estudio microbiologico de las salinas en el estado falcÓn
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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE FARMACIA Y
BIOANÁLISIS
ESCUELA DE BIOANÁLISIS
COMPONENTE DE INVESTIGACIÓN
“ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DE LAS
SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN”
TUTOR:
FÉLIX D. ANDUEZA L.
AUTORES:
CASTILLO J. JOHAN X.
REY S. KLERISMAR.
MÉRIDA, MARZO DEL 2013
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE FARMACIA Y
BIOANÁLISIS
ESCUELA DE BIOANÁLISIS
COMPONENTE DE INVESTIGACIÓN
“ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DE LAS
SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN”
Tesis de Grado para obtener el Titulo de
Licenciado (a) en Bioanálisis
TUTOR:
FÉLIX D. ANDUEZA L.
AUTORES:
CASTILLO J. JOHAN X.
REY S. KLERISMAR.
MÉRIDA, MARZO DEL 2013
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
INDICE GENERAL
Pág.
DEDICATORIA………………………………………………………………viii
AGRADECIMIENTOS………………………………………………………..ix
RESUMEN……………………………………………………………………..x
INTRODUCCION…………………………………………………………. 1
CAPITULO I
ANTECEDENTES DEL PROBLEMA………………………………. 3
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………………... 5
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION…………………………….. 6
CAPITULO II
MARCO TEORICO………………..…………………………………… 7
Ambientes extremos: Generalidades…………………………...…. 7
Ambientes hipersalinos……………………………………………… 8
Origen de la salinidad……………………………………………….. 9
Efectos de la salinidad en propiedades fisicoquímicas del agua.. 9
Factores que originan la coloración de las salinas……………….. 11
Microorganismos halófilos…………………………………………... 14
Clasificación de los microorganismos según sus requerimientos
Salinos………………………………………………………………...
iii
15
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Clasificación de los halófilos en función de la salinidad………… 16
Adaptación de los microorganismos a los ambientes salinos….. 17
Taxonomía de los microorganismos halófilos……………………. 21
Clasificación de los microorganismos en función de su
temperatura optima de crecimiento………………………………
Alcalófilos……………………………………………………………...
…
25
26
CAPITULO III
ANTECEDENTES DE LA HIPOTESIS…………………………. 27
HIPOTESIS……………………………………………………....... 29
CAPITULO IV
MARCO METODOLOGICO……………………………………… 30
MATERIALES…………………………………………………..….. 30
Población muestral……………………………………………….. 30
Descripción del área de estudio………………………………… 30
Medios de cultivo…………………………………………………. 31
Reactivos………………………………………………………….. 31
METODOLOGIA………………………………………………….. 32
Tratamiento de la muestra……………………………………….
Aislamiento y Cuantificación de microorganismos halófilos
presentes
iv
32
33
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Determinación de la cantidad de microorganismos
heterótrofos aerobios
Identificación de los microorganismos aislados……………….
Elaboración de antibiogramas…………………………………..
CAPITULO V
RESULTADOS Y DISCUSIONES..………………..…………
CAPITULO VI
CONCLUSIONES……………………….……………………...
RECOMENDACIONES………………………………………...
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………............
35
36
36
38
51
52
53
v
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
INDICE DE TABLAS
Tabla Pág.
Tabla 01: Clasificación de los halófilos en función de la salinidad…. 16
Tabla 02: Clasificación de los microorganismos en función de su
temperatura optima de crecimiento……………………………………
…
25
Tabla 03: Preparación del medio de agar nutrientes a diferentes
concentraciones salinas
32
Tabla 04: Resultados Galería API de estudio microbiológico de
salinas
38
Tabla 05: Conteo de colonias…………………………………………... 39
Tabla 06: Estructura morfológica de los microorganismos………….. 40
Tabla 07: Características y estructura morfológica de los
microorganismos
41
Tabla 08: Pruebas bioquímicas para identificación de
enterobacterias
42
Tabla 09: Pruebas bioquímicas para identificación del género
Staphylococcus……………………………………………………………
…
43
Tabla 10: Antibióticos…..……………………………………………….. 44
Tabla 11: Interpretación de las zonas de inhibición para especies
de la familia Enterobacteriacea.
…
45
vi
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
INDICE DE FIGURAS
Figura Pág.
Figura 01: Diferentes condiciones ambientales extremas y grupos
de organismos adaptados a ellas (extremófilos)………………………
…
7
Figura 02: Toma de muestras de las salinas…………………………. 30
Figura 03: Agua peptonada en diferentes concentraciones………… 33
Figura 04: Método de siembra por difusión en placa………………… 34
Figura 05: Tratamiento y siembras de las muestras salinas………... 34
Figura 06: Contaje y repique de colonias microbianas……………… 35
Figura 07: Procedimiento para la realización de antibiogramas…… 37
Figura 08: Pruebas API 20 NE usadas para la identificación de los
géneros de bacterias
38
Figura 09: Coloración GRAM…………………………………………… 41
Figura10: Penicillium spp al microscopio……………………………… 42
Figura 11: Pruebas Bioquímicas O/F………………………………….. 43
Figura12: Medio manitol salado………………………………………... 44
Figura 13: Antibiograma………………………………………………… 46
vii
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
DEDICATORIA
A Dios Todopoderoso, por darme la oportunidad de vivir y por estar
conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazón e iluminar mi
mente y por haber puesto en mi camino a aquellas personas que han sido
mi soporte y compañía durante todo el periodo de estudio.
A mis Padres: Maritza y Kléver por haberme traído a este maravilloso
mundo con gran amor y estar conmigo en todo momento. Hoy con
sacrificio han dado una carrera para mi futuro, ustedes son pilares
fundamentales en mi vida, los quiero y Amo con todo mi corazón.
A mis hermanos Kleimar, Klever, Eliezer y Jesús ustedes han sido un
motor para lograr mis propósitos, aun son muchas las bendiciones por
llegar y estoy segura que también vivirán este momento de felicidad. Los
adoro.
A mi sobrino Kleiver mi tesoro, quien me ha brindado alegría en todo
momento, que este triunfo te sirva de motivación.
A toda mi familia por estar presente a lo largo de mi camino brindándome
cariño y la fuerza necesaria para continuar; así como dándome consejos
y orientación.
A mis compañeros (as) en especial a Xavier por compartir momentos
agradables y juntos lograr el objetivo final. A ustedes Mayra, María
Alejandra y Nosllely por la amistad puesta en mí y gran compañía a lo
largo de nuestro trayecto. Lo(as) quiero mucho!
Y a todos los que formaron parte de mi vida profesional estarán en mis
recuerdos y en mi corazón gracias por sus Bendiciones.
Klerismar
viii
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
AGRADECIMIENTOS
Cuando uno se propone alcanzar una meta tal como llevar a cabo la
presente Tesis es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente,
participan muchas personas con su enseñanza, información, experiencia,
apoyo, consejos y dando ánimo, acompañando en los momentos de
crisis y en los momentos de felicidad. A todas ellas quisiéramos brindarle
nuestro más reconocido agradecimiento:
Primeramente agradecemos a Dios por Bendecirnos para llegar hasta
aquí y hacer realidad este sueño anhelado.
A la Ilustre Universidad de Los Andes (ULA) y al Departamento de
Microbiología por darnos la oportunidad y ser parte de esta casa de
estudios.
A los Profesores(as) Félix Andueza y Judith Araque por su esfuerzo y
dedicación, quienes con sus conocimientos, experiencia, paciencia y su
motivación formaron parte en la elaboración de la tesis hoy más que
nunca infinitamente agradecidos.
También nos gustaría agradecer a los profesores que durante toda la
carrera profesional aportaron con un granito de arena nuestra formación
académica y profesional.
Compañeros (as) de estudio por haber compartido grandes momentos y
lograr juntos esta meta.
A mi familia por su compresión y apoyo.
Y a todos los que formaron parte de nuestra vida profesional muchas
gracias y que Dios los bendiga.
Klerismar y Xavier
ix
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS
ESCUELA DE BIOANÁLISIS
COMPONENTE DE INVESTIGACIÓN
“ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO
FALCÓN”
Las salinas son masas de agua situadas normalmente en el litoral y zonas
costeras el cual difieren de otros ambientes por poseer características
únicas y propias como su gran coloración rojiza debido a
microorganismos, crustáceos y flora planctónica presentes en ellas
convirtiéndolas en una gran atracción turística, sin embargo su principal
objetivo es la obtención de sal a través de la evaporación y por acciones
industriales (o en algunos casos de aguas salinas continentales). En el
siguiente trabajo de investigación se analizaron muestras solidas de
salinas de Las Cumaraguas ubicadas en el Estado Falcón con el objetivo
de estudiar si se encuentra presencia microbiológica en ellas. Pruebas
y determinaciones bioquímicas comprobaron la presencia de
Microorganismos Halófilos presentes en ella y cuyo aislamiento se realizó
utilizando medios de cultivos como el agar nutriente y Manitol salado los
cuales se prepararon en diversas concentraciones de sal con la finalidad
de crear distintas condiciones en el medio de cultivo así como también la
realización de Antibiogramas para determinar la susceptibilidad de los
microorganismos. Basándonos en el sistema API el 50 % de las muestras
tratadas se logró hallar Chryseomonas luteola y en menos % Pasteurella
spp, Burkholderia cepacia, Photobacterium dansela y Pseudomonas
fluorescens. En cuanto al cultivo micológico se logró hallar Penicillium spp
De acuerdo a los resultados se concluye que existen individuos
pertenecientes a los organismos procariotas y eucariotas, sin embargo de
acuerdo a la concentración de sal del medio, la abundancia de unos a
otros varía considerablemente. x
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
INTRODUCCIÓN
Entre los amplios propósitos de la Universidad de los Andes U.L.A, se
destaca la investigación científica, la cual además de contribuir a la
formación académica, también aporta en forma práctica y efectiva la
adquisición de conocimientos que enriquecen el saber universal para
encarar problemas que afecten directa o indirectamente a la humanidad.
Sin embargo, universidades de otras partes del mundo han realizados
numerosos trabajos de investigación sirviendo de soporte para el presente
trabajo de investigación que permitirá evaluar el estudio de
microorganismos halófilos en las salinas del Estado Falcón.
Investigaciones realizados en las últimas décadas han descubierto una
gran variedad de organismos microbianos que han logrado prosperar en
diferentes ambientes salinos la cual han tenido que adaptarse a
condiciones ambientales muy extremas a las que deben exponerse por
estar en dichos hábitat, condiciones como variaciones de pH, elevadas
presiones, alta salinidad, disponibilidad de agua, grandes radiaciones,
metales pesados, compuestos tóxicos y cambios bruscos de temperatura
son factores que perturban su crecimiento y modo de vida [1,2,3,4].
Como se describió anteriormente las diferentes comunidades de
microorganismos que se encuentran habitando estos ambientes
extremos, han tenido que recurrir a cambios drásticos en su metabolismo
para así poder sobrevivir y soportar condiciones intolerables a los que se
encuentran expuestos consiguiendo variar unas serie de aspectos como:
el tamaño celular, morfología, estrategias metabólicas, movilidad, división
celular, biología del desarrollo y otros aspectos estructurales de su
organismo [3]. Debido a todos estos cambios sufridos en su organismo se
le han denominado microorganismos extremófilos [4].
1
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Los denominados microorganismos Halófilos se han clasificado en dos
grupos: Halófilos moderados y Halófilos extremos; estos difieren de los
Halotolerantes porque son capaces de reproducirse y realizar sus
funciones metabólicas de una manera más eficaz en presencia de altas
concentraciones salinas logrando así despertar el interés de muchos
científicos del mundo biotecnológico [4, 5,6].
Los ambientes hipersalinos se encuentran actualmente en diversos
puntos geográficos del mundo; sin embargo sus condiciones físico
químicas así como sus niveles de sales, van a depender de una serie de
características particulares como su topografía geológica, condiciones
climática e incluso la mano del hombre, clasificándolas en salinas
naturales y artificiales; estos tipo de ambientes representan una utilidad
importante en la realización de estudios sobre el mundo microbiano
halófilo, despertando interés desde el punto de vista biotecnológico como
industrial dentro de los cuales la PCR es uno de los más destacados [4,
5,7].
En Venezuela no se han realizado proyectos relacionados a este
contenido; no obstante en otros países, numerosos estudios han arrojado
una gran complejidad de microorganismos halófilos de los que apenas se
han aislado y analizados un pequeño porcentaje [5].
Tomando en consideración lo antes señalado y teniendo en cuenta, que
es un campo de estudio cuya exploración apenas se ha iniciado, se ha
planificado llevar a cabo el presente proyecto el cual se basa en el
Estudio Microbiológico de Salinas ubicadas en el Estado Falcón.
2
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
CAPITULO I
ANTECEDENTES DEL PROBLEMA
Hoy en día el estudio de especies microbianas halófilas a nivel mundial
han arrojado numerosos resultados de gran importancia biotecnológica
destacando la producción de diversas enzimas y biopolímeros los cuales
aportan ventajas a nivel industrial y científico, debido a las imponentes
condiciones hipersalinas han recurrido a elaborar gran variedad de
sustancias y moléculas para su adaptabilidad en ambientes extremos
logrando competir exitosamente ante los efectos desnaturalizantes de las
sales [3].
La importancia de estos microorganismos y sus productos enzimáticos en
el mercado biotecnológico han despertado en los últimos años un gran
interés debido a sus propiedades catalíticas y potencial aplicación
industrial en la formulación y elaboración de detergentes, productos
dietéticos, procesamiento de cuero, papel, biodegradación de residuos
tóxicos y contaminantes industriales, mineras e industrias farmacéuticas,
así como el estudio de los lactobacilos, empleados para la fabricación de
quesos en la industria Láctea, podría aportar conocimiento para acelerar
los procesos industriales, jugando un papel importante en el campo
industrial [2,5]
Actualmente, en la Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco se
está realizando un proyecto experimental titulado “Caracterización de
actinomicetos aislados a partir de ambientes Hipersalinos”. En dicho
proyecto se realizan muestreos en ambientes salinos extremos de
distintas zonas geográficas de México, tales como: suelos salados,
lagunas saladas así como salinas costeras, dicha investigación tiene
como objetivo aportar conocimientos sobre la diversidad de los
actinomicetos halófilos en este país [6].
3
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Otra investigación realizada es en la Universidad Mayor de San Simón
titulado “Aislamiento, Caracterización parcial y perfil de producción
enzimática de bacterias halófilas y halotolerantes de la Laguna Chairkota,
Potosí-Bolivia; este trabajo es un aporte al estudio de la diversidad
microbiana de dicho país y al potencial biotecnológico de los
microorganismos extremófilos para su posterior explotación [27].
Otras se están estudiando a escala piloto, o están en desarrollo.
Seguramente muchas aun no las conocemos pero en los últimos años se
está haciendo un gran esfuerzo, potenciando los proyectos de
investigación destinados a buscar nuevos productos entre
microorganismos extremófilos: halófilos, termófilos, psicrofilos, etc, por lo
que cabe esperar un futuro muy prometedor en el campo de la
biotecnología de estos microorganismos [3].
4
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Por lo anterior se plantea la siguiente interrogante:
¿Cuáles son los tipos de Microorganismos Halófilos que prevalecen en las
principales Salinas ubicadas en el Estado Falcón.
5
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
OBJETIVOS
a. Objetivo General
Detectar e Identificar microorganismos halófilos en salinas
ubicadas en el Estado Falcón.
b. Objetivos Específicos
1. Determinar la cantidad de microorganismos heterótrofos presentes
en las salinas ubicadas en el Estado Falcón.
2. Aislar y cuantificar los microorganismos halófilos presentes en las
salinas ubicadas en el Estado Falcón.
3. Identificar los microorganismos aislados.
4. Determinar los perfiles antimicrobianos de las cepas aisladas e
identificadas.
6
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
CAPITULO II
MARCO TEÓRICO
AMBIENTES EXTREMOS: GENERALIDADES
Los ambientes extremos son lugares inimaginables entre los cuales se
encuentran los ambientes hipersalinos, estos se caracterizan por
presentar condiciones físico-químicas muy variables en relación a
cualquier otro ambiente presente en la naturaleza. La mayoría de los
organismos están adaptados a las condiciones físicas y químicas
estándar medias de la superficie de la Tierra, que les permite cumplir las
funciones necesarias para poder sobrevivir, estas condiciones influyen en
el intercambio de materia, energía y diversas funciones metabólicas del
microorganismo, de manera que el medio debe permitirle realizar estas
funciones, pero las condiciones en estos medios salinos son tan
inestables que provocan al organismo una situación de stress, dichas
condiciones como variaciones temperatura, pH, presión hidrostática,
potencial redox, actividad del agua, salinidad, irradiación solar,
concentración de nutrientes o metales tóxicos extremos e inusuales se
ven alteradas tanto por variaciones del clima atribuibles a causas
naturales como a acciones antrópicas, convirtiéndolos así en ambientes
no favorables, incluso letales para la mayoría de los seres vivos [8].
(Figura 01).
Figura 01.Diferentes condiciones ambientales extremas y grupos de
Organismos adaptados a ellas (extremófilos).
Fuente: Comerio et al., (2007).
7
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
AMBIENTES HIPERSALINOS
Los ambientes hipersalinos son considerados como ecosistemas con una
baja diversidad de especies dominados por microorganismos procariotas,
no obstante aun se conoce muy poco sobre la cantidad de bacterias
halofílicas que coexisten en estos ambientes, debido a que ellos se
caracterizan por presentar altas concentraciones de sales inorgánicas
más elevadas que las del agua del mar impidiendo cualquier modo de
vida [10]. Dentro de los hábitats hipersalinos se encuentran también los
desiertos de sal que cubren enormes áreas de mundo, salitrales y lagos
salados formados por el proceso de evaporación cuyos niveles dependen
de su localización geográfica, por lo general estos ambientes se
encuentran en zonas áridas presentado por ello un mayor grado de
evaporación a comparación de la precipitación originando que a mayor
evaporación aumente la concentración de las sales en relación a los
niveles que naturalmente presenta el agua del mar [11].
El agua del mar está compuesta en promedio de un 96.52% de agua y un
3.49% de sustancias disueltas mayormente sales la cual el NaCl es el
compuesto más importante de los cloruros y el principal producto de estos
ambientes salinos conocido generalmente como sal común o sal de mesa,
el ión de sodio es el catión más abundante en el agua del mar
aproximadamente 30.4 % mientras que el ión cloruro es el anión principal
aproximadamente en 55.2% encontrándose junto a otras sales como
partículas cargadas eléctricamente llamadas iones, distribuidos de forma
disociada por su interacción con el agua [12].
Además del proceso de evaporación los ambientes salinos también se
han ido formando por una serie de procesos de transporte y acumulación
de sales de índoles geográficas y geoquímicas que conducen, en
periodos más o menos prolongados a la salinización de determinadas
áreas.
8
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Muchos de estos ambientes representan un rol fundamental en el
desarrollo económico tanto a nivel industrial tal es el caso de las
industrias saleras como a nivel social como fuente turística [13].
ORIGEN DE LA SALINIDAD
El origen de la salinización de las aguas marinas viene dado por los
diversos acontecimientos que formaron parte del proceso de formación de
la tierra como géiseres que se formaban en la superficies, gases volátiles
y otros como el vapor de agua que al salir a la atmósfera y enfriarse se
condensaba y se convertía en agua de lluvia cayendo sobre los mares y
superficie terrestre, las erupciones volcánicas originaban la expulsión
elementos químicos como potasio magnesio, sulfatos, calcio, bicarbonato,
bromuro que por ser elementos mucho más pesados que el vapor de
agua quedaban depositados en la superficie de las rocas y suelos dando
lugar a la acumulación de sales en estos sitios formando así los suelos
salinos, además la salinización se mantiene de forma interrumpida, sin
embargo hay ciclos de salinización que han ido formando ambientes
salinos a lo largo del tiempo [11].
Además de la cantidad elevada de sales, los medios hipersalinos
presentan al mismo tiempo un alto contenido de iones (factor que le
atribuye la característica de ser un ambiente inhóspito para la mayoría de
los microorganismos), se suelen caracterizar por registrar generalmente
temperaturas elevadas, una luz intensa, un pH alcalino y la presencia de
otros aceptores de electrones alternativos al oxígeno [14].
9
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
EFECTOS DE LA SALINIDAD EN PROPIEDADES FISICO
QUIMICAS DEL AGUA
La excesiva cantidad de sales presentes perturban varios procesos físicos
elementales, así como propiedades importantes del agua y de sustancias
disueltas en agua, propiedades como densidad, viscosidad, tensión
superficial, presión osmótica, punto de fusión, punto de ebullición y
solubilidad de los gases. Un parámetro afectado es la densidad donde se
ha demostrado que es más densa incluso que la del agua del mar debido
a su alta concentración de sales estas partículas se encuentran disueltas
y mas unidas debido a las condiciones de los medios salinos, provocan
además de una disminución de la temperatura dado a que sus partículas
no pueden acomodarse libremente en el agua incrementando así su
densidad [15].
La viscosidad depende principalmente de dos variables como lo son la
salinidad y la temperatura, relacionadas directamente ya que cuando la
salinidad aumenta la viscosidad también lo hace. Estas variaciones
impactan la fisiología, reproducción, morfología, distribución, diversidad y
el comportamiento de los organismos superiores y microorganismos que
habitan estos ambientes inclusive afectando el desplazamiento de
microorganismos motiles y llegando a destruir cualquier tipo de vida ya
que las condiciones que les ofrece el medio salino no son las adecuadas
y deben invertir mayor cantidad de energía para poder vencer la
resistencia que este les ocasiona pero que dicha energía se torna critica
cuando los nutrientes escasean o los microorganismos enfrentan
temperaturas bajas que reducen su actividad metabólica [15].
10
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Cuando la salinidad logra alcanzar niveles mayores de 30% sumadas a
las variaciones de temperaturas que se registran en dichos ambientes,
explican el carácter anóxico que estos poseen, debido a que las sales
disueltas excluyen a las moléculas de oxígeno por que reducen los
espacios intermoleculares disponibles reduciendo así la solubilidad de
este gas en el agua [15].
FACTORES QUE ORIGINAN LAS COLORACIONES DE LAS SALINAS
La coloración que adoptan las salinas se debe a los microorganismos que
ocupan estos lugares hostiles e inhóspitas llamadas salinas (altas
temperaturas, alta salinidad y carencia de oxígeno). Pero estudios
realizados han confirmado que la Artemia salina es un pequeño crustáceo
braquiópodo, pertenece a la subclase de los anostráceos su nombre
científico es Brine shrimps y conforma el plancton de las aguas
continentales salobres, su tamaño es de 8 a 13 mm. de longitud, habitan
en lagunas salobres o zonas salinas donde ya existen unos rangos de
salinidad superior a los del agua de mar (3,6 gr/l), estos crustáceos son
unos de los pocos organismos eucariotas que se pueden observar en
estos hábitats con salinidad intermedia o mayor a 10% de sal; asimismo le
proporcionan una coloración a las salinas debido a que su alimentación
está basada en microalgas ricas en pigmentos carotenoides, pero además
dicha coloración es producida cuando el medio donde se encuentran va
aumentando su salinidad debido a la rápida evaporación y de su
localización geográfica que se encuentre dicho hábitat, ellos al exponerse
a una concentración de NaCl muy alta deben aumentar notoriamente la
hemoglobina en sangre para compensar la falta de oxígeno, estos
crustáceos pueden llegar a soportar aguas hipersalinas hasta de 300 gr/l
[16].
11
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Otro responsable del color rojo que se presentan en los ambientes salinos
es la Dunaliella salina es un alga microscópica o unicelular que crecen
óptimamente en sistemas con concentraciones de sales de 20-25% y
aunque pertenece a las algas verdes su color es rojo debido a que posee
grandes cantidades de beta y alfa carotenos [16].
La Dunaliella salina es una alga planctónica clorofita microscópica
perteneciente a las clorofíceas o algas verdes, caracterizada por acumular
grandes cantidades de carotenoides llegando hasta 14% de su masa
seca, debido a esto su coloración roja se hace mucho más notoria debido
a que ellas no presentan pared celular, haciéndola muy digestiva para los
consumidores, así como por poseer gran cantidad de pigmentos rojos de
α y ß-caroteno y glicerol aparte de la clorofila, pero bajo las condiciones
hipersalinas el glicerol funciona en el citoplasma como un soluto
compatible para mantener la integridad de la membrana y proteínas. Al
parecer las respuestas celulares al estrés salino son regulatorias y
parecen depender de una diversidad de mecanismos ligados a la
modificación en el balance del ácido abcisico. Diversos estudios han
demostrado que el aumento de la concentración de NaCl, intensidad
luminosa, temperatura y/o limitación de nutrientes acrecienta la
producción de carotenoides y clorofila en Dunaliella salina la cual la hace
responsable de la gran parte de la coloración de los ambientes salinos,
además, sirve de alimento a la Artemia, dado que esta última es filtradora
de plancton y en rangos altos de salinidad prácticamente sólo vive este
tipo de microalgas [16,17,18].
La Dunaliella salina sintetiza altas concentraciones de glicerol intracelular
7 M (56%) como soluto compatible para mantener el balance osmótico y
ser prácticamente la única alga presente en lagos o ambientes salinos [6].
12
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Las bacteriorrodopsina es una proteína de color purpura presente en la
membrana de algunos microorganismos halófilos característica de las
Arqueas y Halobacterias, actúa como bomba de protones, es decir, tiene
función foto sensitiva ya que captura luz solar para proveer de energía
química al microorganismo así como también la utiliza para mover los
protones a través de la membrana celular. Esta proteína posee enlaces π
conjugados en la molécula retinal. Esta conformación de la molécula
retiniana cambia al absorber un fotón, produciendo un cambio
conformacional en la proteína circundante y el bombeo del protón,
Cuando los nutrientes son escasos, la membrana celular que es rica en
bacteriorrodopsina entra en acción. Sirven como enzimas fotoconversoras
que mantienen en ciclo de vida del organismo en funcionamiento.
Específicamente, en respuesta a la luz la esta proteína bombea protones
a través de la membrana, transportando iones cargados dentro y fuera de
la célula. De esta forma, la bacteriorrodopsina es una central eléctrica de
proteína que se conecta en tiempos de escasez, cambiando el color de
morado a amarillo cuando está absorbiendo luz [16].
No obstante algunas bacterias como las Halobacterium salinarum y
Halobacterium. halobium pertenecientes al grupo de las Arqueobacterias,
consideradas como los organismos más antiguos del planeta, poseen
características bioquímicas y genéticas bastante diferentes a las bacterias
comunes ya que no poseen paredes celulares con peptidoglicano,
presentar secuencias únicas en la unidad pequeña del ARNr, y poseen
lípidos de membranas diferentes tanto de las bacterias como de los
eucariotas entre otros aspectos permitiéndoles así su adaptación a estos
medios salinos [12].
Los microorganismos por su carácter unicelular los hace muy vulnerables
a las diferentes condiciones a los que se encuentran expuestos como los
diversos cambios de temperaturas, pH, y luz solar, que presenta el
medio ambiente [13]. 13
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
MICROORGANISMOS HALÓFILOS
El término “halófilo” viene del griego, donde “halo” es “sal” y “filo” es
“amante de”, es decir, significa “amante de sal”. Sin embargo no todos los
microorganismos halófilos tienen los mismos requerimientos de sal, por lo
que tienden a agruparse en función al rango de sales que necesitan para
tener un crecimiento óptimo [5].
Muchos organismos pueden llegar a vivir en un rango de salinidad, que va
desde el agua destilada hasta soluciones saturadas de sal. La osmofilía
se refiere a los aspectos osmóticos de la vida en altas concentraciones de
sal, especialmente la presión de la tensión hídrica, la deshidratación
celular y la desecación. Los halófitos hacen referencia a los
requerimientos iónicos para la vida en altas concentraciones de sal. Los
halófitos incluyen un rango de microbios, muchas son archeas,
cianobacterias y el alga verde Dunaliella salina que puede sobrevivir en
soluciones saturadas de cloruro sodio [5].
La estrategia de estos microorganismos para soportar la gran
concentración de sal es evitar los efectos de un proceso denominado
ósmosis. En este proceso, el agua pasa a través de la membrana de la
célula, de la solución más diluida a la más concentrada. Por tanto, si fuera
de un organismo hay una alta salinidad, el agua saldrá de él y el
organismo morirá deshidratado. Los halófilos logran retener el agua en su
interior acumulando numerosos compuestos en el citoplasma, de modo
que se compensa la presión osmótica, y el agua no sale de ellos evitando
su deshidratación [5].
Estos microorganismos se diferencian de los halotolerantes porque son
capaces de reproducirse y realizar sus funciones metabólicas de una
manera más eficaz en presencia de altas concentraciones de sales que
en ausencia [5].
14
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SEGÚN SUS
REQUERIMIENTOS SALINOS
Cada cepa microbiana tiene un determinado rango de tolerancia a
factores ambientales como son: la temperatura, el pH y la salinidad, los
cuales pueden afectar al crecimiento y actividad de las poblaciones
microbianas. En consecuencia, cuanto mayor sea la diversidad de
microorganismos existentes, potencialmente mayor será el rango de
tolerancia. Los microorganismos que requieren elevadas concentraciones
de sal se denominan halófilos. Kushner y Kamekura, en 1998,
propusieron las siguientes categorías de microorganismos teniendo en
cuenta sus requerimientos de NaCl [30].
No Halófilos: su crecimiento óptimo se produce a una concentración de
NaCl inferior a 0,2 M (1% p/v). Existen microorganismos no halófilos
capaces de crecer en medios hasta con 2,5 M de NaCl (15% p/v).
Denominándose halotolerantes [14].
Halófilos débiles: También llamadas bacterias marinas. Su crecimiento
se produce a una concentración de NaCl de 0,2-0,5 M (1-3%p/v) [14].
Halófilos moderados: crecen de forma óptima a concentraciones de
NaCl comprendidas entre 0,5 y 2,5 M (3-15% p/v) [14]. Las bacterias
halófilas moderadas representan el grupo más común de las bacterias
halófilas, en los ambientes hipersalinos se encuentran en mayor
frecuencia representantes de bacterias Gram negativas aerobios o
anaerobios facultativos [14].
Del grupo de bacterias halófilas moderadas aisladas e identificadas en
diversos proyectos de investigación, se destaca el género Pseudomonas.
15
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Los miembros pertenecientes a esta familia son bacilos Gram negativos
rectos o ligeramente curvos, móviles por medio de flagelos polares,
estrictamente aerobios y están ampliamente distribuidos en la naturaleza
particularmente en ambientes acuáticos [14].
Halófilos extremos: Tienen un crecimiento optimo entre 2,5 y 5,2 M (15-
32% p/v) de NaCl [14].
CLASIFICACION DE HALÓFILOS EN FUNCIÓN DE LA SALINIDAD
Sin embargo estudios realizados en los últimos años han dado a conocer
que los microorganismos extremófilos han elevado su capacidad de
soportar las altas concentraciones de sal por diversos mecanismos
utilizados en su metabolismo logrando así aumentar el rango de salinidad
en el cual crecen [30] (Tabla 01).
Halófilos Concentraciones de NaCl
Halófilos Débiles 0.5 – 10 %
Halófilos Moderados Arriba de 10 – 20 %
Halófilos Extremos Arriba de 20 %
Halotolerantes Toleran la salinidad
Tabla 01. Clasificación de los halófilos en función de la salinidad.
Fuente: Ramírez et al., (2006).
16
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
ADAPTACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS A LOS AMBIENTES
SALINOS
a) Osmoadaptación
Las bacterias adaptadas a vivir en ambientes hipersalinos han de
enfrentarse a un medio con una fuerza iónica elevada [15]. Debido a que
las membranas biológicas celulares son permeables al agua, las células
que no están adaptadas no pueden mantener una concentración del
citoplasma mayor que la del medio externo, ya que se produciría una
deshidratación y la consiguiente muerte de la célula [16]. La adaptación
del medio ambiente hipersalinos consiste en equilibrar la presión osmótica
interna con la externa, a fin de mantener la integridad celular y las
funciones vitales [16].
Los microorganismos que viven en ambientes hipersalinos han adoptado
dos estrategias de Osmoadaptación: mediante la acumulación de grandes
cantidades de sal, “salt in” en concreto KCl, en el interior de la célula, y
mediante el empleo de solutos compatibles orgánicos. Algunos sistema
intracelulares deben adaptarse a la presencia de altas concentraciones de
sal para poder sobrevivir y lo realizan por medio de la estrategia “salt in”
manteniendo en las células bajas concentraciones de sal en su
citoplasma para una adaptación osmótica de las enzimas y componentes
estructurales de las células consiguiendo asegurarse de un propio y
adecuado funcionamiento de la maquinaria enzimática intracelular,
aunque también se han determinado adaptaciones moleculares dentro de
las cuales existe un exceso de aminoácidos con carácter ácido y pocos
aminoácidos hidrofobitos en sus proteínas [4].
Sin embargo la adaptación a estos hábitats son muy exigentes por su
elevada fuerza iónica exterior significando para los microorganismos
realizar un gasto energético mayor.
17
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
La estrategia del KCl es menos costosa que la acumulación de solutos
compatibles pero requiere grandes adaptaciones de la maquinaria celular,
de modo que se lleva a cabo por un proceso más complejo y largo desde
el punto de vista evolutivo [16].
Esta opción solo la realizan los grupos de procariotas especializados,
como las arqueas halófilos y las bacterias anaerobias halófilas, que
obtienen cantidades limitadas de energía debido a su metabolismo
fermentador. El resto de los microorganismos utilizan solutos compatibles
orgánicos, que son más costosos energéticamente [17].
Los microorganismos que acumulan KCL son las arqueas halófilas del
orden Halobacteriales [14] y las bacterias halófilas del orden
Haloanaerobiales [17]. También acumulan esta sal Acetohalobium [17], y
algunas bacterias sulfato reductoras [19].
La acumulación de solutos compatibles depende de la fuerza osmótica,
de la fase de crecimiento del cultivo, de la fuente de carbono y de la
presencia de osmolitos en el medio de cultivo [19]. Las condiciones de
crecimiento son muy importantes; por ejemplo, Chromohalobacter
israelensis y Chromohalobacter salexigens sintetiza y acumula
principalmente trehalosa como mecanismo de respuesta al estrés
osmótico y de osmorregulación durante la etapa de crecimiento y térmico
cuando crece a concentración de NaCl inferior a 0,6 M, además muestra
características de estabilizador de proteínas y membranas bajo
condiciones de estrés actuando como protector reemplaza a las
moléculas de agua a través de las uniones polares de sus residuos
previniendo la desnaturalización de las proteínas y la fusión de membrana
formando cristales en estado seco proceso requerido para la
estabilización de las moléculas en estado deshidratado, manteniendo así
estables a las proteínas en altas temperaturas y pH ácido, pero a mayores
concentraciones el soluto principal es la ectoína al igual que,
hidroxiectoína la cual ayuda a sobrevivir a un estrés osmótico extremo
[4,18]. 18
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Dichos microorganismos al estar sometido constantemente a un shock
hipo osmótico desencadenan la apertura de canales mecanosensibles en
la membrana citoplasmática permitiendo la salida de solutos al exterior
favoreciendo así su permanencia en dicho medio [20].
La ectoína es un compuesto natural que se encuentra en varias especies
de bacterias se trata de un soluto compatible, que sirve como una
sustancia protectora, actuando como un osmolito que confiere resistencia
a los microorganismos estabilizando las proteínas, el ácido nucleico y las
membranas ante el estrés salino y la temperatura. En las bacterias
halófilas se han descrito dos tipos de transportadores de ectoína: un
transportador osmoregulador de la familia TRAP con alta afinidad por
ectoína, codificado por los genes teaABC y el transportador EctM (tipo
BCCT) implicados en la captación de ectoína [20].
Por otra parte algunos microorganismos halófilos y halotolerantes su
balance osmótico lo establecen mediante pequeñas moléculas que son
sintetizadas por las células o tomadas del medio donde se encuentra, la
estrategia “compatible solute” se define en solutos que a altas
concentraciones permiten un alto grado de adaptabilidad de las células y
protección de las enzimas contra los efectos de las altas concentraciones
de sal y el estrés, alguno solutos compatibles encontrados son los polioles
como el glicerol y arabimitol, azúcares y sus derivados como (sacarosa,
thealosaglucosil, glicerol) aminoácidos y derivados de aminas, que
poseen un bajo peso molecular y que son totalmente solubles en agua,
[4].
19
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
La lógica que apoya estas ideas es que muchas de las maquinarias
metabólicas y biosintéticas de los organismos multicelulares están en el
compartimiento intracelular y que durante un estrés hiperosmótico los
osmolitos orgánicos se acumulan en formas elevadas dentro de la células
pero sin alterar la actividad enzimática a comparación de las sales
inorgánicas, por ello, se les denomina solutos compatibles [4].
b) Modificación en la morfología celular y estructura
Las bacterias que normalmente crecen en condiciones diferentes a
medios salinos pueden mostrar grandes modificaciones cuando se
someten a una elevada concentración de sal. 18
El engrosamiento, el alargamiento y la reducción del volumen de las
células son las modificaciones más frecuentes. Se trata de una respuesta
común en algunas bacterias como Pseudomonas fluorescens. Sin
embargo estos cambios no ocurre en Escherichia coli gram negativa
debido a que su pared es más delgada, resultándole difícil sobrevivir en
un ambiente salino [21].
Las bacterias Gram positivas como Bacillus y Staphylococcus también
modifican su estructura, al 10-20% (p/v) de NaCl [21].
Por otro lado también se han encontrado modificaciones estructurales en
las bacterias halófilas. Un aspecto importante es el cambio en la pared
celular y en las membranas. Las adaptaciones estructurales de la
membrana principalmente se refieren a alteraciones en la composición y
síntesis de proteínas, lípidos y ácidos grasos sin embargo la Bacillus
subtilis es una bacteria Gram positiva el cual presenta una membrana y
una gruesa pared que permite que la bacteria pueda soportar con
entereza el estrés osmótico pero otra propiedad importante de los Bacillus
es la esporulación. 20
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Frente a condiciones de falta de alimento (estrés nutricional) estas
bacterias, en lugar de morir, desarrollan un proceso de diferenciación que
les permite formar una estructura inerte, la espora, que los cobija. Con
ella, espera condiciones de vida mejores para volver a multiplicarse. Este
rasgo resulta interesante pues, al igual que la mayoría de las bacterias, B.
subtilis posee un solo cromosoma, y esa información genética la puede
modular para crecer libremente en forma bacilar o para formar esporas.
Es decir, esta bacteria puede llevar a cabo un proceso de diferenciación,
aunque en pequeña escala, al igual que los organismos superiores [22].
TAXONOMÍA DE LOS MICROORGANISMOS HALÓFILOS
a) Taxonomía de las arqueas halófilas:
La mayoría de las arqueas halófilas se consideran halófilas extremas, ya
que su optimo de crecimiento se encuentra a 3,5-4,5 M de NaCl. Entre
sus características distintivas destacan la carencia de todos los casos del
ácido murámico (peptidoglicano) como constituyente principal de la pared
celular, presentan una morfología típica que no se ha encontrado en
ninguno de los microorganismos que componen el dominio bacteria como
formas poligonales o cocos extremadamente irregulares que presentan
algunos hípertermófilos. Se denominaban comúnmente Halobacterias
(actualmente Haloarqueas), y quedan agrupadas en el orden
Halobacteriales con una sola familia, Halobacteriaceae [21].
Este grupo incluye cocos, bacilos y multitud de formas pleomórficas como
las triangulares y cuadradas causando una gran controversia sobre la
relación que existe entre los dominios, sin embargo son llamados halófilos
obligados ya que muestran una estricta dependencia por altas
concentraciones de sal requiriendo al menos un 1,5 M de NaCl para su
crecimiento y estabilidad estructural por ello considerados como halófilos
por excelencia. 21
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Hasta hace varios años se pensaba que únicamente las arqueas eran
capaces de habitar dichos ambientes no obstante empleando técnicas de
hibridación in situ por fluorescencia se puso en manifiesto que constituyen
una parte significativa de la microbiota de estos ambientes salinos como
es el caso de la Salinibacter ruber [21].
Esta familia de Halobacteriaceae para sobrevivir a estas limitaciones que
le ofrecen estos ambientes han recurrido a estrategias como por ejemplo
forman vesículas de gas que le permiten flotar hasta la superficie donde la
concentración de oxigeno es mayor, otras utilizan aceptores de electrones
alternativos en la respiración como el nitrato.
Además las colonias de la mayoría de las cepas tienen colores rojizos
debido a la presencia de carotenoides, asimismo toleran bastante bien
temperatura elevadas incluso su temperatura optima de crecimiento para
la mayoría de las arqueas halófilas es de 35-50°C [21].
b) Taxonomía de las bacterias halófilas
Bacterias halófilas extremas
La mayoría de las bacterias halófilas se clasifican como moderadas o
débiles. Es difícil encontrar verdaderas bacterias halófilas extremas, entre
ellas podemos nombrar Acetohalobium arabaticum [22], y también las
especies del genero Halorhodospira [23]. Otro microorganismo halófilo
extremo es el actinomiceto Actinopolyspora halophila [23].
22
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Bacterias halófilas moderadas
El orden Halanaerobiales incluye bacilos Gram negativos anaerobios.
Este orden reúne la familia Halanaerobiaceae, con los géneros
Halanaerobium, Halothermothrix y Halocella, y la familia
Halobacteriodaceae, que incluye los géneros Halobacteroides,
Acetohalobium, Haloanaerobacter, Sporohalobacter y Orenia [24].
Excepto Acetohalobium, formado por bacterias halófilas extremas, todos
agrupan a bacterias halófilas moderadas.
Uno de los grupos de microorganismos halófilos moderados más
ampliamente distribuido en las aguas y suelos, independientemente de su
situación geográfica, lo constituyen los miembros del genero Halomonas
[25].
Bacterias halófilas débiles
Se encuentran ampliamente distribuidos en ambientes marinos,
denominándose generalmente bacterias marinas. Desde el punto de vista
taxonómico, se distinguen géneros de bacterias anaerobias facultativas
fermentadoras como Vibrio, Photobacterium, Moritelia y Colwelia,
no fermentadoras o débilmente fermentadoras como Shewanella y
Ferrimonas, y aerobios estrictos, distribuidos en géneros que incluyen
microorganismos halófilos y halotolerantes como Alcanivorax,
Alteromonas, Cycloclasticus, Fundibacter, Gelidibacter, etc.
Algas Halófilas
Hay algas halófilas en el Phylum Chlorophyta, en el orden Volvocables. El
género principal con especies halófilas es Dunaliella y Chlamydomonas.
Ambos son flagelados; la principal distinción morfológica entre ellos es la
carencia de una pared celular en Dunaliella [4].
23
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Una diferencia fundamental entre las bacterias y las algas halófilas reside
en la capacidad de las algas para extender sus límites de tolerancia a la
sal, hacia una alta o baja concentración, con la implicación de que esos
límites están determinados en parte por la historia evolutiva del organismo
[4].
Levaduras Halófilas
Estudios fisiológicos con las levaduras marinas han puesto en evidencia
un amplio margen de adaptabilidad en algunas de ellas. Por ejemplo, al
estudiar el efecto de la presión osmótica se encontraron diferentes
respuestas para organismos de los géneros Aurobasidium, Cándida,
Cryptococcus, Debaryomyces y Rhodotorula [4].
Dos estrategias generales de los organismos se han registrado para
sobrevivir en ambientes de alta salinidad: uno es la exclusión de sodio del
citoplasma acumulando grandes cantidades de solutos compatibles para
evitar la pérdida de agua (sodio-excluyentes); otro, el que los organismos
usan y acumulan altas concentraciones de sodio sin que éste represente
un problema de toxicidad para la célula (sodio-incluyentes) [4].
La levadura D. hansenii puede ser aislada de ambientes con baja
actividad de agua o con salinidades relativamente altas, como el medio
marino.
Desde hace más de 30 años se demostró que esta levadura tiene la
capacidad de resistir altas concentraciones de NaCl por lo que
originalmente se le consideró el modelo eucariótico ideal para estudios de
halotolerancia. Posteriormente, se demostró que esta levadura puede
acumular altas concentraciones de Na⁺ intracelular provocando una mejor
funcionalidad bajo diferentes condiciones de estrés, dado que la
acumulación de sodio intracelular, no ejerce algún efecto tóxico en su
metabolismo. 24
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Pese a que la D. Hansenii es una levadura sodio incluyente, los primeros
estudios relacionados a su carácter halofílico estuvieron dirigidos a la
producción de glicerol como soluto compatible [4].
CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN FUNCIÓN DE SU
TEMPERATURA ÓPTIMA DE CRECIMIENTO.
Temperatura Descripción
Hipertermófilos Su temperatura óptima de crecimiento está por encima de
los 80ºC y el máximo crecimiento de cultivos puros se ha
llegado a dar entre 110ºC y 113ºC.
Termófilos Crecen por encima de los 45ºC.
Mesófilos Frecuentemente su crecimiento es en rango alrededor de
25 a 45ºC.
Psicrófilos Capaces de crecer por debajo de 5ºC y con temperaturas
máximas de 20ºC , frecuentemente crecen en 10ºC.
Psicrófilos
facultativos
Temperaturas optimas de 15ºC llegando alcanzar los 20
ºC y también capaces de crecer hasta por debajo de 0 ºC.
Tabla 02. Clasificación de los microorganismos en función de su
temperatura optima de crecimiento.
Fuente: Ramírez et al., (2006).
25
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
ALCALÓFILOS
Los microorganismos alcalófilos son aquellos que viven en ambientes con
pH por encima de 9 y que principalmente se encuentran localizados en
hábitats muy básicos como lagos sódicos y suelos muy carbonatados,
estos para poder sobrevivir a esta condiciones han tenido que aislar el
interior de la célula del medio alcalino exterior ya que algunas moléculas,
especialmente hechas de ARN se rompen a pH superior de 8. Ellas se
protegen por medio de extremoenzimas que se localizan cerca de la
pared celular o por medio de secreciones externas además del
peptidoglicano tienen en su pared celular polímeros cargados
negativamente, los cuales pueden reducir la densidad de la carga en la
superficie de la célula y ayudar a estabilizar la membrana de la célula. La
mayor parte de estos microorganismos pertenecen al género Bacillus y
son también llamados halófilos [6].
26
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
CAPITULO III
ANTECEDENTES DE LA HIPÓTESIS
La diversidad microbiana es un término general que comprende la
diversidad genética, que es la cantidad y distribución de la información
genética de las especies microbianas; la diversidad de las bacterias y los
hongos que forman parte de las comunidades microbianas; y la diversidad
ecológica, que es la variación en la estructura de las comunidades, la
complejidad de las interacciones, el número de niveles tróficos y el
número de agrupaciones. Así, la diversidad microbiana incluye el número
de las distintas especies bacterianas y fúngicas (riqueza) y su abundancia
relativa en la microflora del suelo [5]. En los ambientes hipersalinos
coexisten microorganismos halófilos pertenecientes a grupos filogenéticos
muy diferentes. Sin embargo su distribución no es precisamente
homogénea sino que existe un claro predominio de unos grupos frente a
otros dependiendo del grado de salinidad del medio [5].
Entre los microorganismos halófilos estudiados hasta la fecha se
encuentran géneros pertenecientes a los tres dominios Eukarya, Bacterias
y Archeas que van a depender de la concentración de sal del medio
donde se encuentren [3].
Dentro de los dominios de bacterias estudiados el primer miembro
reconocido es la Salinibacter ruber descrito por primera vez en las salinas
de Mallorca y Alicante y desde entonces han sido detectadas en múltiples
localizaciones a nivel mundial por su capacidad de crecimiento por debajo
del 16% de NaCl [21].
Otra especie de las bacterias halófilas es la Chromohalobacter salexigens
por su capacidad de síntesis de solutos compatibles en respuesta a los
diferentes tipos de estrés abióticos [20].
27
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
También la Haloferax mediterranei, arquea halófila tiene la capacidad de
crecer en medios carentes de O2 utilizando glucosa como única fuente de
carbono, cabe destacar dos propiedades de este microorganismo muy
interesante desde el punto biotecnológico.
La primera consiste en la acumulación de cantidades considerables de
polihidroxialcanoato un copolímero que se emplea para la producción de
plásticos biodegradables aunque todavía no se ha comercializado, y la
segunda se basa en la producción de exopolisacáridos que pueden ser
empleados como agentes gelatinizantes, emulsionantes, espesantes
pero su producción a gran escala todavía no se ha iniciado [20].
Así mismo otro dominio encontrado perteneciente a la Eukarya es la
Levadura Halófila Debarynomyces hansenii, siendo interesantes por
competir exitosamente en los medios salinos y resistir a los efectos
desnaturalizantes [4].
28
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
HIPÓTESIS
Para tratar dar respuesta a esta interrogante, se planteó la siguiente
hipótesis:
Es posible encontrar una diversidad de microorganismos halófilos como
bacterias y hongos; en salinas ubicadas en el Estado Falcón
29
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
CAPITULO IV
MARCO METODOLOGICO
MATERIALES
Población Muestral
La fuente primaria para determinar la presencia de microorganismos
halófilos fue una muestra sólida de sal cloruro sódico (NaCl),llamada sal
marina debido a que su obtención se tiene por evaporación, se recolecto
una sola muestra sólida de sal y su posterior transporte se realizó de
manera aséptica y adecuada en una bolsa plástica hermética con la
finalidad de preservar la materia prima para evitar alteraciones (Figura
02).
Descripción del área de estudio.
El Estado Falcón está ubicado al noreste del país, entre los 10°18´08",
12°11´46" de latitud Norte y los 68°14´28",71°18´21" de longitud Oeste. El
sitio de investigación se realizó en La salina de Las Cumaraguas ubicada
al noreste de la Península, específicamente en el Municipio Falcón del
Estado Falcón.
Figura 02. Toma de muestras de las salinas.
30
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Medios de cultivos
En la investigación microbiológica se utilizaron medios de cultivos
deshidratados comerciales, así como los medios preparados directamente
por el fabricante, como los medios Petrifilm. Los medios de cultivos
comerciales utilizados venían deshidratados por lo que se realizó su
hidratación con agua destilada mezclando y calentando ligeramente.
Posteriormente se llevó a cabo la esterilización del medio de cultivo el cual
se utilizó el autoclave a 120 ºC a 20 PSI durante 20 minutos, este método
de autoclavado es el más comúnmente utilizado ya que consiste en la
esterilización con presión de vapor de agua. Una vez concluido el proceso
de esterilización del medio se procedió a sacar y dejar reposar por 1 hora
aproximadamente hasta alcanzar la temperatura ambiente, se vertió en
las placas de petri previamente esterilizadas y se colocaron en la estufa
para su condensación.
Reactivos
Todos los reactivos comerciales presentan diferentes grados de pureza
según las necesidades de la investigación y lo que se pretende realizar es
por ello que los reactivos que se utilizaron fueron de grado analítico ya
que el contenido de ciertas impurezas que este presenta están por debajo
de los límites establecidos por el comité de reactivos analíticos de la
Analytical Chemical Society (ACS), siendo los más adecuados para el
análisis investigativo y químico [38].
31
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
METODOLOGIA
Tratamiento de la muestra.
A cada una de las muestras de salinas obtenidas se le realizaron
diluciones seriadas con agua peptonada al 0.1 %. Seguidamente se
realizó las determinaciones microbiológicas [27].
Para el análisis microbiológico de esta investigación se prepararon 15
tubos de agua peptonada al 1%y diversos medios de cultivo dentro de los
cuales se encuentra el agar nutriente, el cual se preparó a diferentes
concentraciones de sal que van desde 0%, 3%, 5%, 10%, 15% con la
finalidad de crear diferentes condiciones en el medio de cultivo y así
favorecer el crecimiento a los microorganismos de acuerdo a sus
requerimientos salinos (Tabla 03) (Figura 03).
Nº de placas
Concentración de sal
Agar nutriente
Concentración] de sal (muestra)
mL de agar para el total de
placas
10 0% 5,75 gramos 0 gramos 250 mL
10 3% 5,75 gramos 7,5 gramos 250 mL
10 5% 5,75 gramos 12,5 gramos 250 mL
10 10% 5,75 gramos 25 gramos 250 mL
10 15% 5,75 gramos 37,5 gramos 250 mL
Tabla 03. Preparación del medio de agar nutrientes a diferentes
concentraciones salinas
32
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Figura 03. Agua peptonada en diferentes concentraciones.
Aislamiento y Cuantificación de Microorganismos halófilos
presentes
Para el aislamiento de microorganismos halófilos a partir de las muestras
obtenidas se procedió a homogenizar debido a que la muestra se
encontraba de manera sólida por lo cual se añadió 10 gramos de la
muestra a un recipiente con 90 mL de agua peptonada estéril al 0.1%, se
realizó la siembra en agar nutritivo con cloruro de sodio al 1,5%, para
obtener un aislamiento primario; la incubación fue a temperatura ambiente
por una semana
.
En la segunda fase de aislamiento, una vez homogenizada la muestra se
procedió a realizar las diluciones 1:100 y 1:1000 en tubos con agua
peptonada estéril al 0.1%, una vez que se han obtenido las diluciones se
inocularon en los medios de cultivo agar nutriente preparados
anteriormente. Para la siembra se utilizó el método de siembra por
difusión en placa basado en un extendido con una varilla de cristal que
permite esparcir la muestra por toda la superficie del agar quedando así
las bacterias separadas unas de otras, llevando a incubar a 30ºC por 24
horas.
33
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Este procedimiento se realizó por duplicado (Figura 04,05).
Se realizó el recuento de las colonias en agar estándar platecount (PCA)
durante un periodo de incubación a 30°C.
Figura 04. Método de siembra por difusión en placa.
Figura 05. Tratamiento y siembra de la muestra salinas.
34
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Determinación de la cantidad de Microorganismos heterótrofos
aerobios
Para los microorganismos heterótrofos se utilizó el número más probable
a través de las diluciones. Trascurrido el tiempo de incubación y realizada
la observación en las placas inoculadas el crecimiento microbiano se
realizó los cálculos correspondientes con la finalidad de expresar el
contaje de colonias en placas como unidades formadoras de colonia por
centímetro cuadrado (UFC/cm²).
De acuerdo a esto se llevó a cabo el repique de las colonias presente en
el medio de cultivo de igual forma que en la siembra anterior utilizando
medios de cultivo de diferentes concentraciones salinas (Figura 06).
Posteriormente se realizo pruebas confirmatorias bioquímicas y a su vez
galería API 20NE para la determinación de las bacterias.
Figura 06. Contaje y repique de colonias microbianas.
35
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Identificación de los microorganismos aislados
La identificación de los géneros predominantes se realizó mediante la
aplicación de las pruebas API20 NE, específicas para bacterias aerobias
Gram negativas no Enterobacterias.
El API 20 NE BioMérieux es un sistema para la identificación de bacilos
Gram negativos no Enterobacterias. El sistema está estandarizado, y
combina 8 pruebas convencionales y 12 de asimilación. El kit consta de
una galería con 20 microtubos que contienen medios y/o sustratos en
forma deshidratada.
Elaboración de antibiogramas
Se empleo el método de difusión por disco ó método Kirby-Bauer, trata
de una técnica en placa que permite obtener una lectura directa y
determinar la sensibilidad de un agente microbiano frente a la acción de
un antibiótico.
Se inoculó una o varias placas de agar y sobre su superficie se colocaron
los discos correspondientes a varios antibióticos. Se incuban las placas
durante 16-24 horas a 37º C y se estudia el crecimiento en ellas. Su
valoración está en la medición del diámetro de la zona de inhibición que
se forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias
oportunas publicadas por la NCCLS, y de esta manera saber si el
microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente a cada uno de los
antibióticos [39].
36
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Esquemáticamente se resume en la figura 07 el procedimiento realizado
para la elaboración de los antibiogramas de las cepas aisladas.
Agar Müeller Hinton.
Figura 07. Procedimiento para la realización de antibiogramas
37
Cepas positivas se
inoculan en solución
salina
Comparación
con el patrón
de Mac
Farland
Incubación
a 37°C por
24 horas
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
CAPITULO V
RESULTADOS
Al realizar el estudio microbiológico de las salinas obtenidas en el Estado
Falcón se pudo identificar el género y especie de los microorganismos
aislados. Se notó la presencia de Chryseomonas luteola en la mayoría de
las muestras estudiadas (Tabla 04) (Figura 08).
Cepa Concentración salina
Microorganismos
4 0 % Chryseomonas luteola 99,9 %
5 0 % Chryseomonas luteola 99,9 %
2 3 % Chryseomonas luteola 99,1 %
6 3 % Photobacterium dansela 99,8 %
4 3 % Pasteurella spp 83 %
6 3 % Burkholderia cepacia 99,8 %
2 5 % Pseudomonas fluorescens 85,2 %
8 5 % Chryseomonas luteola 95,9 %
3 3 % Chryseomonas luteola 99,1 %
Tabla 04. Resultados Galería API de estudio microbiológico de salinas
Fuente: Datos obtenidos de los análisis de laboratorio
Figura 08. Pruebas API 20 NE usadas para la identificación de los
géneros de bacterias.
38
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
En el caso del conteo de colonias, cuyos resultados se exponen en la
tabla 05 podemos indicar lo siguiente: cada una de las cepas en diversas
concentraciones analizadas arrojaron diferentes cantidades de UFC/cm².
Dilución Concentración salina del medio de
cultivo
Nº de colonias (UFC/cm²)
SD 0 % 61 61
1:10 0 % 13 130
1:100 0 % >2.0 x 10³ >2.0 x 10³
SD 3 % 26 26
1:10 3 % 25 250
1:100 3 % >2.0 x 10³ >2.0 x 10³
SD 5 % 70 70
1:10 5 % 9 90
1:100 5 % 6 600
SD 10 % 61 61
Tabla 05. Conteo de colonias.
Fuente: Datos obtenidos de los análisis de laboratorio.
Identificación de Cepas
Para identificar las cepas puras se llevó a cabo el extendido de las
colonias en láminas portaobjeto posteriormente se realizó la tinción de
GRAM el cual es una coloración de tipo diferencial que tiñe a los
microorganismos de acuerdo a su estructura y composición bioquímica
de su pared celular logrando así observar la morfología celular bacteriana
y la diferenciación bacteriana de cada cepa (Tabla 06) (Figura 09).
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ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Cepa Concentración salina
Forma Bacteriana
1 0 % Bacilos Gram positivos y cocos Gram negativos
2 0 % Bacilos Gram negativos *
3 0 % Cocos Gram positivos dispuestos en cadena y racimo
4 0 % Bacilos Gram positivos y cocos Gram negativos
5 0 % Cocos Gram positivos, Bacilos Gram positivos y negativos
6 0 % Bacilos Gram positivos
1 3 % Bacilos y cocos Gram positivos
2 3 % Bacilos Gram positivos
3 3 % Bacilos Gram positivos
4 3 % Bacilos y Cocos Gram positivos, Bacilos Gram negativos
6 3 % Bacilos Gram negativos
Tabla 06. Estructura morfológica de los microorganismos. (*)Cepas puras.
Fuente: Datos obtenidos de los análisis de laboratorio
40
1 5 % Cocos Gram positivos y negativos
2 5 % Bacilos Gram negativos *
3 5 % Bacilos Gram positivos y negativos
4 5 % Bacilos Gram positivos
5 5 % Cocos Gram positivos
6 5 % Bacilos Gram positivos y negativos
1 10 % Bacilos Gram positivos y negativos
2 10 % Bacilos Gram positivos y negativos
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Figura 09. Coloración GRAM
Se realizó la Siembra de las colonias en agar BHI con el fin de aislar
cepas puras y terminar con el proceso de diferenciación morfológica
(Tabla 07).
Cepa Concentración salina
Características Gram
1 0 % Blanca, pequeña, lisa
Bacilos Gram negativos y positivos
2 0 % Rosada, pequeña, lisa
Cocos Gram negativos y positivos
3 0 % Amarilla brillante,
pequeña, lisa
Cocos Gram negativos
4 0 % Amarilla, pequeña, cremosa
Bacilos Gram negativos*
1 3 % Amarilla, pequeña, cremosa
Bacilos Gram negativos y positivos
2 3 % Blanca, pequeña, lisa
Bacilos Gram negativos *
3 3 % Blanca, pequeña, lisa
Bacilos Gram negativos *
8 5 % blanca, pequeña,
rugosa
Bacilos Gram negativos *
Tabla 07. Características y estructura morfológica de los
microorganismos. 41
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
De acuerdo a las características microscópicas de la cepa impura n° 9
correspondiente al 3% se notó la presencia de Penicillium spp. (Figura
10).
Figura 10. Penicillium spp al microscopio
Fuente: Datos obtenidos de los análisis de laboratorio
Se realizaron pruebas bioquímicas a las cepas puras de bacilos Gram
negativos aisladas para determinar sus características metabólicas y
diferenciar un grupo de bacterias de otras. Los medios utilizados fueron
O/F (Hugh y Leifson), oxidasa (Tabla 08) (Figura 11) [28].
Tabla 08. Pruebas bioquímicas para identificación de enterobacterias.
42
Cepa [ ] salina O/F Oxidasa
2 0 % -/- Negativa
4 0 % -/- Negativa
5 0 % -/- Negativa
2 3 % -/- Negativa
3 3 % -/- Negativa
4 3 % -/- Negativa
6 3 % -/- Negativa
8 5 % -/- Negativa
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Figura 11. Pruebas Bioquímicas. O/F
Las pruebas bioquímicas para identificación de cocos Gram positivos
determinaron que eran Staphylococcus coagulasa negativa por los
resultados arrojados, estos microorganismos se caracterizan por no
utilizar el manitol como fuente de energía siendo aerobios y anaerobios
facultativos (Tabla 09) (Figura 12).
Cepa Concentración
salina
Manitol Salado Caldo Nutriente
Coagulasa
3 0 % Cocos Gram positivos no
fermentadores
Crecimiento a las 48 hrs
Negativa
7 0 % Cocos Gram positivos no
fermentadores
Crecimiento
a las 48 hrs
Negativa
8 0 % Cocos Gram positivos no
fermentadores
Crecimiento
a las 48 hrs
Negativa
5 5 % Cocos Gram positivos no
fermentadores
Crecimiento
a
las 48 hrs
Negativa
Tabla 09. Pruebas bioquímicas para identificación del género
Staphylococcus. 43
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Figura 12. Medio Manitol salado.
Una vez concluido con las pruebas bioquímicas correspondientes para la
identificación metabólica de las cepas microbianas se procedió a realizar
los respectivos antibiogramas para determinar la actividad y sensibilidad
de los antimicrobianos frente a los microorganismos en acción (Tabla 10
y 11) (Figura 12).
Antibióticos Casa comercial
AmC: Amoxicilina acidoclavulanico 30 μg BectonDickinson
CTX: Cefotaxime 30 μg BenexLimited
CAZ: Ceftazidime 30 μg BectonDickinson
IPM: Imipenem 10 μg BectonDickinson
CIP: Ciprofloxacina 5 μg BectonDickinson
GM: Gentamicina 10μg BectonDickinson
Tabla 10. Antibióticos
44
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Antibiótico zona de inhibición (mm) C.
luteola
0-3-5 %
P.
dansela
P.
fluorescens
B.
cepacia
P.
spp
R I S
AmC30 μg ≤13 14 – 17 ≥18 34 44 31 44 36
CTX 30 μg ≤ 14 15 – 22 ≥ 23 R 26 14 26 26
CAZ 30 μg ≤ 14 15 – 17 ≥ 18 R 26 30 26 26
CIP5 μg ≤ 15 16 – 20 ≥ 21 25 18 34 18 25
IPM10 μg ≤ 13 14 – 15 ≥ 16 36 48 46 48 36
GM10 μg ≤ 12 13 – 14 ≥ 15 26 28 ≥34 28 26
Tabla11. Interpretación de las zonas de inhibición para especies de la
familia Enterobacteriaceae.
Fuente: Clinical and Laboratory Standards Institut, Technical Procedure
Manuals, (2007).
De las 5 bacterias aisladas que presentaron crecimiento bacteriano solo
Chryseomonas luteola resulto ser resistente a los antibióticos cefotaxime
y ceftazidima los cuales son cefalosporinas de 3era generación
pertenecientes al grupo de los β-lactámicos, la Chryseomonas luteola
adquiere parte de su resistencia natural y es que este género por
característica propia son naturalmente resistentes a la mayoría de los
antibióticos relacionados con Monobactámicos y β-lactámicos debido a su
pared celular resistente que contiene porinas proteína formada por
laminas β que a diferencia de otras proteínas de transporte de
membranas, estas son lo suficientemente grandes para permitir procesos
de difusión pasiva y donde se encuentran β-lactamasas enzimas que
hidrolizan el anillo β-lactámico de los antibióticos, de esta manera
destruyen el sitio activo del antibiótico e impiden su actividad.
45
Las β-lactamasas se caracterizan por su capacidad de inhibir
determinados subgrupos de β-lactámicos, es por esto que algunas sub
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
clasificaciones las denominan, penicilinasas, cefalosporinasas o
carbapenemasa.
Esta resistencia también se atribuye a las bombas de flujo, que bombean
algunos antibióticos antes de que los antibióticos sean capaces de actuar.
El resto de microorganismos aislados fue sensible para los demás grupos
de antibióticos gran parte de esto corresponde a que ellas a pesar de
habitar estos ambientes salinos y soportar acondiciones extremas no son
microorganismos que ocasionen enfermedad en individuos sanos los
cuales corresponden a los llamados patógenos oportunistas [37].
Figura 13. Antibiograma
46
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
DISCUSIONES
Al analizar los resultados obtenidos del estudio microbiológico de las
salinas en el estado Falcón podemos afirmar que en este tipo de
ambiente habitan numerosos microorganismos que requieren diferentes
rangos de concentración de sal para su crecimiento óptimo. Gracias a los
resultados obtenidos se pudo demostrar que las muestras analizadas
tuvieron un rango de concentración de sales de 0, 3, 5, 10 y 15%.
Actualmente en Venezuela no se han reportado estudios en los que se
utilicen dichas muestras pero en otros países si se han desarrollado
exitosamente [5].
De lo expuesto anteriormente podemos deducir que hay una estrecha
relación con los resultados obtenidos por González y Peña (2002) donde
demostraron que los microorganismos halófilos cuentan con estrategias
que les permiten enfrentar el estrés osmótico manteniendo altas
concentraciones intracelulares de sal [4].
Actualmente en la Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco se
está realizando un proyecto experimental titulado “Caracterización de
actinomicetos aislados a partir de ambientes hipersalinos” en dicho
proyecto se realizan muestreos en ambientes salinos extremos de
distintas zonas geográficas de México como: lagunas saladas y salinas
costeras, esta investigación tiene como objetivo aportar conocimientos
sobre la diversidad de los actinomicetos halófilos a este país [6].
Trabajos realizados por Consuelo y colbs (2006) valoraron la capacidad
de microorganismos como P. aeruginosa (8), Bacillus(9), y algunos
hongos (10) para remover metales pesados como mercurio, plomo,
cadmio, cobalto, entre otros han evidenciado que los microorganismos
son capaces de cambiar los iones originales y formar complejos.
47
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
No se conocen reportes científicos en los cuales se haya considerado la
posibilidad de utilizar microorganismos para biorremediar suelos salinos y
sódicos.
La hipótesis de esta investigación fue que microorganismos bacterianos
con capacidad halófila, es decir que dependen para su supervivencia del
sodio, podrían ser utilizados como posibles remediadores de suelos
sódicos y salinos.
Los resultados del presente trabajo arrojaron los siguientes
microorganismos:
Chryseomonas luteola llamada anteriormente Pseudomonas luteola es un
aerobio obligados ya que requieren al menos mínimas condiciones de sal
para su crecimiento. [21] Son Gram-negativos, son de pigmento amarillo
característico a naranja que después de 48 horas de incubación, las
colonias son típicamente áspera o rugosa estos organismo son no
fermentadores, oxidasa negativa, catalasa positiva [31]. Actualmente
constituyen un grupo heterogéneo de patógenos oportunistas que se
encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y dado a su
obicuidad pueden sobrevivir en aguas destilada, soluciones salinas
superficies húmedas sin embargo no son considerados como patógenos,
pero debido a sus grandes condiciones que han adquirido para sobrevivir
en ambientes hostiles se consideran patógenos intrahospitalararios y
debido a esto han adquirido resistencia a los β- lactámicos como
ampicilina, cefalosporinas [32].
La Pasteurella spp son cocobacilos Gram negativos, que tienen aspecto
bipolar en los frotis, aerobios y anaerobios facultativos, poseen cápsulas y
no esporas. Todas las especies son positivas a oxidasa pero divergen
entre sí en otras reacciones bioquímicas.
48
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
El hábitat de estos microorganismos puede ser el medio ambiente en
general, Los medios de cultivo para este género son el agar-sangre
(donde origina hemolisis) y agar-chocolate. En el BHI da una
característica especial, y es que estas colonias son grises, mucoides y
presentan un olor característico [32,36].
Photobacterium dansela muestra una forma cocobacilar, perteneciente a
la familia Vibrionaceae, halófilos facultativos ya que utilizan otras vías
para obtener energía debido a la ausencia de oxigeno presentan una
series de características fenotípicas los cuales algunas proteínas y
genes están implicados tanto en el metabolismo general y control de los
niveles intracelulares del mismo que le permite modificar su metabolismo
para adaptarse a diferentes condiciones el cual para su crecimiento
óptimo necesita un rango de 160- 280 mmol de iones de Na⁺ así como
también un rango de temperatura que oscila entre 18 y 25 ºC, estudios
anteriores relacionados acerca de los genes implicados y proteínas en la
membrana externa tienen un estudio especial para estudios de
patogenicidad, diagnostico y desarrollo de vacunas [33,34].
Burkholderia cepacia es un bacilo Gram negativo no fermentador, aerobio
facultativo, perteneciente a la familia Psedomonadaceae formado a partir
del género Pseudomonas en función de su ARNr, aunque existe 7
especies de Burkholderia la que tiene acción patógena sobre los seres
humanos es la especie Burkholderia cepacia sin embargo es una
patógeno oportunista, se encuentra distribuido ampliamente en la
naturaleza interviniendo en el proceso de reciclaje de materia orgánica
ellos utilizan como sustancia de reserva el polihidrixibutirato, participa en
el metabolismo energético anaerobio, reduciendo el piruvato (procedente
de la glucólisis) para regenerar el NAD+ que, en presencia de glucosa, es
el sustrato limitante de la vía glucolítica.
49
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
Los polihidroxialcalonatos son biopolímeros degradables de naturaleza
lipídica que se acumulan en el citoplasma de algunos microorganismos
cuando están en condiciones desfavorables funcionando como almacén
energético para las células convirtiéndolo en material carbonado cuando
las condiciones ambientales varían. El polidroxibutirato en investigaciones
anteriores se ha determinado que es un biopolímero biodegradable
suscitado como alternativa a las aplicaciones de termoplásticos sintéticos
con propiedades físico mecánicas muy similares al poliéster producido a
partir de petroquímicos como el polipropileno [35,36].
La durabilidad de los plásticos sintéticos en el medio ambiente y el
aumento de los desechos sólidos producto de las sociedades de consumo
han generado gran impacto ambiental generando grandes emisiones de
gases tóxicos y epidemias constituyendo un problema epidemiológico y
estético en la sociedad. Por otra parte la investigación biotecnológica de
enzimas, biopolímeros y diferentes moléculas originados por diversas
especies de microorganismos han arrojados resultados satisfactorios a
nivel del campo industrial aportando un gran interés científico en el
desarrollo de plásticos o materiales biodegradables a partir de fuentes
renovables de energía cuyo fin principal es sustituir gran parte del material
convencional no degradable [2,5,35].
Pseudomonas fluorescens Bacilo Gram negativo no fermentador
aeróbicas provista de un flagelo polar que le confiere movilidad y le
permiten adherirse a las superficies.
50
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
CAPITULO VI
CONCLUSIONES
Las salinas del estado Falcón cuenta con la presencia de
microorganismos halófilos los cuales se aislaron e identificaron como
bacterias aerobias halófilas débiles debido a su crecimiento a
concentraciones salinas comprendidas entre 0.5 a 10%, tras sembrar en
medios nutrientes modificados con la finalidad de obtener condiciones
similares a las del medio salino, así como también en medios BHI que
permitieron su desarrollo y aislamiento para su posterior identificación
bacteriana [30].
Según la hipótesis planteada, se pudo determinar diversidad de
microorganismos halófilos como bacterias y hongos; en salinas ubicadas
en el Estado Falcón siendo la mayoría de los aislados bacterianos
identificados como especies pertenecientes al género Pseudomonas
como uno de los predominantes en ambientes hipersalinos.
De acuerdo a los antibiogramas realizados para determinar la sensibilidad
y actividad de los antimicrobianos frente a las cepas aisladas se observó
gran sensibilidad a las diferentes clases de antibióticos a los que fueron
expuestos esto debido a que los microorganismos identificados son
microbiota habitual que colonizan un amplio rango de nichos el cual
representan un bajo riesgo para el hombre por su bajo rol patógeno frente
a ellos.
No obstante, el hecho que en la investigación se determinó un pequeño
margen de microorganismos se concluye que la población microbiana en
estos ambientes salinos es baja, de acuerdo al estudio, los resultados
arrojados y sus diferencias metabólicas con respecto a los requerimientos
salinos conducen a pensar que hay mayor diversidad que proporcionaran
un gran interés para las aplicaciones Biotecnológicas.
51
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
RECOMENDACIONES
Realizar estudios sobre las bacterias halófilas y sus aplicaciones
biotecnológicas.
Revisar aspectos relacionados con su ecología en los ambientes
hipersalinos y sus características como microorganismos
extremófilos.
Realizar estudios de caracterización molecular específicamente en
los aislados del género Chryseomonas identificados, ya que
presentan las mejores características deseables para los fines del
presente proyecto.
52
ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013
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