estandariz de un protocolo

7/24/2019 Estandariz de Un Protocolo

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INSTITUTO TECNOLGICO DE COSTA RICA

ESCUELA DE BIOLOGA

INFORME DEL TRABAJO FINAL DE GRADUACIN

ESTANDARIZACIN DE UN PROTOCOLO PARA MEDICIN DECATECOLAMINAS EN ORINA DE ADULTOS MAYORES COMO

MARCADOR BIOLGICO EN LA DETERMINACINDE LA CARGA ALOSTTICA

Silvia Benavides Varela

CARTAGO, 2005


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ESTANDARIZACIN DE UN PROTOCOLO PARA MEDICIN DE CATECOLAMINAS ENORINA DE ADULTOS MAYORES COMO MARCADOR BIOLGICO

EN LA DETERMINACIN DE LA CARGA ALOSTTICA

Silvia Benavides Varela*

RESUMEN

La estandarizacin de un protocolo confiable para la medicin de catecolaminas en orina

de adultos mayores se realiz en el marco del Estudio de Longevidad y Envejecimiento

Saludable (CRELES) que realiza en Costa Rica el Centro Centroamericano de Poblaciones y el

Instituto de Investigaciones en Salud, como parte de la batera de pruebas necesarias para la

determinacin de la carga alosttica en personas mayores de 60 aos. Este protocolo se

desarroll en el Programa de Investigacin en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica,

incluy la estandarizacin de los procesos de colecta, anlisis, y manejo de la muestra de orina.

Se evalu la variacin en la concentracin da las catecolaminas segn el preservante utilizado

durante la colecta, y se demostr que no existen diferencias significativas en los tratamientos

(!>0.05). El procedimiento de extraccin en fase slida propuesto en el kit de la casa comercial

Bioanalytical Systems, no produjo los resultados esperados de recuperacin de las sustancias,

razn por la que se realizaron algunas modificaciones al protocolo que incluyeron la disminucin

de la velocidad de elusin (0,1ml/min) y de la cantidad del eluente colectado (0,5ml). Se

incorporaron adems modificaciones en el flujo de inyeccin (1,5ml/min) y la temperatura de la

columna analtica (28C) como consecuencia de los resultados obtenidos en pruebas realizadas.Se mantuvo el potencial de 600mV sugerido en el manual del kit, aunque se varo la intensidad

de corriente aplicada (10nA en los primeros 15 minutos y 20nA en lo sucesivo de la corrida).

Finalmente se valid el mtodo, al probar que este resulta repetible (CV97.5%),

lineal (r2> 0.9882) y reproducible entre los das, y que tanto las muestras como los calibradores

se mantienen estables durante el perodo requerido para el anlisis. Las pruebas piloto

realizadas a 15 individuos confirmaron la efectividad del mtodo estandarizado y su utilidad para

la medicin de epinefrina y norepinefrina en orina de adultos mayores; se ampli adems el

potencial de aplicacin del mtodo, pues se logr tambin la estandarizacin para la deteccin

de dopamina en orina.

*Informe de Trabajo Final de Graduacin, Escuela de Biologa, Instituto Tecnolgico de Costa Rica,Cartago, Costa Rica. 2005


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ii

ESTANDARIZACIN DE UN PROTOCOLO PARA MEDICIN DE CATECOLAMINAS ENORINA DE ADULTOS MAYORES COMO MARCADOR BIOLGICO

EN LA DETERMINACIN DE LA CARGA ALOSTTICA

Informe presentado a la Escuela de Biologa del

Instituto Tecnolgico de Costa Rica como requisito parcial

para optar al ttulo de Bachiller en Ingeniera en Biotecnologa.

Miembros del Tribunal

_______________________________

Miguel Rojas Chvez, PhDProfesor Asesor

_____________________ ___ ___________________________Jaime Fornaguera Tras, PhD Xinia Fernndez Rojas, PhD

Asesor externo Lectora


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iii

DEDICATORIA

A papi

por su trabajo incansable y

por su ejemplo de paciencia y escucha.

A mami

por su preocupacin constante

y su dedicacin completa a nosotros sus hijos.

A los dos gracias,

por su apoyo incondicional

y por ser mi inspiracin en gran parte

de mis retos personales.

Gracias tambin por estar a mi lado siempre.


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iv

AGRADECIMIENTOS

La autora desea dejar constancia de su agradecimiento:

A Dios, porque en este trabajo me permiti conocer ms de cerca la grandeza de sus obras

y me ayud a valorar todos los regalos que me ha dado.

A mis hermanos y hermana, por luchar junto a m en las pequeas adversidades que se

presentaron, y por brindarme su ayuda en todos y cada uno de los momentos en que

tuvieron esa oportunidad.

A mi novio, que me ense a vivir a plenitud mi trabajo y mis estudios, a aprender que el

esfuerzo no tiene razn de ser si el fin ltimo no es dar a los dems un poquito de m. Por

estar cerca aunque estuviramos lejos.

Al Doctor Miguel Rojas por ofrecer su aporte profesional para la realizacin de este trabajo.

A la Doctora Olga Baudrit, por sus valiosos y acertados aportes tcnicos durante el

desarrollo del proyecto y por la colaboracin desinteresada que siempre me brind.

A la Doctora Xinia Fernndez, por confiar en m y en mi trabajo, por su comprensin y por

brindar parte de su valioso tiempo no slo a la revisin sino a la supervisin durante la

realizacin de todo mi proyecto.

A la Master Elvira Salas, en quien encontr una nueva amiga y quien estuvo dispuesta

siempre a brindarme sus conocimientos adquiridos en el laboratorio.

Al Doctor Jaime Fornaguera, por los esfuerzos realizados para hacer posible la consecucin

de mi trabajo, por todas las enseanzas transmitidas en el da a da, su aliento en los

momentos de desesperacin y su compaa en los momentos de alegra, pero sobre todo

por ensearme que el xito en el trabajo slo se logra si se disfruta lo que se hace.


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v

NDICE GENERAL

RESUMEN ................................................................................................................................................... I

DEDICATORIA.......................................................................................................................................III

AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................................... IV

NDICE GENERAL ..................................................................................................................................VNDICE DE CUADROS ......................................................................................................................VIII

NDICE DE FIGURAS ........................................................................................................................... IX

NDICE DE ANEXOS ............................................................................................................................ XI

1.INTRODUCCIN...................................................................................................................................1

2. REVISIN DE LITERATURA ...........................................................................................................4

2.1 Homeostasis y alostasis ................................................................................................. 4

2.2 Alostasis y carga alosttica ........................................................................................... 5

2.3 Respuesta neurofisiolgica al estrs ............................................................................. 7

2.3.1 Activacin autonmica ...................................................................................................................8

2.3.2 Activacin neuroendocrina ..........................................................................................................10

2.4 Comunicacin intercelular en el organismo............................................................... 11

2.5 Transmisin de seales .............................................................................................. 12

2.5.1 Sealamiento neuronal .................................................................................................................12

2.5.2 Sealamiento humoral ..................................................................................................................15

2.6 Catecolaminas ............................................................................................................. 15

2.6.1 Definicin ......................................................................................................................................15

2.6.2 Biosntesis ......................................................................................................................................16

2.6.3 Almacenamiento ............................................................................................................................17

2.6.4 Liberacin de catecolaminas .......................................................................................................18

2.6.5 Norepinefrina ................................................................................................................................19

2.6.7 Los exmenes de catecolaminas en orina ...................................................................................21

2.7 Principio de Cromatografa de columna.................................................................... 22

2.7.1 Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) ..................................................................23

2.8 Bases tericas de la deteccin electroqumica ............................................................ 25

2.9 Principio de extraccin en fase slida......................................................................... 26

2.9.1 Interacciones moleculares en la extraccin en fase slida........................................................27

3. MATERIALES Y MTODOS ...........................................................................................................29

3.1 Colecta......................................................................................................................... 29

3.1.1 Determinacin del refrigerante....................................................................................................29


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vi

3.1.2 Determinacin del preservante ....................................................................................................31

3.2 Pruebas analticas ....................................................................................................... 32

3.2.1 Preparacin de las sustancias empleadas en los anlisis..........................................................32

3.2.2 Clculo de la concentracin de catecolaminas segn la respuesta obtenida...........................35

3.2.3 Elaboracin de las curvas de calibracin...................................................................................35

3.3 Extraccin en fase slida (EFS) .................................................................................. 36

3.3.1 Condiciones iniciales de trabajo..................................................................................................36

3.3.2 Estabilidad de las muestras con previa EFS...............................................................................37

3.4 Condiciones del sistema de cromatografa................................................................. 38

3.4.1 Condiciones iniciales de trabajo..................................................................................................38

3.4.2 Evaluacin del potencial e intensidad de corriente aplicada en la deteccin..........................38

3.5 Valor estadstico del ensayo y otras condiciones........................................................ 39

3.5.1 Variacin entre das......................................................................................................................39

3.5.2 Estabilidad de los calibradores ...................................................................................................39

3.5.3 Repetibilidad .................................................................................................................................39

3.5.4 Exactitud ........................................................................................................................................40

3.5.5 Linealidad ......................................................................................................................................40

3.6 Variantes planteadas al mtodo de trabajo................................................................ 41

3.6.1 Determinacin del porcentaje de recuperacin..........................................................................41

3.6.2 Velocidad de elusin en el proceso de extraccin ......................................................................41

3.6.3 Cantidad de eluente D colectado al final del proceso de EFS ..................................................42

3.6.4 Flujo y temperatura de la columna de separacin .....................................................................42

3.6.5 Mtodo de calibracin..................................................................................................................43

3.7 Prueba piloto............................................................................................................... 43

4. RESULTADOS .....................................................................................................................................45

4.1 Determinacin del refrigerante .................................................................................. 45

4.2 Determinacin del preservante................................................................................... 46

4.3 Extraccin en fase slida............................................................................................. 48

4.4 Determinacin del porcentaje de recuperacin ......................................................... 484.5 Velocidad de elusin en el proceso de extraccin....................................................... 49

4.6 Cantidad de eluente D colectado al final del proceso de EFS.................................... 50

4.7 Estabilidad de las muestras con previa EFS.............................................................. 51

4.8 Evaluacin del potencial e intensidad de corriente aplicada en la deteccin............ 52

4.9 Flujo y temperatura de la columna de separacin..................................................... 52


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vii

4.10 Mtodo de calibracin............................................................................................... 54

4.11 Estabilidad de los calibradores................................................................................. 55

4.12 Variacin entre das .................................................................................................. 55

4.13 Repetibilidad ............................................................................................................. 56

4.14 Exactitud ................................................................................................................... 56

4.15 Linealidad.................................................................................................................. 57

4.16 Pruebas piloto............................................................................................................ 58

5. DISCUSIN ..........................................................................................................................................59

6. CONCLUSIONES ................................................................................................................................69

7. RECOMENDACIONES ......................................................................................................................71

REFERENCIAS ........................................................................................................................................72

ANEXOS ....................................................................................................................................................76


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viii

NDICE DE CUADROS

Nm. Ttulo Pgina

1 Condiciones de preservacin de las muestras por evaluar 31

2 Concentracin de las catecolaminas en los calibradores preparados 34

3 Planteamiento de evaluacin de distintas intensidades de corriente ypotencial de trabajo en el detector electroqumico.

38

4 Condiciones de evaluacin en el aparato de medicin de HPLC. 43

5 Promedio de la concentracin de las catecolaminas segn los

tratamientos en la preservacin de la muestra durante la colecta.

47

6 Diferencias en la deteccin de las catecolaminas segn el potencial e

intensidad de corriente aplicadas en el electrodo.

52

7 Tiempos de corrida de las muestras inyectadas, segn el flujo y la

temperatura de la columna de separacin.

53

8 Promedio de la concentracin de las catecolaminas en muestrasinyectadas a un flujo de un mililitro/minuto, cuando se vari la

temperatura en la columna de separacin.

54

9 Promedio de la concentracin de las catecolaminas en muestras

analizadas por diferentes mtodos de calibracin.

54

10 Porcentaje de recuperacin de la solucin acuosa extrada de acuerdo

con el mtodo de integracin.

55

11 Resultados obtenidos en las pruebas de repetibilidad para las distintas

sustancias y segn la matriz de la muestra inyectada.

56

12 Exactitud del ensayo en la medicin de catecolaminas 56

13 Valores de las concentraciones de catecolaminas en 15 personas

mayores de 60 aos, colaboradoras en el proyecto CRELES.

58


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ix

NDICE DE FIGURAS

Nm. Ttulo Pgina

1 Esquema de las conexiones y respuestas autonmicas. 9

2 Esquema de la respuesta neuroendocrina al estrs. 10

3 Esquema del proceso de sntesis de neurotransmisores,

empaquetamiento, liberacin y unin a los receptores.

13

4 Biosntesis de catecolaminas. 17

5 Estructura de la Norepinefrina. 19

6 Estructura de la Epinefrina. 20

7 Mecanismos mediante los que se logra la elusin de los compuestos

en el proceso de extraccin en fase slida.

27

8 Diagrama del ensamblaje del recipiente para la colecta de las

muestras de orina del proyecto CRELES

30

9 Diagrama de la cmara de vaco y colocacin adecuada de las

columnas de extraccin.

37

10 Evaluacin de la temperatura de muestras colectadas con distintos

refrigerantes.

45

11 Evaluacin de la temperatura de muestras colectadas con distintas

marcas de hielo gel.

46

12 Comparacin de la resolucin y limpieza de los cromatogramas,segn el tratamiento de colecta empleado en cada caso.

47

13 Porcentaje de recuperacin en las catecolaminas segn el lote de

columnas empleado en la extraccin en fase slida.

49

14 Porcentaje de recuperacin obtenido al variar la velocidad de elusin

en el proceso de EFS.

49

15 Porcentaje de recuperacin obtenido en los estndares acuosos al

variar el volumen de reactivo D que se colecta al final del proceso de

EFS.

50

16 Variacin en la deteccin de las catecolaminas de las muestras de

orina segn la cantidad de eluente D que se colecta al final del

proceso de EFS.

51

17 Respuesta de las catecolaminas obtenida al recoger tanto el primero

como el segundo mililitro del reactivo D al realizar el proceso de

extraccin en fase slida en muestras de estndar acuoso.

51


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x

Nm. Ttulo Pgina

18 Separacin de los picos en los cromatogramas y diferencias en los

tiempos de retencin y corrida de las soluciones, segn la

temperatura en la columna de separacin y el flujo de inyeccin.

53

19 Linealidad observada en las curvas de calibracin de lascatecolaminas.

57


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xi

NDICE DE ANEXOS

Nm. Ttulo Pgina

1 Instructivo de colecta y distribucin de las muestras de orina,elaborado para el proyecto CRELES-INISA

76

2 Instructivo para recepcin y almacenamiento de muestras de orina delproyecto CRELES-PIN

80

3 Protocolo estandarizado para la medicin de catecolaminas en orina-PIN

81

4 Hojas de registros Proyecto CRELES-PIN 87

5 Manual de colecta de muestras de orina y sangre dirigido a adultosmayores colaboradores del proyecto CRELES

90

6 Concentracin de catecolaminas en orina de los adultos mayoresparticipante en la prueba piloto, Proyecto CRELES-PIN 93

7 Resultados obtenidos en las evaluaciones de los preservantes duranteel procedimiento de colecta.

94

8 Porcentaje de recuperacin obtenido con los distintos lotes decolumnas.

94

9 Porcentaje de recuperacin obtenido al variar la velocidad de elusinen el proceso de EFS.

95

10 Porcentaje de recuperacin obtenido en los estndares acuosos alvariar el volumen de reactivo D que se colecta al final del proceso deEFS.

95

11 Respuesta de las muestras acuosas y de la mezcla de orina en el dauno y el da siete despus de la extraccin en fase slida.

95

12 Concentracin de las catecolaminas segn la temperatura, flujo yestndar de calibracin empleado en el anlisis.

96

13 Variacin diaria de la respuesta de los calibradores preparados endesde el da de evaluacin uno.

96

14 Variacin diaria de la concentracin de las catecolaminas en lasdistintas de las distintas matrices.

97


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1

1. INTRODUCCIN

En nuestro pas, el mejoramiento en los sistemas de salud entre otros factores, ha

logrado la disminucin considerable de la mortalidad infantil y el aumento de la esperanza de

vida al nacer (75,59 aos para hombres y 79,96 aos para mujeres) (Proyecto Estado de la

Nacin 2003).

Los resultados del Censo del ao 2000 confrontados con otros censos de aos

anteriores, muestran cmo la poblacin costarricense ha mostrado un aumento en el

porcentaje de adultos mayores y una disminucin en el porcentaje de los individuos menores

de 15 aos. Esta estructura poblacional es el resultado, entre otras cosas, de una mortalidad

baja y estable y una fecundidad en descenso, situacin que conducira para el ao 2025 (de

mantenerse las tendencias segn la proyeccin) a una estructura de poblacin envejecida,

es decir, aquella en la que el porcentaje de personas mayores de 65 aos, supera el de los

menores de 15 (INEC 2001).

Un indicador que refleja los cambios de la estructura por edades de la poblacin, es la

relacin o razn de dependencia demogrfica; sta se define como el cociente de la

poblacin en edades econmicamente dependientes (0-14 aos y ms de 65 aos) entre la

poblacin de edades econmicamente productivas (de 15 a 64 aos). El supuesto bsico

para utilizar esta definicin es que la mayora de las personas menores de 15 y mayores de

65 aos, generalmente no participan en la actividad econmica y, por lo tanto, dependen de

quienes estn en edad productiva (15 a 64 aos) (INEC 2001).

Los cambios en la razn de dependencia que se proyectan, sugieren posibles impactos

econmicos y sociales de importancia para la sociedad costarricense (INEC 2001).

Ante esta realidad, el Centro Centroamericano de Poblacin (CCP) y el Instituto de

Investigaciones en Salud (INISA) han planteado el proyecto denominado CRELES (Costa

Rica: Estudio de Longevidad y Envejecimiento Saludable), que tiene como objetivo

determinar la calidad de vida y longevidad de los adultos mayores costarricenses, as como

los factores causales de estas variables poblacionales.

El estudio pretende establecer correlaciones entre la longevidad de los adultos

mayores en Costa Rica y factores como: resultados intermedios en la salud, situacinnutricional, comportamientos a lo largo de sus vidas, situacin socioeconmica, condiciones

de vida y apoyo familiar, el acceso, uso y gastos en la atencin de la salud. Una variable

importante que tambin se incluir dentro de este conjunto, es la carga alosttica. Visto

como un indicador directo del comportamiento de la poblacin y como un signo del riesgo de

tener problemas en la salud debido a alteraciones fisiolgicas, la carga alosttica permite


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2

relacionar el nivel de vida y las condiciones socio-demogrficas de adultos mayores con

marcadores biolgicos de riesgo (McEwen 1998, Seeman et al.2001, Crimmins et al.2003,

Seeman et al. 2004).

Dentro de los marcadores de riesgo biolgico que forman parte de la batera de

pruebas que se emplean en la determinacin de la carga alosttica, se encuentra la

medicin de epinefrina y la norepinefrina, catecolaminas que se secretan en la mdula

suprarrenal y que han sido catalogadas como hormonas de estrs, por su funcin en

respuesta a situaciones que producen alteracin nerviosa en los individuos.

En el pas, se realizan las pruebas para medicin de catecolaminas en el laboratorio

del Hospital Nacional de Nios, aunque solamente se llevan a cabo para el diagnstico

clnico de enfermedades como feocromocitoma y no para investigacin. Por esta razn es

que resultaba necesario el desarrollo de un mtodo estandarizado para uso del proyecto

CRELES y que podra utilizarse en un futuro para otros estudios o trabajos de investigacin.

La responsabilidad del desarrollo de este protocolo, fue adquirida por el Programa deInvestigacin en Neurociencias.

En este protocolo, la medicin de catecolaminas podra realizarse tanto en plasma

como en orina; pero, debido a los constantes cambios en la concentracin de estas

sustancias en respuesta a diversas situaciones que el individuo experimenta, es que se

prefiere la colecta nocturna de las muestras de orina durante 12 horas, al igual que lo han

hecho otros investigadores (Ming-Cheng et al. 2000, Seeman et al. 2001, Seeman et al.

2004).

Debido a que los humanos somos generalmente ms activos por la maana, lamedicin nocturna sugiere una medida ms basal, en la que variaciones de catecolaminas

fuera del rango esperado, pueden asociarse con mayor propiedad a desordenes fisiolgicos

crnicos, ms que a eventos especficos o espordicos. (Ming-Cheng et al.2000)

Existen varias tcnicas que podran emplearse en la medicin de catecolaminas, como

por ejemplo RIA (Radioinmunoanlisis), que aunque es un mtodo muy sensible, presenta

algunas desventajas en precio y cierta dificultad en cuanto al manejo de la radiactividad,

ELISA (del ingls: Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay) que tiene una menor sensibilidad

y resulta un poco menos preciso que los otros mtodos, Espectometra de masas que es unmtodo muy preciso y sensible pero sumamente caro si no se cuenta con el equipo de

medicin; y finalmente HPLC (del ingls: High Performance Liquid Chromathography) que es

el mtodo seleccionado para este estudio, pues adems de su especificidad y sensibilidad,

proporciona ms datos de inters en menor tiempo. Este mtodo es el ms utilizado en la

mayor parte de los estudios de medicin de catecolaminas, y tambin presenta la ventaja de


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ser econmicamente viable para el laboratorio pues ya se cuenta con el cromatgrafo de

deteccin electroqumica necesario para el anlisis.

El protocolo para medicin de catecolaminas se implement en el laboratorio del

Programa de Investigacin en Neurociencias (PIN) de la Universidad de Costa Rica, con el

aporte econmico y logstico del Proyecto CRELES.

Objetivos

El presente Trabajo Final de Graduacin tiene como Objetivo General estandarizar un

protocolo para la medicin de catecolaminas en orina de adultos mayores.

Los objetivos especficos de este trabajo son:

Estandarizar el protocolo de colecta de las muestras de orina que se evaluarn en el

proyecto CRELES.

Normalizar el protocolo de extraccin en fase slida de las muestras de orina que se

emplearn en la cuantificacin de la concentracin de catecolaminas.

Validar el protocolo para la cuantificacin de epinefrina, norepinefrina en orina de

adultos mayores.

Elaborar los procedimientos de operacin para medicin de catecolaminas del

proyecto CRELES, segn el formato de la documentacin del manual de calidad delINISA (norma ISO 17025).

Disear los instructivos para el procedimiento de colecta de la muestra de orina que

sern entregados a los adultos mayores que participan en el proyecto CRELES.


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2. REVISIN DE LITERATURA

Los ltimos resultados que se han publicado sobre los estudios de la poblacin en

nuestro pas, sealan que, el aumento en la esperanza de vida y la disminucin de la tasa de

natalidad y mortalidad, as como otros ndices de salud pblica, provocarn a mediano plazo

un cambio en la estructura poblacional, caracterizado principalmente por el aumento en elnmero de personas que se ubican en edades avanzadas (ms de 65 aos) (Proyecto

Estado de la Nacin 2003).

En una poblacin que tiende a envejecerse, las polticas del pas, deben avocarse al

mejoramiento de los sistemas de salud pblica y de seguridad social, con especial atencin

en la calidad de vida de los adultos mayores.

Muchas y muy diversas son las enfermedades cuya incidencia aumenta en las etapas

de la vejez, entre las que se mencionan con ms frecuencia: la diabetes, el cncer de colon,

las enfermedades coronarias, la depresin y la hipertensin. Esta realidad exhorta a labsqueda y obtencin de diagnsticos tempranos, en los que se utilicen marcadores

biolgicos que revelen los primeros signos de desajustes en los sistemas fisiolgicos

(Seeman et al2001).

Una respuesta a sta bsqueda, es la introduccin del concepto de carga alosttica

(AL: Allostatic load). De acuerdo con McEwen (1998), la alostasis puede definirse como la

capacidad de los sistemas fisiolgicos para lograr estabilidad durante los procesos de

cambio de los factores externos al ser humano.

2.1 Homeostasis y alostasis

El cuerpo humano sufre cambios constantes que le permiten llevar a cabo los procesos

metablicos adecuadamente. La homeostasis, entendida como el mantenimiento del

equilibrio dinmico en el organismo, que se logra por medio de mecanismos reguladores que

compensan las variaciones que ocurren en el cuerpo, (Fornaguera y Gmez 2004) es el

concepto que mejor describe la razn de ser de los cambios que realiza el organismo

internamente.

A principios de los 90s, Bruce McEwen public los primeros trabajos sobre alostasis

(Bonet 2004). Al igual que la homeostasis, la alostasis es un mecanismo compensatorio,

pero que tiene como objetivo regular los procesos internos para adaptar el cuerpo a los

cambios que ocurren como consecuencia de los factores o estmulos externos. Dicho de otra

manera, es la actividad necesaria para mantener la estabilidad a travs de situaciones de

cambio; o el proceso activo que sirve para mantener la homeostasis (Bonet 2004). La


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alostasis est medida con marcadores que no tienen rangos tan rgidos o lmites crticos

para la supervivencia del ser humano, como s los tienen los ndices homeostticos (pH,

temperatura, disponibilidad de oxgeno) (McEwen 1998, Bonet 2004).

2.2 Alostasis y carga alosttica

Cuando el cuerpo ha sido sometido por muchos aos a constantes situaciones de

estrs, los sistemas fisiolgicos pueden comenzar a operar fuera de los mbitos normales, o

presentar una incapacidad de retornar a los rangos ptimos despus de nuevas alteraciones

o presiones externas (Crimmins et al.2003).

El sistema nervioso autnomo, el eje hipotalmico-hipofisiario-adrenal (HHA) y los

sistemas cardiovascular, metablico e inmunolgico, protegen al cuerpo, respondiendo al

estrs interno y externo; a esta respuesta es a la que se ha denominado alostasis. El

esfuerzo adicional que realiza el cuerpo para responder adecuadamente a este estrs que

se genera, es lo que se denomina carga alosttica, y se manifiesta en el desgaste

prematuro por sobreactividad crnica de los sistemas fisiolgicos o por la falta de activacin

de los mismos (McEwen y Stellar 1993, McEwen 1998, Crimmins et al2003).

Las respuestas alostticas ms comunes comprometen al sistema nervioso simptico

y al eje Hipotlamo-hipofisiario-adrenal, liberando catecolaminas y cortisol. La posterior

inactivacin de estas respuestas alostticas hace que los sistemas vuelvan a los niveles

basales. Sin embargo, si la inactivacin es ineficiente, existe una sobreexposicin del

organismo a las hormonas de estrs, que si se prolonga, puede resultar en el aumento de la

carga alosttica (McEwen 1998).

Para cada sistema en el cuerpo, existen tanto acciones adaptativas protectoras

(alostasis), y efectos de esas acciones prolongadas en el tiempo, que pueden ser dainas

(carga alosttica).

As por ejemplo, en el sistema cardiovascular, el rol de las catecolaminas en

situaciones estresantes, al ajustar el ritmo cardiaco y la presin sangunea, incluso tambin

al dormir, al caminar o al hacer ejercicio fsico, es un reflejo de la alostasis en el cuerpo.

(McEwen y Seeman 1999). Pero, la carga alosttica podra presentarse con repetidas o

prolongadas alteraciones a causa del estrs, las cuales pueden traer como consecuencia el

aumento en la presin sangunea, que adems podra acelerar el proceso de aterosclerosis

y el padecimiento de diabetes tipo II (McEwen y Seeman 1999).

Igualmente los esteroides adrenales son sustancias que promueven la alostasis

favoreciendo la disponibilidad de las reservas energticas, cuando stas son necesarias

para reaccionar ante un evento especfico. Pero la sobreactividad de stas hormonas implica


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7

poblacin. De esta forma, la AL se convierte en una manera cuantitativa de clasificar a

quienes tienen el ms alto riesgo de padecer alguna patologa (Seeman et al. 2001, Seeman

et al. 2004).

En resumen, se tiene que los eventos que se han relacionado con altos valores en la

carga alosttica son: la incidencia de enfermedades cardiovasculares, la disminucin de la

funcionalidad fsica y cognitiva, e incluso la mortalidad (Seeman et al. 2001, Seeman et al.

2004).

2.3 Respuesta neurofisiolgica al estrs

El trmino estrs lo introduce el fisilogo Walter Cannon en 1920 para referirse a la

reaccin fisiolgica provocada por la percepcin de una situacin aversiva o amenazante

(Carlson 1993, Gmez y Escobar 2002). Si en el enfrentamiento a esa situacin se produce

un desbalance entre los mecanismos fisiolgicos que se utilizan para afrontarla, es cuando

se habla del fenmeno de estrs (Carlson 1993, Gmez 2000).

El estrs suele manifestarse a travs de una serie de reacciones que van desde la

fatiga prolongada y el agotamiento, hasta dolores de cabeza, gastritis, lceras, ocasionando

tambin trastornos psicolgicos(Glaxo SmithKline 2004).

El estrs normal, tambin llamado estrs agudo, forma parte de la vida cotidiana y no

se puede considerar, en principio, como una enfermedad, sino como la respuesta tanto fsica

como mental, a las adaptaciones y ajustes del ser humano a los diversos acontecimientos

vitales (Glaxo SmithKline 2004).

La respuesta fisiolgica ante los distintos estresores, puede darse como una activacin

autonmica, del sistema neuroendocrino o ambas.

Desde el punto de vista neurofisiolgico se han descrito tres sistemas involucrados en

la respuesta al estrs:

Sistema nervioso central (procesador de la informacin): quien se encarga de

reconocer y procesar la informacin que puede ser estresante o no (Sadek y Nemeroff

2000).

Sistema autnomo: genera la primera respuesta al estrs. Esta respuesta se

caracteriza por la liberacin de catecolaminas: Norepinefrina y Epinefrina principalmente

(Sadek y Nemeroff 2000).

Sistema neuroendocrino: genera una respuesta ms lenta en el tiempo y

bsicamente se encarga de liberar los glucocorticoides, que contribuyen en la activacin


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general del sistema nervioso y en la preparacin al organismo para reaccionar (Sadek y

Nemeroff 2000).

2.3.1 Activacin autonmica

Inicia con la excitacin del hipotlamo como consecuencia de seales estresantes que

vienen del medio. La informacin que llega a sta regin del cerebro, y que fue evaluada

como peligrosa en procesos cognitivos previos, provoca la rpida liberacin de

catecolaminas: Norepinefrina y Epinefrina (Sadek y Nemeroff 2000).

La Norepinefrina y Epinefrina son las encargadas de poner el cuerpo en estado de

alerta, preparndolo para luchar o huir. Ambas catecolaminas intervienen en gran parte de

los procesos propios del sistema autnomo, tal y como se puede observar en la figura uno.

Entre estos procesos se pueden mencionar:

Dilatacin de las pupilas.

Dilatacin bronquial.

Movilizacin de los cidos grasos.

Incremento del ritmo cardaco.

Aumento de la glicemia.

Vasodilatacin muscular y vasoconstriccin cutnea.

Reduccin de los niveles de estrgenos y testosterona, que son hormonas que

estimulan el desarrollo de las caractersticas sexuales secundarias.

Inhibicin de la secrecin de prolactina, que influye sobre la glndula mamaria.

Incremento de la produccin de tiroxina, que favorece el metabolismo energtico y la

sntesis de protenas.


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Figura 1.Esquema de las conexiones y respuestas autonmicas. Tomado de Purves et al. (2001)


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SE ALINHIBITORIA

GL NDULASUPRARENAL

CAMBIOS FISIOL GICOSRESUESTAS DE LUCHA Y HUIDA

FLUJOSANGUNEO

ACTH

CORTISOL

GL NDULAPITUITARIAANTERIOR

CRF

HIPOT LAMO

ESTR S

2.3.2 Activacin neuroendocrina

La respuesta neuroendocrina es

relativamente lenta puesto que se pone en marcha

al cabo de segundos o minutos y su efecto se

mantiene desde quince minutos y hasta por una

hora. Se le denomina neuroendocrina porque su

activacin depende del sistema nervioso central y

en ella participan adems glndulas endocrinas

(Sadek y Nemeroff 2000).

La activacin neuroendocrina se inicia cuando

las neuronas en el ncleo paraventricular del

hipotlamo secretan un pptido llamado Factor

Liberador de Corticotropina (CRF). La CRF y otras

hormonas relacionadas entran en el sistema

circulatorio porta-hipotlamico hipofisiario, para

lograr que se libere de la hipfisis anterior

corticotropina, tambin conocida como

adenocorticotropa o ACTH (Carlson 1993). La

corticotropina estimula a su vez a la corteza

suprarrenal para que libere glucocorticoides como

el cortisol, la hidrocortisona y la corticosterona; y mineralocorticoides como la aldosterona

(figura dos).

La liberacin de glucocorticoides en situaciones de estrs provoca un aumento de

glucosa en la sangre, ayuda a que las grasas se conviertan en energa, aumenta el flujo

sanguneo y estimula las respuestas conductuales, al tiempo que inhibe actividades

vegetativas innecesarias en esos momentos (Carlson 1993).

Los efectos de los glucorticoides como respuesta al estrs son importantes y

necesarios, sin embargo, su activacin a largo plazo puede generar efectos dainos en la

salud tales como aumento en la presin sangunea, ateroesclerosis, dao en el tejidomuscular, infertilidad, inhibicin del crecimiento y de las respuestas inflamatorias e

inmunolgicas (Carlson 1993). Tambin se han descrito daos en estructuras cerebrales

como el hipocampo (Matey 1999, McEwen 1999, Glaxo SmithKline 2004)

Los niveles de glucocorticoides se regulan mediante una retroalimentacin negativa

sobre la hipfisis anterior y el hipotlamo, a travs de los receptores de estas sustancias que

Figura 2. Esquema de la respuesta

neuroendocrina al estrs. Modificado

de Sadek y Nemeroff (2000)


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estn presentes en esas regiones cerebrales. Esto permite mantener los niveles de cortisol

dentro de los rangos adecuados para cada situacin (Sadek y Nemeroff 2000).

Tanto el estrs agudo como el estrs crnico pueden tener consecuencias a largo

plazo. Los factores que determinan ampliamente las respuestas individuales a situaciones

potencialmente estresantes son, por una parte, la forma en que la persona percibe una

situacin y por otra, su estado general de salud fsica, determinado este ltimo no slo por

factores genticos, sino tambin por su conducta y estilo de vida (McEwen 1998).

La capacidad para adaptarse al estrs reiterado est determinada adems por el

aprendizaje y el desarrollo de estrategias de afrontamiento eficaces, que se suman a la

forma en que una persona percibe la situacin. Por ejemplo, la mayora de las personas

reacciona inicialmente al hablar en pblico mediante la activacin del eje HHA. Sin embargo,

despus de haber hablado varias veces, la mayora se habita y su secrecin de

corticoesteroides deja de aumentar, o el aumento es menor ante este estmulo (McEwen

1998).

2.4 Comunicacin intercelular en el organismo

Los seres humanos, al igual que otros organismos superiores, son individuos muy

complejos en cuanto a su estructura celular y anatmica. Esta estructura demanda una

perfecta coordinacin de las funciones metablicas en espacio y tiempo, para lo cual se

requieren mecanismos de interaccin y comunicacin intercelular muy avanzados.

Existen varias formas por las que las clulas y tejidos pueden comunicarse unos con

otros, que implican en la mayor parte de los casos, el intercambio de sustancias para la

transmisin de una seal (Martini 1998). Las clulas del sistema nervioso estn anatmica y

fisiolgicamente especializadas para la transmisin intercelular de seales qumicas y

elctricas, as como para el transporte de metabolitos de una clula a la otra y de solutos del

interior de la clula al espacio extracelular (Zigmond et al.1999).

El sistema nervioso utiliza muchos y muy diversos procesos para la comunicacin

intercelular. Estos procesos incluyen la transmisin electro-sinptica y sealizacin autocrina

(activa seales para la misma clula que las secreta) y paracrina (activa seales que son

captadas por las clulas vecinas), en las cuales, las molculas son producidas por clulas

tanto del sistema nervioso como de otros sistemas que interactan con este (Zigmond et al.

1999).


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En la comunicacin intercelular, los estmulos en las clulas nerviosas pueden liberar

sustancias qumicas como neurotransmisores u hormonas que se unirn a receptores

especficos de las clulas blanco, y pueden eventualmente generar cambios en estas

clulas, como por ejemplo modificar la expresin de algunos genes (Greger y Windhorst

1996).

2.5 Transmisin de seales

Las molculas extracelulares que llevan seales son llamadas primeros mensajeros e

incluyen a los neurotransmisores, hormonas y factores de crecimiento. La funcin primordial

de las molculas extracelulares es la comunicacin intercelular (Roskoski 1997).

2.5.1 Sealamiento neuronal

En el encfalo humano, las neuronas se comunican principalmente liberando

mensajeros qumicos denominados neurotransmisores, aunque en algunos casos tambinse comunican mediante sinapsis elctricas (Roskoski 1997).

Un neurotransmisores una sustancia secretada por las neuronas y que se difunde a

una corta distancia hasta llegar a las clulas blanco, donde produce una respuesta

fisiolgica (Roskoski 1997).

El proceso mediante el cual se lleva a cabo la sinapsis utilizando neurotransmisores

se muestra en la figura tres, e implica tres procesos bsicos:

1) Sntesis y empaquetamiento en vesculas

2) Liberacin y unin a los receptores3) Eliminacin o degradacin. (Kandel et al. 1991, Greger y Windhorst 1996, Purves

et al.2001)


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Figura 3. Esquema del proceso de sntesis de neurotransmisores, empaquetamiento, liberacin y

unin a los receptores. Tomado de Purves et al. (2001)

Cuando el sistema de comunicacin a travs de neurotransmisores no funciona

adecuadamente, se producen una amplia gama de trastornos neurolgicos y psiquitricos;

es por esa razn que gran cantidad de las terapias o tratamientos de esas enfermedades se

basan en la regulacin de estas sustancias y sus procesos de sntesis, de

empaquetamiento, de liberacin, de unin a receptores y de degradacin (Purves et al.

2001).

2.5.1.1 Sntesis de los neurotransmisores

Una transmisin sinptica eficaz requiere un control cuidadoso de la concentracin de

los neurotransmisores en el interior de la hendidura sinptica. Por eso, las neuronas han

desarrollado una capacidad sofisticada para regular la sntesis, el empaquetamiento, la

liberacin y la degradacin de los neurotransmisores (Purves et al.2001).

De acuerdo con Purves et al. (2001) la sntesis de los neurotransmisores de molculas

pequeas (entre los que se encuentran las catecolaminas), se desarrolla localmente en las

terminales presinpticas. Las enzimas necesarias para la sntesis de los neurotransmisores

son transportadas hasta el citoplasma de la terminacin nerviosa por un mecanismo

conocido como transporte axnico lento. Las molculas precursoras utilizadas por estas


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enzimas suelen ser captadas en la terminacin nerviosa por protenas de transporte que se

encuentran en la membrana plasmtica de la terminacin(Purves et al.2001).

2.5.1.2 Liberacin y eliminacin de los neurotransmisores

Las vesculas que contienen los neurotransmisores se asocian con la membranapresinptica y se fusionan con ella en respuesta a la entrada del in Ca2+.

Cuando el transmisor ha sido secretado en la hendidura sinptica, se une a receptores

especficos en la clula postsinptica, generando as una seal elctrica. Una vez que esto

sucede, el transmisor debe ser eliminado rpidamente para permitir que la clula

postsinptica participe en otro ciclo de liberacin, fijacin del neurotransmisor y generacin

de seales. Los mecanismos por los cuales se eliminan los neurotransmisores varan, pero

siempre implican la difusin, la recaptacin en las terminaciones nerviosas o las clulas

gliales circundantes, la degradacin por enzimas especficas o, en algunos casos, unacombinacin de estas (Purves et al.2001).

2.5.1.3 Receptores de los neurotransmisores

Cada uno de los neurotransmisores se une a receptores especficos que son protenas

de la membrana plasmtica, sta unin desencadena una serie de cambios en la clula,

como por ejemplo la apertura o cierre de canales inicos en la membrana durante la sinapsis

(Purves et al.2001, Mckee y Mckee 2003).Existen dos clases principales de receptores de neurotransmisores: a) Los

denominados canales inicos regulados por ligando, b) Los receptores metabotrpicos. Un

transmisor dado, puede activar tanto a los receptores metabotrpicos como a los canales

inicos regulados por ligando, para producir tanto potenciales postsinpticos rpidos (con

receptores ionotrpicos), como lentos (receptores metabotrpicos) en una nica sinapsis

(Purves et al.2001, Mckee y Mckee 2003).


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2.5.2 Sealamiento humoral

El modo no sinptico de transmisin extracelular ms utilizado por el organismo, es el

sealamiento humoral (hormonal).

Una hormona es una sustancia secretada por las clulas en cantidades traza

(microgramos o nanogramos) y es transportada por el torrente sanguneo a las clulasblanco, donde regula el metabolismo mediante la modificacin de ciertas funciones

fisiolgicas (Roskoski 1997).

Las hormonas perifricas pueden entrar al sistema nervioso, e incluso producirse

dentro de este, para conducir, inhibir o modular la actividad neuronal y las respuestas en el

organismo (Zigmond et al.1999).

Las catecolaminas, por su modo de funcionar, distribucin en el cuerpo, y lugar de

liberacin, son consideradas molculas de sealamiento con caractersticas tanto de

neurotransmisores como de hormonas (Mathews et al.2002).

2.6 Catecolaminas

2.6.1 Definicin

El trmino catecolamina se refiere generalmente a compuestos orgnicos que

contienen un ncleo catecol (un anillo de benceno con dos sustituciones adyacentes de

grupos hidroxilo) y un grupo amino (Zigmond et al. 1999) (figuras cinco y seis). Sonmolculas relativamente pequeas y estructuralmente semejantes a los aminocidos,

debido a que estos ltimos son sus precursores (Martini 1998).

Las principales catecolaminas conocidas son la dopamina, norepinefrina (tambin

llamada noradrenalina) y epinefrina (o adrenalina).

Son sustancias solubles en agua, que cuando son secretadas por el cerebro u otro

tejido neural, funcionan como neurotransmisores, sin embargo, especficamente la

epinefrina y la norepinefrina, tambin se producen y son secretadas como hormonas por las

glndulas adrenales (Nelson y Cox 2000).Actan sobre prcticamente todos los tejidos del cuerpo y estn relacionadas con la

regulacin de una amplia variedad de procesos. Las catecolaminas son metabolizadas por

los tejidos destinatarios o por el hgado y el resultado de ese proceso metablico genera

otras sustancias o metabolitos que aparecen en la orina; as, la dopamina se convierte en

cido homovanlico (AHV), la norepinefrina se convierte en normetanefrina y cido


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vanilmandlico (AVM); y la epinefrina se convierte en metanefrina y AVM (Adam Quality

2001). En la orina tambin se pueden encontrar cantidades considerables de estas

catecolaminas que no han sido metabolizadas y que por tanto son medibles por diferentes

mtodos de anlisis.

2.6.2 Biosntesis

Los aminocidos fenilalanina y tirosina, que son los precursores de las catecolaminas,

estn presentes en el plasma y en el cerebro en altas concentraciones. En los mamferos, la

tirosina tambin se deriva de la fenilalanina que se consume en la dieta, gracias a la enzima

fenilalanina hidroxilasa que se encuentra principalmente en el hgado (Zigmond et al.1999).

Las catecolaminas se forman en el cerebro, las clulas cromafines adrenales y los nervios

del sistema simptico. En general los procesos que regulan de la sntesis son los mismos en

los diferentes tejidos (Zigmond et al.1999).

El ciclo de las catecolaminas, tal y como se observa en la figura cuatro, parte del

aminocido tirosina, el cual, por accin de la tirosina hidroxilasa (TH), se convierte en 3,4-

dihidroxifenilalanina (L-dopa). La L-dopa es metabolizada casi inmediatamente para producir

dopamina, gracias a la L-aminocido aromtico descarboxilasa (AADC) (tambin llamada

dopa descarboxilasa) (Biopsicologa 2004). En las neuronas que liberan dopamina, este es

el paso final en la sntesis de los neurotransmisores, sin embargo, en las neuronas que

utilizan norepinefrina y epinefrina como transmisores, la dopamina es oxidada por la

dopamina "- hidroxilasa (DBH) o "-hidroxi-dopamina y se transforma en norepinefrina (NE),

que se biosintetiza en las terminaciones sinpticas. Finalmente, en las neuronas en las que

la epinefrina se utiliza como transmisor, una tercera enzima, la feniletanolamina N-

metiltransferasa (PNMT), convierte la Norepinefrina en Epinefrina (E) por una metilacin en

el grupo amino terminal (Zigmond et al.1999, Biopsicologa 2004).

El transmisor de una neurona es la ltima catecolamina que se forma, segn las

enzimas que en ella se encuentran, de tal forma que una neurona adrenrgica (aquella que

utiliza epinefrina como transmisor), contiene cuatro enzimas (TH, AADC, DBH, PNMT) que

secuencialmente metabolizan la tirosina hasta obtener epinefrina; las neuronas

noradrenrgicas expresan slo las enzimas TH, AADC y DBH y por lo tanto la norepinefrina

no puede ser metabolizada a epinefrina. Por ltimo en las neuronas dopaminrgicas slo se

encuentran TH y AADC (Zigmond et al.1999).


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Figura 4. Biosntesis de catecolaminas. Tomado de Mathews et al. (2002)

2.6.3 Almacenamiento

Los neurotrasmisores son almacenados en vesculas sinpticas donde estn

protegidos de la degradacin enzimtica, y donde se encuentran disponibles y listos para la

pronta liberacin (Zigmond et al. 1999).

Generalmente encontramos catecolaminas en una baja concentracin de forma libre en

el citosol, donde pueden ser metabolizadas por diversas enzimas incluyendo las

monoaminooxidasas (MAO). La conversin de tirosina a L-dopa, y de L-dopa a dopamina,

tiene lugar en el citosol; de ah, posteriormente la dopamina es introducida en las vesculas

de almacenamiento. En las neuronas que contienen norepinefrina, la !-hidroxilacin final se

produce en el interior de estas vesculas. En la glndula adrenal, la norepinefrina es N-

Tirosina

Do a

Dopamina

E inefrina

Norepinefrina

Tirosinhidroxilasa

Dopadescarboxilasa

Dopamina

hidroxilasa

CO2

O2

PNMT


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metilada por la PNMT en el citoplasma y finalmente la epinefrina es transportada de vuelta a

los grnulos para su almacenamiento (Siegel et al. 1994).

El mecanismo que concentra a las catecolaminas en el interior de las vesculas es un

proceso dependiente del adenosn-trifosfato (ATP) ligado a una bomba de protones. El

proceso de recaptacin vesicular es relativamente especfico, pues con l tambin se

transportan varias aminas biognicas, incluyendo a la triptamina, la tiramina y a las

anfetaminas; estas aminas pueden competir con las catecolaminas endgenas por ocupar

un lugar en las vesculas de almacenamiento (Siegel et al. 1994).

2.6.4 Liberacin de catecolaminas

La liberacin de neurotransmisores ocurre por medio de una ruta regulada y controlada

por seales extracelulares (Zigmond et al. 1999).

En general las catecolaminas son liberadas por el mismo proceso dependiente de Ca2+

(exocitosis). Aunque en el caso de la dopamina se ha reportado tambin un proceso de

liberacin que utiliza autoreceptores (Zigmond et al. 1999).

Las catecolaminas epinefrina y norepinefrina se han asociado a condiciones de estrs,

y adems algunos estudios relacionan a estas hormonas adrenomedulares simpticas, como

moduladores endgenos de la memoria (Zigmond et al.1999).

La epinefrina, que es liberada desde la mdula adrenal, no entra en el cerebro, sino

que su efecto modulador de la memoria resulta como consecuencia de la activacin del

sistema nervioso perifrico. La epinefrina aumenta los niveles de norepinefrina en las

estructuras lmbicas, incluyendo la amgdala, y potencia los niveles de otras sustancias en el

locus coeruleus (conjunto de clulas noradrenrgicas que se proyectan desde las regiones

del cerebro que estn relacionadas con el almacenamiento de la memoria, como la amgdala

y el hipocampo) (Zigmond et al.1999).


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2.6.5 Norepinefrina

Es un neurotransmisor que se encuentra en el cerebro y en la mayora de las fibras

simpticas post-ganglinicas. Los cuerpos celulares de las neuronas noradrenrgicas estn

localizadas principalmente en el locus coeruleus, en el piso del cuarto ventrculo (Greger y

Windhorst 1996), a pesar de que estas neuronas son relativamente pocas, se proyectan en

forma difusa a travs de la corteza, hipocampo, cerebelo y cordn espinal (Kandel et al.

1991, Siegel et al.1994)

Otros cuerpos celulares proyectan fibras que conectan con el tallo cerebral y el

hipotlamo (Siegel et al.1994).

La norepinefrina se almacena en vesculas de las terminales del axn desde donde se

libera para la transmisin sinptica del impulso nervioso. Afecta rpidamente las funciones

fisiolgicas y el metabolismo de la mayora de los rganos al estimular, en la mayora de los

casos, la sntesis de Adenosn-monofosfato cclico (AMPc) (Biopsicologa 2004).

En el sistema nervioso perifrico, se forma en las neuronas postganglinicas del

sistema nervioso simptico especficamente (Kandel et al.1991, Roskoski 1997).

En su funcin humoral, se forma en la mdula suprarrenal. La norepinefrina se

almacena en los grnulos de secrecin hasta el momento en que las clulas son

estimuladas para liberar la hormona a la sangre. La mayor parte de la norepinefrina es

metilada por una feniletanolamina N-metil-transferasa relativamente inespecfica para dar

epinefrina, que tambin se almacena en los grnulos cromafnicos. (Biopsicologa 2004)

La norepinefrina (figura cinco) es uno de los principales neurotransmisores

estimuladores que se conocen.

Las neuronas noradrenrgicas son especialmente importantes para modular el

sueo y la vigilia (Purves et al.2001).

Figura 5.Estructura de la Norepinefrina. Tomado de Mathews et al(2002).


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2.6.6 Epinefrina

La epinefrina o adrenalina (figura seis) es un neurotransmisor en el cerebro, pero

tambin una de las hormonas principales del cuerpo (Adam Quality 2001). Por un lado tiene

su origen en las neuronas adrenrgicas y por el otro, es secretada por la mdula suprarrenal

en respuesta a niveles bajos de glucosa sangunea, ejercicio y varias formas de estrsagudo (en el ltimo caso, el cerebro estimula la liberacin de la hormona).

La epinefrina causa la degradacin del glucgeno a glucosa en el hgado y en los

msculos esquelticos, y la liberacin de cidos grasos del tejido adiposo. Tambin provoca

la vasodilatacin de pequeas arterias dentro del tejido muscular, aumenta el ritmo y fuerza

del latido cardiaco (Adam Quality 2001) y dilata las vas respiratorias para que ingrese

mayor cantidad de oxgeno a la sangre (necesario para la sntesis de Adenosn-trifosfato o

ATP en las mitocondrias) (Fornaguera y Gmez 2004).

Figura 6.Estructura de la Epinefrina. Tomado de Mathews et al(2002)

La epinefrina est presente en niveles mucho menores en el encfalo que cualquiera

de las otras catecolaminas, aunque se han logrado identificar dos grupos importantes de

neuronas adrenrgicas en el bulbo rostral y la mdula oblongada, de donde se proyectan

algunas terminales nerviosas hacia el tallo cerebral y el hipotlamo (Siegel et al. 1994,

Purves et al.2001).

Inicialmente se desconoca la presencia de esta catecolamina en el sistema nervioso

central, pero fue gracias a tcnicas de inmunohistoqumica que se demostr la existencia de

neuronas adrenrgicas, en las que se produca tincin como respuesta a la utilizacin de

anticuerpos contra la enzima PNMT (enzima que permite la conversin de norepinefrina a

epinefrina, figura cuatro) (Nieuwenhuys 1985).


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2.6.7 Los exmenes de catecolaminas en orina

Las catecolaminas pueden ser medidas tanto en la sangre como en la orina. Uno de

los mtodos ms frecuentes empleados en este anlisis es la Cromatografa Lquida de Alta

Resolucin (HPLC: High Performance Liquid Chromatography) por la sensibilidad y

especificidad que se logra.

Ciertos alimentos como el caf, t, pltanos, chocolate, cacao, frutas ctricas y vainilla

pueden aumentar las catecolaminas urinarias, por lo tanto, es preciso evitarlos por varios

das antes del examen (Adam Quality 2001).

Otras condiciones como el estrs agudo y el ejercicio vigoroso pueden tambin afectar

y por lo tanto deben considerarse cuando se analiza el resultado del examen. (Adam Quality

2001).

El examen es empleado principalmente como exploracin selectiva, diagnstico y

seguimiento del tratamiento de feocromocitoma o neuroblastoma, enfermedades en las que

est aumentada la concentracin de las catecolaminas y sus metabolitos (Adam Quality

2001).

Algunos medicamentos tambin pueden alterar los resultados del examen, por lo que

se debe consultar con el mdico sobre la necesidad de suspenderlos o en su defecto

considerar muy bien las variaciones causadas por los mismos al momento de interpretar los

resultados obtenidos (Adam Quality 2001).

sta consideracin es particularmente importante en el caso de los adultos mayores,

quienes generalmente se encuentran altamente medicados para tratar problemas como

hipertensin, depresin o hiperglicemia entre otros.

Entre las drogas que pueden disminuir los niveles de catecolaminas se encuentran

clonidina, disulfiram, guanetidina, imipramina, inhibidores de monoaminooxidasa,

fenotiacinas, salicilatos y reserpina (Adam Quality 2001).

2.6.7.1 Valores normales en el examen de excrecin urinaria

La colecta de la orina se realiza normalmente durante 24 horas, perodo en el que se

obtienen muestras representativas tanto de los estados de mayor actividad (durante el da)

como los de menor actividad (por la noche). Otros estudios ms especficos, como por

ejemplo la determinacin de la carga alosttica, utilizan la medicin de catecolaminas en

muestras de orina colectada durante 12 horas durante la noche, por representar ms

adecuadamente los niveles basales del metabolismo de estas sustancias en el cuerpo.


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Se ha encontrado una amplia variabilidad en los estudios de concentraciones normales

de catecolaminas, pero sobre todo muy diversas unidades utilizadas en los reportes. As por

ejemplo, en mediciones de catecolaminas en personas menores de 60 aos, se ha

encontrado que los valores normales de epinefrina estn por debajo de 20 "g/da, en el caso

de norepinefrina son menores de 100 #g/da y para la dopamina se esperan valores por

debajo de los 400 #g/da (Bionalytical Systems 2001, IBL online catalogue 2004).

Los estudios con adultos mayores, presentan datos que no permiten una comparacin

con los valores normales antes reportados, pues, adems de que la unidad en la que se

expresan es diferente, los reportes se basan no en valores normales, sino en criterios de

contribucin a la carga alosttica, as, cuando el dato resulta mayor o igual a cinco

microgramos de epinefrina por gramo de creatinina, o mayor o igual a 48 microgramos de

norepinefrina por gramo de creatinina, se produce un aporte para el aumento de la carga

alosttica del adulto mayor que se est evaluando (Seeman et al. 2001, Seeman et al.

2004). No se encontraron estudios semejantes en adultos mayores en donde se evalen losvalores de Dopamina.

2.7 Principio de Cromatografa de columna

Como ya se mencion en la introduccin de este trabajo, el mtodo seleccionado para

la medicin de catecolaminas es el de cromatografa lquida de alta resolucin. Los mtodos

cromatogrficos en general implican el paso de una solucin a travs de un medio (columna)

que presenta una adsorcin selectiva para los distintos componentes del soluto (Mathews y

van Holde 1999).

La columna est constituida por un material que puede adsorber molculas de modo

selectivo debido a alguna diferencia en su estructura qumica; esta columna se humedece

con una solucin tampn adecuada (fase mvil). A continuacin se coloca la mezcla de las

molculas que se van a separar en la parte superior de la columna y se hace pasar

lentamente a lo largo de esta, junto con una solucin tampn. Se toman fracciones, mientras

contina este proceso de elusin (paso a travs de la columna). Algunas clases de

molculas slo se adsorben dbilmente o no se adsorben en lo absoluto, con lo que son las

primeras en eluir. Las que se adsorben con ms intensidad, son por tanto, las ltimas en

fluir. En ocasiones debe modificarse la composicin de la solucin tampn durante la

elusin, para eliminar las molculas ms fuertemente ligadas (Mathews y van Holde 1999).

En los mtodos cromatogrficos, se le denomina fase mvil a la solucin tampn en la

que se diluye la muestra por analizar, mientras que a la matriz slida se le llama fase


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estacionaria. Es as como el movimiento relativo de cada molcula es consecuencia de su

capacidad para permanecer asociada con la fase estacionaria, mientras que contina

fluyendo la fase mvil (Mckee y Mckee 2003).

2.7.1 Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC)

La cromatografa lquida de alta resolucin, es la tcnica de separacin ms

ampliamente utilizada por su aplicabilidad en la industria y en muchos campos de la ciencia.

Su versatilidad se ve reflejada en caractersticas de gran utilidad como lo son su sensibilidad,

fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas e idoneidad para la separacin

de especies no voltiles o termolbiles (Skoog y Learly 1994).

Es una de las modificaciones ms recientes de las tcnicas de cromatografa de

columna, en la que las muestras son inyectadas, y arrastradas a altas presiones en un

aparato automatizado (2000-4000 psi), para hacer que las soluciones pasen rpidamente a

travs de la fase estacionaria. Con este mtodo, las separaciones que anteriormente

tardaban horas, en la actualidad pueden realizarse en minutos y con una resolucin ms

elevada (Mathews y van Holde 1999).

2.7.1.1 Instrumentacin para cromatografa de lquidos

A continuacin se describen de manera general los componentes fundamentales de un

cromatgrafo de alta resolucin:

Recipientes para la fase mvil y sistemas para el tratamiento de los disolventes

Los sistemas para HPLC se equipan con uno o ms recipientes de vidrio o de acero

inoxidable, cada uno de los cuales contiene aproximadamente 500ml de un disolvente. Los

recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos

(desgasificador) que permite eliminar principalmente oxgeno y nitrgeno que interfieren

formando burbujas en los sistemas de deteccin. Los sistemas tambin deben incluir un

dispositivo para la filtracin del polvo y de las partculas slidas en suspensin de los

disolventes (Skoog y Learly 1994).

Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se denomina

elusin isocrtica.

Sistemas de bombeo: Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son

rigurosos e incluyen: a) generacin de presiones por encima de 6000 psi (lbs/pulg2)- razn

por la que tambin se le llama cromatografa de alta presin-, b) un flujo libre de pulsaciones,

c) un intervalo de caudales entre 0,1 a 10 ml/min, d) que est formado por componentes


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resistentes a la corrosin. En el mercado existen tres tipos de bombas: las recprocas, las de

desplazamiento, y las neumticas, en su mayora poseen dispositivos controlados por una

computadora para medir y regular el caudal o flujo (Skoog y Learly 1994).

Sistemas de inyeccin de muestra: Para favorecer la reproducibilidad con que se

puede introducir la muestra en la columna se inyectan volmenes muy pequeos en

sistemas que emplean asas o loops que permiten introducir la muestra a presin con una

precisin relativamente alta (Skoog y Learly 1994).

Columnas analticas para cromatografa de lquidos: Se construyen normalmente con

tubos de acero inoxidable de dimetro interno uniforme. La mayora de las columnas para

cromatografa de lquidos tienen una longitud entre 10 y 30 cm, un dimetro de cuatro a

10mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son tres, cinco y 10m

(Skoog y Learly 1994). La columna es el medio que retiene diferencialmente las sustancias

por evaluar y que las separa de manera que pueda realizarse efectivamente una deteccin

posterior.

Precolumnas:Se colocan delante de las columnas para aumentar la vida til de stas,

eliminando la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes. Adems, la

precolumna se emplea para saturar la fase estacionaria con la fase mvil y as minimizar las

prdidas de sta en la columna analtica. La composicin del relleno de precolumna debe

ser semejante al de la columna analtica, sin embargo, el tamao de partcula generalmente

es mayor, para minimizar la cada de presin. (Skoog y Learly 1994).

Termostatos: Son hornos que controlan la temperatura de las columnas analticas

hasta en dcimas de grado. En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de

temperatura, sin embargo, si sta se controla, se obtienen cromatogramas mejor definidos.

Tipos de relleno de la columna: En cromatografa lquida se han utilizado dos tipos

bsicos de relleno: el pelicular y el de partcula porosa. El primero consiste en esferas de

vidrio o de polmero, no porosas, y con dimetros de 30 a 40m. En la superficie de estas

esferas se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina o de una resina de

intercambio inico; en algunos casos tambin se adiciona un recubrimiento con una fase

estacionaria lquida que se mantiene fija por adsorcin. Los de partculas porosas estn

formados por esferas con dimetros entre 3 y 10m, hechas a partir de slice, almina o

resinas de intercambio inico (Skoog y Learly 1994).

Detectores: Existen distintos tipos de detectores para cromatografa lquida segn las

necesidades o disponibilidad para el anlisis de las sustancias en cada caso. Existen

detectores que miden absorbancia, fluorescencia, ndice de refraccin, dispersin de luz, y

por espectometra de masas (Skoog y Learly 1994). Tambin hay detectores


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electroqumicos como el que se utiliz para la medicin de catecolaminas en el Programa de

Investigacin en Neurociencias.

Detectores electroqumicos: Estos dispositivos se basan en cuatro mtodos

electroanalticos que incluyen la amperometra, la voltamperometra, la coulombimetra y la

conductimetra. Los procedimientos electroqumicos de deteccin ofrecen ventajas por su

elevada sensibilidad, simplicidad, adecuacin y extensa aplicabilidad. Los cromatgrafos con

deteccin electroqumica funcionan con dos electrodos, uno de ellos es el de referencia y el

otro es el de trabajo. El electrodo de trabajo es de platino, oro, carbono vitrificado o de pasta

de carbono y es donde se llevan a cabo las oxidaciones o reducciones de las sustancias por

evaluar. El electrodo de referencia se coloca ms adelante en el canal de flujo, por detrs del

bloque del electrodo de trabajo y con base en l se mide la diferencia de potencial que

existe, as como la intensidad de la seal que emite cada sustancia (oxidada o reducida),

seal que adems se amplifica para lograr su deteccin por los aparatos de medicin

internos. El efluente de la columna pasa primero por el electrodo de trabajo, donde sufre unproceso de reduccin (u oxidacin); a continuacin, el segundo electrodo acta como ctodo

(o nodo) para detectar de sta manera el producto de la oxidacin (o reduccin) que ha

sufrido la sustancia en anlisis (Skoog y Learly 1994).

2.8 Bases tericas de la deteccin electroqumica

La deteccin electroqumica difiere de otros mtodos de deteccin en que los analitos

experimentan una reaccin electroqumica mientras estn siendo analizados. Mientras se

lleva a cabo la elusin a travs de la columna, el analito pasa a travs de la celda

electroqumica, donde experimenta tambin una oxidacin o reduccin en el electrodo de

trabajo.

El controlador (potenciostato) mantiene el potencial del electrodo de trabajo en un valor

en el que causa la electrlisis del analito (el valor est dado en relacin con el electrodo de

referencia). Simultneamente mide la corriente de electrlisis resultante de la oxidacin (o

reduccin) del analito (Waters 1991).

Si el potencial es mayor (ms positivo para las oxidaciones o ms negativo para las

reducciones) que lo requerido para la electrlisis de los analitos, una carga medible pasa

desde el electrodo hacia el analito o viceversa, y la corriente resultante es directamente

proporcional a la concentracin del soluto que est pasando a travs del canal de flujo, esta

corriente ser subsecuentemente convertida a voltaje de modo que es posible obtener los

cromatogramas (BAS 1983).


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2.9 Principio de extraccin en fase slida

La extraccin en fase slida es un mtodo que se utiliza para el pretratamiento de las

muestras antes de ser analizadas, y que por sus caractersticas permite su uso en distintas

aplicaciones como anlisis ambientales y farmacuticos, anlisis bioqumicos, de qumica

orgnica, anlisis de alimentos y HPLC entre otros (Macherey-Nagel 2000).El proceso de extraccin en fase slida presenta algunas ventajas sobre los mtodos

de extraccin lquido-lquido, como lo son:

Bajo consumo de solventes.

Disminuye el tiempo del proceso y tiene un alto potencial de automatizacin.

La preparacin de las muestras utilizando extraccin en fase slida puede ser ms

especfica, pues pueden promoverse tantas y tan diferentes interacciones del analito

con la fase slida como sea necesario.

Las condiciones de la extraccin pueden ser optimizadas de manera que se ajusten

al proceso y condiciones de la tcnica de cromatografa con la que se cuente.

El proceso de extraccin en fase slida ofrece amplia variedad de columnas

absorbentes para interacciones polar hidrofbico y/o inicas, mientras que la

extraccin lquido-lquido est limitada por el equilibrio de particin de la fase lquida

(Thermo Electron Corporation 2004-2005).

Los principales objetivos del proceso de extraccin en fase slida son:

Remover de la matriz los compuestos de interferencia.

Concentrar y aislar selectivamente el analito de inters.

Cambiar la matriz del analito, de manera que pueda llevarse a cabo con xito el

anlisis posterior (Thermo Electron Corporation 2004-2005).

El analito puede ser absorbido en el material de la columna de extraccin o fluir

directamente a travs de sta, mientras que las sustancias de interferencia son retenidas.

(figura siete). Antes de adicionar la muestra se realiza generalmente un acondicionamiento

de la columna con un lquido que humedece la columna pero que no se adhiere a ella por

sus caractersticas qumicas.

Los dos procesos generales de separacin se muestran en la figura siete.

En el primer caso la muestra se hace pasar a travs de la columna de extraccin. Las

molculas del analito son absorbidas, mientras que los compuestos de interferencia son

lavados con una solucin que permite solubilizarlos. Finalmente el analito es removido de la


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columna con un eluyente que permite arrastrarlo para su anlisis (figura siete-A) (Macherey-

Nagel 2000).

Figura 7.Mecanismos mediante los que se logra la elusin de los compuestos en el proceso de

extraccin en fase slida. A. Las molculas del analito son adsorbidas primero. B. El

analito eluye antes que los compuestos de interferencia. Tomado de (Macherey-Nagel

2000).

En otros casos, los compuestos de interferencia quedan fuertemente atrapados en elabsorbente, ofreciendo la posibilidad de una prepurificacin de matrices dificultosas. Este

procedimiento se muestra en la figura siete-B (Macherey-Nagel 2000).

2.9.1 Interacciones moleculares en la extraccin en fase slida

2.9.1.1 Interacciones no polares

Ocurre entre los residuos de hidrocarbonos de los grupos funcionales en la columna

de absorcin, y el analito. Mientras ms compuestos orgnicos tengan una estructura no

polar, pueden ser mejor absorbidos con columnas no polares gracias a las fuerzas de van

der Waals que se establecen entre ellos.

Casi todos los compuestos orgnicos tienen algn potencial de interaccin no polar.

Las excepciones son compuestos que poseen un amplio nmero de grupos polares o

inicos.

ElusinElusin

Lavado

AcondicionamientoAcondicionamiento

Aplicacin de

la muestra Aplicacin de

la muestra

Compuestos de interferencia

AnalitoAB


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Las tpicas columnas con carcter no polar son por ejemplo las slicas C18ec, C18,

C18 Hydra y C18 modificada. Estas columnas muestran una baja selectividad pues sus

grupos funcionales, sustituyentes alquil, pueden interactuar con casi todos los analitos no

polares y pueden ser usadas para el aislamiento de grupos de sustancias de diferente

estructura. En este tipo de columna el acondicionamiento se lleva a cabo con solventes

miscibles en agua (metanol, isopropanol, etc), seguido por el solvente en el cual el analito

estar disuelto (Thermo Hypersil-Keystone 2002).

2.9.1.2 Interacciones polares

Incluyen interacciones de los puentes de hidrgeno, dipolo-dipolo y !-!, las cuales

pueden ocurrir entre las columnas y los grupos funcionales de muchas y muy diferentes

sustancias y solventes. Algunas de estas interacciones se dan con grupos amino, hidroxilo y

carbonilo, incluso con anillos aromticos y dobles enlaces. Los tpicos absorbentes polares

incluyen slica modificada con los siguientes grupos funcionales: CN, NH2 y OH (diol),

aunque tambin presentan slica no modificada.

En general, los compuestos polares son fcilmente absorbidos por una columna polar

en un ambiente no polar, y son eluidas con solventes polares.

Las columnas polares se acondicionan con solventes no polares (Termo Hypersil-

Keystone 2002).

En el estudio que se realiz, se emplearon las tcnicas de extraccin en fase slida y

cromatografa lquida de alta resolucin con deteccin electroqumica para la medicin de

catecolaminas (epinefrina y norepinefrina) en orina de adultos mayores.

El protocolo para su cuantificacin se estandariz y valid despus de realizar las

pruebas que se describen en el siguiente apartado.


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3. MATERIALES Y MTODOS

Las evaluaciones analticas correspondientes al Trabajo Final de Graduacin se

llevaron a cabo en los laboratorios del Programa de Investigacin en Neurociencias, en la

Universidad de Costa Rica, San Pedro de Montes de Oca.

La definicin del protocolo para la medicin de catecolaminas en orina comprende laestandarizacin de tres procesos: la colecta de la muestra, el anlisis, y el manejo y

manipulacin de la misma.

A continuacin se describe la metodologa mediante la que se logr la validacin de los

protocolos que se emplearn en lo sucesivo en el Programa de Investigacin en

Neurociencias, para el anlisis de catecolaminas de las muestras del Proyecto CRELES.

3.1 Colecta

Para determinar el procedimiento a seguir en la colecta de las muestras, se realiz una

revisin bibliogrfica exhaustiva, utilizando como base otros estudios que han evaluado

carga alosttica en adultos mayores (Ming-Cheng et al. 2000, Seeman et al.2001, Seeman

et al. 2004). Con base en esos estudios, otras referencias de anlisis y la disponibilidad de

materiales en el pas, se hicieron algunas adaptaciones al nuevo mtodo de trabajo.

3.1.1 Determinacin del refrigerante

La literatura seala que una posible forma de preservar la muestra de orina es la

utilizacin de un refrigerante que mantenga la muestra a una temperatura igual o menor a

cuatro grados Celsius durante el periodo de colecta. En el caso del proyecto CRELES este

periodo es de 12 horas, y a eso se le suma el tiempo desde que se entrega el recipiente,

hasta que este se recoge el da siguiente. En total el tiempo que se requiere el refrigerante

para mantener la muestra preservada es de aproximadamente 24 horas. Por esta razn se

realiz una prueba de durabilidad de dos refrigerantes que estaban disponibles para la

compra (hielo seco y en gel) y se evalu su idoneidad de acuerdo con los requerimientos del

mantenimiento de las muestras en el proyecto CRELES.

Para ello se realiz un ensayo con dos recipientes de plstico con capacidad para 1920

ml (TX-1/2G, Proplax) colocados dentro de un material aislante del calor, y en el que se

encontraba tambin el refrigerante a evaluar en cada caso.


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El hielo en gel estaba empacado en bolsas de diferentes tamaos pertenecientes a

distintas casas comerciales extranjeras (Cold Pack, Glaciar Ice, Cold Ice, Re-Freez-R-Brix);

las bolsas cubran en su totalidad la superficie del recipiente de plstico, tal y como se

observa en la figura ocho. El hielo seco empleado, era un bloque de tres kilogramos que se

coloc junto a la botella y se adquiri en la empresa Florida Bebidas.

A cada botella de plstico se le adicionaron 250ml de agua a 37C cada cuatro horas

aproximadamente, para simular la adicin de orina en condiciones normales de colecta de

muestra. El agua se calent en horno microondas durante 30 segundos y se regul hasta

obtener la temperatura deseada, utilizando agua fra. La medicin se realiz con un

termmetro VWR Scientific (cat No. 61010-020) con una escala entre -20C y 110C.

Se midi la temperatura ambiente y de la muestra cada hora, durante 12 horas; en la

medicin de la muestra se introdujo el termmetro durante 10 segundos y se elev luego a la

altura de los ojos para determinar la marca del mercurio.

A continuacin se hicieron observaciones cada tres horas para determinar el tiempo enel que cada refrigerante se descongelaba por completo.

Para determinar si existan diferencias entre las propiedades de las marcas de hielo gel

extranjeras y nacionales, que influyeran en las condiciones de colecta durante el proyecto

CRELES, se evaluaron las caractersticas de una marca de hielo gel que facilit un

proveedor nacional (Ice Pack) comparando este con las caractersticas del hielo gel de

algunas de las marcas que se importan al pas (Cold Pack, Glaciar Ice, Cold Ice, Re-Freez-

R-Brix).

En este caso se emplearon tambin los recipientes de plstico de Proplax (TX-1/2G)que se colocaron dentro de hieleras de estereofn cilndricas de 20,5cm de altura y 21,5cm

de dimetro (Termopor). Las botellas se cubrieron en su totalidad por las bolsas congeladas

de hielo gel de las marcas a evaluar y hasta completar la capacidad de las hieleras de

estereofn, tal y como se observa en la figura ocho:

Figura 8. Diagrama del ensamblaje del recipiente para la colecta de las muestras de orina del

proyecto CRELES.

Botellade

plstico

Hielera deestereofnHielo

gel

Vista

interior


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Se realizaron observaciones cada tres horas durante 24 horas, para monitorear el

comportamiento del hielo gel de las diferentes marcas. Al igual que en el ensayo anterior, se

adicionaron 250ml de agua a 37C, simulando la colecta de orina.

3.1.2 Determinacin del preservante

Puesto que en estudios previos que otros autores han realizado se han encontrado

diferencias en relacin con el preservante utilizado, se llevaron a cabo algunas pruebas para

determinar si se utilizara algn refrigerante, si se empleara cido clorhdrico 6N, ambos o

ninguno de estos preservantes para el mantenimiento de la muestra durante la colecta.

Se evalu la orina de cuatro individuos voluntarios (todos mayores de 60 aos, dos de

ellos varones). Los voluntarios recogieron su orina por la noche durante 12 horas (de 6 de la

tarde a 6 de la maana). La colecta se realiz con las mismas personas en cuatro das

distintos, pero con diferentes condiciones de preservacin:

Cuadro 1. Condiciones de preservacin de las muestras por evaluar

Condicin de la colecta

Sin refrigeracin sin cido

Sin refrigeracin con cido

Refrigerada sin cido

Refrigerada con cido

Las muestras refrigeradas durante la colecta, se recogieron en una botella plstica

cubierta con bolsas de hielo gel, que se introdujo en una hielera de estereofn. Las muestras

que se colectaron con cido, tenan 15 ml de HCl 6N dentro de la botella, previo a la colecta

(segn BAS 2001).

Los recipientes se entregaron debidamente etiquetados en cada uno de los das de

evaluacin, y las muestras fueron recogidas por los tcnicos la maana siguiente de cada

da de colecta.Aquellas muestras que fueron colectadas sin cido, se separaron y trataron

diferencialmente previo a su almacenamiento. La mitad del volumen de cada muestra se

conserv sin el cido, y a la otra mitad se le adicion HCl 6N, hasta alcanzar pH 2.

Se almacenaron en el congelador de -20C hasta que se tuvo estandarizado y validado

el mtodo de anlisis (segn se describir en el siguiente apartado). Algunas rplicas de


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esas muestras, se colocaron en refrigeracin (aproximadamente cuatro grados Celsius) con

el objetivo de evaluar la estabilidad de las catecolaminas segn la condicin de

almacenamiento.

Para analizar si hubo variacin entre los tratamientos de colecta, se llev a cabo un

anlisis de varianza (SPSS 8.0). Tambin se aplic ANOVA para determinar variaciones

entre las muestras almacenadas en el congelador y las que se mantuvieron en refrigerac

estandariz de un protocolo

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