Estudio de la resistencia a glifosato en una subpoblación de Sorghum halepense de Gobernador Crespo

Martinatto, A.1; Permingeat, H.2; Perotti, V.3

1) IICAR-CONICET (FCA- UNR- Zavalla). 2) AGROBIOTEC-FCA , IICAR-CONICET (FCA- UNR- Zavalla) 3) AGROBIOTEC-FCA (FCA- UNR- Zavalla)martinattoan@gmail.com.

El sorgo de Alepo (Sorghum halepense (L.) Persoon) ha sido introducido al país con propósitos forrajeros, pero actualmente es considerado una de las malezas más problemáticas delmundo. Es una gramínea C4, perenne y alotetraploide. Por sus características es una especie sumamente competitiva, interfiriendo con los barbechos previos a cultivos primavero-estivales como soja, maíz o girasol. La aparición de biotipos resistentes a herbicidas sistémicos post-emergentes como el glifosato condujo a un retroceso en las capacidades de controlde esta maleza. El glifosato está involucrado en una gama muy amplia de mecanismos moleculares de resistencia en relación a los otros modos de acción. No obstante, el mecanismo deresistencia más frecuente para este herbicida en gramíneas parece ser la translocación reducida del mismo.

En este trabajo, se realizaron estudios in vivo y moleculares a partir de la subpoblación de Gobernador Crespo (GC-R) (Santa Fe) con el objetivo de dilucidar el mecanismo deresistencia a glifosato. La subpoblación de Zavalla (Zav-S) (Santa Fe) se utilizó como control susceptible. En los experimentos de dosis respuesta las supboblaciones GC-R y Zav-S fuerontratadas con dosis de glifosato correspondientes a 1/4X a 4X y 1/32 a 1X, respectivamente (1X= 1080 g ia ha-1). Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con cinco réplicas pordosis. Estos estudios confirmaron la resistencia de la subpoblación GC-R con un valor de LD50 (1494 ± 256 g ia ha-1) poco mayor a la dosis recomendada a campo. Sin embargo, labiomasa remanente se vio severamente afectada a dicha dosis (29 %). Los estudios moleculares efectuados permitieron descartar un mecanismo asociado al sitio de acción (mutacionesen la secuencia y amplificación del gen blanco EPSPS), de acuerdo con lo reportado hasta el momento para esta maleza. Futuros estudios serán orientados a la caracterización delmecanismo no asociado al sitio de acción presente.Palabras clave: glifosato, resistencia, translocación reducida.

Resultados

Materiales y métodos:Experimentos de dosis-respuesta : La supboblación GC-R fue tratada con glifosato (Roundup®, full II, ia: glifosato 66.2% P/V, Monsanto Argentina) con las dosis: 270, 540, 1080, 2160 y 4320 g ia ha-1, correspondientes a dosis 1/4X a 4X, y la susceptible Zav-S con 33,5; 67,5; 135; 270; 540 y 1080 gia ha-1 correspondiente a dosis 1/32 a 1X, respectivamente. Los experimentos se realizaron por triplicado y con un diseño completamente aleatorizado con 5 réplicas por dosis (1 planta por maceta). Se determinó la supervivencia y el peso seco 20 días después de la aplicación del herbicida. Lascurvas fueron ajustadas por medio de un modelo de regresión no lineal, cuya expresión es: Y= C + ((D – C) / (1 +(x/GR50)b). Mediante el cociente de los GR50 o LD50 (dosis de herbicida que causa un 50% de reducción en la biomasa o supervivencia, respectivamente) se estimó el factor deresistencia (FR). El error asociado se calculó mediante propagación de las variancias obtenidas en cada curva. Las diferencias significativas mínimas se calcularon mediante t-test usando el software Sigma Plot (versión 11.0, Systat Software, Inc., San Jose, CA, USA). Secuenciación del gen EPSPS:Se llevó a cabo la amplificación de un segmento conservado del gen EPSPS que comprende los sitios conocidos que confieren resistencia (posiciones 101, 102; 103 y 106). Se utilizó como molde ADN genómico de los tres individuos seleccionados de la supboblación GC-R (GC-C4, C6 y C7) y uno dela suppoblación de Zav-S. Los productos de PCR fueron secuenciados a través del servicio proporcionado por Macrogen Inc. (Corea del Sur). El análisis de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas se llevó a cabo utilizando las herramientas de los programas DNA Star (Lasergene) o μGENE; y elalineamiento múltiple de secuencias mediante el programa CLUSTALW (Thompson et al., 1994). Estimación del número de copias del gen EPSPS: Se determinó el número de copias genómicas del gen EPSPS en los individuos seleccionados de las supboblaciones Zav-S y GC-R realizando una PCRcuantitativa en tiempo real (qPCR). Los oligocebadores utilizados son epspsShf (5´CTGTTGTTGTTGGCTGTGG 3´) /epspsShr (5´CGTAAGTTGCATTTCCACCAG 3´); y para el gen de Ubiquitina (UBQ) utilizado como normalizador UBQSbf (5´ CAAGAGCGCAAGAAGAAGACGTACACCAAG 3´) y UBQSbr (5´GATTACGCCTTCTGGTTGTAGACATAGGTG 3´). El número de copias fue evaluado mediante el método comparativo (E+1) –ΔΔCt (Livak y Schmittgen, 2001). Las cuantificaciones comparativas de los valores Ct fueron calculados con el software REST (Relative Expression Software Tool V 2.0.7 for RotorGene, Corbett Life Sciences).

SubpoblaciónPeso Seco Supervivencia

GR50R2

FR LD50R2

FR

GC-R 715 (47)a 0,9913 3,3 1494 (256)a 0,9264 4,3

Zav-S 223 (33)b 0,9540 382 (23)b 0,9880

CURVAS DOSIS RESPUESTA CON GLIFOSATO

Sorghum halepense(S) GGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGCAGCTGTT

consenso de nucleótidos

Zea mays(S) GGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGCAGCTGTTSorghum bicolor(S) GGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGCAGCTGTT

Zav-S(S) GGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGCAGCTGTTGC-C4(R) GGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGCAGCTGTTGC-C6(R) GGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGCAGCTGTTGC-C7(R) GGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGCAGCTGTT

106103102292 333101

consenso de aminoácidos 106103102101

Sorghum halepense(S) G N A G T A M R P L T A A V

Sorghum bicolor(S) G N A G T A M R P L T A A V

GC-C7(R) G N A G T A M R P L T A A V

Zav-S(S) G N A G T A M R P L T A A VGC-C4(R) G N A G T A M R P L T A A V

Zea mays(S) G N A G T A M R P L T A A V

GC-C6(R) G N A G T A M R P L T A A V

Parámetros obtenidos de las curvas dosis respuesta de las subpoblaciones conglifosato. Los valores de LD50 y GR50 se expresan en g ia ha-1 y son el promedio detres curvas repetidas en el tiempo. Los factores de resistencia (FR) se calcularonutilizando la concentración de glifosato requerida para reducir la biomasa seca(GR50) y la tasa de supervivencia en un 50% (LD50). Los valores entre paréntesis sonlos errores estándar de la media. Las letras en superíndice indican diferenciasestadísticamente significativas (P<0,001) después de la comparación de a pares delos GR50 o LD50 usando t-test (software Sigmaplot).

1 X 1 X

BIOMASA SECA SUPERVIVENCIA

29% del control no tratado >50% del control no tratado GC-R

Dosis de campo (1X= 1080 g ia/ha-1)

La subpoblación de Sorghumhalepense de Gobernador

Crespo (GC-R) es resistente a GLIFOSATO

SECUENCIACIÓN DE REGIÓN CONSERVADA DEL GEN EPSPS

ESTUDIO DEL NÚMERO DE COPIAS DEL GEN EPSPS

Alineamiento de las secuencias parciales del gen EPSPS. Secuencia de nucleótidos (superior) y aminoácidos(inferior) en la región conservada de EPSPS de las especies de referencias (Z. mays, S. bicolor y S. halepense) y deplantas de la subpoblación sensible (Zav-S) y resistente (GC-R). Los aminoácidos son enumerados de acuerdo ala numeración de EPSPS de plantas usada por Padgette (1996).

No se encontraron cambios de secuencia en la región conservada de EPSPS

Número relativo de copias del gen EPSPS en los individuos seleccionados de GC-R respecto a losindividuos sensibles (Zav- S1 y S2). Las barras verticales representan el error estándar de lamedia. Las letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas.

Gen

Número de copiasrelativa

Error estándar

IC (95%) P(H1)

EPSPS 0,915 0,525-1,437 0,341-2,740 0,701

UBQ 1,000

Los individuos seleccionados resistentes no mostraronaumento del número de copias en el gen EPSPS respecto alindividuo sensible.