ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA

1. INTRODUCCIÓN

Antes de realizar un análisis lo primero que tenemos que hacer es la toma de muestra. Es importante que la muestra sea representativa. Además a nivel microbiológico es importante que esa muestra no se contamine ni en la toma de muestras, ni en la manipulación o transporte.

Primero cogemos las muestras para el análisis microbiológico, para que no se contamine la zona donde están las muestras.

En análisis físico-químico el material simplemente tiene que estar limpio. En cambio para el análisis microbiológico, el material tiene que estar esterilizado. Se puede utilizar material de vidrio, boro silicatado, o plástico.

El material de vidrio o plástico tiene que tener la apertura de frasco perfectamente cerrada con un tapón esmerilado, o tapón de rosca.

Cómo se puede esterilizar un bote de vidrio: En el autoclave, y si es muy resistente en estufa (180º durante una hora). Si es de plástico ya vienen esterilizados, se esterilizan con óxido de etileno, radiaciones gamma.

Cuál es el volumen para una muestra de agua:

Dependiendo de la muestra, si es para filtración por membrana como mínimo una muestra de 500 ml, para el NMP sería de 250 ml.

Conceptos previos:

Muestreo simple: aquel que se coge en un momento determinado y en un punto.

Muestreo compuesto: en el mismo sitio pero a diferentes tiempos.

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Muestreo Integrado: de distintos sitios pero en el mismo momento.

En el análisis microbiológico son siempre muestreos simples.

Muestra de agua clorada, un tipo de desinfectante, en el transporte del agua, el cloro mata los microorganismos. Cómo eliminar el cloro, echamos tiosulfato sódico, que es un reductor. Reduce el cloro a cloruros.

Esterilización del frasco

Frasco de boca ancha, bote de 1000 ml. Se lava bien con agua y jabón, se enjuaga con agua del grifo y luego con agua destilada.

Antes de esterilizar se echa el tiosulfato de sodio, tanto si está clorada como no. En qué cantidad: 18 g/l. 0,1 ml de Na2S2O3 por cada 100 ml de agua que vayamos a coger.

Tanto el tapón como el cuello de la botella tienen que estar cubiertos de papel de aluminio. Si le ponemos papel de aluminio, este debe estar esterilizado.

Material que se utiliza para la toma de muestra.

Quitamos los filtros que tenga el grifo, lavamos bien el grifo, con agua y jabón o alcohol. Dejamos correr el agua un tiempo, unos 10 minutos. Una vez que hemos hecho esto, tenemos que esterilizar el grifo con alcohol etílico. Se flamea el grifo. Una vez que esta esterilizado le damos otra vez al agua, unos 5 minutos. Procedemos a la toma de muestra.

El tapón en la mano y en posición invertida, ponemos el bote en el grifo, pero no pegado al grifo. No lo llenamos totalmente, para que luego podamos homogenizar el frasco.

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Análisis de un pozo:

Bomba de aspiración. Si lleva bomba, se bombea y se esteriliza. Si no tiene bomba, cogemos un frasco con una cuerda. Agitamos la superficie para homogenizar. Tienen que estar lastrados. También hay frascos que se cierran solos dependiendo de la presión.

Análisis del agua de un río:

No debemos hacerlo en la orilla, sino en una profundidad media, ni en zonas de estancamiento, debe hacerse donde haya fluidez de agua. Le quitamos el tapón en sentido contrario a la corriente.

Transporte de una muestra de agua:

Rápido. Hacer el análisis antes de 6 horas de la toma de

muestra. No se debe producir ningún tipo de cambio en la muestra.

Introducimos la muestra de agua en una nevera. Los microorganismos inhiben su crecimiento en una temperatura de 4 – 5ºC. Se puede refrigerar un tiempo máximo de 24 horas.

pH inferior a 7, crecen menos los microorganismos. Si el agua tiene un pH básico se tiene que echar algún tipo de sustancia.

Determinaciones de análisis químico que se deben hacer in situ:

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El oxígeno disuelto. Temperatura. pH. Cloruros disueltos

Material a nivel microbiológico:

Un equipo de filtración de membrana. Estufa de incubación, con batería. Medios de cultivo. Alcohol, en un recipiente metálico.

Caso: en el análisis de agua Lanjarón sale un recuento con unos datos que dicen que puede ser peligroso para la salud. En casos de litigios. Se cogen tres muestras:

Primero se hace el análisis en un laboratorio oficial o privado acreditado.

Segundo: en el tiempo de cinco días, u perito, y en presencia de esta persona la empresa hace un análisis.

Tercero: si los datos no concuerdan, se hace un tercer análisis, en el tiempo de ocho días. Se tiene que acatar los resultados de este tercer laboratorio oficial acreditado

Identificación de la muestra.

Fichero de datos de la muestra: fecha, lugar, nombre y dirección de la persona jurídica o física, nombre de la persona que ha realizado la toma, sitio, fecha, hora, día, mes, año. Un código de referencia para su identificación, si ha ahabido algún tipo de anomalía

2. MICROORGANISMOS INDICADORES

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En el agua es probable que haya microorganismos patógenos. Hay que hacer análisis continuos. El agua puede provocar enfermedades: cólera, malaria, diarreas, virus, bacteriófagos.

En el análisis de agua no se hace un análisis de todos los microorganismos patógenos, por la gran cantidad de estos, además son muy difíciles de detectar todos estos microorganismos.

Se detectan otros microorganismos, que están en el agua y que nos están poniendo en alerta de que podemos tener microorganismos patógenos.

A estos microorganismos se les llama microorganismos indicadores. Deben ser inóculos inofensivos para el hombre y los animales, son fácilmente detectables y se pueden analizar en cualquier laboratorio. Deben ser más resistentes que los patógenos.

Tienen que estar relacionados cualitativa y cuantitativamente con los microorganismos patógenos, es decir, que si hay este tipo de microorganismos es muy posible que haya patógenos.

Si tenemos E.Coli es posible que haya Salmonella. La coli dependiendo de la cepa no siempre es patógena.

Microorganismos indicadores:

Coliformes totales. Coliformes fecales. Estreptococcus fecales

Los colifomes pertenecen al género de las enterobacterias:

Enterobacterias más importantes:

Escherichia coli Salmonella. Shigella. Citrobacter. Enterobacter. Yersinia

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Serratia. Klebsiella. Edwarsiella. Proteus. Erwinia Hafnia.

Los coliformes son bacterias que pertenecen a la familia de las enterobacterias. Son Gram -, aerobias o anaerobias facultativas, no espolurados, que fermetan la lactosa a 37ºC produciendo ácido y gas en un tiempo máximo de 48 horas, y en presencia de sales biliares

No todas las enterobacterias son coliformes.

2.1. COLIFORMES TOTALES

Escheria Coli, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Serratia (a veces) son coliformes totales.

Los coliformes totales serían estas enterobacterias, no sabemos de su origen, forman parte de la flora intestinal de los mamíferos. No viven solamente en el intestino.

Los coliformes totales su hábitat puede ser el intestino, pero puede tener otros destinos (suelo). En el caso de la E.Coli, el agua puede presentar contaminación fecal; es el único en el que el hábitat es el intestino.

2.2. COLIFORMES FECALES

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La E.Coli tiene un origen fecal, solamente su hábitat es el intestino. La E.Coli puede fermentar la lactosa a una temperatura de 44-45ºC; el resto de los coliformes a esa temperatura morirían.

Los coliformes totales no conocemos su origen. Los coliformes fecales son parte de los totales

2.3. ESTREPTOCOCCUS FECALES

Son Gram positivo, son cocos, fermentan la glucosa a 37ºC produciendo ácido. Su origen puede ser fecal (el agua estaría contaminada), puede tener otro origen, puede formar parte de la flora intestinal de los animales.

Son más resistentes fuera de su hábitat normal que lo coliformes. En el agua es más resistente que la E.Coli.

Son más importantes como indicadores los coliformes totales y fecales que los estreptococcus fecales, porque con la E.Coli estamos seguros de cuál es su hábitat, en los estreptococcus no se conoce el origen.

3. TÉCNICA FILTRACIÓN SOBRE MEMBRANA FILTRANTE

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La técnica de filtración por membrana se ha convertido en el método más común para evaluar las características microbiológicas del agua. Se pasa la muestra de agua a través de un filtro de membrana con diferente tamaño de poro. El filtro con las bacterias atrapadas se transfiere a la superficie de un medio sólido. El uso del medio apropiado permite la detección rápida de los coliformes totales, fecales estreptococos fecales por sus colonias características.

Ventajas de la técnica de filtración sobre membrana:

Se pueden utilizar grandes volúmenes de agua.

Se utiliza para aguas poco contaminadas.

Es un método más rápido y preciso que el NMP.

Se puede realizar una análisis insitu, con el NMP no se puede hacer en caso de emergencias

Material que se utiliza:

Matraz kitasato, una capacidad de 250 ml Membrana portafiltro. Un embudo, capacidad de 250 ml, se puede medir

directamente en el embudo

Cómo se filtra:

El embudo y la membrana deben estar esterilizados, al igual que la probeta donde midamos la muestra de agua.

Para aguas potables se puede filtrar u volumen de 100ml, para aguas envasadas 250 ml. También se puede filtrar para volúmenes más pequeños o hacer diluciones. Si se desconoce la procedencia del agua tenemos que filtrar menos volumen.

PROCEDIMIENTO:

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1. Flameamos la punta de las pinzas metálicas, no estriadas, con alcohol etílico.

2. En condiciones asépticas se coge el filtro de membrana estéril por el borde y se coloca sobre el soporte del embudo de filtración, con la cuadrícula hacia arriba. Dejamos las pinzas en el vaso de etanol. El embudo debe estar bien sujeto, que ajuste adecuadamente. Esta parte del embudo tiene que estar esterilizada.

3. Homogeneizamos la muestra y vertimos un volumen de 100 ml enrasando en el embudo de filtración.

4. Aplicamos el vacío, a través de la trompa de agua, al sistema de filtración, para que la muestra atraviese en su totalidad el filtro.

5. Una vez filtrada la muestra se enjuaga el embudo un par de veces con la solución tamponada estéril (con unos 30 ml de solución tamponada si filtramos 100 ml de agua), para arrastrar las bacterias adheridas.

Si el volumen está comprendido entre 1-30 ml, (porque está muy contaminada) se diluye aquí mismo. Sobre el embudo echamos 30 ml de solución tamponada más la muestra de agua, y filtramos sin tener el vacío funcionando. Se tiene que enjuagar un par de veces.

Si tenemos distintas muestras tenemos que hacer una desinfección entre muestra y muestra. Se coge la membrana filtrante y se pone en un vaso con agua destilada hirviendo, se deja al lado del mechero hasta que se seque. Otra forma sería sumergirla en alcohol hasta que se evapore. Hay que tener cuidado de que el alcohol etílico se evapore totalmente, sino puede matar las bacterias.

6. Flameamos de nuevo la punta de las pinzas en alcohol etílico.

7. Retiramos asépticamente el filtro de membrana estéril, tomándolo por el borde y lo colocamos sobre el medio de cultivo, con la cuadrícula hacia arriba. Hay que procurara que no queden burbujas de aire entre el medio de cultivo y el filtro de membrana.

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8. Rotulamos las placas para identificarlas.

9. Incubamos las placas.

El uso del medio apropiado permite la detección rápida de los coliformes totales, fecales estreptococos fecales por sus colonias características.

PRÁCTICAS EN CLASE:

COLIFORMES TOTALES

Volumen de muestra: 50 ml medidos en probeta esterilizada.

Medio de cultivo: Agar m-Endo Temperatura de incubación: 37ºC Tiempo: 24 horas. Interpretación de los resultados: Los coliformes totales aparecerán como colonias rojas con

brillo metálico.

COLIFORMES FECALES

Volumen de muestra: 50 ml medidos en probeta esterilizada.

Medio de cultivo: Agar eosina azul de metileno (Agar Levine).

Temperatura de incubación: 44ºC Tiempo: 24 horas. Los dos indicadores inhiben el crecimiento de las

bacterias Gram positivo, inhiben el crecimiento de las bacterias que no son coliformes.

No es un agar específico de coliformes totales, solo crecerá en este medio la E.Coli, a temperatura de 44ºC

Interpretación de los resultados: colonias de color verde, con un punto negro y un brillo metálico

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ESTREPTOCOCOS FECALES

Volumen de muestra: 50 ml medidos en probeta esterilizada.

Medio de cultivo: Agar Slanetz- Bartley Temperatura de incubación: 37ºC Tiempo: 24 horas. Interpretación de los resultados: colonias rojas, prueba

positiva. El medio lleva ácida sódica, no se puede esterilizar, inhibe

el crecimiento de las Gram negativa. También tiene cloruro de tetrazodio (precipitado de color rojo en el interior de la célula, las colonias se ven de color rojo).

RESULTADOS REPRESENTATIVOS

Coliformes totales: de 20 a 100. Coliformes fecales: de 20 a 80. Estreptococos fecales: de 20 a 60.

3. CLOSTRIDIUM SULFITO-REDUCTORES

Son bacilos Gram positivo, anaerobios estrictos, forman esporas y son capaces de reducir el sulfito a sulfuro (con actividad sulfito reductora)

Indican si hay contaminación fecal o no. Los clostridium duran mucho tiempo fuera de su hábitat, puede indicarnos una contaminación remota. Indicador de contaminación fecal.

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El medio de cultivo: SPS (Sulfito Polimixina Sulfadiazina). Los dos últimos inhiben el crecimiento de las Gram negativas. El sulfito reduce a sulfuro y en presencia de una sal de hierro forma un precipitado de color negro.

Material de siembra: pipeta graduada de 10 ml.

Técnica:

1. Fundir el medio a 50ºC.

2. Calentar 100 ml de agua que se va a inocular, para eliminar las células vegetativas y dejar las esporas. A 80ºC durante 5 minutos.

3. Enfriar el agua hasta 50ºC

4. Sembrar. Con una pipeta cogemos 10 ml, hasta el fondo y conforme vamos ascendiendo vamos saltando el líquido.

5. Como son anaerobios estrictos, añadimos un ml de vaselina en la parte superior del tubo

6. Incubar a 37ºC durante 48 horas.

7. Interpretación de los resultados: Si a las 24 horas observamos colonias de color negro esféricas, tiene clostridium, sino dejamos otras 48 horas

Cómo se leen los resultados:

Coliformes totales: por 100 ml Coliformes fecales: por 100 ml Estreptococos fecales: por 20ml (Realmente se deben

utilizar 20 ml de medio de cultivo, pero en la práctica se utilizó 10 m de medio de cultivo, por eso el resultado obtenido se multiplica por 2).

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ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS

1. INTRODUCCIÓN

La contaminación de los alimentos puede venir de:

Ambiente Suelo. Superficie de contacto de los alimentos Del propio animal. De los manipuladores

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Calidad en la manipulación de los alimentos, la legislación ha establecido una serie de normas para llevar a cabo con rigor este análisis.

Tipos de análisis microbiológicos de los alimentos que se van a realizar:

Bacterias aerobias a 37ºC. Enterobacterias. E.Coli. Salmonella. Estafilococos Aureus. Clostridium Sulfito Reductores.

1. BACTERIAS AEROBIAS A 37ºC

Un número elevado de bacterias aerobias indican que las condiciones en las que se ha elaborado o manipulado ese alimento no son las adecuadas.

Si tiene un número bajo, esto no quiere decir que no haya microorganismos patógenos, y a la inversa, un número elevado no quiere decir que haya microorganismos patógenos. Pero si indica que no ha sido almacenado, transportado, elaborado o manipulado de la forma adecuada.

El resultado se expresa en g o ml de alimento (muestra líquida ml, muestra sólida gramo).

Primero: Preparación de diluciones decimales.

Tomamos 5 gramos de carne, lo trituramos y lo introducimos de forma aséptica en un matraz erlenmeyer esterilizado. Utilizamos como diluyente agua de peptona tamponada. ¿Qué cantidad de diluyente se añade? El número que hemos pesado de alimento multiplicado por 9; en este caso 45 ml

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550 = 0,1 = 10-1 A partir de aquí (suspensión madre)

preparamos las restantes diluciones decimales

Puntas de pipetas esterilizadas, para cada dilución una pipeta esterilizada

Una vez hechas las diluciones seriadas, desde su preparación hasta los posteriores análisis no debe transcurrir más de dos horas.

Técnica: Vertido en placa.

1. Lo ideal sería utilizar placas vacías y esterilizadas para cada dilución. Añadimos a cada placa vacía un ml de la muestra. Para cada dilución utilizamos una punta de micropipeta o pipeta esterilizada.

2. Vertimos en cada una de ellas medio de cultivo agar nutritivo o agar PCA a 50-45ºC. No puede transcurrir más de diez minutos desde que echamos el inóculo hasta que añadimos el agar.

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3. En cada placa anotamos la dilución correspondiente, para posteriormente hacer el recuento.

4. Movemos la placa suavemente, de izquierda a derecha, de arriba abajo, y viceversa, de manera que se extienda.

5. En posición invertida la metemos en la estufa a incuba durante 24-48 horas a 37ºC

2. ENTEROBACTERIAS

La familia enterobacterias está compuesta por microorganismos bacilares, Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, móviles e inmóviles, fermentadores de la glucosa, redutores de nitratos anitritos, oxidasa negativos y capaces de crecer en medios con sales biliares.

Medio de cultivo:

Agar Mac Conkey

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Las sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de las Gram positiva. Es un medio selectivo y diferencial (entre coliformes y no coliformes.

Técnica de siembra: Extensión en placa

1. Cogemos tres placas con medio de cultivo de agar Mac Conkey solidificado y frío.

2. Se utiliza la micropipeta o una pipeta esterilizada para tomar 0,1 ml de las diluciones seriadas 10-2, 10-3, 10-4 ( no se toma de la suspensión madre)

3. Antes de pipetear el inóculo se homogeniza la muestra.

4. Añadimos con la micropipeta 0,1 ml de la muestra en la placa con agar solidificado, y la extendemos con el asa de Dygrasky. Primero, tenemos que introducirla en alcohol y flamearla, esperamos a que se enfríe. Se homogeniza dando vueltas, pero no llegando con el asa a los bordes de la placa.

5. Una vez extendido el inóculo dejamos que se seque.

6. Hacemos la misma operación con las otras placas. En cada extensión esterilizamos el asa de Dygrasky, antes de limpiar con alcohol y flamearla, se introduce en un vaso con lejía.

7. Invertimos la placa y se incuba a 37ºC, 24 -48 horas.

Interpretación de resultados:

Coliformes: colonias rosas.

No coliformes: colonias incoloras

En las placas de colonias rosas podemos determinar si son o no coliformes fecales.

3. DETERMINACIÓN DE LA E.COLI

Medio de cultivo:

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Agar Eosina Azul de Metileno (Agar Levine). Placas grandes.

Material de siembra: el asa.

Técnica de siembra:

Agotamiento por estrías. Aquellas colonias de color rosa en el agar Mac Conkey se recogen con el asa de siembra para realizarles un aislamiento en el medio de agar Levine. Sembramos de cada placa donde hayan aparecido colonias rosas. Lo ideal sería sembrar de cada una de las colonias para determinarlas.

Temperatura de incubación: 37ºC.

Tiempo: 24-48 horas.

Interpretación de los resultados:

No coliformes: colonias incoloras. Coliformes totales: colonias rosas. E.Coli: colonias verde con brillo metálico La eosina y el azul de metileno son dos indicadores que

inhiben el crecimiento de las Gram positivas.

4. DETERMINACIÓN DE ESTAFILOCOCOS AUREUS

Estafilococos aureus es un microorganismo de forma cocácea que se agrupa en forma de racimos. Es anaerobio facultativo, Gram positivo. No todos son patógenos. Puede producir intoxicaciones alimentarias por producción de enterotoxinas que persisten en el alimento.

Primero: Se realizará un enriquecimiento para aislarlo del resto de estafilococos.

Medio de cultivo: Caldo Gliolitti - Cantoni

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Contiene una gran cantidad de cloruro sódico, los únicos microorganismos que pueden crecer en concentraciones de hasta 75 g/l son los estafilococos aureus.

Lleva otros dos compuestos: el manitol (es un azúcar, hidrato de carbono) y el cloruro de litio que inhibe el crecimiento de las Gram negativas.

También se puede hacer la prueba de la catalasa: estafilococos positivos.

Técnica: NMP (Prueba Presuntiva)

De las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 tomamos 1 ml y lo añadimos a cada serie de tubo. Para cada dilución una pipeta distinta.

Se cubre la superficie del caldo con vaselina estéril

Tiempo de incubación: 37ºC durante 48 horas Interpretación de los resultados:

Ennegrecimiento de los tubos: Posibles estafilococos.

Luego consultamos las tablas del NMP

Prueba Confirmativa

Medio de cultivo: Agar Manito-Sal Es un medio selectivo y diferencial, lleva una gran

cantidad de sal que inhibe el crecimiento de las Gram positivas.el manitol es un azúcar, solo los

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estafilococos lo fermetan, produciendo ácido. También lleva un indicador, rojo de fenol; al principio es de color rojo, al vira se convierte en amarillo, o un punto negro (sulfuro ferroso).

Técnica: Extensión en placa De los tubos positivos de la prueba presuntiva

sembramos con la técnica de extensión en placa.

Tiempo de incubación: 37ºC durante 48 horas.

Interpretación de los resultados: colonias que presenten un halo amarillo.

A las colonias positivas en Manito-Sal se les puede someter a la prueba de la DNAsa.

5. CLOSTRIDIUM SULFITO-REDUCTORES

Son bacilos Gram positivo, anaerobios estrictos, forman esporas y son capaces de reducir el sulfito a sulfuro (con actividad sulfito reductora)

Indican si hay contaminación fecal o no. Los clostridium duran mucho tiempo fuera de su hábitat, puede indicarnos una contaminación remota. Indicador de contaminación fecal.

El medio de cultivo: SPS (Sulfito Polimixina Sulfadiazina). Los dos últimos inhiben el crecimiento de las Gram negativas. El sulfito reduce a sulfuro y en presencia de una sal de hierro forma un precipitado de color negro.

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Material de siembra: pipeta graduada de 10 ml.

Técnica:

1. Fundir el medio a 45ºC-50ºC.

4. Sembrar. Con una pipeta esterilizada cogemos 1 ml de la suspensión madre hasta el fondo, sin soltar el líquido y conforme vamos ascendiendo vamos saltando el líquido.

5. Como son anaerobios estrictos, añadimos un ml de vaselina en la parte superior del tubo

6. Incubar a 37ºC durante 24 horas.

7. Interpretación de los resultados: Si a las 24 horas observamos colonias de color negro esféricas, tiene clostridium.

6. DETERMINACIÓN DE SALMONELLA

La Salmonella es una enterobacteria, pero no es un coliforme.

Se realizan varias etapas:

1. Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo

La suspensión madre 10-1 constituida por 25 g de alimento en 225 ml de Agua de Peptona Tamponada, se lleva a incubación en un matraz de 500 ml a 37ºC durante un tiempo máximo de 24 horas.

2. Enriquecimiento en medio líquido selectivo

Medio de cultivo: Caldo Selenito-Cistina CSC

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Este medio no se esteriliza en autoclave, se calienta únicamente para su disolución, se reparte en matraces esterilizados de 100ml y para uso exclusivo en el día de la preparación

Técnica:

1. Se agita la suspensión madre tras 24 horas máximo de incubación y se traspasa 10 ml de la misma a 100ml del medio CSC

Tiempo de incubación: 37ºC durante 24 horas

3. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos

Medio de cultivo: Agar Hecktoen Técnica:

Con el asa de siembra se recogerá un poco de medio selectivo de enriquecimiento y se realizará una siembra en superficie

Tiempo de incubación: 37ºC durante 24-48 horas.

Interpretación de los resultados: las colonias de salmonella no producirán viraje del indicador, pues no fermentan estos azúcares, a veces se puede observar un precipitado negro central (algunas cepas de Salmonella son capaces de reducir el sulfato).

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4. Prueba confirmativa

Prueba Kligler: Tubo en pico de flauta, se siembra por estría en la

superficie del tubo y por picadura hacia el interior del medio.

Tiempo de incubación : 37ºC durante 24 horas.

Interpretación de los datos: en el caso de la salmonella, el pico de flauta aparecerá siempre rojo porque no fermentan la lactosa, sin embargo, la base del tubo será amarilla por la fermentación de la glucosa

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