analisis microbiologico de mariscos
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ANÁLISIS
MICROBIOLÓGIC
O DE MARISC
OS
Preparación de la muestraMariscos con valvas
Materiales: Recipiente de boca ancha con capacidad para 20 unidades de
mariscos con valvas. Recipiente con escurridero de agua. Vaso de precipitado con 500 ml de capacidad. Vaso de licuadora estéril. Escobilla dura. Cuchillo estéril. Cuchara estéril. Servilletas de papel. Balanza de capacidad no inferior a 2.500 gramos y una sensibilidad
de 0.1 gramo. Licuadora de 2 velocidades. Alcohol etílico de 70%. Solución buffer de fosfato o agua de peptona al 0.1%
1. Colocar 20 unidades de mariscos valvados en un recipiente de boca ancha. Cepillar cada uno de ellos bajo el chorro de agua potable, con especial atención a las grietas y uniones de valvas.
2. Colocar las muestras limpias en un recipiente con colador y dejar escurrir el agua.
3. Lavar y desinfectar las manos con alcohol de 70%
4. Colocar la muestra en la mano sobre una servilleta de papel limpia, de tal forma que una de las partes convexas, descanse sobre la palma de la mano.
5. Insertar el cuchillo en el punto de unión de las valvas. Cortar el músculo aductor de la valva superior, palanquear las valvas y dejar que el líquido caiga sobre el vaso de precipitado previamente tarado. Retirar la valva superior y transferir la carne al vaso conteniendo el líquido valvar.
Procedimiento
6. Pesar el vaso con la muestra extraída.7. Transferir la muestra al vaso de la licuadora.8. Adicionar una cantidad igual al peso de la muestra,
de solución buffer de fosfato o agua peptonada al 0.1%
9. Homogenizar tomando las precauciones indicadas en preparación y dilución de las muestras de alimentos (2 ml de este homogenizado contiene 1 gramo de marisco).
En caso de que el homogenizado resulte de consistencia pesada y difícil de pipetear, adicionar 3 partes de diluyente en peso de la muestra (4 ml de esta muestra contiene 1 gramo de la muestra en examen). Corregir las proporciones a ser tomadas para la siembra.
Preparar las diluciones decimales, siguiendo una de las técnicas descritas en Preparación y Dilución de las Muestras de Alimentos, hasta la dilución 10-4 ó 10-5 si es necesario.
Efectuar las determinaciones microbiológicas
de acuerdo al esquema de trabajo y a la metodología descrita.
Reportar los resultados por gramo de muestra.
Análisis de la muestra
Preparación de dilucionesÍndices Microbiológicos:
1. Numeración de microorganismos aerobios viables.
2. Numeración de Coliformes fecales (para muestras frescas).
3. Numeración de Enterococos (para muestras congeladas).
4. Investigación de Salmonella.5. Investigación de Vibrio
parahaemolyticus.
NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS VIABLES
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ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS DESHIDRATADOS
TOMA DE MUESTRA
PRODUCTOS A GRANEL
LA TOMA DE muestra en los compartimentos de los barcos o en los vagones de tren se efectúan durante la carga o descarga.
Si no se pudiera efectuar este procedimiento utilizar paletas estériles.
Recoger la muestra mediante la inserción de la paleta en el producto.
ALIMENTOS ENVASADOS EN SACOS O BARRILES
Eliminar la contaminación superficial con alcohol de 70°.
Abrir los paquetes cerrados con un instrumento cortante.
Utilizar una paleta , los sacos se eligen de forma aleatoria y tomar muestra de cada envase.
esto mismo se procede también en los alimentos envasados a granel en caja de cartón.
FRUTAS SECAS ENVASADAS EN CAJAS Ó BOLSAS
UTILIZAR UN SACABOCADO del tipo utilizado para tomar la muestra a partir del queso.
En caso de productos envasados en paquetes dentro de una caja, elegir como muestra, un paquete tomado en forma aleatoria.
PREPARACIÓN DE LAS UNIDADES DE MUESTRA
PARA EL ANÁLISIS
HIGOS Y DÁTILES
1. SELECCIONAR 10 FRUTAS Y CORTARLAS en dos con un cuchillo estéril.
2. Pesar en una jarra estéril.
3. Dejar en reposo 30´ a temperatura ambiente.
4. Agitar a mano por 1-3 minutos.
PASAS,GROSELLAS,CEREZAS,ETC
1. PESAR aproximadamente 100 piezas de fruta en una jarra estéril.
2. Dejar en reposo 30 minutos.
3. Agitar 1-3 minutos.
VEGETALES DESHIDRATADOS
a) VERDURAS CON MUCHAS HOJAS :
1. PESAR 10-20g EN UN ERLENMEYER ESTERIL DE 250ml.
2. AGREGAR 190ml DE AGUA PEPTONADA ESTERIL.
3. DEJAR REHIDRATAR POR 30´ A T° DE REFRIGERACION.
4. AGITAR POR 30´.
b) RAICES Y VEGETAL SOLIDOS :
1. PESAR 10-20g EN UN FRASCO ESTERIL.
2. AÑADIR 190ml DE AGUA PEPTONADA.
3. DEJAR REHIDRATAR POR 30´ A T° DE REFRIGERACION.
4. AGITAR POR 3 MINUTOS.
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
DE SOPA DESHIDRATADA
INDICES MICROBIOLOGICOS
(RECUENTO ESTÁNDAR EN
PLACA O POUR PLATE O RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD).
EL METODO SE RECOMIENDA
PARA PRODUCTOS LACTEOS Y PARA ALIMENTOS CONGELADOS ,ENFRIADOS PRECOCIDOS O PREPARADOS EXCEPTO QUE EL ULTIMO ESPECIFICA LA TEMPERATURA DE INCUBACION DE 35°.
NUMERACION DE MICROOORGANISMOS
AEROBIOS MESOFILOS VIABLES
I. EQUIPOS Y MATERIALES : 1. Los requisitos necesarios para la preparación y dilución de las muestras de alimentos. 2. Placas de petri (100x15mm). 3. Pipetas bacteriológicas de 1,5 y 10 ml . 4. Baño de agua regulado a 44-46°C para mantener
el agar licuado. 5. Incubadora regulada a 29-31°C. 6. Contador de colonias. 7. Agar Plate Count.
II. PROCEDIMIENTO: 1. Preparar la muestra por uno de los
procedimientos recomendados en la seccion-preparacion y dilución de la muestra.
2. Pipetear por duplicado a placas de petri estériles alícuotas de 1ml a partir de la dilución 10-1 , 10-2 , 10-3 , 10-4 y 10-5 y una alícuota de 0.1ml de la dilución 10-5 para obtener de 10-1 a 10-6 g o ml de muestra por placa de petri.
3. Agregar a las placas de petri 15 ml de agar licuado y temperado .
4. Mezclar las alícuotas con el agar mediante movimientos de vaivén y rotación de las placas petri .
5. Adicionar a placas de petri , agar sin inocular y agar inoculado con el diluyente.
6. Invertir las placas e incubarlas a 29-31°C durante 48±3 horas. 7. Computo del Recuento Estándar en placa. 8. Computo del Estimado del Recuento Estándar en placa. 9. Expresión de resultados.
NUMERACION DE COLIFORMES FECALES (DETERMINACION DEL
NÚMERO MAS PROBABLE)
I. EQUIPOS Y MATERIALES: 1. Los requisitos necesarios para la preparación
y dilución de muestras de alimentos. 2. Incubadora a 35°-37° . 3. Pipetas bacteriológicas de 1ml. 4. Caldo–lauril sulfato (LST) volúmenes de
10ml en tubos de 150x15mm
II. PROCEDIMIENTO: 1. Preparar la muestra de alimento por uno de los
tres métodos descritos en el capitulo de preparación y dilución de las muestras de alimentos.
2.Pipetear 1ml de cada una de las diluciones del homogeneizado de alimento en tubos de caldo lauril-sulfato , utilizando tres tubos de dilución.
3. Incubar los tubos a 35-37°C por 24-48 horas . 4.Anotar los tubos que muestren producción de gas
(PRUEBA PRESUNTIVA).
NUMERACIÓN DE ENTEROBACTERIACEAS(PRUEBA DE PRESENCIA
O AUSENCIA)
I. EQUIPOS Y MATERIALES : 1. Frascos de 100ml. 2. Pipetas bacteriológicas de 1ml y 10ml graduadas 0.1ml. 3. Incubadora a 35-37°C. 4.Caldo peptona de caseina-peptona de harina de
soja (caldo casoy). 5. Caldo de enriquecimiento para Enterobacteriaceas según MOSSEL.
II.PROCEDIMIENTO 1. Preparar la muestra de alimento por uno de
los tres métodos descritos en el capitulo de preparación y dilución de las muestras de alimentos.
2. Pipetear 1ml o pesar 1g del alimento y 1ml de la serie de diluciones a frascos de 100ml conteniendo 10ml de caldo casoy.
3. Incubar a 20-25°C por 2 horas, agitando los frascos cada 15min durante 30seg.
4. Adicionar 10ml de caldo de enriquecimiento de enterobacteriaceas de doble concentración .
5. Incubar a 35-37°C por 20-24 horas.
NUMERACIÓN DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
I. EQUIPOS Y MATERIALES: 1. Los requisitos necesarios para la
preparación y dilución de muestras de alimentos.
2. Placas de petri (100x15nm). 3. Pipetas de 1ml graduada al 0.1. 4. Baño de agua regulado a 44-46°C. 5. Incubadora regulada a 35-37°C. 6.Agar TSN (agar selectivo para clostridium
perfringens seg. MARSHALL) o Agar TSC (agar triptosa sulfito ciclocerina).
II.PROCEDIMIENTO: 1.Preparar la muestra y las diluciones por uno
de los métodos descritos recomendados en la seccion sobre preparación y dilución de la muestra . Preparar hasta la dilución 10-3 .
2. Pipetear 1ml de cada una de las diluciones por duplicado a placas estériles que contienen una placa delgada de TNS o TSC (5ml).
3.Verter el agar fundido y templado a ±45°C y mezclar , dejar solidificar.
4.Cubrir con una capa , de ±5ml del agar empleado, dejar solidificar.
5. Colocar las placas en posición normal en una jarra de anaerobiosis.
6.Incubar a 37°C por 20 a 24 horas.7. Contar las colonias negras y seleccionar las
placas que tengan entre 20-200 colonias en el medio TSN y también TSC(recuento presuntivo de clostridium perfringens).
DETECCION DE SALMONELLA
I. EQUIPOS Y MATERIALES: 1. Frasco Erlenmeyer. 2. 225ml de Caldo Peptonado
Bufferado ó Caldo Lactosado. 3. Tubos de Ensayo. 4. Incubadora regulada a 35-37°C.
I. PROCEDIMIENTO: 1. Pesar 25g de muestra. 2. Sembrar en 225ml de caldo de
enriquecimento Caldo Bufferado Peptonado o alternativamente en 225ml de Caldo Lactosado.
3. Incubar 35-37°C por 18-24 horas.
ANALISIS MICROBIOLOGICO
DEL AGUA
TOMA DE LA MUESTRA
Muestreo en grifos o llaves.-
El grifo no deberá tener alrededores o presentar escapes
de agua.
Antes de la recolección de la muestra se debe abrir el
grifo y dejar correr el agua durante 2 o 3 minutos para
eliminar impurezas y agua acumulada en el interior de la
cañería.
Muestreo en ríos, arroyos, lagos, etc.
Sumergir rápidamente el frasco debajo de la superficie
del agua (15 a 20 cm) para evitar recolectar material
flotante y dirigir la boca del mismo en sentido contrario
de la corriente para prevenir el contacto del agua con las
manos.
El frasco debe ser tapado inmediatamente.
Identificación de la muestra.-
En la etiqueta que se adosa al frasco se debe
anotar claramente:
El lugar del muestreo.
La fecha y hora exacta del mismo.
En el caso de muestra de agua potable, se
debe anotar también el cloro residual (total y
libre) encontrado a la hora del muestreo.
Observación especial que sugiera
contaminación (da idea de las diluciones a
realizar).
Envase para la recolección de muestras.-
Se debe utilizar frascos de vidrio neutro o plástico, no
toxico, esterilizables, de boca ancha, con tapa protectora
y cierre hermético, para evitar escapes de agua. Las
botellas de vidrio deben ser de borosilicato u otro vidrio
neutro, de preferencia provistas de tapa de rosca hecha
de metal o plástico. Las tapas de metal deben ser
forradas con un protector no toxico que evite el contacto
directo entre el metal y la muestra.
Las botellas de plástico ofrecen la ventaja de ser livianas
y resistentes. Se recomiendan que estas sean de
polipropileno o policarbonato.
El polietileno no es aconsejable porque no resiste bien la
esterilización en la autoclave.
Volumen de muestra.-
La capacidad de las botellas debe ser, por lo
menos, de 120 ml con el objeto de tomar una
muestra de 100 ml y dejar un espacio vacío que
facilite la agitación del agua antes del examen.
Las botellas que se emplean para el muestreo de
100 ml de agua potable deben contener, antes
que su esterilización, 0.1 ml de una solución al 10
% de tiosulfato de sodio (para que reaccione con
los vestigios de cloro libre).
Cuando se tenga que investigar P.aeruginosa y/o
Salmonella, se debe tomar un volumen mayor de
muestra.
Transporte y preservación de la muestra.
Para muestras de agua potable al tiempo de
transporte al laboratorio no debe ser mayor de
48 horas y de preferencia, no más de 30 horas.
Se recomienda refrigeración (4-10 °C) de las
muestras especialmente si se requiere un
recuento total en placa o si se sospecha que el
agua está contaminada con organismos
patógenos.
En muestras de agua superficiales, incluyendo
fuentes de agua potable, reservorio y agua de
balnearios, el tiempo de transporte al laboratorio
no debe exceder de seis horas.
ANALISIS DE LA MUESTRA
EQUIPOS Y MATERIALES
Los requisitos necesarios para la preparación y
dilución de la muestra. Utilizar solución de
fosfato para la preparación de las diluciones.
Los requisitos necesarios para la numeración
de microorganismos aerobios mesofilos
viables.
Los requisitos necesarios para la numeración
de coliformes y coliformes fecales.(NMP,
método 1)
Los requisitos necesarios para la numeración
de enterococos(NMP)
PROCEDIMIENTOS
Agitar vigorosamente el recipiente que contiene la muestra
y preparar las diluciones decimales por uno de los métodos
recomendados en la sección sobre preparación y dilución
de la muestra, utilizando como medio de dilución la
solución amortiguada de fosfato.
Efectuar las siguientes determinaciones de acuerdo a la
metodología descrita en la presente guía de trabajos
prácticos.
Numeración de microorganismos aerobios viables a 35 °C
por 24-48 horas y a 20 °C por 72 horas.
Numeración de coliformes y coliformes fecales.
Numeración de enterococos.
Reportar los resultados por mi muestra para el número de
microorganismos aerobios y por 100 ml para coliformes y
enterococos.
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE
LOS PRODUCTOS ENLATADOS
MICROORGANIS
MOS
EN ALIMENTOS DE
ACIDEZ B
AJA
Aerobios Esporulados
Anaerobios Esporulados
Los más difundidos son los del género Bacillus, que tiene su origen en el suelo y agua, por lo que casi siempre están presentes en las materias primas empleadas en conservas.
Los anaerobios esporulados proceden principalmente del suelo, por lo que se encuentran ampliamente distribuidos en la leche, hortalizas y otros productos alimenticios. También es posible encontrarlos en la carne, ya que algunas especies también se desarrollan en los intestinos del hombre y animales.El género más importante es el Clostridium
MICROORGANIS
MOS
EN
ALIMENTOS
ACIDOS
Bacterias Esporuladas
Mohos
Levaduras
Bacterias No Esporuladas
MARCO TEORICO
Grupos según
grado de acidez
Rango de pH
Grupos de alimento Microorganismos
grupo 1: poco
ácidos > 5
productos cárnicos , productos
marinos, leche hortalizas
aerobios esporulados , anaerobios esporulados , levaduras, mohos y
bacteria no esporuladas
Grupo 2:semiacidos
4,5 < pH <5.0
mezclas de carne y
vegetales , sopas, salsas
Grupo 3:ácidos
3,7 < pH<4,5
tomates, peras, higos , piñas, otras frutas
bacterias esporuladas, bacterias no esporuladas, levaduras, mohos
Grupo 4: muy
ácidos pH<3,7
escurtidos, pomelo, zumos
citricos
Existen microorganismos que se forman de acuerdo al pH
del alimento
EQUIPOS MATERIALE
S
Alcohol, etílico 70%.
Solución de bicloruro de mercurio de 1: 1,000.
Potenciómetro.
Cuarto estéril o cubículo de siembra estéril o cabina de flujo laminar.
Embudo de vidrio.
Pipetas graduadas de 10ml.
Abridor de latas.
Incubadoras reguladoras de 35° y a 55°.
Parafina estéril.
Microscopio.
Escobilla.
Detergente.
Placas petri estériles (100 x 15 mm)
Vástago de metal con punta en unos de los extremos.
Muestras de enlatados
Mechero Bunsen
CasoyPara microrganismos aerobios
Medios para alimentos de PH < 4.6 (baja acidez).
aerobios: Tubos de 200 x 25 mm conteniendo 50 ml de caldo- cerebro – corazón con 0.1% de almidón soluble
anaerobios: Tubos de 200 x 25 mm conteniendo 50 ml de caldo- cerebro –corazón con 0.1% de almidón soluble y 0.05% cisteina
Medios alternativos:Tubos de 200 x 25 mm con 50 ml de medio de cultivo PE-2(para aerobio y anaerobios).
.
Brewer Para microrganismos
anaerobios
Medio para alimentos < 4.6 (ácidos).
para bacteria y hongos: Tubos de 200 x 25 mm conteniendo 50ml de medio de carne de naranja.
bacterias ácido láctico: Tubos de 200 x 25 mm conteniendo 20 ml de contenido de caldo de APT.
Medios de cultivo
Placas con agar
Aquí además de anotar el número del lote, dimensiones de la lata y peso; se realizar la inspección visual del recipiente para detectar la presencia de defectos mecánicos, integridad de las saturas, preformaciones, corrosión, abolladuras u otras anormalidades que pueden ser útiles en los hallazgos bacteriológicos.
EXAMEN EXTERNO PRELIMINAR.
Dimensiones
Incubar las latas aparentemente normales según las condiciones del PH del producto, de acuerdo a la tabla de rangos normales de PH de alimentos enlatados.
INCUBACIÓN PRELIMINAR.
Alimentos de PH < 4.6: (ácidos y altamente ácidos)
incubar a 55°C por 7- 10 días
Alimentos de PH > 4.6: (mediana y baja acidez) incubar a 35°C - 50°C por 10 a 21 días.
NOTA: las conservas de carne que llevan harinas o almidones como ingredientes, incubar además a 55°C.
pH: 3,0- 3,4
pH : 6,4- 6,8
1. Retirar la etiqueta lata.2. Lavar con agua jabonosa y con escobilla, enjuagar con abundante agua limpia y
secar.3. Colocar entre dos hojas de papel de filtros limpios para detectar cualquier pérdida
del producto durante la incubación.4. Incubar las latas a la temperaturas indicadas, durante el periodo de incubación
preliminar, agitar las latas cada 2 días separar las que presenten manifestación de crecimiento, que se traducen por abombamiento o microfugas y proceder a su examen como lata alterada.
5. Si al término del periodo de incubación, las latas no presentan signos de alteración realizar “control de esterilidad”
PREPARACIÓN DE LA LATA.
Abombamiento o fuga
35ºC por 10 días 55º C por 7-10
días
No hay alteración
Se realiza un control de esterilidad
Se examina y se control las latas
alteradas
Productos ácidos
incuba incuba
Productos no ácidos
1.Efectuar el examen de los alimentos enlatados en atmósferas estériles tomando todas las precauciones de asepsia.2.Desinfectar la tapa de lata (por el lado que no lleva impreso el código), cubriendo con alcohol al 70%, dejando por contacto de 10- 15 minutos, luego escurrir el exceso de alcohol y flamear.3.Abrir con abrelatas estéril y eliminar totalmente la tapa, reemplazando inmediatamente con la base de una placa petri estéril.4.Transferir 5 gr o ml de muestra a tubos con medio de cultivo apropiados por triplicado para incubación aeróbica y anaeróbica, adicionar a estas últimas parafinas estériles.
CONTROL DE ESTERILIDAD
las latas no presentan signos de alteración
5. Incubar a las mismas temperaturas de incubación preliminar, así, si las muestra han sido incubadas a 35°C, incubar los tubos a 35°C por 48 horas hasta 5 días, si han sido incubabas a 55°C, incubar los tubos a 55° C por 48 horas por 5 días.6. Efectuar la coloración Gram de la muestra, para el examen de microscopia, si en el examen microscópico, se observa un número elevado de microorganismos por campo (más de 3) excepto en productos obtenidos por fermentación, indica pésima condiciones de higiene durante la elaboración del producto y/o utilización de materias primas contaminantes. Además, medir el Ph, observar el aspecto, color y anotar otras características 7. Después del período de incubación, examinar los tubos, si hay desarrollo, Realizar coloración Gram y observar al microscopio, si es necesario hacer subcultivos sobre agar Casoy , para aerobios y sobre agar para anaerobios según BREWEN , incubar a las temperaturas adecuadas .InterpretaciónConsiderar si un tubo es estéril si un tubo aerobio como máximo demuestra desarrollo.
5 g o ml de muestra
5 g o ml de muestra
Parafinasesteril
negativo positivo
Coloración Gram
Si mas de un tubo presenta
desarrollo
Medios para aerobios
Medios para anaerobios
Estéril
Desinfectar una de las tapas de la conserva (por el lado que no lleva impreso el código), con una solución de bicloruro de mercurio al 1/1000, dejar actuar durante 10- 15 minutos. Retirar el agente sanitizante y secar (no flamear las latas hinchadas).
Colocar la lata sobre un recipiente con desinfectante. Cubrir la lata con un embudo estéril invertido. Introducir por la parte tubular del embudo un vástago metálico con la punta hacia la lata y realizar un
orificio en la parte central de la tapa a fin de eliminar el gas. Proceder a la apertura de la lata usando un abrelatas estéril. Inmediatamente después de abierta la lata cubrir con la base de una placa de Petri estéril.
Transferir aproximadamente 5 g o ml de la muestra a 4 tubos con medios de cultivos para aerobios y a 4 tubos con medios de cultivo para anaerobios, agregar parafina estéril a los últimos tubos.
Efectuar coloraciones Gram del producto y observar al microscopio. Si se observa bastones positivos esporulados, la alteración de la conserva se debe a un subprocesamiento. Si se observa presencia de bastones, cocos, levaduras, indican que la alteración es por microfugas.
Incubar la mitad de los tubos, aerobios y anaerobios a 35º por 48 horas hasta 5 días y la otra mitad a 55ºC por 48 horas hasta 5 días.
Hacer sub cultivos en placas de agar Casoy para aerobios y agar Brewer para anaerobios. Incubar a 35ºC o a 55ºC por 24 horas según el caso. A partir de las colonias aisladas, realizar el bacteriograma diferencial, según el esquema propuesto.
ANÁLISIS DE LATAS ALTERADAS
Gracias