invasatildeo pelos parasitas durante todo o periacuteodo da infecccedilatildeo

com diferentes concentraccedilotildees de Memantina (5 a 300 microM) IC50 31 microM A anaacutelise foi realizada no quinto dia

apoacutes a infecccedilatildeo pela contagem em cacircmara de Neubauer dos parasitas que encontravam-se no sobrenadante A

determinaccedilatildeo do valor de IC50 foi realizada utilizando-se o programa OriginPro8

55

5 DISCUSSAtildeO

Como demonstrado nos resultados os faacutermacos Vigabatrina (inibidor do receptor

GABA T) e Pregabalina (anaacutelogo do GABA) natildeo apresentaram efeito inibitoacuterio na

proliferaccedilatildeo de formas epimastigotas Poreacutem jaacute havia sido relatado a atividade tripanocida de

faacutermacos anaacutelogos de GABA Por exemplo o acamprosato que eacute utilizado no tratamento da

dependecircncia alcooacutelica foi avaliado pelo nosso grupo em curvas de crescimento de formas

epimastigotas e apresentou efeito inibitoacuterio (IC50 250 microM) (Lange 2012)

Dentre os faacutermacos com accedilatildeo glutamateacutergica o MTEP que atua como um antagonista

seletivo natildeo competitivo do receptor metabotroacutepico mGluR5 tambeacutem natildeo apresentou efeito

inibitoacuterio nas curvas de crescimento das formas epimastigotas Jaacute o MK-801 e a Memantina

demonstraram efeito inibitoacuterio na proliferaccedilatildeo dos parasitas Ambos atuam em mamiacuteferos

bloqueando receptores de glutamato do tipo NMDA principalmente em humanos onde esses

receptores de glutamato estatildeo bem caracterizados e associados a canais iocircnicos

principalmente Ca2+

(Coan et al 1987 Lipton 2005 Xia et al 2010) Em T cruzi

receptores de glutamato do tipo NMDA ainda natildeo foram caracterizados Uma anaacutelise feita na

sequecircncia do genoma de T cruzi demonstrou que natildeo haacute uma sequecircncia compatiacutevel com

receptores do tipo NMDA de humanos (TriTrypDB) No entanto Paveto e colaboradores tecircm

sugerido que T cruzi pode apresentar receptores de glutamato similar ao receptor NMDA

descrito para o tecido nervoso e como ocorre em ceacutelulas neurais receptores NMDA de T

cruzi seriam provavelmente os principais responsaacuteveis por controlar os niacuteveis de Ca2+

citosoacutelico do parasita (Paveto et al 1995)

MK-801 e Memantina satildeo utilizados no controle de doenccedilas neurodegenerativas ou

ligadas ao sistema nervoso central Jaacute foi demonstrado que o MK-801 apresenta propriedades

anesteacutesicas e anticonvulsivantes (Ameer et al 2010) Em formas epimastigotas de T cruzi foi

observado que a conversatildeo de L-[3H]arginina para [

3H]citrulina eacute estimulada por L-glutamato

e NMDA e eacute bloqueada por EGTA MK-801 e ketamina (Paveto et al 1995) Tambeacutem foi

verificada uma dimuniccedilatildeo na motilidade de epimastigotas tratados com MK-801

provavelmente por interferecircncia nos niacuteveis de GMP ciacuteclico mediado por oacutexido niacutetrico (Pereira

et al 1997) Jaacute a Memantina eacute uma amina triciacuteclica o primeiro da classe de novos

medicamentos para a doenccedila de Alzheimer (Lipton 2005 Xia et al 2010) Jaacute foi descrita

atividade tripanocida para outras aminas O Trypanosoma brucei por exemplo eacute sensiacutevel ao

tratamento com Rimantadina uma droga utilizada para o tratamento e profilaxia da infecccedilatildeo

pelo viacuterus da influenza A (Kelly et al 1999) Kelly e colaboradores tambeacutem sintetizaram e

56

testaram vaacuterios compostos derivados da aminoadamantana e aminoalquilciclohexano e

observaram que vaacuterios desses compostos apresentam atividade consideraacutevel contra as formas

sanguiacuteneas do T brucei tanto in vitro como tambeacutem in vivo (Kelly et al 2001)

Recentemente o mesmo grupo sintetizou compostos anaacutelogos de amantadina e memantina

que continham caracteriacutesticas estruturais necessaacuterias para atividade antagonista de receptores

NMDA e atividade tripanocida Esses compostos foram avaliados em T brucei e foi

observado que a introduccedilatildeo de um grupo etil em C-5 aumenta a atividade tripanocida (Duque

et al 2010)

Ao avaliarmos a interaccedilatildeo do MK-801 ou da Memantina com diferentes situaccedilotildees de

estresse (metaboacutelico teacutermico e oxidativo) observamos que natildeo haacute interaccedilatildeo visto que os

valores de IC50 obtidos nessas condiccedilotildees foram maiores ou iguais do que foi obtido quando os

parasitas foram mantidos em condiccedilotildees normais de cultivo Uma interaccedilatildeo entre os faacutermacos

e as condiccedilotildees de estresse seria interessante do ponto de vista terapecircutico uma vez que o T

cruzi estaacute exposto a situaccedilotildees de estresse teacutermico metaboacutelico e oxidativo durante o seu ciclo

de vida jaacute que transita em diferentes regiotildees do intestino do inseto vetor e no meio intra e

extracelular no hospedeiro mamiacutefero (Silber et al 2005a) O parasita eacute submetido ao estresse

teacutermico quando passa pelo inseto vetor visto que o triatomiacuteneo natildeo regula sua temperatura

interna podendo variar de acordo com a temperatura no ambiente externo Como tambeacutem o

parasita alterna entre o hospedeiro mamiacutefero que apresenta uma temperatura meacutedia de 37 ordmC e

o inseto vetor no qual a meacutedia de temperatura eacute 28 ordmC (Magdaleno et al 2009) O estresse

metaboacutelico ocorre principalmente na porccedilatildeo final do intestino do triatomiacuteneo onde ocorre a

diferenciaccedilatildeo das formas epimastigotas para tripomastigotas metacicliacutecos (Contreras et al

1985) e no estabelecimento da infecccedilatildeo no citoplasma das ceacutelulas do hospedeiro mamiacutefero

onde devem competir por nutrientes com a proacutepia ceacutelula hospedeira Aleacutem do mais os

parasitas precisam adaptar-se a disponibilidade de diferentes nutrientes nos diversos

ambientes (diferentes meios extracelulares e intracelulares no hospedeiro mamiacutefero e

diferentes porccedilotildees do tubo digestivo no inseto vetor) (Silber et al 2009) Jaacute o estresse

oxidativo pode ocorrer tanto pelo metabolismo do proacuteprio parasita ou pela resposta imune do

hospedeiro mamiacutefero (Turrens 2004)

A Memantina tambeacutem interferiu na metaciclogecircnese processo de diferenciaccedilatildeo em

que o parasita passa do estaacutegio epimastigota (estaacutegio replicativo e natildeo infectivo) para

tripomastigota metaciacuteclico (estaacutegio infectivo e natildeo replicativo) Esse processo ocorre

naturalmente na porccedilatildeo final do intestino de triatomiacuteneos onde o parasita encontra

aminoaacutecidos como prolina glutamato e aspartato que satildeo importantes nesse processo

57

(Contreras et al 1985) pois permitem ao parasita restabelecer os niacuteveis de ATP intracelular

necessaacuterios agrave metaciclogecircnese (Cazzulo 1992) Os parasitas que foram submetidos ao

tratamento apresentaram uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de formas metaciacuteclicas em

aproximadamente 30 em relaccedilatildeo ao controle Como jaacute mencionado tambeacutem obeservamos

uma diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de ATP intracelular dos parasitas quando desafiados com

Memantina Provavelmente essa inibiccedilatildeo na metaciclogecircnese pode estar relacionada com a

diminuiccedilatildeo nos niacuteveis de ATP

T cruzi eacute um parasita intracelular obrigatoacuterio como mencionado anteriormente no

hospedeiro mamiacutefero o parasita passa por diferenciaccedilatildeo do estaacutegio tripomastigota para

amastigota e novamente para tripomastigota passando por um estaacutegio intermediaacuterio chamado

epimastigota intracelular (Almeida-De-Faria et al 1999) Como observado nos resultados a

Memantina interfere no ciclo intracelular do T cruzi Tanto na infectividade de formas

tripomastigotas como no tratamento ao longo do periacuteodo de infeccedilatildeo diminuindo o nuacutemero de

formas tripomastigotas que eclodem no quinto dia apoacutes a infecccedilatildeo A fase do ciclo intracelular

mais susceptiacutevel ao tratamento eacute o estaacutegio amastigota uacutenico estaacutegio replicativo do ciclo

intracelular Esse dado eacute muito importante visto que na fase crocircnica da doenccedila de Chagas o

parasita forma ninhos de amastigotas em tecidos do hospedeiro mamiacutefero principalmente no

tecido cardiacuteaco (Rassi Marin-Neto 2010) e nesta fase da doenccedila a eficaacutecia da terapia

disponiacutevel atualmente eacute controrversa (Boscardin et al 2009 Silber et al 2005b)

Nossos resultados tambeacutem sugerem que o tratamento com Memantina desencadea o

mecanismo de morte celular programada com caracteriacutesticas de apoptose em formas

epimastigotas de T cruzi Como foi demonstrado formas epimastigotas tratadas com

Memantina apresentam aumento da produccedilatildeo de EROs diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de ATP

intracelular aumento da concentraccedilatildeo de Ca2+

intracelular exposiccedilatildeo de fosfatidilserina na

membrana do parasita aleacutem de mudanccedilas morfoloacutegicas Esse tipo de MCD tem sido descrita

para protistas unicelulares incluindo T cruzi Plasmodium e Leishmania (Al-Olayan et al

2002 Ameisen et al 1995 Das et al 2001 Duszenko et al 2006) Alguns autores tem

descrito a participaccedilatildeo da mitococircndria no processo de apoptose em T cruzi semelhante ao

que ocorre em metazoaacuterios onde a mitococircndria eacute a principal organela envolvida nesse

processo Mudanccedilas na funccedilatildeo mitocondrial principalmente quando ocorre a produccedilatildeo de

(EROs) foram identificadas como o principal evento de sinalizaccedilatildeo e execuccedilatildeo desse processo

(Irigoin et al 2009 Menna-Barreto et al 2009 Smirlis et al 2010) Foi descrito tambeacutem

que aleacutem do aumento da produccedilatildeo de EROs a desregulaccedilatildeo da homeostase de Ca2+

tambeacutem

pode contribuir para a apoptose em tripanossomatiacutedeos (Smirlis et al 2010)

58

Os dados apresentados demonstram que dos faacutermacos estudados apenas Memantina

apresentou um melhor efeito tripanocida Inibe a proliferaccedilatildeo de formas epimastigotas

interfere na metaciclogecircnese como tambeacutem afeta o metabolismo energeacutetico do parasita com a

diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de ATP aleacutem de desencadear mecanismos que levam a apoptose das

formas epimastigotas Aleacutem do mais interfere no ciclo intracelular do parasita mais

especificamente no estaacutegio amastigota Interessantemente as fases do ciclo do parasita que

satildeo mais afetadas satildeo as fases que requerem mais energia estaacutegios replicativos (amastigota e

epimastigota) como tambeacutem os processos de diferenciaccedilatildeo e invasatildeo celular Estes dados

sugerem que o metabolismo energeacutetico do parasita estaacute sendo afetado como tambeacutem

provalvelmente ocorra uma dimuniccedilatildeo na motilidade do parasita pela interferecircncia nos niacuteveis

de GMP ciacuteclico mediado por oacutexido niacutetrico conforme sugerido por Pereira e colaboradores

(Pereira et al 1997)

Apesar de apresentar valores de IC50 que podem ser considerados altos em relaccedilatildeo aos

valores descritos para formas epimastigotas tratadas com Benzonidazol (76 a 32 microM)

variando de acordo com a cepa do T cruzi (Moreno et al 2010) esses resultados mostram

perspectivas promissoras visto que a Memantina poderaacute ser utilizado como composto liacuteder

para o desenho de derivados com atividade anti-T cruzi otimizada como jaacute estaacute sendo

trabalhado em relaccedilatildeo ao tratamento do Trypanosoma brucei (Duque et al 2010) Aleacutem do

mais jaacute eacute utilizado em humanos para doenccedila de Alzheimer sendo bem tolerado pelos

pacientes

59

6 CONCLUSOtildeES

Diante do exposto concluimos que

1- Os faacutermacos Vigabatrina Pregabalina e MTEP natildeo apresentaram efeito inibitoacuterio nas

curvas de crescimento de T cruzi

2- Os faacutermacos MK-801 e Memantina apresentaram efeito antiproliferativo em formas

epimastigotas sendo que Memantina apresentou um valor de IC50 mais baixo sendo portanto

mais eficaz Interessantemente os dois compostos tem o mesmo mecanismo de accedilatildeo descrito

na literatura para mamiacuteferos receptores de glutamato do tipo NMDA

3- Memantina foi capaz de desencadear mecanismos de morte celular programada do

tipo apoptose em formas epimastigotas as quais apresentaram exposiccedilatildeo de fosfatidilserina

na membrana externa aumento de Ca2+

intracelular aumento da geraccedilatildeo de EROs

diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de ATP e mudanccedilas morfoloacutegicas

4- O processo de metaciclogecircnese tambeacutem foi afetado pelo tratamento com Memantina

visto que ocorreu uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de parasitas que diferenciam quando tratados

5- Memantina eacute bem tolerada pelas ceacutelulas CHO-K1 visto que o valor de IC50

determinado quando as ceacutelulas foram desafiadas eacute quase trecircs vezes maior que o determinado

nas curvas de crescimento de formas epimastigotas e mais de dez vezes maior do que o valor

determinado no tratamento do ciclo intracelular (CHO-K1 6245 plusmn 46 microM formas

epimastigotas 1726 microM e ciclo intracelular 31 microM)

6- A capacidade de infecccedilatildeo de formas tripomastigotas foi dimuiacuteda quando os parasitas

foram tratados com Memantina durante o periacuteodo da invasatildeo celular como tambeacutem

observou-se uma diminuiccedilatildeo do nuacutemero de parasitas que eclodiram quando as ceacutelulas CHO-

K1 infectadas foram tratadas durante todo periacuteodo de infecccedilatildeo

7- O estaacutegio amastigota eacute a forma mais susceptiacutevel ao tratamento com Memantina

60

8- As fases do ciclo de vida do parasita mais afetadas satildeo as fases que requerem mais

energia estaacutegios replicativos (amastigota e epimastigota) Como tambeacutem os processos de

diferenciaccedilatildeo e invasatildeo celular Esses dados em conjunto sugerem que o tratamento com

Memantina interfere no metabolismo energeacutetico do parasita

61

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Aacuterea de concentraccedilatildeo Biologia da Relaccedilatildeo

Patoacutegeno-Hospedeiro

Orientador Prof Dr Ariel Mariano Silber

Versatildeo corrigida A versatildeo original eletrocircnica

encontra-se disponiacutevel tanto na Biblioteca do ICB

quanto na Biblioteca Digital de Teses e Dissertaccedilotildees

da USP (BDTD)

Satildeo Paulo

2013









(CNPq)



AGRADECIMENTOS









momentos















experimentos


financeiro












RESUMO































ABSTRACT




Paulo 2013









































de morte celular 48



50





celular 54






Ca2+

Caacutelcio















mg Miligramas







Celular)

NH4+

Ion amocircnio








U Unidades

μg Micrograma

μl Microlitro

μm Microcircmetro

SUMAacuteRIO








2 OBJETIVOS 30





















epimastigotas 35







tripomastigotas 37


compostos 37


4 RESULTADOS 39






5 DISCUSSAtildeO 55


REFEREcircNCIAS 61

16

































17























18

































2001)

19


















20



































21



























evitar o cacircncer






22


processo





eletrocircnica














2009)














23






homeostase de Ca2+





















Rochaganreg



24











eletrofiacutelicos






2002)









25


















novos faacutermacos









desses alvos

26























Proteases






27


























28














(Ha et al 2008)



(1) (2)

29

















30

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral












31












331 Epimastigotas












-1)

32



















posteriores






33



106 ceacutelulas mL




ATP intracelular
















ceacutelulas mL-1










34

































35













ceacutelulas mL-1




-1 tratadas ou














avaliado

36




























37





























38








39

4 RESULTADOS
























40






+)


41



(a) (b)











(d) respectivamente





0 100 200 300

0

50

100

d

e in

ibiccedil

ao


0

50

100

d

e inib

iccedilao

Memantina (uM)

42








43





03 plusmn 0028 mM










44







45





os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





46


















47
















natildeo necrose

48


morte celular








49















plt 005

50



















Smirlis et al 2010)

51




52

































53











54










55

5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















56








et al 2010)



























57



































tambeacutem


58




















pacientes

59

6 CONCLUSOtildeES

























60





61

REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




62






2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







63










1989109(33)3424-6
























64



Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

65






2009136(5)499-510














199744(2)155-6



2002526(1-3)111-4



2)201-5









66





2003126(2)219-30




















2009168(1)102-8



Vectors 20103107







67



20046(8)733-41




200131(5-6)472-81






2)199-210





2003 Apr384(4)517-25





1830(33)11246-50















(CNPq)



AGRADECIMENTOS









momentos















experimentos


financeiro












RESUMO































ABSTRACT




Paulo 2013









































de morte celular 48



50





celular 54






Ca2+

Caacutelcio















mg Miligramas







Celular)

NH4+

Ion amocircnio








U Unidades

μg Micrograma

μl Microlitro

μm Microcircmetro

SUMAacuteRIO








2 OBJETIVOS 30





















epimastigotas 35







tripomastigotas 37


compostos 37


4 RESULTADOS 39






5 DISCUSSAtildeO 55


REFEREcircNCIAS 61

16

































17























18

































2001)

19


















20



































21



























evitar o cacircncer






22


processo





eletrocircnica














2009)














23






homeostase de Ca2+





















Rochaganreg



24











eletrofiacutelicos






2002)









25


















novos faacutermacos









desses alvos

26























Proteases






27


























28














(Ha et al 2008)



(1) (2)

29

















30

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral












31












331 Epimastigotas












-1)

32



















posteriores






33



106 ceacutelulas mL




ATP intracelular
















ceacutelulas mL-1










34

































35













ceacutelulas mL-1




-1 tratadas ou














avaliado

36




























37





























38








39

4 RESULTADOS
























40






+)


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(a) (b)











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0 100 200 300

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d

e in

ibiccedil

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iccedilao

Memantina (uM)

42








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03 plusmn 0028 mM










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os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





46


















47
















natildeo necrose

48


morte celular








49















plt 005

50



















Smirlis et al 2010)

51




52

































53











54










55

5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















56








et al 2010)



























57



































tambeacutem


58




















pacientes

59

6 CONCLUSOtildeES

























60





61

REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




62






2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







63










1989109(33)3424-6
























64



Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

65






2009136(5)499-510














199744(2)155-6



2002526(1-3)111-4



2)201-5









66





2003126(2)219-30




















2009168(1)102-8



Vectors 20103107







67



20046(8)733-41




200131(5-6)472-81






2)199-210





2003 Apr384(4)517-25





1830(33)11246-50









AGRADECIMENTOS









momentos















experimentos


financeiro












RESUMO































ABSTRACT




Paulo 2013









































de morte celular 48



50





celular 54






Ca2+

Caacutelcio















mg Miligramas







Celular)

NH4+

Ion amocircnio








U Unidades

μg Micrograma

μl Microlitro

μm Microcircmetro

SUMAacuteRIO








2 OBJETIVOS 30





















epimastigotas 35







tripomastigotas 37


compostos 37


4 RESULTADOS 39






5 DISCUSSAtildeO 55


REFEREcircNCIAS 61

16

































17























18

































2001)

19


















20



































21



























evitar o cacircncer






22


processo





eletrocircnica














2009)














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homeostase de Ca2+





















Rochaganreg



24











eletrofiacutelicos






2002)









25


















novos faacutermacos









desses alvos

26























Proteases






27


























28














(Ha et al 2008)



(1) (2)

29

















30

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral












31












331 Epimastigotas












-1)

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posteriores






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106 ceacutelulas mL




ATP intracelular
















ceacutelulas mL-1










34

































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ceacutelulas mL-1




-1 tratadas ou














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36




























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4 RESULTADOS
























40






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(a) (b)











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0 100 200 300

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42








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03 plusmn 0028 mM










44







45





os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





46


















47
















natildeo necrose

48


morte celular








49















plt 005

50



















Smirlis et al 2010)

51




52

































53











54










55

5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















56








et al 2010)



























57



































tambeacutem


58




















pacientes

59

6 CONCLUSOtildeES

























60





61

REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




62






2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







63










1989109(33)3424-6
























64



Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

65






2009136(5)499-510














199744(2)155-6



2002526(1-3)111-4



2)201-5









66





2003126(2)219-30




















2009168(1)102-8



Vectors 20103107







67



20046(8)733-41




200131(5-6)472-81






2)199-210





2003 Apr384(4)517-25





1830(33)11246-50














RESUMO































ABSTRACT




Paulo 2013









































de morte celular 48



50





celular 54






Ca2+

Caacutelcio















mg Miligramas







Celular)

NH4+

Ion amocircnio








U Unidades

μg Micrograma

μl Microlitro

μm Microcircmetro

SUMAacuteRIO








2 OBJETIVOS 30





















epimastigotas 35







tripomastigotas 37


compostos 37


4 RESULTADOS 39






5 DISCUSSAtildeO 55


REFEREcircNCIAS 61

16

































17























18

































2001)

19


















20



































21



























evitar o cacircncer






22


processo





eletrocircnica














2009)














23






homeostase de Ca2+





















Rochaganreg



24











eletrofiacutelicos






2002)









25


















novos faacutermacos









desses alvos

26























Proteases






27


























28














(Ha et al 2008)



(1) (2)

29

















30

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral












31












331 Epimastigotas












-1)

32



















posteriores






33



106 ceacutelulas mL




ATP intracelular
















ceacutelulas mL-1










34

































35













ceacutelulas mL-1




-1 tratadas ou














avaliado

36




























37





























38








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4 RESULTADOS
























40






+)


41



(a) (b)











(d) respectivamente





0 100 200 300

0

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d

e in

ibiccedil

ao


0

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d

e inib

iccedilao

Memantina (uM)

42








43





03 plusmn 0028 mM










44







45





os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





46


















47
















natildeo necrose

48


morte celular








49















plt 005

50



















Smirlis et al 2010)

51




52

































53











54










55

5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















56








et al 2010)



























57



































tambeacutem


58




















pacientes

59

6 CONCLUSOtildeES

























60





61

REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




62






2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







63










1989109(33)3424-6
























64



Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

65






2009136(5)499-510














199744(2)155-6



2002526(1-3)111-4



2)201-5









66





2003126(2)219-30




















2009168(1)102-8



Vectors 20103107







67



20046(8)733-41




200131(5-6)472-81






2)199-210





2003 Apr384(4)517-25





1830(33)11246-50







ABSTRACT




Paulo 2013









































de morte celular 48



50





celular 54






Ca2+

Caacutelcio















mg Miligramas







Celular)

NH4+

Ion amocircnio








U Unidades

μg Micrograma

μl Microlitro

μm Microcircmetro

SUMAacuteRIO








2 OBJETIVOS 30





















epimastigotas 35







tripomastigotas 37


compostos 37


4 RESULTADOS 39






5 DISCUSSAtildeO 55


REFEREcircNCIAS 61

16

































17























18

































2001)

19


















20



































21



























evitar o cacircncer






22


processo





eletrocircnica














2009)














23






homeostase de Ca2+





















Rochaganreg



24











eletrofiacutelicos






2002)









25


















novos faacutermacos









desses alvos

26























Proteases






27


























28














(Ha et al 2008)



(1) (2)

29

















30

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral












31












331 Epimastigotas












-1)

32



















posteriores






33



106 ceacutelulas mL




ATP intracelular
















ceacutelulas mL-1










34

































35













ceacutelulas mL-1




-1 tratadas ou














avaliado

36




























37





























38








39

4 RESULTADOS
























40






+)


41



(a) (b)











(d) respectivamente





0 100 200 300

0

50

100

d

e in

ibiccedil

ao


0

50

100

d

e inib

iccedilao

Memantina (uM)

42








43





03 plusmn 0028 mM










44







45





os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





46


















47
















natildeo necrose

48


morte celular








49















plt 005

50



















Smirlis et al 2010)

51




52

































53











54










55

5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















56








et al 2010)



























57



































tambeacutem


58




















pacientes

59

6 CONCLUSOtildeES

























60





61

REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




62






2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







63










1989109(33)3424-6
























64



Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

65






2009136(5)499-510














199744(2)155-6



2002526(1-3)111-4



2)201-5









66





2003126(2)219-30




















2009168(1)102-8



Vectors 20103107







67



20046(8)733-41




200131(5-6)472-81






2)199-210





2003 Apr384(4)517-25





1830(33)11246-50
























de morte celular 48



50





celular 54






Ca2+

Caacutelcio















mg Miligramas







Celular)

NH4+

Ion amocircnio








U Unidades

μg Micrograma

μl Microlitro

μm Microcircmetro

SUMAacuteRIO








2 OBJETIVOS 30





















epimastigotas 35







tripomastigotas 37


compostos 37


4 RESULTADOS 39






5 DISCUSSAtildeO 55


REFEREcircNCIAS 61

16

































17























18

































2001)

19


















20



































21



























evitar o cacircncer






22


processo





eletrocircnica














2009)














23






homeostase de Ca2+





















Rochaganreg



24











eletrofiacutelicos






2002)









25


















novos faacutermacos









desses alvos

26























Proteases






27


























28














(Ha et al 2008)



(1) (2)

29

















30

2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral












31












331 Epimastigotas












-1)

32



















posteriores






33



106 ceacutelulas mL




ATP intracelular
















ceacutelulas mL-1










34

































35













ceacutelulas mL-1




-1 tratadas ou














avaliado

36




























37





























38








39

4 RESULTADOS
























40






+)


41



(a) (b)











(d) respectivamente





0 100 200 300

0

50

100

d

e in

ibiccedil

ao


0

50

100

d

e inib

iccedilao

Memantina (uM)

42








43





03 plusmn 0028 mM










44







45





os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





46


















47
















natildeo necrose

48


morte celular








49















plt 005

50



















Smirlis et al 2010)

51




52

































53











54










55

5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















56








et al 2010)



























57



































tambeacutem


58




















pacientes

59

6 CONCLUSOtildeES

























60





61

REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




62






2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







63










1989109(33)3424-6
























64



Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

65






2009136(5)499-510














199744(2)155-6



2002526(1-3)111-4



2)201-5









66





2003126(2)219-30




















2009168(1)102-8



Vectors 20103107







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2)199-210





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Ca2+

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U Unidades

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2 OBJETIVOS 30





















epimastigotas 35







tripomastigotas 37


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4 RESULTADOS 39






5 DISCUSSAtildeO 55


REFEREcircNCIAS 61

16

































17























18

































2001)

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21



























evitar o cacircncer






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processo





eletrocircnica














2009)














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homeostase de Ca2+





















Rochaganreg



24











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2002)









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novos faacutermacos









desses alvos

26























Proteases






27


























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(Ha et al 2008)



(1) (2)

29

















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2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral












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331 Epimastigotas












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ATP intracelular
















ceacutelulas mL-1










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ceacutelulas mL-1




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0 100 200 300

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Smirlis et al 2010)

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REFEREcircNCIAS






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De acordo com




62






2004236(1)79-84



199426(2)157-65



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Nova 200932


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63










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Death Differ 201219(8)1358-69



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2009168(1)102-8



Vectors 20103107







67



20046(8)733-41




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2)199-210





2003 Apr384(4)517-25





1830(33)11246-50










U Unidades

μg Micrograma

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2 OBJETIVOS 30





















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4 RESULTADOS 39






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REFEREcircNCIAS 61

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(Ha et al 2008)



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331 Epimastigotas












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Smirlis et al 2010)

51




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pacientes

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60





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REFEREcircNCIAS






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200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




62






2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



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Nova 200932


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Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



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67



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1830(33)11246-50







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2 OBJETIVOS 30





















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(Ha et al 2008)



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29

















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44







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os experimentos




-1 foram cultivadas









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46


















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natildeo necrose

48


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49















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Smirlis et al 2010)

51




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56








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pacientes

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60





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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












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62






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199426(2)157-65



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Nova 200932


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1989109(33)3424-6
























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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

65






2009136(5)499-510














199744(2)155-6



2002526(1-3)111-4



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66





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20046(8)733-41




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2)199-210





2003 Apr384(4)517-25





1830(33)11246-50









tripomastigotas 37


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4 RESULTADOS 39






5 DISCUSSAtildeO 55


REFEREcircNCIAS 61

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evitar o cacircncer






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processo





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(Ha et al 2008)



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ceacutelulas mL-1










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ceacutelulas mL-1




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os experimentos




-1 foram cultivadas









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46


















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natildeo necrose

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morte celular








49















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Smirlis et al 2010)

51




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56








et al 2010)



























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tambeacutem


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pacientes

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60





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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




62






2004236(1)79-84



199426(2)157-65



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Nova 200932


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63










1989109(33)3424-6
























64



Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



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Pharmacol 200365(6)999-1006

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natildeo necrose

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morte celular








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Smirlis et al 2010)

51




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56








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tambeacutem


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pacientes

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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












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200914(6B)1373-84






De acordo com




62






2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







63










1989109(33)3424-6
























64



Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

65






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199744(2)155-6



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66





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processo





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Rochaganreg



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(Ha et al 2008)



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21 Objetivo geral












31












331 Epimastigotas












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ceacutelulas mL-1










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ceacutelulas mL-1




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iccedilao

Memantina (uM)

42








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03 plusmn 0028 mM










44







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os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





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natildeo necrose

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morte celular








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plt 005

50



















Smirlis et al 2010)

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5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















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et al 2010)



























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tambeacutem


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pacientes

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6 CONCLUSOtildeES

























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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




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2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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1989109(33)3424-6
























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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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2009136(5)499-510














199744(2)155-6



2002526(1-3)111-4



2)201-5









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2003126(2)219-30




















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Vectors 20103107







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evitar o cacircncer






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processo





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homeostase de Ca2+





















Rochaganreg



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2002)









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novos faacutermacos









desses alvos

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Proteases






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(Ha et al 2008)



(1) (2)

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2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral












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331 Epimastigotas












-1)

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posteriores






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106 ceacutelulas mL




ATP intracelular
















ceacutelulas mL-1










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ceacutelulas mL-1




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4 RESULTADOS
























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+)


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(a) (b)











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0 100 200 300

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ao


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Memantina (uM)

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os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





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natildeo necrose

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morte celular








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plt 005

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Smirlis et al 2010)

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5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















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et al 2010)



























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tambeacutem


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pacientes

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6 CONCLUSOtildeES

























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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




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2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



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Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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1989109(33)3424-6
























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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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2009136(5)499-510














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Vectors 20103107







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(Ha et al 2008)



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os experimentos




-1 foram cultivadas









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natildeo necrose

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morte celular








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Smirlis et al 2010)

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5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















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et al 2010)



























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pacientes

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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




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2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



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Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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Vectors 20103107







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os experimentos




-1 foram cultivadas









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natildeo necrose

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morte celular








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Smirlis et al 2010)

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principalmente Ca2+






















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pacientes

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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



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2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



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Nova 200932


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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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Vectors 20103107







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2)199-210





2003 Apr384(4)517-25





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(Ha et al 2008)



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106 ceacutelulas mL




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ceacutelulas mL-1










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ceacutelulas mL-1




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os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





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natildeo necrose

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morte celular








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plt 005

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Smirlis et al 2010)

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principalmente Ca2+






















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pacientes

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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



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De acordo com




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2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



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Death Differ 201219(8)1358-69



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Infect Immun 200977(7)3023-32



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Memantina (uM)

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os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





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natildeo necrose

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morte celular








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Smirlis et al 2010)

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principalmente Ca2+






















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pacientes

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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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200914(6B)1373-84






De acordo com




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2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



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Nova 200932


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Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














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Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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199744(2)155-6



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Vectors 20103107







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De acordo com




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199426(2)157-65



198780(1)111-4



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Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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Vectors 20103107







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Memantina (uM)

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os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





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natildeo necrose

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morte celular








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Smirlis et al 2010)

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5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















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tambeacutem


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pacientes

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6 CONCLUSOtildeES

























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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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200914(6B)1373-84






De acordo com




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2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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1989109(33)3424-6
























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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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2009136(5)499-510














199744(2)155-6



2002526(1-3)111-4



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2003126(2)219-30




















2009168(1)102-8



Vectors 20103107







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20046(8)733-41




200131(5-6)472-81






2)199-210





2003 Apr384(4)517-25





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novos faacutermacos









desses alvos

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Proteases






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(Ha et al 2008)



(1) (2)

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2 OBJETIVOS

21 Objetivo geral












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posteriores






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106 ceacutelulas mL




ATP intracelular
















ceacutelulas mL-1










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ceacutelulas mL-1




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4 RESULTADOS
























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(a) (b)











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Memantina (uM)

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os experimentos




-1 foram cultivadas









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principalmente Ca2+






















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et al 2010)



























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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




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2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



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Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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1989109(33)3424-6
























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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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2003126(2)219-30




















2009168(1)102-8



Vectors 20103107







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20046(8)733-41




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2)199-210





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Proteases






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(Ha et al 2008)



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2 OBJETIVOS

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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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De acordo com




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199426(2)157-65



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Nova 200932


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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



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Infect Immun 200977(7)3023-32



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Parasitol 200232(9)1133-43












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De acordo com




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Nova 200932


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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



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Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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De acordo com




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Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














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Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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Vectors 20103107







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Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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De acordo com




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199426(2)157-65



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Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














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Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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Vectors 20103107







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Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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De acordo com




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Nova 200932


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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














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Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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Vectors 20103107







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Lett 201020(6)2001-6



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De acordo com




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2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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2009136(5)499-510














199744(2)155-6



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2003126(2)219-30




















2009168(1)102-8



Vectors 20103107







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20046(8)733-41




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os experimentos




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5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















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et al 2010)



























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tambeacutem


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pacientes

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6 CONCLUSOtildeES

























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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



200949(11)1667-74



200914(6B)1373-84






De acordo com




62






2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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1989109(33)3424-6
























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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



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199744(2)155-6



2002526(1-3)111-4



2)201-5









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2003126(2)219-30




















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Vectors 20103107







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20046(8)733-41




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2)199-210





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ATP intracelular
















ceacutelulas mL-1










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ceacutelulas mL-1




-1 tratadas ou














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4 RESULTADOS
























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+)


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(a) (b)











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0 100 200 300

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d

e in

ibiccedil

ao


0

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d

e inib

iccedilao

Memantina (uM)

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03 plusmn 0028 mM










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os experimentos




-1 foram cultivadas









da Memantina





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natildeo necrose

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morte celular








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Smirlis et al 2010)

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principalmente Ca2+






















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et al 2010)



























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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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200914(6B)1373-84






De acordo com




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2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



198516(3)315-27












Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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1989109(33)3424-6
























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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



20052(2)155-65














199972(3)247-80



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Pharmacol 200365(6)999-1006

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os experimentos




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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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200914(6B)1373-84






De acordo com




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2004236(1)79-84



199426(2)157-65



198780(1)111-4



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Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



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Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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Vectors 20103107







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pacientes

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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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De acordo com




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Nova 200932


Interact 199073(1)1-27







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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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De acordo com




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199426(2)157-65



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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



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Infect Immun 200977(7)3023-32



Pharmacol 200365(6)999-1006

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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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De acordo com




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Chemother 200145(5)1360-6









Death Differ 201219(8)1358-69



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Smirlis et al 2010)

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Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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Death Differ 201219(8)1358-69



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Death Differ 201219(8)1358-69



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Death Differ 201219(8)1358-69



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Pharmacol 200365(6)999-1006

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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












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Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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5 DISCUSSAtildeO













principalmente Ca2+






















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pacientes

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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












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De acordo com




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principalmente Ca2+






















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et al 2010)



























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REFEREcircNCIAS






Parasitol 200232(9)1133-43












Lett 201020(6)2001-6



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Nova 200932


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REFEREcircNCIAS






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Nova 200932


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Parasitol 200232(9)1133-43












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Parasitol 200232(9)1133-43












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estudo da interferência de fármacos, que atuam via receptores … · gaba no metabolismo do t....

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