estabilidade de espécies de arsênio em amostras biológicas...
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CARLOS ALFREDO SUÁREZ
Estabilidade de espécies de arsênio em amostras
biológicas acoplando cromatografia líquida ou eletroforese
capilar com detectores atômicos
Tese apresentada ao Centro de Energia
Nuclear na Agricultura, da Universidade de
São Paulo, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor em Ciências
Área de Concentração: Química na Agricultura
e no Ambiente
Orientadora: Profa. Dra. Maria Fernanda G.
Giné Rosias
Piracicaba
2010
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AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Seção Técnica de Biblioteca - CENA/USP
Suárez, Carlos Alfredo
Estabilidade de espécies de arsênio em amostras biológicas acoplando cromatografia líquida ou eletroforese capilar com detectores atômicos / Carlos Alfredo Suárez; orientadora Maria Fernanda G. G. Rosias. - - Piracicaba, 2010.
147p.: fig.
Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Ciências. Área de Concentração: Química na Agricultura e no Ambiente) – Centro de Energia Nuclear na Agricultura da Universidade de São Paulo.
1. Compostos organometálicos 2. Cromatografia líquida de alta eficiência
3. Cromatografia por troca iônica 4. Eletroforese capilar de zona 5. Espectrometria de massas I. Título
CDU 564.19:543.05
A minha filha, Ana, fonte de toda inspiração e alegria,
porque já não consigo imaginar a vida sem você.....
A minha esposa, Lorena, amiga e companheira,
por estar ao meu lado, e não desistir de mim.......
Aos meus pais Alfredo e Margarita e meus irmãos Marcelo,
Gustavo e Celeste,
Pela educação, carinho e amizade, por estarem sempre apesar das
distâncias.....
DEDICO.
A minha esposa Lorena e minha filha Ana pela paciência,
À professora Maria Fernanda, pela oportunidade oferecida, pelos ensinamentos e amizade,
Ao Centro de Energia Nuclear na Agricultura pela oportunidade de realizar meu doutorado,
Ao CNPq pela bolsa e pelo apoio financeiro,
Aos meus sogros Nidia e Guile, por considerarme realmente parte de sua família,
A minha cunhada Guadalupe, pela amizade e alegria de viver contagiante,
À Fátima e Sheila pela inestimável ajuda e disponibilidade durante estes longos anos de
pesquisa,
Ao professor Boaventura pelos ensinamentos em eletrônica e pelo espaço em sua oficina,
À Mário e Marcelo pela amizade, paciência e disposição para a montagem dos diversos
circuitos eletrônicos utilizados durante esta pesquisa,
Ao Professor José Ferreira, pela sessão do espaço para trabalhar com seus equipamentos,
A Gabriel e Zé Paulo pela ajuda com as análises no final deste doutorado,
Aos professores Chico e Zagatto, e aos técnicos Tatinha e Valdemir pelo convívio armonioso,
Ao professores Jorge Sarkis e Marco Aurélio Arruda pelo espaço gentilmente cedido em seus
laboratórios, a Mauricio e Marcelo pela ajuda e assessoramentos dentro dos mesmos,
A todos os colegas e amigos da sessão de Química Analítica, pelos bons momentos de
descontração e diversão.
Aos funcionários da Pós-Graduação e da Biblioteca do CENA-USP, pelo suporte técnico
oferecido sempre com boa disposição e amabilidade,
Agradeço
RESUMO
SUÁREZ, C. A. Estabilidade de espécies de arsênio em amostras biológicas
acoplando cromatografia líquida ou eletroforese capilar com detectores
atômicos. 2010. 147 p. Tese (Doutorado) - Centro de Energia Nuclear na
Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2010.
Neste projeto foram abordados procedimentos analíticos para extração, separação e
identificação de espécies de arsênio encontradas normalmente em quantidades de
traços e ultra-traços em amostras biológicas e ambientais. Entre as amostras alvo
deste estudo, teve-se alimentos de origem marinha como por exemplo camarão. Foi
avaliada a estabilidade das espécies de arsênio nas soluções geradas pelos
processos de extração. Para separação das espécies inorgânicas (arsenito e
arsenato), metiladas (ácidos mono e dimetil arsênio) e orgânicas (arsenobetaina)
empregaram-se as técnicas eletroforese capilar (CE) e cromatografia líquida (LC).
Os sistemas de separação para a determinação das espécies de arsênio foram
acoplados com os espectrômetros massas (ICP-MS), e de fluorescência atômica
(AFS). Os sistemas acoplados apresentaram resolução e sensibilidade na
determinação das espécies de arsênio nas amostras estudadas neste trabalho. A
extração com água de espécies de As utilizando-se banho de ultra-som apresentou
eficiência acima de 78%. A estabilidade das espécies nas soluções padrão e nos
extratos das amostras foi mantida por um período de até uma semana quando
armazenadas em geladeira (+4°C). Visando uma política de química limpa, foi
desenvolvida uma metodologia para evitar desperdiço preparando micro-volumes de
amostras e soluções padrão, para especiação de arsênio por eletroforese capilar.
Para tal se empregou um injetor seqüencial, também foi desenvolvido um dispositivo
de injeção hidrodinâmica para eletroforese capilar. Além disto, as soluções residuais
geradas durante a pesquisa analítica foram tratadas para a recuperação de arsênio
e boro. A extração no ponto nuvem foi empregada para recuperar As entanto que a
precipitação por mineralização hidrotérmica foi aplicada para a recuperação de B . A
aplicação deste procedimento resultou na extração de 80% de arsênio e 75% de
boro. Isto, permitiu converter grandes volumes de resíduos líquidos perigosos em um
pequeno volume de resíduos sólidos.
Palavras-chave: Especiação de arsênio. Extração por ultra-som. Eletroforese
capilar. Cromatografia líquida. Espectrometria de massas com fonte de plasma.
Espectrometria de fluorescência atômica.
ABSTRACT
SUÁREZ, C. A. Stability of arsenic species in biological samples by coupling
liquid chromatography or capillary electrophoresis with atomic detectors. 2010.
147 p. Tese (Doutorado) - Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade
de São Paulo, Piracicaba, 2010.
Analytical procedures for extraction, separation and identification of arsenic species
at ultra-trace levels in biological and environmental samples were investigated.
Stability studies of arsenic species in sample extracts and standard solutions were
carried out. Separation of arsenite, arsenate, monomethylarsonic and dimethylarsinic
acids and also arsenobetaine were carried out by capillary electrophoresis or liquid
chromatography. Determination of the separated arsenic species was accomplished
by coupling the separation techniques to inductively coupled plasma mass
spectrometry (ICP-MS) or atomic fluorescence spectrometry (AFS). Satisfactory
resolution and sensibility were achieved by the coupled systems described.
Extraction efficiency better than78% were achieved with water in an ultrasonic bath at
the laboratory temperature (23-27°C). Whereas, stability of species in solutions
stored in refrigerator at +4°C was efficient for aperiod up to one week. Micro-volumes
of standards and sample solutions mixed in a sequential injector were prepared for
arsenic speciation by capillary electrophoresis, aiming green chemistry. A time
controlled micro-volume injector device for hydrodinamic injections was also
developed. Finally, waste solutions from arsenic speciation analysis in a system with
hydride generation were treated for arsenic and boron removal. Cloud point
extraction for recovery of arsenic and hydrothermal mineralization of boron by
calcium hydroxide were employed. Satisfactory removal of 80% of arsenic and 75%
of boron from waste solution was achieved. These procedures allowed to reduce
volumes of hazardous waste solutions.
Keywords: Arsenic speciation. Ultra sound extraction. Capillary electrophoresis.
Liquid chromatography. Inductively coupled plasma mass spectrometry. Atomic
fluorescence spectrometry.
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 – Eficiência do método de extração por ultra-som empregando somente água como solvente, por comparação do teor total de arsênio nas soluções dos extratos e do material digerido. Validação do método utilizando Material Certificado de Referência Dorm-2. ........................................................................... 37
Figura 2.2 – Estabilidade das espécies de arsênio durante o procedimento de extração em banho de ultra-som a intervalos de 15, 30 e 60 minutos. Os desvios para arsenito, arsenato, monometilarsênio e dimetilarsênio foram de 0,96; 0,99; 1,17 e 0,59 respectivamente. ........................................................................................... 38
Figura 2.3 – Cromatograma do extrato de uma amostra de camarão adicionada com arsenito, arsenato, monometilarsênio e dimetilarsênio, extraídos em banho de ultra-som durante uma hora com a mistura 20:80 metanol-água. ............................ 39
Figura 2.4 – Estabilidade das espécies em solução. Degradação das espécies em soluções padrão armazenadas ema geladeira. Línea pontilhada = solução preparada no dia. Linea sólida = cromatograma após 3 semanas. .......................... 41
Figura 3.1 - Sistema de eletroforese capilar. Foto do sistema de eletroforese capilar projetado no Laboratório de Química Analitica do CENA. 1. Base, 2. Hastes, 3. Vareta, 4. Injetor, 5. Unidade controladora de gás, 6. Válvulas solenóide, 7. Circuito eletrônico, 8. Detector UV/Visível, 9. Recipiente coletor, 10. Fonte de alta voltagem. ........................................................................................................... 57
Figura 3.2 - Circuito eletrônico temporizador. Esquema do circuito eletrônico desenvolvido para controle automático do tempo de injeção de amostras no injetor hidrodinâmico. V1 e V2 = válvulas solenóides de três vias; PBS = botão de pulso (trigger); Tr = transistor BC547; D1, D2 e D3 = diodos 1N4007; S = Botao de liga e desliga. O circuito eletrônico contendo um circuito integrado temporizador, 555 IC, atua como controlador dos tempos de acionamento de V1 e V2. (Desenvolvido por Sivanildo S. Borges (PQ). ............................................ 58
Figura 3.3 – Influência do pH e da ddp aplicada. Variação da corrente elétrica observada com relação aos diferentes pH da solução eletrolítica e à voltagem aplicada .................................................................................................................... 60
Figura 3.4 – Interface CE-ICP. Interface para o acoplamento da eletroforese capilar com espectrômetros de massas o de emissão ótica com fonte de plasma (CE-ICP). a y b mostram duas posições distintas do extremo do capilar no interior do canal de amostragem do nebulizador. ...................................................................... 64
Figura 3.5 – Câmara de separação de fases. Interface para o acoplamento de sistemas de eletroforese capilar ou cromatografia líquida projetado e confeccionado no laboratório de Química Analítica do CENA/USP ...................................................... 69
Figura 3.6 – Eletroferograma de um extrato de camarão seco, extraído em banho de ultra-som empregando-se água como solvente. Se observa o pico correspondente à arsenobetaina além de outros três picos não identificados (?). ... 71
Figura 3.7 - Separação de espécies de arsênio em amostra de camarão extraída por ultra-som com água como solvente. Adição de As5+, MMA, DMA e As3+, em
concentração 100 g/L cada expressados como molécula. (As5+: 52,6 %As; MMA: 53,5% As; DMA: 54,3% As; As3+: 59,5% As). ................................................ 72
Figura 3.8 – Eletroferograma de quatro espécies de arsênio separadas por eletroforese capilar com geração de hidretos na interface e detecção por espectrometria de massas com fonte de plasma. CE-HG-ICP-MS. ....................................................... 73
Figura 3.9 – Eletroferograma de espécies de arsênio em uma amostra de urina contaminada, empregando eletroforese capilar com geração de hidretos na interface com detecção por ICP-SFMS. ................................................................... 74
Figura 4.1 – Esquema do sistema LC-HG-AFS montado no laboratório, A e B são os tampões empregados; V= válvula solenóide, BP= bomba Peristáltica, GL= Câmara de separação gás/Líquido e AFS o detector de fluorescência atômica. ..... 83
Figura 4.2 – Cromatograma de quatro espécies de arsênio, em diferentes concentrações, quando empregada uma vazão da bomba cromatográfica igual a 1,5 mL/min. ............................................................................................................ 93
Figura 4.3 – Sensibilidade do detector de fluorescência atômica. Cromatograma de uma
solução padrão de As3+ em concentração 10 g/L indicando a variação na relação sinal ruído com as diferentes combinações de sensibilidade do detector
empregadas, utilizando alça de amostragem de 100 L. ......................................... 94 Figura 4.4 - Triplicata da separação de quatro espécies de arsênio, As3+, DMA, MMA e
As5+ pelo sistema acoplado LC-HG-AFS, empregando as condições de trabalho apresentadas na Tabela 4.1. .................................................................................... 95
Figura 5.1 - Peça em formato T para o acoplamento CE-ICP-MS. Observa-se nesta figura a passagem do capilar através dela, além da inserção perpendicular ao capilar para a platina e o tubo para bombeamento da solução auxiliar ................. 107
Figura 5.2 - Representação esquemática do sistema SIA, com uma bomba de seringa de 500 µL e uma bobina para mistura das soluções também de 500 µL e o recipiente para a posterior injeção hidrodinâmica de 200 µL. ................................ 108
Figura 5.3 - Esquema do injetor hidrodinâmico construído em acrílico, onde CE é o capilar eletroforético, S um septo que permite fixar o capilar impedindo vazamentos no sistema, SV é o recipiente de 200 mL e Pt o eletrodo de platina. À esquerda da figura se apresenta o sistema controlado eletronicamente para a injeção temporizada onde V1 e V2 são as válvulas solenóide conectadas em linha, EI o circuito eletrônico, GU o controlador de pressão do gás e Ar o cilindro de argônio. ................................................................................................. 110
FIGURA 5.4 - Eletroferograma de uma amostra de urina liofilizada contendo arsenito (As3+), arsenato (As5+), ácido monometilarsônico (MMA) e ácido dimetilarsínico (DMA). 200 µg/L de As5+ e DMA foram adicionados à amostra. ............................ 117
Figura 5.5 - Eletroferograma de um extrato de camarão pelo sistema CE-ICP-MS detectado na razão m/z= 75. De esquerda para a direita os picos correspondem à arsenobetaina e ao arsenato (As5+) adicionado respectivamente. .................................................................................................... 118
Figura 6.1 - Percentagens de arsênio extraído das soluções laboratoriais de descarte mediante extração no ponto nuvem empregando diferentes concentrações do complexante utilizado. ............................................................................................ 130
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 – Espécies de arsênio encontradas no meio ambiente (Gong, Lu et al.,
2002). ........................................................................................................................ 22 Tabela 3.1 – Pka’s de espécies de arsênio. Apresentam-se os pka’s conhecidos das
espécies de arsênio em sistemas biológicos e ambientais Adaptado de (Larsen, 1998; Le, Lu et al., 2004; Sun, Macka et al., 2004; Wu e Ho, 2004; Kitagawa, Shiomi et al., 2006; Jaafar, Irwan et al., 2007). *R corresponde às diferentes estruturas de açúcares ligados ao arsênio. .............................................................. 52
Tabela 3.2 – Recopilação de trabalhos que empregaram eletroforese capilar para a separação de espécies de arsênio, se indica nesta tabela o tipo e pH do tampão empregado, modificador de fluxo, caso utilizado, voltagem aplicada, tempo de análise e espécies separadas(*) indicando a ordem de aparecimento das espécies nos respectivos eletroferogramas. ...................................................... 54
Tabela 3.3 – Condições operacionais do acoplamento CE-ICP-MS para a obtenção dos eletroferogramas apresentados nas Figuras 3.6 e 3.7 respectivamente. ................. 65
Tabela 3.4 – Parâmetros empregados para o acoplamento CE-HG-ICP-SFMS para separação das espécies de arsênio em amostras de urina e camarão.................... 70
Tabela 4.1 – Parâmetros de operação do sistema acoplado LC-HG-AFS. ........................... 96 Tabela 4.2 – Tempos de retenção de cada espécie de arsênio estudada quando
empregada uma vazão constante de 1 mL/min. ....................................................... 97 Tabela 5.1 - Parâmetros operacionais para as condições de trabalho empregando o
acoplamento CE-ICP-MS. ...................................................................................... 112 Tabela 5.2 - Volumes em nL injetados no capilar empregando as diversas combinações
de pressão aplicada e tempo de injeção. (n=3) ...................................................... 114 Tabela 5.3 - Tempos de migração e áreas dos picos calculados após 5 injecoes,
detectadas a 185 nm .............................................................................................. 115 Tabela 6.1 - Resultados da % extraída do arsênio presente nas soluções de descarte
originais e nos precipitados obtidos após o tratamento pelo método de extração no ponto nuvem. (n=3) ............................................................................................ 131
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 12
2 Preparação de Amostras para Análise de Espécies .......................................... 17
Resumo ................................................................................................................ 18
Abstract ................................................................................................................ 19
2.1 Introdução ...................................................................................................... 20
2.2 Métodos de extração ..................................................................................... 23
2.2.1 Extração enzimática ................................................................................... 25
2.2.2 Extração por microondas .......................................................................... 27
2.2.3 Extração por ultra-som .............................................................................. 28
2.3 Procedimentos de preservação das espécies de As em solução ............. 30
2.4 Material e Métodos ........................................................................................ 32
2.4.1 Reagentes, soluções e equipamentos. ..................................................... 32
2.4.2 Procedimentos de extração ....................................................................... 33
2.4.3 Conservação das amostras e dos extratos .............................................. 35
2.5 Resultados e Discussão ............................................................................... 36
2.5.1 Eficiência do método de extração ............................................................ 36
2.5.2 Interconversão de espécies ...................................................................... 37
2.5.3 Interferências nas análises dos extratos ................................................. 38
2.5.4 Estabilidade das espécies em solução e dos extratos ........................... 40
2.5.5 Espécies tóxicas na decomposição natural da amostra de camarão ....................................................................................................... 42
2.6 Conclusões .................................................................................................... 42
3 Especiação de As por Eletroforese Capilar Acoplada a Espectrometria de Massas com Fonte de Plasma ........................................................................ 44
Resumo ................................................................................................................ 45
Abstract ................................................................................................................ 46
3.1 Introdução ...................................................................................................... 47
3.2 Material e Métodos ........................................................................................ 49
3.2.1 Reagentes, soluções e equipamentos ...................................................... 49
3.3 Desenvolvimento Experimental ................................................................... 51
3.3.1 Sistema de eletroforese capilar ................................................................ 56
3.3.2 Efeito da variação do pH e da ddp aplicada em eletroforese capilar .......................................................................................................... 59
3.3.4 Acoplamento do sistema de eletroforese capilar com ICP-MS .............. 61
3.3.5 Acoplamento da eletroforese capilar com o ICP-MS e geração de hidretos na interface ............................................................................. 66
3.4 Resultados e Discussão ............................................................................... 70
3.4.1 Determinação de espécies de arsênio pelo sistema acoplado CE-ICP-MS ................................................................................................... 70
3.4.2 Determinação de espécies de arsênio pelo sistema acoplado CE-HG-ICP-MS ............................................................................................. 73
3.5 Conclusões .................................................................................................... 75
4 Especiação de As por Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de Fluorescência Atômica ............................................................................... 76
Resumo ................................................................................................................ 77
Abstract ................................................................................................................ 78
4.1 Introdução ...................................................................................................... 79
4.2 Material e Métodos ........................................................................................ 81
4.2.1 Reagentes, soluções e equipamentos ...................................................... 81
4.2.2 Sistema LC-HG-AFS ................................................................................... 82
4.2.3 Volatilização das espécies de arsênio ...................................................... 83
4.2.4 Espectrometria de Fluorescência Atômica .............................................. 86
4.2.5 Acoplamento da coluna de cromatografia líquida com o Espectrômetro de Fluorescência Atômica ............................................... 88
4.3 Resultados e Discussão ............................................................................... 90
4.3.1 Efeito das vazões de hidrogênio e argônio .............................................. 90
4.3.2 Efeito da vazão dos reagentes inseridos pós-coluna ............................. 91
4.3.3 Efeito das combinações de ajuste da sensibilidade do detector ........................................................................................................ 93
4.4 Conclusões .................................................................................................... 97
5 Minimização dos Resíduos Gerados Durante a Pesquisa ................................. 99
Resumo .............................................................................................................. 100
Abstract .............................................................................................................. 101
5.1 Introdução .................................................................................................... 102
5.2 Material e Métodos ...................................................................................... 105
5.2.1 Sistema de Injeção Seqüencial ............................................................... 105
5.2.2 Injeção Hidrodinâmica ............................................................................. 105
5.2.3 Interface CE-ICP-MS ................................................................................. 106
5.3 Procedimento Experimental ....................................................................... 107
5.3.1 Injeção Seqüencial para preparo das soluções padrão ........................ 108
5.3.2 Introdução de amostras no CE ............................................................... 109
5.3.3 Separação das espécies e recondicionamento do capilar ................... 111
5.3.4 Otimização dos parâmetros na interface CE-ICP-MS ............................ 112
5.4 Resultados e Discussão ............................................................................. 113
5.5 Conclusões .................................................................................................. 118
6 Recuperação dos Resíduos Gerados Durante a Pesquisa .............................. 120
Resumo .............................................................................................................. 121
Abstract .............................................................................................................. 122
6.1 Introdução .................................................................................................... 123
6.2 Material e Métodos ...................................................................................... 125
6.2.1 Reagentes e soluções .............................................................................. 125
6.2.2 Equipamentos ........................................................................................... 126
6.2.3 Recuperação de arsênio .......................................................................... 126
6.2.4 Recuperação de boro ............................................................................... 128
6.3 Resultados e Discussão ............................................................................. 130
6.3.1 Extração de arsênio ................................................................................. 130
6.3.2 Extração de boro ...................................................................................... 131
6.4 Conclusões .................................................................................................. 132
REFERÊNCIAS ................................................................................................... 134
12
1 INTRODUÇÃO
No meio ambiente, os elementos traço apresentam normalmente
comportamentos diferentes aos esperados em função das propriedades químicas do
elemento em questão. A obtenção de informações sobre a espécie encontrada em
determinadas condições se torna um pré-requisito fundamental para uma melhor
compreensão de sua distribuição, atividade biológica, e das interações com o meio
ambiente.
O arsênio apresenta uma biogeoquímica oceânica complexa, cujo estudo e
compreensão são importantes uma vez que se refletem na toxicidade de organismos
marinhos. A concentração de arsênio em águas oceânicas é aproximadamente de
1,7 g/L, sendo o arsenato (As5+) a forma predominante. O arsenito (As3+), a forma
mais tóxica e potencialmente carcinogênica, raramente se apresenta em
concentrações maiores do que o 20% do arsênio total (NEFF, 1997). A toxicidade do
arsênio depende de sua forma química e de seu estado de oxidação, os quais
apresentam diversos efeitos biológicos e toxicológicos nos seres vivos. Além das
formas inorgânicas como arsenito e arsenato, encontram-se nos organismos vivos,
compostos organometálicos como ácido monometil e dimetil arsênio (MMAA e
DMAA), óxido de trimetilarsina (TMAO), arsenobetaina (AsB), íon tetrametilarsênio
(TMA+ ou TETRA), arsenoaçúcares e arsenolipídeos (PHILLIPS, 1990).
Alimentos de origem marinha, tais como algas, mexilhões, ostras e moluscos
possuem principalmente arsenobetaina, arsenocolina (AsC) e arsenoaçúcares.
Considerando que a maior parte do As ingerido pelo homem provêm de alimentos de
origem marinha diversos estudos tem sido feitos sobre a degradação das formas
orgânicas de As. Entretanto, tem sido verificadoa que a arsenobetaina se elimina
13
rapidamente na urina sem aparentes modificações metabólicas. Portanto, existe a
percepção de que todas as espécies organoarseniacais de alimentos de origem
marinho sejam excretados sem alterações, sem provocar efeitos indesejáveis à
saúde humana (LE et al., 2004). Por conseguinte, arsenobetaina parece não ser
acumulada nem mesmo metabolizada no organismo de seres humanos. Entretanto,
uma publicação muito recente, (NEWCOMBE et al., 2010), a partir de resultados da
análise de urina de cinco voluntários submetidos a uma dieta de arroz e suco de
soja, sem teor de arsenobetaina, discutem a possibilidade de que a mesma seja
metabolizada no organismo, uma vez que foi detectada arsenobetaina na urina de
três dos cinco voluntários utilizados na pesquisa.
A decomposição de animais marinhos contendo arsenobetaína sugere a
biodegradação para as formas mais tóxicas de arsênio (metiladas) pelos
microorganismos existentes na flora dos mesmos (KAISE et al., 1998; JENKINS et
al., 2003). Da mesma forma, a decomposição das algas marinhas nos solos em
regiões da Escócia e Inglaterra, revelou a formação de espécies inorgânicas,
arsenito e arsenato e as formas metiladas MMA e DMA, mais tóxicas
(PENGPRECHA et al., 2005). Assim, a conservação dos produtos marinhos, usados
como alimentos ou remédios, deve evitar a degradação das espécies As-orgânicas,
o que disponibiliza as espécies tóxicas de arsênio. Deste modo, estudos de
preservação destas espécies durante o preparo e conservação das amostras
tornam-se importantes.
Os métodos para determinação de espécies de arsênio em tecidos biológicos
são precedidos normalmente por processos de extração, com misturas de etanol ou
metanol/água, em alguns casos realiza-se uma segunda extração para remover
lipídeos (SZPUNAR, 2000). O emprego da extração enzimática e também da
14
extração assistida por microondas foi descrita (LAMBLE e HILL, 1996; PARDO-
MARTINEZ et al., 2001; RATTANACHONGKIAT et al., 2004; ACKERMAN et al.,
2005; SANZ et al., 2005). Cabe salientar a importância dos processos de cocção dos
alimentos, não só visando a extração das espécies de interesse, como assim
também o estudo das interconversões e, a possível biodisponibilização de espécies
tóxicas.
Os alimentos são considerados a maior fonte de arsênio ingerido por
populações de áreas que não apresentam problemas de contaminação natural ou
antropogênica Estudos referentes à alimentação humana, realizados em vários
paises, revelaram uma grande variabilidade na ingestão diária total de arsênio, com
valores que oscilaram entre 10 g/dia para os moradores de Mumbai na India
(TRIPATHI et al., 1997) e 345 g/dia para a população do Japão (HERCE-PAGLIAI
et al., 1999). Os alimentos do mar são os contribuintes principais na ingestão total de
arsênio, por tanto, torna-se importante um estudo das variacões no conteúdo total de
arsênio e das espécies encontradas nestes alimentos (DEVESA et al., 2008).
A separação das espécies de arsênio tem sido realizada principalmente por
métodos cromatográficos, tais como, cromatografia gasosa GC (do inglês Gás
Chromatography), cromatografia líquida de alta eficiência HPLC (do inglês High
Performance Liquid Chromatography) e cromatografia iônica IC (do inglês Ion
Chromatography), ou por eletroforese capilar CE (do inglês Capillary
Electrophoresis). Uma variedade de detectores atômicos tem sido acoplada ao
HPLC, incluindo absorção atômica com chama FAAS (HANSEN et al., 1992) (do
inglês Flame Atomic Absorption Spectrometry), fluorescencia atômica AFS (do ingles
Atomic Fluorescence Spectrometry) (MESTER; FODOR, 1997) , emissão ótica com
plasma acoplado indutivamente ICP OES (do inglês Inductively Coupled Plasma
15
Optical Emission Spectrometry) e espectrometria de massas com fonte de plasma
ICP-MS (do inglês Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry), (ZHANG et al.,
1996). Na maioria dos casos a derivatização para formação de hidretos, visando
incrementar a sensibilidade dos sistemas, torna-se necessária. Nestes casos, há
necessidade da redução, em linha, das espécies orgânicas, para facilitar a reação
de geração dos hidretos. Entre as técnicas utilizadas para conseguir esta
decomposição em linha têm-se a fotoredução com luz ultravioleta (SLEJKOVEC et
al., 2001), decomposição por microondas (BURGUERA; BURGUERA, 1997), ou
térmica (LOPEZ et al., 1993). Zhang e colaboradores descreveram a fotooxidação
em linha com fonte ultravioleta (UV) após a separação por cromatografia de troca
iônica (ZHANG et al., 1996). Estes autores relataram a determinação de As(III),
As(V) MMA e DMA por HG-AAS em amostras de soro de pacientes com arseno-
uremia.
Gómez-Ariza e colaboradores (GOMEZ-ARIZA et al., 2001) pesquisaram
procedimentos de extração, concentração e derivatização, prévio à separação
cromatográfica, para determinação de espécies de As em amostras ambientais. A
acidificação é comum em amostras de água e outros líquidos para deter ou
minimizar atividades biológicas. Entretanto, este procedimento não é recomendado
quando as amostras contêm espécies organo-metálicas, uma vez que estas são
degradadas em condições ácidas. Nestes casos, são comumente utilizados
solventes tais como, tolueno e metanol (ALI; JAIN, 2004). Feldman e colaboradores
pesquisaram o efeito do ácido clorídrico (HCl) e alguns aditivos como nitreto sódico
(NaN3), cloreto de trimetil benzil amônia, ácido benzóico, cloreto de cetilpiridinio e
metanol sobre amostras de urina, relatando a degradação dos compostos
16
organoarseniacais em amostras acidificadas na presença de alguns destes aditivos
(FELDMANN et al., 1999).
Em estudos de especiação o preparo de amostras torna-se essencial, uma
vez que, amostras com elevado conteúdo de sais causam problemas na separação
por eletroforese capilar, resultando em picos alargados, devido à alteração do fluxo
eletroosmótico (ALI; JAIN, 2004). Por outra parte, na separação por cromatografia
líquida deve ser considerada a compatibilidade entre a matriz das amostras e a fase
móvel (FALLON et al., 1987).
17
2 Preparação de Amostras para Análise de Espécies
18
Resumo
Neste capítulo descrevem-se os fundamentos para a extração das espécies
de arsênio em amostras biológicas, apresenta-se uma pequena mais detalhada
revisão sobre estado da arte em técnicas de extração enzimática, extração assistida
por microondas e extração por ultra-som para análise de especiação, empregando
diferentes solventes como meio extrator. Entretanto, nesta pesquisa foi avaliada a
eficiência da extração assistida por ultra-som em amostras de tubarão e camarão.
Foi conseguida uma eficiência de extração maior que 78% do arsênio total no
material de referência certificado DORM-2. A interconversão das espécies durante o
procedimento de extração foi avaliada submetendo uma solução padrão contendo as
espécies ao mesmo procedimento de extração aplicado às amostras. Foi avaliada a
preservação das espécies nos extratos e nas soluções padrão. Estes extratos foram
posteriormente analisados pelo sistema acoplado LC-HG-AFS.
19
Abstract
The main considerations for arsenic species extraction from biological samples
are presented in this chapter. A little review about enzymatic, microwave and
ultrasonic assisted extraction on arsenic speciation from biological samples, by
employing different solvent is also offered. Furthermore the efficiency of ultra-sound
extraction was evaluated in shark and shrimp samples. An efficiency better than 78%
was achieved from DORM-2 certified reference material. Ultra-sound extraction was
also applied to a multi-species standard solution for stability studies of species during
extraction procedure. Extracts and solutions in this work were further analyzed by
LC-HG-AFS
20
2.1 Introdução
Quando a meados do século passado começa a vigorar a idéia de
especiação associando-a com efeitos tóxicos e, se começa a perceber a importância
da determinação da espécie química na qual o elemento em questão se encontra,
ao invés da determinação da determinação de teores totais, surge a necessidade de
desenvolver metodologias confiáveis e robustas que permitam a determinação das
espécies presentes nas diversas matrizes abordadas, sem incorrer em erros devido
a possíveis interconversões ou degradação das espécies.
Historicamente em química analítica instrumental os esforços foram focados
na redução de limites de detecção e na ampliação da faixa linear das curvas
analíticas. Embora os detectores mais robustos provejam atualmente limites de
quantificação da ordem de partes por trilhão, tanta sensibilidade freqüentemente se
torna desnecessária uma vez que o erro absoluto introduzido nas diferentes etapas
do processo analítico pode ser de uma ordem de magnitude maior. O erro
introduzido durante o preparo de amostras pode atingir 50% do erro total, entretanto
este erro pode ser ainda maior se considerarmos o preparo de amostras para
análise de especiação onde, matrizes complexas, baixas concentrações das
espécies envolvidas e distribuição heterogênea das mesmas implicam geralmente
na necessidade de implementar procedimentos adicionais como purificação e/ou
pré-concentração. Portanto a otimização de processos de amostragem, preservação
das espécies e melhorias na eficiência de recuperação das espécies durante o
preparo de amostras se tornam de vital importância, constituindo-se estes
parâmetros no principal objetivo em desenvolvimento de metodologias para análise
de especiação (MORIN et al., 1992; CAMARA, 2005).
21
Além da água potável, os seres humanos estão expostos ao arsênio através
dos alimentos de origem marinha, os quais contêm as maiores concentrações de
arsênio. Mais de duas dúzias de espécies de arsênio têm sido detectadas (Tabela
2.1), embora existe apreensão acêrca da eficiência dos métodos de extração os
quais podem destruir as espécies originais. A excreção urinaria representa a
exposição recente ao arsênio devido à curta vida media das espécies e por tanto, a
especiação de arsênio em urina se considera como biomarcador de exposição
(GONG et al., 2002).
22
Tabela 2.1 – Espécies de arsênio encontradas no meio ambiente (Gong, Lu et al., 2002).
Nome Abreviatura Fórmula química Arsenito (ácido arsinoso) As
III As(OH)3
Arsenato (ácido arsínico) AsV AsO(OH)3
Ácido monometilarsônico MMAV CH3As(OH)2
Ácido monometilarsinoso MMAIII CH3As(OH)2
Ácido dimetilarsínico DMAV (CH3)2AsO(OH)
Ácido dimetilarsinoso DMAIII
(CH3)2As(OH)
Óxido de trimetilarsina TMAO (CH3)3AsO
Trimetilarsina TMAIII (CH3)3As
Íon tetrametilarsônio Me4As+, TMA
+ (CH3)4As
+
Dimetilarsinoil etanol DMAE (CH3)2AsO(CH2)2OH
Arsenobetaina AsB (CH3)3As+CH2COO
-
Arsenobetaina 2 AsB-2 (CH3)3As+(CH2)2COO
-
Arsenocolina AsC (CH3)3As+(CH2)2OH
Arsinas AsH3, MeAsH2, Me2AsH (CH3)xAsH(3-x); (x=0-3)
Etilmetilarsina EtxAsMe(3-x) (CH3CH2)xAsMe(3-x); (x=0-3)
Roxarsone Roxarsone (OH)NO2PhAs(OH)2O
Ácido fenilarsônico PAA PhAsO(OH)2
Ácido hidroxifenilarsônico 4-HPAA (OH)PhAs(OH)2O
p-aminobenzenoarsonato PABA NH2PhAsO(OH)2
Ácido
Aminohidroxifenilarsônico 3-AHPAA NH2(OH)PhAsO(OH)2
Ácido nitrofenilarsônico 4-NPAA NO2PhAsO(OH)2
Ácido
hidroxinitrofenilarsenico 3-NHPAA NO2(OH)PhAsO(OH)2
Ácido ureidofenilarsônico p-UPAA NH2CONHPhAsO(OH)2
Arsênio com grupos
ribosidios Arsenoaçúcares
A temperatura e a forma de cocção dos alimentos também podem modificar
as espécies e concentrações de arsênio, neste sentido, Devesa e colaboradores
23
apresentaram recentemente uma completa revisão sobre os efeitos da temperatura
durante a cocção de alimentos ricos em teor de arsênio (DEVESA et al., 2008).
Devido à ampla abrangência da palavra especiação e, às inúmeras
abordagens sobre este tema encontrados na literatura, neste capítulo se considera
prioritariamente a especiação química de compostos de arsênio. Apresenta-se uma
detalhada revisão do estado da arte em preparo de amostras para análise de
especiação, empregando extração enzimática, assistida por microondas e por ultra-
som.
Nesta pesquisa se avaliou a eficiência do procedimento de extração por ultra-
som, assim como também a ocorrência de possíveis interconversões das espécies
nos procedimentos de extração. Estudou-se também a estabilidade dos extratos
conservados em geladeira a 4°C e, ao abrigo da luz.
2.2 Métodos de extração
As metodologias mais usadas para extração de espécies de arsênio são
extração Soxhlet, sonicação, extração assistida por microondas, extração acelerada
por solvente e extração por fluido supercrítico. A sonicação favorece a
homogeneização de amostras sólidas. A extração assistida por microondas envolve
aquecimento das amostras com solvente ou combinação destes, gerando a partição
das espécies entre as fases. Os solventes mais comumente utilizados são: água,
diferentes proporções de metanol/água e metanol/água/clorofórmio (ALI; JAIN,
2004).
A extração de espécies organoarseniacais assistida por microondas utilizando
metanol e mistura de metanol-água tem sido relatada (DAGNAC et al., 1998;
24
GOMEZ-ARIZA et al., 2000b). Na extração em banho de ultra-som de espécies de
arsênio em ostras, não foram evidenciadas diferenças significativas na eficiência de
extração quando empregados os solventes, água, metanol e metanol-água (1:1).
(MCSHEEHY et al., 2001). Diversos autores relataram também a utilização de
enzimas nos processos de extração (LAMBLE; HILL, 1996; PARDO-MARTINEZ et
al., 2001; RATTANACHONGKIAT et al., 2004; ACKERMAN et al., 2005; SANZ et al.,
2005). A especiação de arsênio empregando agitação com água como solvente foi
descrita, com eficiência de extração na faixa de 57 a 81% do arsênio total extraído
de amostras de mexilhões, (SOROS et al., 2003). Na comparação de métodos de
extração empregando agitação, extração por ultra-som, extração acelerada por
solvente e extração por microondas, uma eficiência de 100% foi conseguida na
extração aquosa assistida por microondas e de 50% na extração com metanol,
entretanto a extrações por agitação e assistida por ultra-som apresentaram
eficiências de 30% e 20% para os extratos aquoso e com metanol respectivamente
(NARUKAWA et al., 2008). Yuan e colaboradores realizaram uma comparação da
eficiência de métodos de extração, empregando cinco tipos diferentes de solvente ,
estes autores estudaram o rendimento da extração por soxhlet, ultra-som, agitação,
e assistida por microondas; a melhor eficiência de extração foi conseguida
empregando uma mistura etanol-água, entretanto as menores eficiências foram
conseguidas quando empregado metanol puro (YUAN et al., 2005). Mais tarde,
Wrobel e colaboradores apresentaram uma revisão de procedimentos para o pre-
tratamento de amostras com matrizes complexas visando a especiação de arsênio e
selênio (WROBEL; CARUSO, 2005).
25
2.2.1 Extração enzimática
O emprego de enzimas em química analítica tem, geralmente a finalidade de
simular processos biológicos ou digestivos dos organismos vivos. As enzimas são
muito utilizadas especialmente para ensaios de biodisponibilidade, seja de
elementos tóxicos ou de nutrientes, as enzimas mais comumente utilizadas são as
enzimas digestivas como proteases, tripsina, lípase, amilase, por exemplo, a
pancreatina, mistura de lípase e amilase pode ser empregada para digerir matrizes
pouco homogêneas (SANZ et al., 2007).
Para extração das espécies de arsênio em alimentos para bebês foram
avaliadas duas enzimas diferentes, pancreatina e tripsina; embora ambas enzimas
tenham apresentado eficiência de extração similares, os extratos em meio de
pancreatina apresentaram superposição de picos de arsenobetaina e dimetilarsênio
nos cromatogramas (PARDO-MARTINEZ et al., 2001). A extração enzimática com
tripsina,de espécies de arsênio em peixes e crustáceos do lago Pak Pa-Nang, um
estuário no meio de uma região de mineração no sul da Tailândia, teve eficiência de
82-100% (RATTANACHONGKIAT et al., 2004). A comparação dos métodos
enzimáticos e métodos químicos de extração para a especiação de arsênio em
farinha de arroz e cinco tipos diferentes de arroz em grão, revelou boa eficiência
para ambos os métodos, contudo quando a extração enzimática foi empregada, se
evidenciou o aparecimento de um pico não identificado no cromatograma
(ACKERMAN et al., 2005). Nam e colaboradores realizaram um estudo da eficiência
de diferentes métodos de extração para especiação de arsênio em amostras de
alimentos e suplementos alimentares. Os autores concluiram que quando
empregada a extração enzimática assistida por ultra-som utilizando -amilase, a
eficiência de extração resultou em 104% para farinha de arroz, 98% para maçã
26
congelada, entanto que para espinafres a eficiência de extração foi de apenas 7%
(NAM et al., 2006).
Recentemente foi descrita a lixiviação continua em linha com cromatografia
de intercambio iônico e detecção por ICP-MS para a extração e determinação de
espécies de arsênio em alimentos de origem marinha; mediante o bombeamento em
seqüência de saliva, suco gástrico e suco intestinal artificiais, através de uma coluna
contendo as amostras, 7 espécies de arsênio foram determinadas no extrato de
saliva, sendo esta, segundo os autores, responsável pela remoção de quase a
totalidade do arsênio biodisponível (DUFAILLY et al., 2008).
A extração enzimática assistida por microondas empregando uma mistura de
lipase e pronase E, em meio de tampão fosfato a pH 7,25 e 37°C demonstrou uma
eficiência de extração de 82-94% e 57-97% para os matérias de referência DOLT-2
e BCR-627 respectivamente, sem indução aparente de interconversão das espécies
(REYES et al., 2009).
Uma revisão sobre métodos de extração in-vitro empregando enzimas gastro-
intestinais, métodos conhecidos como biodisponibilidade oral, aplicada a amostras
de solo e alimentos foi realizada enfatizando parâmetros como pH, composição das
amostras e tamanho de partícula empregado (INTAWONGSE E DEAN, 2006). Mais
tarde, Vale e colaboradores apresentam uma revisão e discusão sobre a viabilidade
do emprego de extração enzimática assistida por ultra-som (VALE et al., 2008).
27
2.2.2 Extração por microondas
A extração por microondas encontra-se amplamente difundida em função da
eficiência e rapidez no preparo de amostras quando comparada com procedimentos
tradicionais. O emprego de baixas potências, entre 20 e 90 W e pressões normais,
torna possível a extração de compostos organometálicos sem afetar as estruturas
das moléculas extraídas em amostras biológicas e ambientais. No entanto
parâmetros como solvente empregado, potência e tempo aplicados precisam ser
cuidadosamente avaliados para evitar perda de analitos ou interconversões
indesejadas (DIETZ et al., 2007). Nóbrega e colaboradores apresentaram uma
completa revisão sobre o emprego de microondas para análise de especiação de
estanho, arsênio, mercúrio e selênio em diversas matrizes (NÓBREGA et al., 2002).
Mediante um procedimento desenvolvido para otimização de processos de
extração de espécies de arsênio em mexilhões, aplicando uma potência de arredor
de 40W, foi conseguida a remoção de 85% do arsênio total nas amostras em menos
de 4 minutos (DAGNAC et al., 1998). Mais tarde, Ackley e colaboradores,
empregando uma mistura 80:20 de metanol-água e aquecendo a 65°C durante 4
minutos conseguiram a extração de 100% do arsênio no material certificado de
referência DORM-2 (ACKLEY et al., 1999).
A extração assistida por microondas de arsenito, arsenato e dimetilarsênio em
amostras de farinha de arroz, empregando água como meio de extração e posterior
detecção por LC-ICP-MS apresentou uma eficiência de extração de arredor de 100%
sem alterações químicas aparentes (NARUKAWA et al., 2008). Estes autores
descrevem também um decréscimo de 50% na eficiência de extração quando
empregado metanol como meio extrator. Entretanto, foi relatada uma eficiência de
96-105% de extração quando utilizada uma mistura 1:1 metanol-água na extração
28
assistida por microondas de espécies de arsênio em amostras de camarão e Mya
arenaria Linnaeus, uma espécie de ostras (Yang et al., 2009).
2.2.3 Extração por ultra-som
A extração assistida por ultra-som, seja por sonda focalizada ou banho de
ultra-som, foi primeiramente empregada para determinação de teores totais de
elementos químicos. No entanto nos últimos anos ocorreu um aumento no número
de publicações que descrevem o emprego da extração assistida por ultra-som,
principalmente banho de ultra-som, em estudos de especiação química. O emprego
de ultra-som permite uma melhor homogeneização do meio aquoso solvente/soluto
das amostras a serem extraídas. Um dos fenômenos mais importantes quando
aplicado ultra-som a uma solução aquosa é o fenômeno de cavitação, fenômeno
físico que ocorre gerando pequenas bolhas que aumentam seu tamanho para
finalmente implodir. Devido a isto, os fenômenos de cavitação são considerados
como micro reatores no interior da amostra, onde se atingem temperaturas de
arredor dos 5000°C e pressões da ordem das 1000 atmosferas, causando erosão
mecânica dos sólidos e ruptura de partículas. Por outro lado, no meio líquido se
formam íons que produzem oxidação ou redução das espécies químicas, por
exemplo, quando empregada água como solvente em extração por ultra-som, são
formados radicais hidroxila além de peróxido de hidrogênio (SANTOS; CAPELO,
2007). Caruso e colaboradores relataram o emprego de extração assistida por ultra-
som em amostras de maçã com uma mistura metanol-água (50:50), a extração em
banho de ultra-som durante 6 horas apresentou porcentagens de recuperação de 72
a 97% para três tipos diferentes de amostras, entretanto, a extração foi melhorada
29
consideravelmente (81 a 104%) quando as amostras foram tratadas com -amilase
prévio à extração em banho de ultra-som (CARUSO et al., 2001).
A eficiência do ultra-som para extração de espécies de arsênio em ostras,
empregando diferentes solventes, água, metanol-água (50:50) e metanol foi
avaliada. O procedimento consistiu em submeter uma porção da amostra a duas
extrações consecutivas de uma hora cada em banho de ultra-som, o sobrenadante
resultante foi misturado e em seguida evaporado em rotoevaporador a temperatura
ambiente e finalmente o volume restituído com água deionizada.
Independentemente do solvente empregado, somente 53% do arsênio total foi
extraído, no entanto o perfil cromatográfico não apresentou diferenças dependentes
do solvente empregado (MCSHEEHY et al., 2001).
Uma eficiência de extração de 102% para amostras de camarão e, de 96%
para o material certificado de referência DORM-2 foi conseguido empregando uma
mistura 50:50 metanol-água como solvente. Nessa pesquisa a mesma alíquota da
amostra foi submetida a três extrações de 30 minutos cada uma no banho de ultra-
som. Os extratos foram analisados por LC-ICP-MS (MILSTEIN et al., 2003), segundo
estes autores, variações na composição e pH do solvente não apresentaram
melhoras significativas na eficiência de extração. Estudos de estabilidade das
espécies durante o processo de extração com metanol-água e metanol-cloroformo-
água não apresentaram degradação das seis espécies adicionadas.
Contudo,quando empregada uma mistura tripsina-carbonato de amônia verificou-se
a oxidação de arsenito para arsenato. A mistura metanol-água apresentou melhor
eficiência de extração que a mistura metanol-clorofomio-água para as seis espécies
adicionadas.
30
Wahlen e colaboradores, relatam excelente recuperação de arsenobetaina em
materiais certificados de referência, DORM-2, DOLT-2 e TORT-2, empregando água
como solvente previa agitação por 10 minutos, extração em banho de ultra-som à
temperatura do laboratório (24-26°C) durante 20 minutos e posterior centrifugação,
no entanto apresentam diferenças na extração de dimetilarsênio DMA (WAHLEN et
al., 2004). Para especiação de arsênio em algas provenientes da região antártica, a
extração em banho de ultra-som com uma mistura metanol-água (50:50) durante
duas horas a 30°C foi conseguida com eficiência na faixa de 83 a 108% para arsênio
total (WUILLOUD et al., 2006).
2.3 Procedimentos de preservação das espécies de As em solução
Como já mencionado, a estabilidade das espécies resulta ser um ponto
crucial em análises de especiação, entretanto esta estabilidade depende não só das
metodologias de extração, como também das estratégias de amostragem e
preservação tanto das amostras como dos extratos finais até o momento da análise.
Em 1999 Feldman e colaboradores realizaram um estudo da estabilidade de
arsenito, arsenato, MMA, DMA e arsenobetaina em urina. Para isto, as soluções
decorrentes da reconstituição da urina liofilizada foram armazenadas em diferentes
condições de temperatura, luminosidade, com ou sem emprego de ácidos e
conservantes. Empregando material de referência certificado (Toxic Metals in
Freeze-Dried Urine SRM 2670) e amostras de urina de vários voluntários, estes
autores estudaram o efeito da adição de HCl até 0,1 mol L-1, estocando as soluções
a -20°C, 4°C e 25°C. Nestas mesmas temperaturas foi estudado também o efeito de
possíveis conservantes como azida sódica, ácido benzóico, cloreto de
31
benziltrimetilamonia e cloreto de cetilpiridina. As soluções com os diferentes aditivos
estudados foram estocadas por períodos de 1, 2, 4 e 8 meses. Segundo estes
autores as soluções sem conservantes podem ser armazenadas por um período de
até 2 meses a temperaturas dentre -20 e 4 °C sem que se verifiquem mudanças na
distribuição das espécies nas amostras estudadas. A adição de conservantes não
ofereceu benefícios aparentes no intuito de conservação das espécies; no entanto
as soluções acidificadas com HCl apresentaram processos de degradação afetando
a recuperação das espécies estudadas. A arsenobetaina demonstrou alta
estabilidade nas soluções estocadas por até 8 meses sem o emprego de
conservantes, verificando-se em alguns casos o aparecimento de até 6 e 2% de
DMA e MMA respectivamente (FELDMANN et al., 1999).
A estabilidade de arsenito, arsenato, ácido monometilrasônico, ácido
dimetilarsínico, ácido fenilarsônico, selenito, selenato, selenometionina, antimonito,
antimonato e telurato em água, urina (NIST SRM 2670n), extrato de peixe (DORM-2)
e material de referência certificado de solo (NIST SRM 2710), armazenadas a -
diferentes temperaturas foi descrita (LINDEMANN et al., 2000). Quando
armazenadas a -20°C por um período de 30 dias as soluções aquosas apresentaram
um considerável decréscimo nas concentrações de arsenito, selenito,
selenometionina e antimonito, assim como a aparição de uma nova espécie de
selênio. A estocagem destas soluções a +20°C apresentou maior estabilidade para
as espécies estudadas, embora tenha ocorrido o aparecimento de uma nova espécie
de selênio em quantidades mínimas após 30 dias.
O material de que estão constituídos os recipientes em que serão
armazenadas as amostras joga um papel preponderante na estabilidade das
espécies. Um estudo revelou a contaminação com arsênio da água Milli-Q
32
armazenada em frascos de vidro previamente incubados em uma solução 10% de
ácido nítrico. Os autores atribuíram à provável lixiviação em presença do ácido, uma
vez que As2O é utilizado na industria do vidro (HUANG; ILGEN, 2004). Estes autores
também relatam a adsorção de arredor de 5% de todas as espécies adicionadas nos
diferentes matérias dos frascos armazenados a 5°C, entanto que o DMA apresentou
maior grau de adsorção. Os mesmos testes realizados a 20°C apresentaram
resultados similares, embora neste caso se evidenciou um considerável grau de
oxidação do arsenito para arsenato.
2.4 Material e Métodos
2.4.1 Reagentes, soluções e equipamentos.
Soluções estoque das diferentes espécies de arsênio estudadas neste
trabalho, preparadas e armazenadas em geladeira em frascos de cor âmbar.
1. Arsenito (As3+), AsNaO2 (Merck, Darmstadt, Alemanha)
2. Arsenato (As5+), AsNa2HO4.7H2O (Merck, Darmstadt, Alemanha)
3. Monometilarsênio (MMA) (Supelco, Sigma-Aldrich, USA)
4. Dimetilarsênio (DMA) (Supelco, Sigma-Aldrich, USA)
5. Arsenobetaina (AsB) preparado à partir do material de referência
certificado BCR-626.
Amostras de camarão seco, adquirido em comércios locais.
Amostras de tubarão, cedidas pelo professor José Ferreira.
Material certificado de referência para elementos traço (DORM-2), com teores
certificados para:
1. arsênio total igual a 18 ± 1,1 mg/Kg
33
2. arsenobetaina igual a 16,4 ± 1,1 mg/Kg e,
3. Ìon tetrametilarsônio igual a 0,248 ± 0,054 mg/Kg.
Ácido nítrico concentrado, destilado, e peróxido de hidrogênio 30 % v/v,
(Merck, Darmstadt, Alemanha), empregados para realizar as digestões nitrico-
peróxido das amostras e materiais de referência certificado.
Banho de ultra-som de 40 kHz (Thornton, Nova Técnica, Piracicaba-SP,
Brasil)
Bloco de digestão (Tecnal, Piracicaba-SP, Brasil) e, tubos de digestão de 25
ml.
Para todos os experimentos realizados durante este trabalho, se usou
material previamente descontaminados em banhos contendo 10 % (vv-1) de HNO3
por 24 horas. Água de deionizada, purificada em sistema Milli-Q com uma
resistividade de 18.2 MΩ .cm (Millipore, Bedford, MA, USA), foi empregada no
preparo de todas as soluções.
2.4.2 Procedimentos de extração
Uma vez realizada uma minuciosa recopilação de dados sobre diferentes
metodologias reportadas para a extração de espécies de arsênio em diferentes
matrizes, se resolveu avaliar e subseqüentemente adotar como método de extração
para este trabalho, aqueles que estiverem em assentimento com a química limpa.
Por tanto foi escolhido como método de extração para esta pesquisa, a extração em
banho de ultra-som empregando como solvente apenas água ou, em ocasiões, uma
mistura metanol-água em proporção 20:80.
34
A eficiência da extração determinou-se pela relação percentual do teor de
arsênio total nas soluções digeridas e nas soluções extraídas em banho de ultra-
som. O procedimento de extração consistiu em pesar 0,25 g do material de
referência certificado DORM-2, agregou-se 20 mL de água ultra pura e se submeteu
à extração em banho de ultra-som por intervalo de uma hora. Para a determinação
do teor total de arsênio foi realizada digestão nítrico-peróxido (HNO3 + H2O2). Para
tal, pesaram-se 0,25 g do material de referência e se adicionou 4 mL de ácido
nítrico, deixou-se esta mistura em repouso por 2 horas, ao cabo deste tempo se
adicionou 1 mL de peróxido de hidrogênio 30% e se levou a mistura a 50°C durante
24h em bloco digestor. Em seguida deixaram-se estas soluções em repouso a
temperatura ambiente até esfriar, quando então foi completado o volume e filtrou-se
em filtro de acetato de celulose de 0,45 m de porosidade. Para a determinação de
arsênio total, foi realizada a redução das espécies para arsenito, para tal fim, se
tomou 5 mL de cada solução, extraídas e digeridas, se adicionou 0,5 mL de uma
solução 50% m/v KI e 10% m/v de ácido ascórbico e as determinações foram
realizadas por espectrometria de fluorescência atômica.
Uma vez determinada a eficiência da metodologia de extração empregada, se
procedeu a investigar a estabilidade de espécies durante o procedimento de
extração. Para tal se realizaram dois procedimentos, primeiro se pesaram 0,25 g do
material de referência, ao qual se adicionou quantidade suficiente de cada uma das
espécies para atingir concentrações na solução final iguais a 12, 12, 16 e 15 µg/L,
de mono e dimetilarsênio, arsenito e arsenato respectivamente. Esta mistura foi
deixada em repouso durante duas horas quando finalmente se completou o volume
e se submeteu ao procedimento de extração. Por outro lado, se preparou uma
solução padrão contendo estas mesmas concentrações de cada espécie, logo
35
ambas as soluções foram submetidas à extração por ultra-som em tempos de 15,
30, e 60 minutos. Alternativamente, o mesmo procedimento de extração foi
realizado, empregando como solvente uma mistura metanol-água em uma proporção
20:80.
As análises posteriores a este procedimento levaram-se a cabo empregando
cromatografia líquida acoplada à espectrometria de fluorescência atômica com
geração dos hidretos voláteis na interface. Finalmente estes mesmos procedimentos
foram aplicados às amostras de interesse nesta pesquisa visando à identificação e
quantificação das espécies de arsênio presente nas amostras.
O monitoramento da decomposição da amostra de camarão e, o possível
aparecimento de espécies tóxicas ao longo do tempo também foi realizado. O
procedimento consistiu em pesar 250 g de camarão e, na seqüência cortar em
pequenos pedaços, deixando logo decompor ao ar em capela de fluxo laminar.
Diariamente se tomaram três sub-amostras, as quais foram moídas e submetidas
aos procedimentos de extração descritos acima.
2.4.3 Conservação das amostras e dos extratos
As amostras de camarão seco foram liofilizadas, moídas em moinho
criogênico e posteriormente armazenadas em geladeira.
Os extratos, assim como também as soluções resultantes da digestão das
amostras e as soluções padrão mistas e individuais foram conservadas em geladeira
a 4°C, sem adição de quaisquer conservantes. Semanalmente se realizou a análise
destas soluções com a finalidade de avaliar a estabilidade das mesmas sob estas
condições.
36
2.5 Resultados e Discussão
2.5.1 Eficiência do método de extração
Resultados obtidos das experiências realizadas para a determinação da
eficiência do método de extração em termos de arsênio total extraído apresentam-se
na Figura 2.1. Como pode ser observado nesta figura, o método empregado atingiu
uma eficiência de extração maior do que 78%, eficiência maior do que os 53%
relatados anteriormente por McSheehy e colaboradores para 2h de extração
(MCSHEEHY et al., 2001). Entretanto, em uma hora de extração, estes resultados
se equiparam aos resultados obtidos anteriormente por Caruso e colaboradores
empregando 6h de tratamento com uma mistura metanol-água (CARUSO et al.,
2001). Embora já tenha sido relatada uma eficiência de extração de 102%
(MILSTEIN et al., 2003), estes autores empregaram uma mistura metanol-água
(50:50) sem posterior evaporação do solvente e, como veremos posteriormente,
ocorre interferência na detecção por fluorescência atômica provocada pela presença
do metanol nos extratos.
37
1 2 3 4 5
5
6
1
2
4
7
co
nta
ge
ns x
10
5
N° de Replicatas
Extraido
Digerido
3
Figura 2.1 – Eficiência do método de extração de As por ultra-som. Apresentam-se os teores totais em 5 repetições da extração aquosa e dos extratos obtidos por digestão total. Validação do método utilizando Material Certificado de Referência Dorm-2.
2.5.2 Interconversão de espécies
Para os estudos de possíveis interconversões entre as espécie durante o
procedimento de extração, se preparou uma solução padrão contendo 15 g/L de
arsenito, arsenato, monometil e dimetil arsênio. Esta solução foi então submetida ao
procedimento de extração em banho de ultrassom, alíquotas de 500 L foram
amostradas a intervalos de 15, 30 e 60 minutos. Os resultados deste procedimento
se apresentam na Figura 2.2.
38
As3+ DMA MMA As5+
0
10
20
30
40
50
60
70
80
UF
A
Espécies
15 min
30 min
60 min
Figura 2.2 – Estabilidade das espécies de arsênio durante o procedimento de extração em banho de ultra-som. Análise das soluções após 15, 30 e 60 minutos de duração do procedimento aplicado. Os desvios para arsenito, arsenato, monometilarsênio e dimetilarsênio foram de 0,96; 0,99; 1,17 e 0,59 respectivamente.
Como podemos observar, não houve variações significativas nas
concentrações das espécies ao longo do procedimento de extração, resultados em
consonância com os já relatados para a extração de espécies de arsênio em ostras
(MCSHEEHY et al., 2001).
2.5.3 Interferências nas análises dos extratos
Uma interferência no cromatograma no tempo de retenção correspondente ao
monometilarsênio e dimetilarsênio foi observada como mostrado no cromatograma
da Figura 2.3. quando se empregou mistura 20:80 de metanol-água como solvente
nos procedimentos de extração em banho de ultra-som.
39
0 2 4 6 8 10 12
0
50
100
150
200
As5+
UF
A
t (min)
MeOH:H2O (20:80)
Diluido 1+4 H2O
As3+
DMA + MeOH ?
MMA
Figura 2.3 – Cromatograma das espécies de As em amostra de camarão. Extrato de camarão adicionado com arsenito, arsenato, monometilarsênio e dimetilarsênio, extraídos em banho de ultra-som durante uma hora com a mistura 20:80 metanol-água.
Os procedimentos de extração descritos na literatura, que empregam
diferentes proporções metanol-água, normalmente propõem a evaporação da
solução extratora antes de aferir com água para o volume desejado (HEITKEMPER
et al., 2001; VAN HULLE et al., 2002). Entretanto, isto implicaria acrescentar um
passo a mais no preparo de amostras, com a conseqüente possibilidade de mais
erros introduzidos nas determinações finais. Outros autores também empregaram
mistura metanol-água, para a extração por ultra-som, embora a evaporação do
solvente e reconstituição do volume não foi aplicado (MILSTEIN et al., 2003). No
entanto Nam e colaboradores advertem sobre o incremento do sinal de arsênio com
o incremento da proporção de metanol nos extratos quando analisados por ICP-MS
(NAM et al., 2010).
40
2.5.4 Estabilidade das espécies em solução e dos extratos
Análises semanais das soluções padrão e dos extratos, armazenados em
geladeira a 4°C, sem adição de conservantes, revelaram a degradação das espécies
metiladas. Transcorridas três semanas, as soluções individuais de monometilarsênio
e dimetilarsênio mostraram quase completa degradação para As5+, entanto que as
soluções padrão de arsenito mostraram uma oxidação para arsenato ao longo deste
mesmo período . No percurso de 2 meses todas as soluções padrão individuais
apresentaram mais de 90% de arsenato. Nas soluções padrão multiespécies, este
comportamento se verificou em tempos menores aos das soluções individuais,
evidenciando-se a quase completa oxidação das espécies para arsenato em um mês
(Figura 2.4). Em extratos de tecidos de frango foram relatadas por Pizarro e
colaboradores a oxidação do arsenito para arsenato. entretanto descrevem uma
boa estabilidade das espécies metiladas nos extratos por até 3 meses. Em extratos
de tecidos de frango houve degradação de arsenobetaina para DMA após dois
meses; enquanto que nos extratos de peixes foi detectada a conversão de
arsenobetaina para uma espécie não reconhecida (PIZARRO et al., 2003).
41
0 2 4 6 8 10 12
0
50
100
150
200
MMA
As5+
UF
A
t/min
As3+
DMA
Figura 2.4 – Estabilidade das espécies em solução. Degradação das espécies em soluções padrão armazenadas ema geladeira. Línea pontilhada = solução preparada no dia. Linea sólida = cromatograma após 3 semanas.
Os extratos das amostras de camarão e tecido de tubarão, assim como as
soluções resultantes da digestão total, submetidas ao mesmo procedimento de
armazenagem que as soluções padrão, e sem adição de preservativos,
apresentaram o aparecimento de fungos ao cabo de três semanas. Estes resultados
apresentam ligeira semelhança com resultados apresentados anteriormente
(LINDEMANN et al., 2000) ao estudar a estabilidade de espécies de arsênio, selênio
e antimônio. Estes autores relataram um leve decréscimo na concentração das
espécies de arsênio após 30 dias quando armazenadas as soluções a +3°C e, a -
20°C; conjuntamente com o decréscimo na concentração de arsenito se observou
um aumento na concentração de arsenato. Entretanto, estes resultados contrastam
com os resultados obtidos por Feldman e colaboradores, os quais descrevem a
conservação das espécies e dos extratos por um tempo de até 2 meses a 4°C e -
20°C (FELDMANN et al., 1999).
42
2.5.5 Espécies tóxicas na decomposição natural da amostra de camarão
O experimento para monitorar a possível aparição de espécies tóxicas
durante o armazenamento das amostras de camarão deixando-as em contato com o
ar, não evidenciou degradação da arsenobetaina nem aparecimento de novas
espécies. Quando os extratos foram analisados por eletroforese capilar ou
cromatografia líquida, após diferentes períodos de amostragem não foi detectada
nenhuma modificação.
2.6 Conclusões
O método de extração por banho de ultra-som apresenta satisfatória eficiência
na extração total de arsênio (>78%) para análise de especiação em amostras de
tubarão e camarão.
As espécies de arsênio estudadas se mantiveram estáveis durante o
procedimento de extração por ultra-som, sem que se verifiquem alterações das
proporções entre as espécies, tanto em soluções padrão como nos extratos
contaminados com as espécies estudadas. Por tanto a extração por ultra-som pode
ser aplicada em análises de especiação em amostras biológicas, com boa eficiência
de extração mantendo-se a estabilidade das espécies extraídas.
As amostras de camarão seco se mantiveram estáveis ao longo de três
meses ao ar livre, no percurso deste período não foi detectado aparecimento de
espécies tóxicas. Entretanto o armazenamento de soluções padrão e dos extratos
das amostras, em geladeira a +4°C foi eficiente por um curto período, por tanto
43
torna-se altamente recomendável realizar as análises imediatamente depois das
extrações.
Por ultimo a extração aquosa em banho de ultra-som resultou ser eficiente e
não apresentou interferências nas determinações por espectrometria de
fluorescência atômica. Entretanto quando empregado 20% de metanol no processo
de extração houve severas interferências nos cromatogramas nos tempos de
retenção de dimetil e monometilarsênio. Por tanto a evaporação dos solventes para
posterior reconstituição de volume com água após a extração, se torna
recomendável para análises por AFS.
44
3 Especiação de As por Eletroforese Capilar Acoplada a Espectrometria
de Massas com Fonte de Plasma
45
Resumo
Neste capítulo se apresentam os fundamentos para a separação e
determinação de arsenito, arsenato, monometilarsênio, dimetilarsênio e
arsenobetaina em amostras de camarão empregando eletroforese capilar. Também
foi desenvolvido um dispositivo construído em acrílico com um encaixe hermético
para microtubos de 200 L empregados como recipientes para a injeção
hidrodinâmica no do capilar eletroforético adaptado a sistema caseiro de
eletroforese capilar projetado no Laboratório de Química Analítica do CENA-USP.
Apresentam-se também neste capítulo, o acoplamento do sistema caseiro de
eletroforese capilar com sistema de nebulização de alta eficiência para introdução da
amostra espectrômetro de massas com fonte de plasma ICP-MS. O acoplamento
CE-HG-ICP-MS foi também empregado para determinação de espécies de arsênio
em amostras de urina liofilizada.
46
Abstract
In this chapter are presented fundamentals for separation and determination of
arsenite, arsenate, monomethylarsinic acid, dimethylarsonic acid and arsenobetaine
fro shrimp by capillary electrophoresis system. A time controlled hydrodynamic
injector devise employing 200 L micro-tubes as recipient for samples and electrolyte
was developed for coupling with a “home-made” capillary electrophoresis system.
A high efficiency nebulizer (HEN) was also employed for the coupling of
capillary electrophoresis system to an inductively coupled plasma mass
spectrometer. Hydride generation was also employed as interface derivatization for
determination of arsenic species in lyophilized urine samples by CE-HG-ICP-MS.
47
3.1 Introdução
A eletroforese capilar é um método de separação, baseado na migração
diferenciada pelas diferenças na razão carga/tamanho (z/m) de espécies iônicas ou
ionizáveis através de um campo elétrico, gerado pela aplicação de uma diferença de
potencial (ddp) entre os extremos de um tubo capilar contendo uma solução
eletrolítica. A separação destas espécies se verifica pela ação conjunta da migração
eletrocinética e do fluxo eletroosmótico, produzidos como conseqüência do campo
elétrico gerado no interior do capilar e, da movimentação dos cátions da solução
eletrolítica nas proximidades das paredes do capilar que carregam entre si
moléculas de água, provocando o que se conhece como fluxo eletroosmótico.
Devido à existência deste fluxo eletroosmótico (EOF: do inglês eletroosmotic flow)
torna-se possível realizar a determinação de moléculas aniônicas, catiônicas e, sob
determinadas condições também neutras, numa única separação eletroforética.
Leituras recomendadas sobre os fundamentos e implicações em eletroforese capilar
podemos encontrar em (TAVARES, 1996; 1997; DE MORAES et al., 2009), como
assim também muitas outras publicações que abordam experiências realizadas para
o entendimento desta técnica que reportam resultados de estudos realizados com
diferentes parâmetros implicados na eletroforese capilar e que devem ser levados
em consideração na hora de montar quaisquer experimentos empregando esta
técnica de separação (ATAMNA et al., 1990a; 1990b; ISSAQ et al., 1990;
RASMUSSEN; MCNAIR, 1990; ZHU et al., 1994; BELLO, 1996; MACKA et al., 1998;
STOYANOV; PAWLISZYN, 2004).
Esta técnica tem se mostrado como uma ferramenta seletiva e sensível na
especiação de íons metálicos. Sua relativa simplicidade, seu baixo consumo de
48
amostras e reagentes, baixo custo (as colunas capilares são mais baratas que as
cromatográficas), assim como a possibilidade de separar espécies aniônicas e
catiônicas num mesmo sentido e, em reduzidos tempos de análise, têm feito da
eletroforese capilar uma das técnicas de preferência em estudos de especiação.
A eletroforese capilar tem se mostrado ao longo dos últimos anos como uma
técnica de separação robusta e versátil, empregada em química analítica para
separação tanto de espécies iônicas como neutras. O emprego de capilares com
diâmetros internos pequeníssimos (da ordem de alguns micrômetros) permite uma
eficiente dissipação do calor e suprime efeitos de convecção no interior do capilar,
ao mesmo tempo em que permite a aplicação de altas voltagens sem incorrer em
correntes elétricas muito elevadas, minimizando assim os efeitos de aquecimento,
ao longo do tempo, da solução no interior do capilar. A combinação destas
propriedades confere à eletroforese capilar uma alta eficiência de separação, da
ordem de 105-106 platôs teóricos em um curto período de tempo (MORIN et al.,
1992).
A eletroforese capilar em zona (CZE: do inglês capillary zone electrophoresis)
foi utilizada para a determinação de seis espécies de arsênio com detecção UV
(VAN DEN BROECK; VANDECASTEELE, 1998), conseguindo-se a separação e
detecção de As(III), As(V), MMA, DMA, arsenobetaina e arsenocolina, em um tempo
inferior a 10 minutos, em concentrações de 100 g/L. No ano de 2003 foi reportada a
separação de As(III), As(V), MMA, DMA e outros quatro ácidos orgânicos (SUN et
al., 2003), empregando-se detecção por UV em 192 nm; estes autores reportaram
também a determinação simultânea de As(III), As(V), MMA, DMA, Se(IV), Se(VI),
selenocisteína (SeC), selenometionina (SeM) e selenocistamina (SeCM), utilizando
tampão fosfato 15 mmol/l e detecção UV em 195 e 200 nm para as espécies de
49
arsênio e selênio respectivamente (SUN et al., 2004). A separação e detecção de
seis espécies de arsênio utilizando um acoplamento CE-ICP-MS foi relatado
(MICHALKE; SCHRAMEL, 1998), conseguindo limites de detecção de 15 g/L para
As(III), MMA, DMA e As(V), e 65 g/L para arsenobetaína e arsenocolina. A
separação destas mesmas espécies foi conseguida mais tarde mediante o
acoplamento CE-ICP-MS (VAN HOLDERBEKE et al., 1999), atingindo-se limites de
detecção de 1-2 g/L.
Embora a maioria dos trabalhos citados refere-se à determinação das
espécies orgânicas e inorgânicas em água, neste trabalho será estudada a
possibilidade de utilização desta técnica para a separação de espécies de arsênio
nos extratos de amostras biológicas. Por outra parte a possibilidade de separação e
detecção de espécies aniônicas, catiônicas e neutras num mesmo sentido de
análise, decorrente da ação do fluxo eletroosmótico, permite a simplificação do
sistema, comparado com a utilização de colunas aniônicas e catiônicas no caso da
cromatografia líquida.
3.2 Material e Métodos
3.2.1 Reagentes, soluções e equipamentos
Soluções estoque de fosfato monobásico (NaH2PO4) e dibásico (Na2HPO4) de
sódio em concentração 1 mol/L cada uma (Merck, Darmstadt, Alemanha).
Brometo de tetradecil trimetilamônio (TTAB) empregado como modificador de
fluxo eletosmótico (Merck, Darmstadt, Alemanha).
Ácido fosfórico empregado para o ajuste do pH dos tampões de trabalho,
(Merck, Darmstadt, Alemanha).
50
Ácido Nítrico destilado (HNO3), para ser empregado como solução eletrolítica
auxiliar nos sistemas CE-ICP e também para acidificação em linha das
soluções efluentes do capilar eletroforético, nos sistemas CE-HG-ICP (Merck,
Darmstadt, Alemanha).
Tetrahidroborato de sódio (NaBH4) para a reação de geração dos hidretos
voláteis (Nuclear, CAQ Casa da Química Ind. e.Com.Ltda., Diadema-SP,
Brasil)
Capilares de sílica fundida de 75 mm de diametro interno i.d.(Polymicro
Technologies, EUA)
Tubos Eppendorf® de 200 L de volume interno aferido. (MPL materiais para
laboratório, Piracicaba-SP, Brasil)
Fios de platina de 0,3 mm de espessura (Loccus Brasil, São Paulo)
Bomba de seringa (Shimadzu Corporation, Kyoto-Japão).
Unidade controladora de gás (Shimadzu Corporation, Kyoto-Japão) e um
cilindro de gás argônio qualidade analítica (Oxipira, Piracicaba-SP, Brasil
Válvulas solenóide de três vias NR161T031, (NResearch and Development
Incorporated).
Fonte de alta voltagem modelo CZE 1000R (Spellmam, EUA)
Detector UV/Visível LabAlliance com a interface para aquisição de dados
conectada a um computador 486 provido com interface e programa de
aquisição cromatográfica CSW 1.7 (Data Apex Ltda.) funcionando em sistema
operativo Windows®
Espectrômetro de massas de alta resolução com plasma acoplado
indutivamente (HR-ICP-SFMS) (Finnigan modelo Element)
51
Nebulizador de alta eficiência, HEN (High-Efficiency Nebulizer), (Meinhard,
Santa Ana, CA, USA)
Câmara de separação de fases para geração de hidretos, construída no
laboratório segundo (SUÁREZ; GINÉ, 2005).
Todos os reagentes utilizados para as análises por eletroforese capilar e por
cromatografia líquida foram de grau analítico. As respectivas diluições levaram-se à
cabo empregando água deionizada purificada em sistema Milli-Q com uma
resistividade de 18.2 MΩ .cm (Millipore, Bedford, MA, USA), filtradas em filtro de
acetato de celulose de 0,2 mm de porosidade, previo às análises realizadas.
3.3 Desenvolvimento Experimental
Os mecanismos de separação implicados na eletroforese capilar dependem
das diferenças na mobilidade eletroforética das espécies em solução, esta
propriedade tem estreita relação com as diferenças estruturais de cada soluto, como
por exemplo, seu tamanho, forma ou carga iônica; as quais por sua vez estarão
relacionadas às propriedades físico-químicas do tampão eletroforético empregado,
como pH, força iônica, viscosidade e constante dielétrica, dentre outras. Entretanto a
temperatura afeta diretamente estas propriedades da solução eletrolítica e
conseqüentemente a separação eletroforética, um controle adequado da
temperatura implicará na melhor reprodutibilidade das separações eletroforéticas
(MORIN et al., 1992). Estes autores apresentaram uma detalhada análise da
influência da modificação de parâmetros como pH, temperatura e voltagem aplicada
na modificação do fluxo eletroosmótico, da carga iônica de quatro espécies de
52
arsênio, assim como de suas respectivas mobilidades eletroforéticas. Na Tabela 3.1
se apresentam algumas das espécies de arsênio encontradas comumente em
amostras biológicas e ambientais com suas respectivas estruturas químicas, pKa,
nome e abreviaturas empregadas na literatura.
Tabela 3.1 – Pka’s de espécies de arsênio. Apresentam-se os pka’s conhecidos das espécies de arsênio em sistemas biológicos e ambientais Adaptado de (Larsen, 1998; Le, Lu et al., 2004; Sun, Macka et al., 2004; Wu e Ho, 2004; Kitagawa, Shiomi et al., 2006; Jaafar, Irwan et al., 2007). *R corresponde às diferentes estruturas de açúcares ligados ao arsênio.
Nome Abreviação Formula química Pka
Arsenito, ácido arsinoso As
III As(OH)3 9,2 – 12,1
Arsenato, ácido arsínico AsV AsO(OH)3 2,25 - 6,77 - 11,60
Ácido monometilarsínico MMAV CH3AsO(OH)2 3,6 – 8,2
Ácido dimetilarsínico DMAV (CH3)2AsO(OH) 1,3 – 6,2
Óxido de trimetilarsina TMAO (CH3)3AsO 3,6
Arsenobetaina AsB (CH3)3As+CH2COO
- 2,1
Roxarsone Roxarsone (OH)NO2PhAs(OH)2O 3,5
Ácido fenilarsônico PAA PhAs(OH)2O 3,6 – 8,8
p-aminobenzenoarsonato PABA NH2PhAs(OH)2O 1,9 (NH3+); 4,1; 9,2
As espécies orgânicas e inorgânicas de arsênio são espécies ácidas que, sob
condições normais, não se apresentam como totalmente dissociadas. O grau de
dissociação destes ácidos, o qual apresenta uma relação direta com a carga iônica
dos mesmos em solução e, influencia diametralmente as suas mobilidades
eletroforéticas, depende de seus respectivos pK assim como do pH da solução
tampão utilizada como eletrólito. Os capilares de sílica fundida, normalmente
empregados em eletroforese capilar, possuem cargas negativas na superfície de sua
parede interna, devido à presença dos grupos silanois (SiO-H+) e, quando aplicada
53
uma voltagem positiva, por efeito do fluxo eletroosmótico ocorrerá a movimentação
das formas não dissociadas das espécie de arsênio em direção ao cátodo, em
seqüência ocorrerá a migração das espécies negativas parcialmente dissociadas
(GASPAR et al., 2000). Sob estas condições, unicamente as espécies aniônicas que
apresentem mobilidade eletroforética inferior à velocidade do fluxo eletroosmótico
poderão ser observadas nos eletroferogramas. Contudo, um incremento do pH da
solução eletrolítica, embora implique um incremento do fluxo eletroosmótico,
aumentará também a mobilidade eletroforética das espécies de arsênio, devido a um
maior grau de dissociação. Entretanto a direção do fluxo eletroosmótico foi revertida
empregando uma voltagem negativa assim como também, por adição de um
modificador de fluxo, se obteve um menor tempo da análise. Estes autores
conseguiram a separação de 6 espécies de arsênio adicionando brometo de
cetiltrimetilamônia (cetyltrimethylammonium bromide CTAB) ao tampão eletroforético
(50 mmol/L borato, 0,5 mmol/L CTAB, pH 9,3). (Gaspar, Sogor et al., 2000). Na
Tabela 3.2 apresenta-se uma resenha de alguns artigos publicados no campo da
especiação de arsênio com eletroforese capilar, nesta tabela se descreve o tampão
e o modificador de fluxo empregado (caso utilizado), pH, tempo de análise e ordem
de aparecimento dos respectivos picos no eletroferograma.
54 Tabela 3.2 – Recopilação de trabalhos que empregaram eletroforese capilar para a separação de espécies de arsênio, se indica nesta tabela o
tipo e pH do tampão empregado, modificador de fluxo caso utilizado, voltagem aplicada, tempo de análise e espécies separadas(*) indicando a ordem de aparecimento das espécies nos respectivos eletroferogramas.
Tampão (concentração) Modif. De fluxo (concentração)
pH Voltagem
aplicada (kV) Espécies separadas(*) Tempo
(min) Referência
Fosfato (25 mmol/L) **************** 5,6 20/30 As3+
, DMA, MMA, As5+
, 20/12 (MORIN et al., 1992)
NaH2P04+Na2B407 (0,075+0,025) mol/L
**************** 7,8 20 As
3+, DMA, As
5+
12 (LI; LI, 1995)
Ac. piromelítico, NaOH, trietanolamina, hexamethonioOH
(2,3-6,5-1,6-0,75) mmol/L **************** 7,7 -30 As
5+, As
3+, MMA, DMA < 25 (LIU et al., 1995)
H3PO4 + NaOH **************** 3-13 15 Tio e oxotioarsenatos
30 (SCHWEDT; RIECKHOFF, 1996)
Fosfato (15 mmol/L) SDS1 (10 mmol/L) 6,5 ??????
As3+
, APAO, PAO, DMA, DPAA, APAA, PAA, MMA, As
5+, PAS.
16 (GRESCHONIG et al., 1998)
Na2HPO,/NaH2PO (20 mmol/L)
**************** 5,6 As
3+, DMA, MMA, As
5+, AsC, ASB.
2 (MICHALKE; SCHRAMEL, 1998)
Fosfato 15 mmol/L **************** 6,5 10 As3+
, DMA, PABA, PAA, As5+
< 20 (GIL et al., 1999)
Borato (50 mmol/L) OFM-OH (Waters) 9,4 -25 As
5+, MMA, DMA, As
3+, AsB, AsC.
10 (VAN HOLDERBEKE et al., 1999)
Cromato 5 mmol/L OFM Anion-BT (Waters) 11 10
25 As
5+, As
3+, DMA
As5+
, DMA, As3+
4 6
(NAIDU et al., 2000)
Fosfato + Borato (20 + 10 ) mmol/L
**************** 9,28 +20 As
3+, DMA, MMA, As
5+
20 (ZHANG et al., 2001)
Cromato de sódio 0,5 mmol/L TTAB2 0,5 mmol/L 11,2 -20 As
5+, MMA, As
3+, DMA < 10 (CASIOT et al., 2002)
H3BO3 16 mmol/L (pH ajust.NaOH)
**************** 9,3 30 AsC, AsB, As
3+, DMA, MMA, As
5+
6 (KOELLENSPERGER et al., 2002)
NaHCO3-Na2CO3 (20 mmol/L)
PDDAC3 10 -25
PAO DMA; As3+
, p-ASA, NPAA, PAA, MMA, Roxarsone, As
5+.
12 (SUN et al., 2002)
Fosfato (20 mmol/L) **************** 6,5 +20 As3+
, DMA, MMA, As5+
12 (YIN et al., 2002)
Bicarbonato (2 mmol/L) Fluoresceina (10-7
mol/L) 9,28 +20 As3+
, DMA, MMA, As5+
6 (ZHANG et al., 2002)
NaHCO3-Na2CO3 (50 mmol/L)
Co-EOF NSM stacking 10 -25 As
5+, Roxarsone, MMA, PAA, 4-
NPAA, p-ASA, As3+
, DMA; < 8 (SUN et al., 2003)
1 Sodium Dodecylsulfate,
2 Trimethyltetradecylammonium bromide
3 poly(diallydimethylammoniumchloride)
55
Borato + cromato (12,5 + 10) mmol/L
CTAB4 (0,5 mmol/L) 9,4 -25
As5+
, As3+
, MMA, DMA. < 15 (WU; HO, 2004)
Fosfato 10 mmol/L TTAB 0,35 mmol/L 9,0 -20 As5+
, DMA, As3+
4 (AKTER et al., 2005)
Borato (30 mmol/L) **************** 9,3 +30 AsC, AsB, As
3+, DMA, pAs, MMA,
As5+
25 (FORTE et al., 2005)
Fosfato (20 mmol/L) **************** 5,7 +15/30 As
3+, DMA, 3-AHPAA, 4-HPAA, o-
ASA, MMA, 3-NHPAA, As5+
15/20 (ROSAL et al., 2005)
Tris + SDS5
15 mmo/L cada **************** 9,0 +22
AsB, As3+
, AsC, DMA, MMA, As5+
12 (YEH; JIANG, 2005)
Aniônicos primeiro e cationicos depois
**************** 3,2–12,1
-16 As
5+, MMA, As
3+, DMA
TMA+, AsC, TMAO, AsB 6 (cada corrida)
(KITAGAWA et al., 2006)
Fosfato (15 mmol/L)
**************** 10,6 +25 As
3+; DMA; PAA; MMA; roxarsone;
As5+
25 (JAAFAR et al., 2007)
Borato (25 mmol/L) + Metanol (10% v/v)
**************** 9,2 +30 AsB, As
3+, DMA, As
5+
7 (MEERMANN et al., 2008)
PDC6 (10 mmol/L) **************** 10,3 -25 As
5+, MMA, DMA, As
3+ 10 (JAAFAR et al., 2009)
Na2MoO4 + NaClO4
10 mmol/L cada **************** 3.0 -16
As5+
, MMA, DMA 16
(KOSHCHEEVA et al., 2009)
NaH2PO4 + Na2B4O7
(20 + 5) mmol/L **************** 6,5 ±30
As5+
, MMA, DMA, As3+
; e As3+
, DMA, MMA, As
5+
10 (YANG et al., 2009)
NaH2PO4 + Na2B4O7
(20 + 5) mmol/L **************** 6,25 +20 As
3+, DMA, p-As, MMA, As
5+, < 12 (YANG et al., 2009)
# Continuação da Tabela 3.2
4 n-hexadecyltrimethylammonium bromide
5 Sodium dodecyl sulfate
6 2,6-Pyridinedicarboxylic acid
56
3.3.1 Sistema de eletroforese capilar
Um sistema de eletroforese capilar, mostrado na Figura 3.1, foi projetado
econstruído no laboratório empregando uma fonte de alta tensão, capilares de sílica
fundida de 75 µm de diâmetro interno e fios de platina de 0,3 mm de espessura. O
sistema de injeção de amostras desenvolvido nesta pesquisa apresenta algumas
modificações com respeito ao descrito anteriormente (LAVORANTE et al., 2004). As
modificações realizadas visaram conferir maior robustez, facilidade de manejo e
redução dos volumes de soluções. Em primeiro lugar foi construída uma estrutura
em acrílico constituída por uma base plana, perpendiculares ao plano desta base
foram inseridas duas hastes quadradas que serviram de guia a estrutura que suporta
os componentes do sistema de eletroforese capilar. Esta estrutura consiste numa
vareta retangular com dois orifícios quadrados, para inserção das hastes já
mencionadas e que, permite ajustar a posição vertical da vareta sem incorrer em
variações de altura entre ambos extremos da mesma. Esta vareta possui ademais
ao longo de seu cumprimento, uma caneleta a modo de guia corrediça para encaixe
do sistema injetor, à direita da figura, e o sistema coletor, à esquerda. Este sistema
de encaixe permite o ajuste da distância entre ambos os recipientes, isto possibilita o
emprego de capilares com diferentes cumprimentos, alem de permitir a fácil
substituição de quaisquer dos componentes, por exemplo, quando se realiza o
acoplamento da eletroforese capilar com sistemas de detecção pós-coluna, o
dispositivo do recipiente coletor se substitui pela estrutura para fixação das
respectivas interfaces.
57
Figura 3.1 – Sistema de eletroforese capilar. Foto do sistema de eletroforese capilar projetado no Laboratório de Química Analitica do CENA. 1. Base, 2. Hastes, 3. Vareta, 4. Injetor, 5. Unidade controladora de gás, 6. Válvulas solenóide, 7. Circuito eletrônico, 8. Detector UV/Visível, 9. Recipiente coletor, 10. Fonte de alta voltagem.
O sistema de injeção hidrodinâmico foi também modificado para conseguir
uma melhor precisão nas injeções realizadas, em primeiro lugar se construiu um
injetor empregando-se um tubo recipiente de menor volume, tubo Eppendorf® de 200
µL. Para a injeção hidrodinâmica foi construído um sistema temporizador com duas
válvulas solenóide, conectadas em serie entre uma unidade controladora de gás e o
dispositivo injetor. Os tempos de abertura das válvulas foram controlados por um
circuito eletrônico esquematizado na Figura 3.2, onde o botão S permite a abertura
das válvulas solenóide sem controle de tempo e o botão PBS permite um controle
temporizado de abertura das mesmas.
58
Figura 3.2 – Circuito eletrônico temporizador. Esquema do circuito eletrônico desenvolvido para controle automático do tempo de injeção de amostras no injetor hidrodinâmico. V1 e V2 = válvulas solenóides de três vias; PBS = botão de pulso (trigger); Tr = transistor BC547; D1, D2 e D3 = diodos 1N4007; S = Botao de liga e desliga. O circuito eletrônico contendo um circuito integrado temporizador, 555 IC, atua como controlador dos tempos de acionamento de V1 e V2. (Desenvolvido por Sivanildo S. Borges (PQ).
O controle do tempo de injeção depende do circuito integrado IC555 e, do
valor ajustado no resistor variável de 20 kΩ, segundo especificações do fabricante.
Os tempos controlados por este circuito integrado se regem pela fórmula a seguir,
T= R (Ω)/ 1,1 C (F)
59
onde T é o tempo em que a válvula ficará aberta, R o valor ajustado no
resistor variável, para atingir o tempo de abertura desejado, e C a capacitância em
faraday do capacitor ligado ao resistor variável (1000 F).
As válvulas solenóides utilizadas para a construção do injetor hidrodinâmico
suportam pressões de até 200 kPa e foram dispostas em seqüência, a modo de
barreira dupla com a finalidade de evitar vazamentos do gás para o recipiente do
eletrólito durante a separação eletroforética.
3.3.2 Efeito da variação do pH e da ddp aplicada em eletroforese capilar
Para estudar a influência da variação do pH na solução eletrolítica foram
preparadas soluções de fosfato monobásico e dibásico de sódio em diferentes
proporções, posteriormente foi medido o pH das soluções resultantes de cada uma
das misturas. Estas soluções foram empregadas como tampão eletroforético e, foi
observada a corrente elétrica resultante para cada solução empregada quando
aplicada uma diferença de potencial. A corrente elétrica gerada durante uma
separação eletroforética tem incidência direta na eficiência de separação, correntes
elétricas muito elevadas provocam aquecimento da solução eletrolítica, induzindo
gradientes de temperatura no interior do capilar (MORIN et al., 1992). Na Figura 3.3
se apresenta a variação da corrente elétrica observada quando aplicadas voltagens
de 10 kV e 20 kV em soluções eletrolíticas com diferente pH.
60
4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
100
120
A
pH
10 kV
20 kV
Figura 3.3 – Influência do pH e da ddp aplicada. Variação da corrente elétrica observada com relação aos diferentes pH da solução eletrolítica e à voltagem aplicada.
Como podemos observar, o aumento da corrente elétrica medida não mantém
uma linearidade ao longo do experimento. Esta falta de linearidade se observa
principalmente quando se atingem correntes elétricas mais elevadas e, está
relacionada ao aumento da temperatura no interior do capilar eletroforético, o qual
provoca variações nas propriedades físico-químicas da solução eletrolítica.
Visando um posterior acoplamento da eletroforese capilar com o
espectrômetro de massas com fonte de plasma, todos os procedimentos descritos
nestes dois itens se realizaram empregando HNO3 em concentração 0,5 mol/L no
recipiente coletor, com o intuito de evadir as interferências provocadas pelo íon
40Ar35Cl no canal de leitura m/z 75 quando empregamos HCl como solução auxiliar.
61
3.3.4 Acoplamento do sistema de eletroforese capilar com ICP-MS
Os estudos realizados por Olesik e colaboradores sobre a influência do
volume de solução introduzido no plasma em espectrômetros de emissão ótica ou de
massas com fonte de plasma ICP OES e ICP-MS, empregando vazões de soluções
de amostras da ordem de l/min, comprovando a eficiência da nebulização tanto na
formação do aerossol como no transporte e nos mecanismos de atomização, mesmo
quando empregados volumes da ordem de nl, tiveram vital relevância no
desenvolvimento de acoplamentos de eletroforese capilar com espectrometros
atômicos com fonte de plasma ICP (OLESIK; FISTER, 1991; OLESIK; HOBBS,
1994). Tais estudos levaram a estes autores a publicar em 1995 um trabalho
pioneiro no campo da especiação, acoplando eletroforese capilar com um
espectrômetro de massas com fonte de plasma CE-ICP-MS, para estudar a
separação de espécies de Cr, As, Sr e Sn (OLESIK et al., 1995). A interface
empregada para o acoplamento consistia em um nebulizador concentrico em cujo
canal interno se inseriu, até a ponta, o capilar eletroforético. O segmento final do
capilar eletroforético inserido no canal interno do nebulizador, aproximadamente 4 a
5 cm, foi recoberto externamente com tinta de prata. Esto possibilitou a conexão
elétrica para garantir o aterramento, e foi possivel com esta configuração introduzir
um pequeno volume de amostra no espectrômetro conseguindose um volume morto
muito pequeno. Um ano mais tarde, Kinzer e colaboradores apresentam a primeira
interface que permite a introdução en forma continua de uma solução eletrolítica
auxiliar (KINZER et al., 1996). Nesta mesma linha de pesquisa, ao estudar a
eficiência do acoplamento com o nebulizador DIN (Direct Injection Nebulizer), Liu e
colaboradores propõem a utilização de uma peça em forma de “T” na interface CE-
ICP (LIU et al., 1995). A partir de então surgem diversas pesquisas abordando
62
estudos sobre a eficiência de diferentes nebulizadores empregados na interface CE-
ICP para estudos de especiação (LU et al., 1994; 1995; LU; BARNES, 1996; MEI et
al., 1997; KIRLEW et al., 1998; MAJIDI; MILLER-IHLI, 1998a; 1998b; ACKLEY et al.,
2000; DAY et al., 2000). A separação e detecção de seis espécies de arsênio
empregando eletroforese capilar acoplada à espetrometro de massas com fonte de
plasma CE-ICP-MS foi reportado por (MICHALKE; SCHRAMEL, 1998), conseguindo
limites de detecção de 15 g/l para As(III), MMA, DMA e As(V), e 65 g/l para
arsenobetaina e arsenocolina. Um ano mais tarde, empregando também o
acoplamento CE-ICP-MS, (VAN HOLDERBEKE et al., 1999) conseguem a
separação das mesmas seis espécies atingindo-se limites de detecção de 1-2 g/l.
Para o acoplamento do sistema de eletroforese capilar “caseiro” montado no
nosso laboratório com o espectrômetro de massas com fonte de plasma, foi
necessária a realização de ajuste de novos parâmetros. A interface para o
acoplamento foi construída empregando uma peça de PEEK em formato “T” que
permite a passagem de lado a lado do capilar eletroforético, além da introdução de
um fluxo perpendicular de uma solução eletrolítica auxiliar que possibilita fechar a
corrente elétrica no interior do capilar, assim como o transporte dos analitos
emergentes no extremo terminal para o nebulizador do espectrômetro de massas.
Como observado na Figura 3.5, pelo lado esquerdo da peça em T se fixa o capilar
de modo a evitar não só o desplazamento do mesmo como também possíveis
vazamentos das soluções que fluem no interior do sistema. Através da entrada
perpendicular ao capilar eletroforético, além do tubo correspondente para a
introdução da solução eletrolítica auxiliar, foi inserido um fio de platina de diâmetro
igual a 0,3 mm que ficou em contato com esta solução e permitiu o aterramento para
conferir estabilidade elétrica ao sistema. No extremo emergente desta peça em T foi
63
fixado também um pequeno tubo de diâmetro interno levemente superior ao
diâmetro externo do capilar, com isto se pretendeu possibilitar a passagem de uma
delgada camada de líquido (solução eletrolítica auxiliar), suficiente como para
permitir o contato elétrico sem provocar diluições muito elevadas dos analitos
emergindo do capilar. Este tubo foi inserido no canal de introdução de amostras do
nebulizador do espectrômetro de massas.
Outro parâmetro extremamente importante a ser considerado neste tipo de
acoplamentos resulta ser a posição do capilar no interior do nebulizador.
Observando a Figura 3.4 poderemos entender alguns aspectos da eficiência de
separação assim como da sensibilidade de detecção, relacionados à posição do
capilar no canal do nebulizador. Os nebulizadores concéntricos, como o
esquematizado nesta figura, apresentam um afunilamento de seu canal de
introdução de amostras, este canal se inicia com alguns poucos milímetros de
diâmetro (no extremo de amostragem, à esquerda) para possibilitar a inserção de
tubos de amostragem, o mesmo se afunila na parte média do nebulizador, até atingir
frações de milímetro, inclusive uns poucos micrômetros, dependendo da vazão de
nebulização nominal de cada tipo, mantendo este diâmetro até o final para
possibilitar o efeito Venturi no extremo de nebulização. Deste modo, o extremo
terminal do capilar eletroforético não deve ficar muito longe do afunilamento, como
se mostra na Figura 3.4a uma vez que o volume da solução auxiliar arredor do
capilar será diametralmente superior ao volume interno do mesmo, isto somado aos
escassos nanolitros de amostra injetados no capilar, provocariam uma diluição muito
elevada dos analitos, comprometendo a sensibilidade na detecção. Entretanto, se
considerarmos que, devido ao bombeamento da solução auxiliar se terá a partir
deste ponto um fluxo do tipo pressurizado, se a distância entre o extremo terminal do
64
capilar e o ponto de nebulização for muito grande, ocorrerá junção ou mistura das
espécies com menor separação entre si. Por outro lado, quando posicionamos o
capilar tão perto do afunilamento quanto possível, como observado na Figura 3.4b,
se deve considerar que a vazão da solução auxiliar tem que suprir a vazão de
aspiração do nebulizador, evitando-se assim a aspiração da solução pelo interior do
capilar. Esta vazão, por outro lado, não pode ser maior do que a de aspiração do
nebulizador, de forma a garantir nebulização eficiente. O retorno da solução no
sentido do capilar depende da vazão da solução auxiliar e do posicionamento do
capilar no canal interno do nebulizador. A pressão para o capilar impede a
separação como assim também a saída dos analitos do capilar eletroforético.
Figura 3.4 – Interface CE-ICP. Interface para o acoplamento da eletroforese capilar com
espectrômetros de massas o de emissão ótica com fonte de plasma (CE-ICP). a y b mostram duas posições distintas do extremo do capilar no interior do canal de amostragem do nebulizador.
O procedimento para verificar que estes fenômenos mencionados não estão
ocorrendo consiste no controle da variação de corrente e a formação de gotas na
65
ponta de injeção da amostra no capilar. Se ao aplicarmos a voltagem estabelecida
para a separação eletroforética observarmos instabilidade ou falta de corrente
elétrica significará, ou que pode estar ocorrendo aspiração hidrodinâmica da solução
no interior do capilar, ou a presença de bolhas de ar. Neste trabalho foi utilizado um
nebulizador microconcéntrico de alta eficiência (HEN) com vazão nominal de 100
µL/min.
Os parâmetros para a separação das espécies de arsênio no sistema CE-
ICP-MS se apresentam na Tabela 3.3.
Tabela 3.3 – Condições operacionais do acoplamento CE-ICP-MS para a obtenção dos eletroferogramas apresentados nas Figuras 3.6 e 3.7 respectivamente.
Parâmetros empregados no sistema CE-ICP-MS
Capilar 75 mm d.i. 60 cm
Tampão Fosfato 20 mmol/L; TTAB 1,5 mmol/L; pH 9
Eletrólito auxiliar HNO3 0,5 mol/L
Temperatura Temp. do laboratório 20°C
Injeção das amostras 5 s; 25 kpa
Voltagem aplicada -15 kV
Corrente observada ~35 A
Potência do plasma 1,3 kW
Gás auxiliar 0,5 L/min
Gás de refrigeração 12 L/min
Nebulização(*) 100 L/min
(*) ver texto abaixo
O bombeamento da solução eletrolítica auxiliar na interfase CE-ICP foi
realizado através de uma bomba de seringa e, a vazão de bomeamento foi de 100
L/min, vazão nominal do nebulizador empregado. Segundo recomendações do
66
fabricante, para atingir a vazão nominal do nebulizador microconcêntrico de alta
eficiência deve ser empregada uma pressão do gás de nebulização de
aproximadamente 100 lbf/pol2, para conseguir esta pressão se utilizou uma fonte
externa de gás argônio, um cilindro de 3 m3, de qualidade analítica, equipado com
um manômetro capaz de medir esta pressão com a precisão requerida. A melhor
relação sinal/ruído foi conseguida quando empregamos 114 lbf/pol2, assim sendo,
todas as separações eletroforéticas empregando o sistema CE-ICP-MS foram
realizadas empregando esta pressão do gás de nebulização.
3.3.5 Acoplamento da eletroforese capilar com o ICP-MS e geração de hidretos
na interface
A geração de hidretos têm sido uma das técnicas mais utilizada para a
introdução de espécies gasosas no ICP a partir de amostras líquidas. Espécies
voláteis de As, Se, Sb, Bi e outros elementos sao formados por reducão química
com borohidreto de sódio ou potássio em meio ácido com excelente eficiência
(HOWARD, 1997). Esta técnica tem sido talvez o principal método de derivatização
de amostras na determinação de espécies inorgânicas de arsênio (HOLAK, 1969).
Desenvolvida inicialmente como método para absorção atômica (AAS), onde
o borohidreto (III) de sódio ou potássio (NaBH4 ou KBH4) dissolvido em solucoes
diluidas de hidrôxido de sódio é utilizado como reagente redutor para produzir arsina
em méio ácido (Hung, Nekrassova et al., 2004).
O acoplamento da geração de hidretos em linha com detectores atômicos
AAS (espectrometria de absorção atômica), AFS (espectrometria por fluorescência
atômica) ICP OES (emissão atômica com plasma) e ICP-MS (espectrometria de
massas com plasma), incrementa a sensibilidade da análise, e reduz possíveis
67
efeitos de matriz, (KARTHIKEYAN; HIRATA, 2003). A principal vantagem desta
técnica acoplada ao ICP é que não há necessidade do emprego de nebulizadores,
utilizando, a fase gasosa, separada da fase líquidda num dispositivo de separação
de fases é transportada com maior eficiência para o plasma.
O primeiro acoplamento da eletroforese capilar com detecção por
espectrometria de massas com fonte de plasma e derivatização para a geração de
hidretos voláteis na interface CE-HG-ICP-MS, foi descrito em 1997 por Magnuson e
colaboradores, estes autores reportam a separação de espécies de arsênio em um
tempo inferior a 15 minutos e, em um segundo trabalho reportam a separação de
espécies de arsênio e selênio em 16 min (MAGNUSON et al., 1997a; 1997b).
Nesses trabalhos a separação de fases foi realizada empregando uma membrana
tubular de PTFE expandido de alta densidade, entretanto os hidretos são
transferidos devido a pressão gerada pela reação no interior do sistema. Para evitar
pressão sobre o capilar eletroforético foi utilizando uma mini bomba isolando o
sistema eletroforético do sistema HG-ICP. Mais tarde, Richardson e colaboradores
reportam um sistema de tubos concêntricos para a introdução da solução auxiliar e
dos reagentes HCl e NaBH4 para a reação de geração dos hidretos. A pressão
gerada no interior do sistema contornou-se mediante o controle da vazão e
concentração do ácido e do redutor e, a separação de fases se realizou em uma
câmara ciclônica refrigerada (RICHARDSON et al., 2004). Suárez e Giné (2005),
reportam a separação de espécies inorgânicas de arsênio utilizando como câmara
de separação de fases o corpo de uma seringa de plástico de 10 mL, em cuja base
foram inseridos dois tubos, para entrada do borohidreto de sódio e extração do
resíduo líquido gerado; o ácido, que serviu também como solução eletrolítica auxiliar
foi introduzido mediante uma peça em formato T num tubo concêntrico com o
68
extremo terminal do capilar eletroforético. A solução ácida contendo as espécies
separadas goteja livremente desde uma altura fixa e a reação ocorre ao entrarem as
gotas em contato com a solução redutora no interior da câmara de separação.
Uma vez que a sensibilidade da detecção por CE-UV é muito baixa para as
necessidades analíticas deste trabalho e, recordando que o arsênio é um elemento
químico encontrado em níveis de traços em amostras biológicas e ambientais, após
a avaliação dos parâmetros para as separações eletroforéticas, se procedeu ao
acoplamento deste novo sistema de eletroforese capilar com o espectrômetro de
massas com fonte de plasma, mediante derivatização para a geração dos hidretos
voláteis de arsênio na interface. Esta interface foi construída baseada na interface
apresentada anteriormente (SUÁREZ; GINÉ, 2005), esquematizada na Figura 3.5.
Neste sistema não ocorre pressão contra o capilar porque este encontra-se recuado
dentro de um tubo e a conexão direta da câmara com a tocha facilita o transporte
dos gases, o que aumenta a eficiência de condução dos hidretos para perto de 10%.
A renovação das soluções na base da câmara foi ajustada de forma a evitar efeitos
de memória entre as espécies.
69
Figura 3.5 – Câmara de separação de fases. Interface para o acoplamento de sistemas de eletroforese capilar ou cromatografia líquida projetado e confeccionado no laboratório de Química Analítica do CENA/USP
Neste acoplamento, o gás de nebulização foi empregado para o transporte
dos analitos gasosos gerados na reação de geração de hidretos, um tubo que em
condições normais de operação se conecta ao nebulizador, foi adaptado na lateral
da seringa utilizada como câmara de separação, como se mostra na Figura 3.5. A
otimização da vazão deste gás esta relacionada com a limpeza da câmara de
separação para evitar que os analitos separados no capilar eletroforético se juntem
nesta câmara comprometendo desta maneira a eficiência da análise.
Os parâmetros otimizados para o emprego desta interface no acoplamento
CE-HG-ICP-MS são detalhados na Tabela 3.4 a seguir.
70
Tabela 3.4 – Parâmetros empregados para o acoplamento CE-HG-ICP-MS para separação das espécies de arsênio em amostras de urina e camarão.
Parâmetros empregados no sistema CE-HG-ICP-MS
Capilar 75 mm d.i. 40 cm
Tampão Fosfato 10 mmol/L; TTAB 0,35 mmol/L; pH 10
Eletrólito auxiliar HNO3 0,5 mol/L (1 mL/min)
Borohidreto de sódio 1 % em 0,1% NaOH (0,5 mL/min)
Temperatura Temp. do laboratório 20°C
Injeção das amostras 5 s; 25 kpa
Voltagem aplicada -15 kV
Corrente observada ~60 A
Potência do plasma 1,3 kW
Gás auxiliar 0,5 L/min
Gás de refrigeração 12 L/min
Nebulização(*) 0,6 L/min
(*) limpeza da câmara de separação de fases.
3.4 Resultados e Discussão
3.4.1 Determinação de espécies de arsênio pelo sistema acoplado CE-
ICP-MS
Após a otimização dos parâmetros incumbidos na interface CE-ICP se
realizaram determinações em amostras de camarão. Na Figura 3.6 se apresenta um
eletroferograma de um extrato de camarão seco, como podemos observar ocorreu o
aparecimento de um único pico correspondente à arsenobetaina AsB.
71
0 2 4 6 8 10
0.0
3.0x106
6.0x106
9.0x106
???
AsB
cp
s
t (min)
Figura 3.6 – Eletroferograma de um extrato de camarão seco, extraído em banho de ultra-som empregando-se água como solvente. Se observa o pico correspondente à arsenobetaina além de outros três picos não identificados (?).
No mesmo eletroferograma se observam outras três possíveis espécies não
identificadas, marcadas pelos signos de interrogação.
Na seqüência se procedeu a adicionar na solução da amostra concentrações
conhecidas de arsenito, arsenato, monometil e dimetilarsênio ao extrato, observa-se
na Figura 3.7 a separação das 5 espécies de arsênio num tempo de 11 minutos, a
intensidade do sinal para arsenobetaina foi diminuído devido à diluição sofrida na
mistura das soluções.
72
Figura 3.7 - Separação de espécies de arsênio em amostra de camarão extraída por ultra-
som com água como solvente. Adição de As5+, MMA, DMA e As3+, em
concentração 100 g/L cada expressados como molécula. (As5+: 52,6 %As; MMA: 53,5% As; DMA: 54,3% As; As3+: 59,5% As).
Como observado nesta figura, a recuperação de DMA foi inferior à
recuperação das outras espécies, possivelmente devido a efeitos de matriz. Outros
autores têm relatado discrepâncias na extração aquosa assistida por ultra-som de
DMA em amostras biológicas (WAHLEN et al., 2004). Entretanto, a utilização do
nebulizador de alta eficiência combinado com o ICP-SFMS conferiu a este
acoplamento proposto apresentou maior sensibilidade que outros sistemas
propostos anteriormente (CASIOT et al., 2002) e comparável com os resultados
apresentados por Yang e colaboradores (YANG et al., 2009).
73
3.4.2 Determinação de espécies de arsênio pelo sistema acoplado CE-
HG-ICP-MS
Com a finalidade de conseguir maior sensibilidade na detecção das espécies
de arsênio separadas por eletroforese capilar se empregou o sistema CE-HG-ICP-
MS descrito no item 3.3.5. O eletroferograma apresentado na Figura 3.8
corresponde à separação de quatro espécies de arsênio em soluções padrão em
concentração 50 g/L, como arsênio de: As5+, MMA, DMA, e As3+.
0 2 4 6 8 10
0.00
1.50x106
3.00x106
4.50x106
As3+
DMAMMA
As5+
cp
s
t (min)
Figura 3.8 – Eletroferograma de quatro espécies de arsênio separadas por eletroforese capilar com geração de hidretos na interface e detecção por espectrometria de massas com fonte de plasma. CE-HG-ICP-MS.
Este acoplamento CE-HG-ICP-MS foi empregado também para determinar
espécies de arsênio em amostras de urina contaminadas com quatro espécies de
arsênio, arsenito, arsenato, mono e dimetilarsênio. Um eletroferograma
correspondente a estas amostras se apresenta na Figura 3.9. Podemos observar
74
que os eletroferogramas das amostras diferem levemente dos eletroferogramas
obtidos com as soluções testemunha, isto demonstra a incidência muito forte dos
efeitos de matriz.
0 2 4 6 8 10
4.0x104
8.0x104
1.2x105
As3+
DMA
MMA
As5+
cp
s
t (min)
Figura 3.9 – Eletroferograma de espécies de arsênio em uma amostra de urina contaminada, empregando eletroforese capilar com geração de hidretos na interface com detecção por ICP-SFMS.
O emprego de um eletrólito diferente e um capilar de cumprimento menor que
o empregado no acoplamento CE-ICP, permitiu melhorar o tempo total da análise,
contornando um possível maior tempo resultante da derivatização para geração de
hidretos na interface. Os resultados obtidos, tanto para as soluções padrão como par
as amostras de urina contaminada, apresentaram maior sensibilidade e resolução
dos picos que resultados descritos anteriormente para amostras de água de torneira
e de rio adicionadas com as mesmas espécies estudadas neste trabalho
(MAGNUSON et al., 1997a; RICHARDSON et al., 2004).
75
3.5 Conclusões
Os sistemas acoplados CE-ICP e CE-HG-ICP empregados neste trabalho são
uma ferramenta acessível e robusta para análise de especiação. As análises
empregando os sistemas descritos são realizadas em tempos relativamente curtos.
Estes sistemas devem ser otimizados para cada caso e, procedimentos
analíticos como adição de padrão e testes de recuperação são altamente
recomendados, uma vez que apresentam alta sensibilidade a efeitos de matriz.
76
4 Especiação de As por Cromatografia Líquida Acoplada a
Espectrometria de Fluorescência Atômica
77
Resumo
Neste capítulo se apresentam os fundamentos para a separação e detecção
das espécies de arsênio em amostras de camarão empregando cromatografia
líquida de alta eficiência. Proporciona-se ademais a avaliação dos parâmetros para a
otimização de um sistema acoplado LC-HG-AFS. O sistema LC-HG-AFS foi montado
empregando uma coluna de troca aniônica Hamilton PRP-X-100, uma bomba
isocrática de cromatografia líquida, uma válvula solenóide de três vias para a troca
dos eluentes, uma bomba peristáltica para bombeamento dos reagentes inseridos
pós-coluna e o espectrômetro de fluorescência atômica com sua respectiva câmara
de geração de hidretos.
Visando a redução do volume de resíduos líquidos nocivos para o meio
ambiente, gerados durante as pesquisas, foi implementado de um fluxo adicional de
hidrogênio para a manutenção da chama do espectrômetro de fluorescência. Para
tal fim foi utilizado um rotâmetro adicional com escala adequada para a mensuração
das vazões de hidrogênio empregadas.
78
Abstract
Fundamentals for arsenic speciation in shrimp samples by liquid
chromatography are presented in this chapter. The evaluation of parameters for the
optimization of coupling system LC-HG-AFS are also offered. This system was
ensemble by using an anion exchange column (Hamilton PRP-X-100), an isocratic
chromatography pump, a three way solenoid valve and the atomic fluorescence
spectrometer.
In order to avoid unnecessary large amounts of waste solutions generated
during this research, an additional hydrogen flow was introduced into the HG-AFS
system for flame upholding. For that an additional rotameter was adapted to the
system.
79
4.1 Introdução
A cromatografia é um método físico-químico de separação, baseada na
migração diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes
interações entre a fase móvel e a fase estacionária, imiscíveis entre si (DEGANI et
al., 1998). Diversas forças físicas e químicas atuam entre os componentes da
amostra e as duas fases, as quais determinam a separação e resolução das
espécies, assim a separação pode ser considerada como resultado da distribuição
destas espécies entre as duas fases (FALLON et al., 1987). A cromatografia líquida
de alta eficiência CLAE ou HPLC (do inglês High Performance Liquid Chromatografy)
tornou-se possível devido a tecnologias capazes de empacotar dentro de colunas
altamente resistentes, partículas da ordem de 4 a 10 m. Isto aumentou
consideravelmente a superfície de contato entre a fase móvel e a fase estacionária,
melhorando-se assim a eficiência de separação. Entretanto para possibilitar a
passagem da fase móvel através do empacotamento na coluna, de baixa
permeabilidade, se necessitaram bombas capazes de bombear a elevadas pressões
uma vazão continua sem pulsação, daí que o primeiro nome dado a esta técnica
fosse cromatografia líquida de alta pressão (DEGANI et al., 1998).
A cromatografia de intercâmbio iônico tem seu fundamento nas interações
entre as cargas das moléculas presentes na amostra e as cargas imobilizadas na
fase estacionária. Esta técnica se subdivide em intercambio aniônico e intercambio
catiônico dependendo de que as cargas imobilizadas na fase estacionária sejam
positivas ou negativas respectivamente.
Uma das colunas cromatográficas mais utilizadas em cromatografia líquida
para separação de espécies de arsênio, em diversos tipos de amostras, é a coluna
80
de troca aniônica Hamilton PRP-X100. Esta coluna foi empregada em diversos
trabalhos nos quais realizou-se o acoplamento em linha da cromatografia líquida
com diferentes sistemas de detecção tais como: espectrometria de massas com
fonte de plasma (IC-ICP-MS) para determinação de As(III), As(V), MMA e DMA em
amostras biológicas (THOMAS; SNIATECKI, 1995), determinação de espécies de
arsênio em algas comestíveis (VAN HULLE et al., 2002); para determinação de
espécies de arsênio acumuladas em lá de carneiros expostos a arsenuaçúcares
(RAAB et al., 2002); com geração de hidretos em linha e detecção por
espectrometria de absorção atômica (IC-HG-AAS) para especiação de As(III), MMA,
DMA, arsenobetaina (AsB), arsenocolina (AsC), óxido de trimetilarsina (TMAO) e íon
trimetilarsônio em amostras de urina humana (Tsalev, Sperling et al., 1998);
acoplada a espectrometria de emissão atômica ICP-AES (hoje denominada ICP
OES) para separação de As(III), As(V) e DMA (SCHLEGEL et al., 1994), e com a
derivatização pós-coluna para a geração dos hidretos (IC-HG-ICP-AES) para a
determinação específica de As(III), As(V), MMA e DMA (GETTAR et al., 2000).
Alguns autores têm acoplado esta coluna em sequência com colunas de troca
catiônica, SuperCosil LC-SCX visando a separação de espécies aniônicas e
catiônicas em moluscos (SOROS et al., 2003), Hamilton PRP-X200 para estudos de
estabilidade de espécies de arsênio em raiz (PIZARRO et al., 2003), Alltech
Adsorbosphere SCX 5U para determinação de espécies de arsênio em materiais de
referência (SLEJKOVEC et al., 1999) e detecção por fluorescência atômica (AFS).
81
4.2 Material e Métodos
4.2.1 Reagentes, soluções e equipamentos
Soluções estoque de fosfato monobásico (NaH2PO4) e dibásico (Na2HPO4) de
sódio em concentração 1 mol/L cada uma. O tampão de trabalho foi
semanalmente preparado por diluições adequadas das soluções estoque para
alcançar a concentração e o pH desejados para o carregador e o eluente
empregado na cromatografia líquida.
Ácido fosfórico empregado para o ajuste do pH dos tampões de trabalho,
(Merck, Darmstadt, Alemanha).
Ácido clorídrico (HCl), em concentração 1,5 mol/L para acidificação em linha
das soluções efluentes da coluna cromatográfica, (Merck, Darmstadt,
Alemanha).
Tetrahidroborato de sódio (NaBH4) para a reação de geração dos hidretos
voláteis necessários para a detecção por fluorescência atômica, (Nuclear,
CAQ Casa da Química Ind. e.Com.Ltda., Diadema-SP, Brasil).
Ácido nítrico destilado e metanol de qualidade cromatográfica, (Merck,
Darmstadt, Alemanha), empregados para preparar a solução utilizada para a
regeneração da coluna cromatográfica segundo instruções do fabricante.
Coluna de troca aniônica Hamilton PRP-X100, com dimensões iguais a 250
mm de cumprimento e 4,1 mm de diâmetro, tamanho de partículas de 10
micrômetros, (Hamilton Company, Reno, Nevada-USA).
Bomba isocrática para cromatografia líquida LC-10AD, (Shimadzu
Corporation, Kyoto-Japão).
82
Injetor manual para cromatografia líquida Rheodyne 7125 com alça de injeção
de 100 µL marca, (Rheodyne, Systec, Innovadyne Products, Berkeley,
California-USA).
Válvula solenóide de três vias NR161T031, (NResearch and Development
Incorporated).
Rotâmetro para medição do fluxo adicional de hidrogênio com escala
graduada de 10 a 160 mL/min, calibrada para medição de argônio a 25°C e 3
kPa de pressão, (AppliTech Indústria e Comércio de Equipamentos Industriais
Ltda., Santana de Parnaíba – SP, Brasil).
Bomba peristáltica de oito canais marca Ismatec, (Ismatec S.A., Glattbrugg,
Suiza)
Espectrômetro de fluorescência atômica modelo PSA Excalibur, (PS Analytical
Ltd., Orpington, Kent, Reino Unido).
Câmara de separação de fases para geração de hidretos, própria do
espectrômetro de fluorescência atômica PSA Excalibur.
Todos os reagentes e soluções utilizadas para as análises por cromatografia
líquida acoplada ao espectrômetro de fluorescência foram de grau analítico. As
respectivas diluições levaram-se a cabo empregando água purificada em sistema
Milli-Q com uma resistividade de 18.2 MΩ .cm (Millipore, Bedford, MA, USA).
4.2.2 Sistema LC-HG-AFS
Foi montado no laboratório um sistema acoplado LC-HG-AFS utilizando uma
bomba isocrática para cromatografia líquida, coluna de troca aniônica Hamilton PRP-
83
X100, e um detector de fluorescência atômica PSA Excalibur para arsênio. Devido à
falta de uma bomba de gradiente, se adaptou na entrada da bomba isocrática uma
válvula solenóide de três vias, a qual permitiu intercambiar as soluções empregadas
como eluente na separação cromatográfica através de um controle programável dos
tempos de abertura e fecho da válvula. Um esquema detalhado do sistema montado
se apresenta na Figura 4.1 a seguir.
Figura 4.1 – Esquema do sistema LC-HG-AFS montado no laboratório, A e B são os tampões empregados; V= Válvula solenóide, BP= Bomba Peristáltica, GL= Câmara de separação Gás/Líquido e AFS o detector de fluorescência atômica.
4.2.3 Volatilização das espécies de arsênio
A volatilização dos elementos químicos para fins analíticos foi amplamente
utilizada ao longo dos anos pelos químicos, o conhecido teste de Marsh foi
pioneiramente descrito em 1836 para a identificação de arsênio, mais tarde em 1861
Bloxam descreve um método eletrolítico para formação de arsina (AsH3) e estibina
(SbH3). Devido às vantagens desta técnica, que permite separar o analito de sua
matriz, o emprego da mesma foi explorado para todos os elementos capazes de
formar hidretos voláteis. Desde um ponto de vista analítico a geração de hidretos
84
voláteis considera-se como uma reação de redução do metal ou metalóide a ser
analisado, onde o redutor químico, geralmente zinco metálico ou borohidreto de
sódio (LABORDA et al., 2002).
Várias publicações cientificas hão sido reportadas ao longo dos anos
abordando diversas hipóteses sobre os mecanismos implicados nas reações de
formação dos respectivos hidretos. Neste sentido, Pergantis e colaboradores
apresentaram um estudo dos mecanismos de reação na geração de hidretos de
arsênio, empregando reagentes marcados com deutério e análise por espectrometria
de massas (PERGANTIS et al., 1997). No mesmo ano, Howard apresentou uma
visão do emprego da geração de hidretos em análise de elementos traços
(HOWARD, 1997).
Além do arsênio, outros elementos químicos como antimônio, bismuto,
germânio, chumbo, selênio, telúrio, estanho e vanádio são elementos formadores de
hidretos voláteis (LABORDA et al., 2002). A geração de hidretos de cádmio e zinco
também foi descrita para detecção por espectrômetros de fluorescência atômica
(SUN et al., 2002; LI et al., 2004). Mais recentemente D’Ulivo e colaboradores
publicam um estudo sobre os mecanismos de reação implicados na formação de
hidretos voláteis de bismuto, antimônio, arsênio, germânio, estanho e selênio
empregando compostos deuterados e espectrometria de massas (D'ULIVO et al.,
2005). Esse mesmo ano foi publicada uma revisão criteriosa e completa sobre os
mecanismos de geração de hidretos e a atomização em espectrometria de absorção
atômica (AAS) (KUMAR; RIYAZUDDIN, 2005).
Devido aos excelentes limites de detecção atingidos quando se aplica a
técnica de geração de hidretos voláteis, especialmente quando acoplada a métodos
de atomização como, por exemplo, tubos de quartzo aquecido, espectrômetros de
85
absorção atômica, de fluorescência atômica ou de emissão ótica com fonte de
plasma, esta técnica é amplamente empregada para determinação de elementos em
uma extensa diversidade de matrizes tais como amostras ambientais, biológicas ou
alheações metálicas (CAMPBELL, 1992; LABORDA et al., 2002).
A técnica mais comumente utilizada para a volatilização das espécies de
arsênio é a reação com borohidreto de sódio (NaBH4) em meio ácido, geralmente
ácido clorídrico (HCl). O primeiro trabalho encontrado nos sítios de busca cientifica
data de 1960, onde a detecção de hidretos de arsênio, selênio, antimônio, bismuto,
telúrio, chumbo e estanho em amostras de carvão mineral foram reportados
empregando-se um tubo de quartzo aquecido (NADKARNI, 1982). Uma vantagem
muito importante desta técnica é que não há necessidade de se utilizar
nebulizadores, a fase gasosa é separada da fase líquida impedindo o arraste dos
sólidos para dentro do plasma, o que provocaria um elevado efeito memória e baixa
eficiência de ionização.
Embora a condição ácida para a reação de geração de hidretos seja mais
comumente proporcionada pelo emprego de ácido clorídrico, as condições de
reação assim como a eficiência da geração dos hidretos de arsenito As(III), arsenato
As(V), ácidos monometil e dimetilarsênio (MMA e DMA), empregando-se diferentes
ácidos orgânicos e inorgânicos foi estudado por Anderson e colaboradores
(ANDERSON et al., 1986). Entretanto, na determinação de hidretos de arsênio por
espectrômetros de massas com fonte de plasma (ICP-MS), a escolha de outro ácido
como ácido tioglicólico ou nítrico é recomendável devido á interferência espectral
ocorrida na massa 75 provocada pelo íon 40Ar35Cl+ produzido no plasma.
Embora as espécies de arsênio mais comumente conhecidas como
formadoras de hidretos sejam as espécies mais tóxicas arsenito, arsenato e os
86
ácidos mono e dimetil arsênio, a faixa de espécies de arsênio capazes de ser
detectadas mediante formação de hidretos voláteis pode ser ampliada através da
incorporação de processos de decomposição post-coluna, onde as espécies não
reativas são convertidas em arsenato (AsV) antes da reação de volatilização
(DAGNAC et al., 1999; GOMEZ-ARIZA et al., 2000a). De fato alguns autores
utilizaram a distinção entre espécies borohidreto reativas e não reativas, fato este
que levou à proposição de aplicar métodos analíticos para determinação de
espécies toxicologicamente relevantes em alimentos, baseados na presunção de
que estas espécies são hidreto reativas enquanto outras espécies presentes em
alimentos, principalmente arsenobetaina e arsenoaçúcares seriam espécies não
reativas (SCHMEISSER et al., 2004). No entanto este último enfoque pode ser
confrontado devido à publicação em 2002 da presença de uma pequena resposta de
arsenoaçúcares à geração de hidretos sem o emprego de decomposição pós-coluna
(SANCHEZ-RODAS et al., 2002). Este fato foi confirmado mais tarde com o relato da
determinação de quatro espécies de arsenoaçúcar mediante geração de hidretos
pós-coluna e detecção por espectrometria de massas com fonte de plasma (ICP-MS)
(SCHMEISSER et al., 2004). Entretanto, a identificação e quantificação de
tioarsenoaçúcares ((CH3)2AsX-açúcar-R) onde X pode ser um oxigênio ou sulfeto e
R= OH, PO4, SO3 ou -SO4, ácido dimetilarsinoil acético DMAA, dimetilarsinoil etanol
DMAE e um análogo sulfídrico do ácido dimetilarsenico DMAS (REGMI et al., 2007).
4.2.4 Espectrometria de Fluorescência Atômica
O emprego da fluorescência atômica como técnica analítica foi pioneiramente
descrito por Winefordner e colaboradores no ano de 1964, os quais, no mesmo ano
87
publicam um artigo descrevendo a determinação de zinco, cádmio e mercúrio por
espectrometria de fluorescência atômica (WINEFORDNER; STAAB, 1964;
WINEFORDNER; VICKERS, 1964). Até então a fluorescência atômica era
empregada para estudo da estrutura eletrônica dos átomos (BROWNER, 1974).
A fluorescência atômica consiste na excitação de átomos por fótons, para
produzir átomos excitados que emitiram uma radiação durante um brevíssimo
período de tempo (nano segundos), quando retornarem ao estado fundamental. A
fonte de excitação pode ser uma fonte de linha estreita, onde a meia largura
espectral da radiação será mais estreita do que a linha de absorção dos átomos do
analito no atomizador; ou uma fonte contínua ou semicontínua, onde a meia largura
espectral da radiação de excitação e maior do que a linha de absorção do analito no
atomizador. A intensidade da fluorescência dependerá criticamente da intensidade
da fonte de excitação, assim como da concentração dos analitos presentas nas
amostras estudadas (WINEFORDNER, 1978).
A espectrometria de fluorescência atômica oferece maior sensibilidade e
limites de detecção mais baixos, comparada com a espectrometria de absorção
atômica convencional, principalmente para metais cujas líneas de ressonância
fundamental recaem abaixo de 320 nm. Um bom enfoque para o uso de
espectrômetros de fluorescência atômica é a introdução de amostras gasosas, que
faz menos crítica a escolha do sistema de atomização. Assim a cromatografia
gasosa e a geração química de vapor (CVG) consideram-se os sistemas ideais de
introdução de amostras para AFS. Em geral, se empregam espectrômetros de
fluorescência atômica não dispersivos com fotomultiplicadores sensíveis unicamente
à radiação UV (não detectam a radiação solar), com resposta típica entre 160 e 320
nm com ou sem o uso de filtros óticos que reduzem a faixa espectral empregada.
88
Detectores de fluorescência atômica não dispersivos são simples e permitem a
detecção simultânea de varias líneas do espectro (D'ULIVO et al., 2009). Em
espectrômetros de fluorescência comerciais, como o PS Analytica, a atomização se
realiza em uma chama, alimentada pelo hidrogênio proveniente da reação de
geração dos hidretos com NaBH4 concentrado 1,5-4% m/v, em meio fortemente
ácido (geralmente 30% HCl). Para a manutenção desta chama se requer fluxos
elevados de reagentes, 4,5 mL/mincom a conseqüente geração de grandes volumes
de resíduos químicos. Dédina e colaboradores em 1998 desenvolveram o “Miniature
Ar-H2 Diffusion Flame” (MDF), que consistia na utilização de uma mistura 70/30 de
argônio e hidrogênio respectivamente, obtendo assim uma chama miniaturizada,
mais estável e com menor interferência que a chama dos atomizadores
convencionais (DÉDINA et al., 1998).
4.2.5 Acoplamento da coluna de cromatografia líquida com o Espectrômetro de
Fluorescência Atômica
Com o sistema LC-HG-AFS montado, procedeu-se à realização dos estudos
para a obtenção da melhor sensibilidade do sistema. Para escolher as vazões do
ácido e do redutor envolvidos na reação de geração dos hidretos, tomou-se como
parâmetro o sistema convencional de operação do gerador das espécies voláteis,
acoplado ao detector de fluorescência atômica, as vazões do ácido e do carregador
de amostras correspondem a duas vezes a vazão do redutor, sendo estas 9 mL/min
para os dois primeiros e 4,5 mL/min para o redutor respectivamente. Levando em
consideração que, no sistema convencional estas vazões são imperativas, devido á
necessidade de geração de grandes volumes de hidrogênio para a manutenção da
89
chama no detector de fluorescência atômica e, uma vez que no nosso sistema
implementou-se um fluxo adicional de hidrogênio para tal fim, as quantidades de
ácido e de redutor seriam estritamente necessárias para a geração das espécies
voláteis. Uma vez que a quantidade de amostra injetada seria da ordem de, no
máximo 100 L, não há a necessidade de consumir tais volumes de reagentes. Por
tanto, foram escolhidos para o bombeamento do ácido e do redutor, tubos de tygon®
de diâmetros diametralmente inferiores aos empregados no sistema convencional,
no entanto manteve-se a proporção 2:1 antes mencionada. Uma vez fixado o
tamanho dos tubos de bombeamento a otimização das vazões empregadas levou-se
à cabo por variação da freqüência de rotação da bomba peristáltica.
Os estudos de otimização do sistema foram levados a cabo empregando-se
uma solução padrão de concentração 30 µg/L de As3+, os seguintes parâmetros
foram investigados:
Vazão do gás hidrogênio implementado para a manutenção da chama
no espectrômetro de fluorescência atômica.
Vazão dos reagentes implicados no sistema, HCl, NaBH4 e da bomba
cromatográfica.
Vazão do gás de arraste (Argônio)
Implementação de um fluxo auxiliar de gás de arraste
Combinação dos parâmetros de sensibilidade do software de controle
do espectrômetro de fluorescência atômica e da sensibilidade do
próprio detector.
90
4.3 Resultados e Discussão
4.3.1 Efeito das vazões de hidrogênio e argônio
Com a finalidade de evitar a produção de grandes volumes de resíduos
líquidos, quando se faz necessária a manutenção da chama do espectrômetro de
fluorescência atômica mediante altas vazões do ácido e do redutor, como
mencionado na secção 4.2.5, implementou-se um fluxo adicional de hidrogênio. O
controle da vazão do hidrogênio implementado no sistema se realizou, num primeiro
passo, mediante um dos rotâmetros próprios do equipamento, os quais possuem
graduação de 0 a 600 cm3/min, com incremento de escala de 25 em 25 unidades.
Uma vez que a vazão mínima requerida para manter acesa a chama no
espectrômetro resultou entre 50 e 75 cm3/min, decidiu-se adquirir um rotâmetro
capaz de mensurar vazões menores para obter melhor ajuste e visualização da
escala. Adquiriu-se então um rotâmetro com escala de 10 a 160 cm3/min e
incrementos de 10 cm3/min calibrado para argônio.
A vazão mínima requerida para ligar a chama do espectrômetro de
fluorescência, empregando o novo rotâmetro, resultou ser 70 cm3/min. Entretanto,
quando se introduz na câmara de separação argônio como gás auxiliar para um
melhor transporte dos analitos separados para o detector verificou-se a extinção da
chama por diluição do hidrogênio auxiliar. Experimentos subseqüentes revelaram
que a vazão mínima de do hidrogênio auxiliar para manter a chama era de 80
cm3/min, empregando argônio somente para limpeza da câmara de separação de
até 1 L/min. Entretanto quando aplicada uma vazão de hidrogênio superior a 100
cm3/min, perde-se qualquer sinal devido à saturação do detector. Por tanto, a vazão
do hidrogênio auxiliar resulta um parâmetro crítico para a sensibilidade do sistema,
91
fato este que já foi relatado anteriormente (GOMEZ-ARIZA et al., 1998). A vazão
ótima de trabalho para o gás hidrogênio auxiliar, resultou ser de 90 cm3/min.
De igual modo que o gás hidrogênio implementado, o gás argônio empregado
na câmara de separação para limpeza desta e transporte dos hidretos gerados, joga
um papel importante na sensibilidade do sistema acoplado. Vazões muito baixas
deste gás provocam um transporte ineficiente dos analitos para o detector,
resultando em picos muito largos e, podendo verificar-se inclusive superposição
destes picos cromatográficos. Por outro lado, quanto menor o volume de gás
argônio, maior será a concentração de hidrogênio na chama do espectrômetro e,
como já mencionamos no item 4.3.1, isto provoca uma saturação no detector.
Entretanto, uma vazão muito elevada provoca perda de sensibilidade devido a um
menor tempo de permanência dos analitos na chama do espectrômetro (fonte de
excitação dos átomos), além disto provoca a diluição da concentração de hidrogênio
levando a extinção da chama.
4.3.2 Efeito da vazão dos reagentes inseridos pós-coluna
A vazão dos reagentes empregados pós-coluna para as reações de geração
dos hidretos voláteis joga também um papel importante na cinética de reação,
limpeza da câmara de separação e conseqüentemente na sensibilidade do sistema.
Uma vez decididas as medidas de tubos de bombeamento e, mantendo-se
aproximadamente a relação 2:1 para as vazões de ácido e redutor respectivamente,
mencionados na seção 4.2.5, procedeu-se à modificação das velocidades de
rotação da bomba peristáltica entre 20 e 40 rpm (rotações por minuto), obtendo-se
vazões de 0,8 a 1,6 mL/min para o ácido e de 0,5 a 1,0 mL/min para o redutor.
92
Sob estas condições houve uma melhora na intensidade do sinal quando
aumentada a rotação da bomba até 25 rpm, mantendo-se significativamente
invariável na faixa de 25 a 30 rpm, com decréscimo do mesmo acima deste valor.
Esta perda de sensibilidade deve-se provavelmente ao fato de que velocidades de
bombeamento muito elevadas implicam menor tempo de contato dos reagentes com
as espécies emergentes da coluna cromatográfica, afetando a cinética da reação.
Por outro lado, vazões muito baixas, resultam em menor tempo de limpeza do
sistema resultando em uma junção das espécies separadas na coluna com
superposição dos picos obtidos no cromatograma.
Entretanto, no estudo da vazão ótima de trabalho da bomba cromatográfica
foram testados 1,0 e 1,5 mL/min para a fase móvel. Embora hajamos conseguido um
menor tempo de análise quando aplicada a vazão de 1,5 mL/min, como podemos
observar na Figura 4.2, sob estas condições obteve-se um maior erro na
repetibilidade dos tempos de retenção das espécies, principalmente para o As5+, o
mais fortemente retido na coluna e, em alguns casos se verificou uma superposição
dos picos correspondentes a DMA e MMA. A excelente repetibilidade dos tempos de
retenção para a espécie As3+ observada nesta figura se deve á não retenção desta
espécie na coluna cromatográfica empregada.
93
0 2 4 6 8 10 12
0
50
100
150
200
Alt. (U
F)
t (min)
As3+
DMA
MMA
As5+
Figura 4.2 – Cromatograma de quatro espécies de arsênio, em diferentes concentrações, quando empregada uma vazão da bomba cromatográfica igual a 1,5 mL/min.
4.3.3 Efeito das combinações de ajuste da sensibilidade do detector
O espectrômetro de fluorescência atômica para análise de arsênio PSA
Excalibur possui um resistor variável graduado na escala de 0 a 10 com subdivisões
de 0,1 que permite modificar o ganho do sinal durante as análises visando melhorar
a sensibilidade de detecção. Além deste dispositivo, chamado de “ganho fino do
detector”, o software próprio do equipamento, para ajuste de parâmetros da análise
como filtros de aquisição de dados, curva de calibração, identificação das amostras,
diluições realizadas etc., permite também aumentar a sensibilidade do detector em
1(uma), 10 (dez), 100 (cem) ou 1000 (mil) vezes. Este recurso é chamado de “ganho
grosso” do equipamento e o valor ajustado nele multiplica o valor ajustado no
detector, conseguindo-se assim uma escala de sensibilidade (amplificação do sinal)
de 0,1 a 10000.
94
Considerando que, quando aumentamos a sensibilidade do detector
conseqüentemente incrementamos também a magnitude do sinal de fundo (ruído do
sinal), com a finalidade de determinar as melhores condições para as análises
cromatográficas realizadas durante esta trabalho, se procedeu a verificar a resposta
do detector do espectrômetro de fluorescência atômica com diferentes combinações
de amplificação de sinal. Se levássemos em consideração apenas os valores inteiros
de ambos parâmetros, no mínimo teríamos 40 combinações, se fixou um número
determinado de combinações, os quais se apresentam na Figura 4.3.
4.0 4.5 5.0 5.5
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Altu
ra (
UF
)
Tempo (min)
100-1
100-3
100-6
100-9
1000-1.5
1000-2
Sensibilidade
Figura 4.3 – Sensibilidade do detector de fluorescência atômica. Cromatograma de uma
solução padrão de As3+ em concentração 10 g/L indicando a variação na relação sinal ruído com as diferentes combinações de sensibilidade do
detector empregadas, utilizando alça de amostragem de 100 L.
Como esperado (Figura 4.3), a relação sinal/ruido aumenta
consideravelmente com o aumento da faixa de amplificação do espectrômetro de
fluorescência, o que permitiria atingir limites de detecção da ordem dos ng/L.
Entretanto, também podemos observar uma ligeira instabilidade da linha de base
95
para valores de amplificação acima de 1000 onde, embora a razão sinal/ruído não
se veja afetada, a linha de base forma um desenho de ondas ao longo do
cromatograma. Assim, em caso de aparecer um pico quando a onda estiver no seu
ponto máximo, teríamos perda de sinal por saturação do detector. Esta instabilidade
se deve à elevada corrente elétrica induzida no detector quando se aumenta o seu
ganho. Observados estes resultados, se procede a realizar todas as determinações
cromatográficas com a combinação software/detector 100/9 (900 de amplificação).
Uma vez estabelecidas as melhores condições para a determinação das
espécies formadoras de hidreto empregando o sistema acoplado LC-HG-AFS, se
procedeu a análise dos extratos de amostras de camarão seco moído e liofilizado,
obtidos por extração em banho de ultra-som empregando água como solvente.
Como esperado, as amostras de camarão e de tubarão não apresentaram
espécies formadoras de hidreto. Entretanto, na Figura 4.4 se mostra um
cromatograma em triplicata da separação das quatro espécies de arsênio estudadas,
adicionadas em concentrações aleatórias ao extrato de camarão.
0 2 4 6 8 10 12
0
20
40
60
80
100
120
UF
Tempo
As3+
DMA
MMA
As5+
Figura 4.4 - Triplicata da separação de quatro espécies de arsênio, As3+, DMA, MMA e As5+
pelo sistema acoplado LC-HG-AFS, empregando as condições de trabalho apresentadas na Tabela 4.1.
96
Na Tabela 4.1 são apresentados os parâmetros operacionais escolhidos para
o funcionamento do sistema LC-HG-AFS, decorrentes dos resultados obtidos nos
estudos prévios. Entanto que na Tabela 4.2 se apresentam os tempos de
aparecimento de cada espécie no cromatograma assim como seus respectivos
desvios.
Tabela 4.1 – Parâmetros de operação do sistema acoplado LC-HG-AFS.
Espectrômetro de Fluorescência Atômica
Detector Excalibur PSAnalytical
Comprimento de onda 193,7 nm
Largura de banda 20 nm
Corrente primaria 27,5 mA
Corrente do boost 35,0 mA
Vazão do H2 auxuliar para formar a
chama
90 (400,7 corrigido) mL/min
Geração de Hidretos
Solução ácida HCl 1,5 mol/L (1 mL/min)
Agente redutor NaBH4 1,5% m/v em 0,1 mol/L de NaOH (0,6 mL/min)
Vazão do Ar da câmara de separação 600 mL/min (na camara de separação)
Vazão do Ar auxiliar 350 mL/min
Cromatografia Líquida
Coluna Hamilton PRP-X100 (250 x 4,1 mm i.d., partículas de 10
m)
Temperatura da coluna Temperatura do laboratório (23-26°C)
Vazão da fase movel 1 mL/min
Fase móvel A 12 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4; pH 6,22
Fase móvel B 24 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4; pH 6,22
Seqüência de Eluição 0-5 min A, 5-12 min B, 12-15 min A
97
Tabela 4.2 – Tempos de retenção de cada espécie de arsênio estudada quando
empregada uma vazão constante de 1 mL/min.
Espécie As3+ DMA MMA As5+
T de retenção (min) 4,898 ± 0,012 6,261±0,009 8,035 ± 0,038 9,726 ± 0,006
Os limites de detecção encontrados para as quatro espécies estudadas
empregando este sistema acoplado, considerando 3 foi de 2,10 g/L para As3+;
3,82 g/L para DMA; 2,23 g/L para MMA e 1,19 g/L para As5+ respectivamente,
expresados em concentrações de arsênio. Valores uma vez mais um pouco acima
dos valores relatados anteriormente (GOMEZ-ARIZA et al., 1998). Entretanto o
sistema mostrou-se satisfatoriamente robusto e sensível para as aplicações deste
trabalho.
4.4 Conclusões
O sistema acoplado LC-HG-AFS mostrou-se robusto e sensível para as
determinações de espécies de arsênio. A implementação de um fluxo auxiliar de
hidrogênio para a manutenção da chama no espectrômetro de fluorescência atômica
resultou de vital importância, não só na redução de volumes de resíduo gerados
como também na sensibilidade do sistema devido à formação de uma chama mais
estável. Em comparação com outras técnicas espectrométricas como ICP-MS ou
ICP OES o espectrômetro de fluorescência atômica resulta mais barato e fácil de
98
manipular. Com tudo, a sensibilidade e os limites de detecção do sistema podem ser
ainda melhorados.
99
5 Minimização dos Resíduos Gerados Durante a Pesquisa
100
Resumo
Nesta pesquisa foi utilizado um sistema de análises químicas com injeção
seqüencial para a manipulação de micro-volumes de amostras e soluções padrão de
espécies de arsênio, visando a redução de resíduos líquidos contendo arsênio na
especiação por eletroforese capilar acoplada a um espectrômetro de massas com
fonte de plasma. Foi desenvolvido um dispositivo com controle eletrônico para a
injeção hidrodinâmica de pequenos volumes no capilar eletroforético atingindo-se
precisões menores do que 2%. Este sistema foi otimizado para a determinação de
cinco (5) espécies de arsênio em urina liofilizada e extratos de camarão empregando
um volume de 50 L da solução das amostras.
101
Abstract
Sequential injection analysis is proposed for managing micro-volumes of sample and
arsenic species solutions for speciation analysis by capillary electrophoresis focusing
on the reduction of hazardous waste residues. An electronically controlled
hydrodynamic injector was projected to introduce micro-volumes of solutions
prepared by SIA into the CE capillary with precision better than 2%. The
determination of arsenite, arsenate, monomethylarsonic acid, dimethylarsinic acid,
and arsenobetaine was performed from 50 uL volumes of lyophilized urine and
extract of shrimp with the system hyphenated to inductively coupled plasma mass
spectrometry (CE–ICP–MS).
102
5.1 Introdução
As metodologias analíticas para a especiação de arsênio tem sido e,
provavelmente continuaram sendo, profundamente estudadas devido à alta
toxicidade deste elemento. Entretanto o desenvolvimento de metodologias analíticas
implica largas horas de investigação e ajustes dos parâmetros envolvidos na
otimização destas metodologias. Assim sendo, incorre-se indefectivelmente na
produção de grandes volumes de soluções de descarte ricas em arsênio. Compete
então, a nós pesquisadores, incluir nestes procedimentos, metodologias que visem
minimizar o volume de resíduos gerados, tanto durante a otimização dos processos
analíticos como das análises em si.
Dentre as metodologias mais comumente usadas na análise por especiação
encontramos a que inclui técnicas de separação, como são, por exemplo, a
cromatografia líquida e a eletroforese capilar (LC e CE do inglês Liquid
Chromatography e Capillary Electrophoresis respectivamente). A combinação destas
duas técnicas de separação, com técnicas de detecção de alta sensibilidade como
são a espectrômetria de massas e de emissão ótica com fonte de plasma (ICP-MS e
ICP OES) tem sido amplamente empregada para especiação de arsênio
(TERLECKA, 2005). No entanto, a derivatização para a volatilização das espécies
separadas tem sido implementada com o intuito de melhorar a eficiência de
transporte destes analitos para os detectores, (MAGNUSON et al., 1997a). A system
combining capillary electrophoresis with hydride generation was successfully
hyphenated to ICP OES for this purpose (SUÁREZ; GINÉ, 2005).
Além de apresentar alta resolução dos picos no eletroferograma e, a
possibilidade de se terem a separação das espécies aniônicas e catiônicas numa
103
única análise, a eletroforese capilar apresenta a vantagem de necessitar µ L de
amostras, com a conseqüente geração de baixos volumes de resíduos. Estas
características da eletroforese capilar representam um importante rol considerando a
instabilidade das espécies arsenito (As3+) e arsenato (As5+) em meio aquoso (HALL
et al., 1999) entretanto implicam na necessidade de preparar diariamente as
soluções padrão multi-espécies e a conseqüente produção de maiores volumes de
soluções de descarte com alto teor de arsênio.
Um método não cromatográfico para a especiação de compostos de arsênio
em amostras de peixes tem sido descrito, empregando a geração dos hidretos
voláteis de arsênio e detecção por fluorescência atômica (HG-AFS) (CAVA-
MONTESINOS et al., 2005). Entretanto, com estes procedimentos, além da
necessidade de tratamentos matemáticos e estatísticos, geram-se grandes
quantidades de resíduos líquidos com elevado grau de acidez e teores de arsênio.
Considerando-se, que, para a geração dos hidretos voláteis das diferentes espécies
de arsênio torna-se necessária a otimização de processos separados para cada
espécie, além de mais uma etapa de digestão das amostras para a determinação do
teor total de arsênio.
A preparação de soluções analíticas empregando sistemas de injeção em
fluxo (FIA do inglês Flow Injection Analysis) em linha com os sistemas de detecção
tem sido descrito anteriormente (HINDSON et al., 2004). Sistemas em fluxo com
injeção seqüencial (SIA do inglês Sequential Injection Analysis) acoplados com
eletroforese capilar têm sido propostos para efetuar injeção hidrodinâmica de
pequenos volumes de amostra dentro do capilar eletroforético (FANG et al., 1999;
KUBAN et al., 1999; WU et al., 2002; KULKA et al., 2006; HORSTKOTTE et al.,
2007).
104
A principal vantagem dos sistemas SIA reside na sua flexibilidade e
versatilidade para a automatização completa da pré-mistura de pequenos volumes
de amostras e soluções padrão, com a possibilidade de manipulação de micro-
volumes. Visando melhorar a versatilidade do pré-tratamento em linha das amostras
e, a total automatização do sistema em combinação com a eletroforese capilar, foi
descrito em 2002 um procedimento, aproveitando a miniaturização de um sistema
SIA, para misturar micro-volumes de soluções (µSI) empregando um dispositivo Lab-
On-Valve (LOV) (WU et al., 2002). Outros autores propuseram um sistema
completamente automatizado combinando µSIA em linha com eletroforese capilar
(µSIA-CE) empregando seringa de 100 µL para preparar diferentes misturas de
adenosina e adenosina monofosfato com propósitos de calibração do sistema
analítico (KULKA et al., 2006). Nesse trabalho reporta-se a injeção hidrodinâmica
das amostras, soluções padrão e soluções para o recondicionamento do capilar. A
conexão em linha de ambas técnicas requer a automatização completa do processo
analítico incluindo o recondicionamento e limpeza do capilar eletroforético. Embora
seja informado neste trabalho a injeção de 40 nL de amostra e uma precisão de 5%
das áreas dos picos detectados por UV, não se reporta o volume necessário para
preencher o sistema completo até o capilar.
Mais recentemente, (HORSTKOTTE et al., 2007) descrevem a completa
automatização de um sistema SIA-CE para injeção de amostras e soluções padrão,
assim como também das soluções requeridas para o condicionamento do capilar
eletroforético. Estes autores reportaram a necessidade de 100 µL de solução para
cada injeção no capilar.
Nesta pesquisa, a capacidade do sistema µSIA de manipular pequenos
volumes foi explorada para a preparação in-situ de micro-litros de soluções padrão
105
contendo espécies de arsênio, visando empregar estas soluções seja, nos
processos de calibração externa ou adição de padrão para identificação e
quantificação das espécies. Estas soluções foram depositadas em pequenos
recipientes de 200 µL para a sua posterior injeção hidrodinâmica no capilar
eletroforético.
5.2 Material e Métodos
5.2.1 Sistema de Injeção Seqüencial
Um sistema de injeção seqüencial SIA Lab® (FIAlab Instruments Inc.,
Bellevue, WA, USA) foi empregado para preparar micro-volumes de soluções padrão
mixtas de multi-espécies. O sistema SIA foi equipado com uma válvula de oito vias,
uma seringa de vidro de 500 µL, uma bobina de de 30 cm de comprimento e 0,2 mm
i.d. de poliéter éter cetona (PEEK do inglês polyether ketone). Capilares de PEEK de
10 cm de comprimento e 65 um i.d.foram utilizados para a conexão das vias da
válvula do SIA com os recipientes contendo as soluções a serem misturadas para o
preparo dos padrões.
5.2.2 Injeção Hidrodinâmica
O dispositivo para injeção hidrodinâmica similar ao descrito anteriormente por
Lavorante e colaboradores (LAVORANTE et al., 2004) foi construído com um tubo
de 200 µL (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha) e instalado numa plataforma em
acrílico. Para favorecer a injeção hidrodinâmica foi acoplada ao sistema uma
unidade controladora de gás, (DGU unit, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão)
106
conectada a um cilindro de argônio de 1 m3 (Oxipira, Piracicaba-SP, Brasil). Para
melhorar a precisão e minimizar possíveis erros sistemáticos devido ao operador foi
desenvolvida uma interface com circuito eletrônico temporizado para controlar duas
válvulas solenóides de três vias acopladas em sequencia (NResearch, Stow, MA,
USA). Detector espectrofotométrico ( LabAlliance, mod.500, State College, PA, USA)
e provido de software cromatográfico (CSW 1.7, Data Apex Ltd., Praga, República
Tcheca).
5.2.3 Interface CE-ICP-MS
O sistema de eletroforese capilar foi construído no laboratório empregando-se
capilares de sílica fundida de 75 µm i.d. (Polymicro Technology, Phoenix, AZ, USA) ,
como eletrodos foi empregado 3,5 cm de fios de platina de 0,3 mm de diâmetro
(Loccus, Biotech, São Paulo, Brazil) conectados a uma fonte de alta voltagem (CZE-
1000R, Spellman, Hauppauge, NY, USA).
A interface CE-ICP-MS foi acoplada usando uma peça de PEEK em forma de
T (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA, USA) através da qual passa o capilar
eletroforético .
107
Figura 5.1 – Peça em formato T para o acoplamento CE-ICP-MS. Observa-se nesta figura a passagem do capilar através dela, além da inserção perpendicular ao capilar para a platina e o tubo para bombeamento da solução auxiliar.
Foi usada uma bomba peristáltica de oito canais (Ismatec, mp-8, Zurich,
Switzerland). Um tubo de polietileno de 3 cm de comprimento e 0,5 mm i.d. , uma
conexão em T e um nebulizador de alta eficiência (HEN Meinhard, Santa Ana, CA,
USA), o qual, foi inserido numa câmara de nebulização do tipo ciclônica. O ICP-MS
(Element 1, Finnigan MAT, Bremen, Germany), foi empregado para a detecção das
espécies de arsênio.
5.3 Procedimento Experimental
A manipulação das soluções no sistema SIA foi otimizada de forma
independente da separação eletroforética. Esta configuração independente de
ambos os sistemas foi adotada visando reduzir o volume de soluções de descarte
contendo arsênio e, a possibilidade de reduzir o tempo da análise por superposição
108
dos processos de preparo das soluções a serem injetadas no capilar e o
recondicionamento do mesmo.
O sistema proposto foi empregado para analisar espécies de arsênio em
amostras de camarão e urina por acoplamento de um sistema de eletroforese capilar
ao espectrômetro de massas.
5.3.1 Injeção Seqüencial para preparo das soluções padrão
O injector sequencial esquematizado na Figura 5.2, foi programado para
preparar diariamente 500 µL de soluções padrão mistas na concentração de 200
µg/L para cada espécie.
Figura 5.2 - Representação esquemática do sistema SIA, com uma bomba de seringa de 500 µL e uma bobina para mistura das soluções também de 500 µL e o recipiente para a posterior injeção hidrodinâmica de 200 µL.
109
Na seqüência de ações programadas as soluções aspiradas pela bomba de
seringa do SIA desde seus respectivos recipientes foram misturadas na bobina de
mistura e, revertendo a direção do fluxo do bombeamento, foram posteriormente
depositadas nos tubos Eppendorf® de 200 µL. Estes tubos de 200 µL foram
posteriormente encaixados no injetor do CE.
As soluções de padrões secundários foram preparadas pelo SIA e a partir
delas, devidamente misturadas, foram preparadas as soluções multi-espécies
necessárias para o ajuste dos parâmetros eletroforéticos. A adição das soluções de
espécies individuais foi efetuada nas amostras, tanto para propósitos de
identificação das espécies nas amostras como para quantificação das mesmas.
5.3.2 Introdução de amostras no CE
Um injetor hidrodinâmico eletrónicamente controlado foi projetado para o
sistema de eletroforese capilar segundo o esquema apresentado na Figura 5.3. O
injetor foi construído em acrílico. Na parte inferior da mesma encontra-se o encaixe
para o recipiente contendo a amostra ou o eletrólito segundo corresponda e, este
recipiente por sua vez consiste em um tubo Eppendorf® de 200 µl. A peça em
acrílico apresenta também três perfurações de finíssimo diâmetro (formando três
vias de comunicação que convergem no encaixe do tubo Eppendorf®), estas
correspondem às entradas do capilar eletroforético, do fio de platina e do gás para a
pressurização. O capilar eletroforético e o fio de platina estarão submersos na
solução contida no tubo. Por sua vez a entrada do gás estará conectada com as
válvulas solenóides do sistema de controle eletrônico através de um tubo de
polietileno de 0,8 mm i.d. e o fio de platina conectado com a fonte de alta tensão.
110
Para os estudos de precisão do volume injetado no capilar empregou-se uma
solução 100 mmol/L de cisteína detectado à 214 nm segundo descrito anteriormente
(Lavorante, Gervasio et al., 2004).
Figura 5.3 - Esquema do injetor hidrodinâmico construído em acrílico, onde CE é o capilar eletroforético, S um septo que permite fixar o capilar impedindo vazamentos no sistema, SV é o recipiente de 200 uL e Pt o eletrodo de platina. À esquerda da figura se apresenta o sistema controlado eletronicamente para a injeção temporizada onde V1 e V2 são as válvulas solenóide conectadas em linha, EI o circuito eletrônico, GU o controlador de pressão do gás e Ar o cilindro de argônio.
Para estudos dos parâmetros de pressurização do recipiente para injeção da
amostra no capilar foram empregadas 5, 10 e 20 kPa controlados pela unidade
DGU, durante 5, 10 e 20 segundos controlados pelo circuito integrado IC 555 do
circuito eletrônico esquematizado na Figura 3.2, apresentada no capítulo 3, item
3.3.1.
Outro parâmetro investigado para este injetor foi a influencia do volume de
solução contida no recipiente. Para tal fim os recipientes foram carregados com 50 e
60 µL da solução padrão de cisteína e se realizaram 12 injeções aplicando pressões
111
de 5 e 10 kPa. A repetibilidade das injeções foi avaliada aplicando o teste chi-
quadrado (y2) para comparar as áreas dos picos obtidos para cada injeção.
5.3.3 Separação das espécies e recondicionamento do capilar
O acondicionamento inicial do capilar eletroforético foi realizado mediante a
injeção em seqüência das soluções HCl 1 mol/L, água, NaOH 0,1 mol/L e solução
tampão respectivamente durante 10 minutos cada uma, empregando o modo de
injeção não temporizado do circuito eletrônico e aplicando uma pressão de 15 kPa.
A cada cinco separações eletroforéticas foi realizado um recondicionamento simples
injetando as soluções empregadas no acondicionamento inicial, na mesma
seqüência, durante 30 s cada uma, seguidas pela injeção do tampão eletroforético
durante 1 minuto a uma pressão de 25 kPa antes da injeção da próxima amostra.
A separação eletroforética das espécies arsenito (As3+), arsenato (As5+),
mometilarsênio (MMA) e dimetilarsênio (DMA) evaluou-se empregando uma solução
padrão de concentração 10 mg/L de cada espécie injetada a 10 kPa durante 5
segundos. A repetibilidade do sistema foi avaliada em função dos tempos de
migração e as áreas dos picos de cada espécie após cinco separações
eletroforéticas com a injeção de NaOH 0,1 mol/L e tampão após cada separação.
Os parâmetros empregados para a separação eletroforética acoplada ao
espectrômetro de massas são apresentados na Tabela 5.1.
112
Tabela 5.1 - Parâmetros operacionais para as condições de trabalho empregando o acoplamento CE-ICP-MS.
Voltagem aplicada no CE (kV) -15
Solução eletrolítica (Fosfato) (mmol/L) 20
Modificador de fluxo eletroosmótico TTAB (mmol/L) 1,5
Solução auxiliar HNO3 (mmol/L) 0,5
Vazão da solução auxiliar na interface CE–ICP (µL/min) 120
Comprimento do capilar (cm) 45
Energia aplicada no plasma (kW) 1,3
Vazão do argônio do plasma (L/min) 12
Vazão do argônio de nebulização (mL/min) 100
Massa monitorada no modo “single íon” 75
5.3.4 Otimização dos parâmetros na interface CE-ICP-MS
Para a otimização dos parâmetros do espectrômetro de massas para a
interface CE-ICP-MS, primeiramente foi injetada, através do capilar e a uma pressão
constante de 25 kPa, uma solução padrão de As3+ de concentração 100 µg/L,
enquanto a solução auxiliar foi bombeada a uma vazão constante de 100 µL/min
com o intuito de simular a diluição sofrida pelos analitos neste tipo de interfaces.
Enquanto isto o espectrômetro de massas era operado no modo “single íon”
monitorando sinal da razão m/z 75.
A interface CE foi conectada a um nebulizador de alta eficiência inserido
numa câmara de nebulização ciclônica e a pressão de nebulização foi ajustada para
800 kPa fornecendo uma vazão nominal de aspiração de 100 µL/min. A vazão da
solução auxiliar foi ajustada para 120 µL/min com o intuito suprir a demanda de
aspiração do nebulizador, sem incorrer em erros devido à aspiração da solução
113
contida dentro do capilar, o que ocasionaria um menor tempo de separação mais
provavelmente com picos menos definidos; ou retardar a separação das espécies
devido a uma aspiração insuficiente da solução auxiliar provocando a entrada desta
solução dentro do capilar o que se conhece como “Back Pressure”.
5.4 Resultados e Discussão
O injetor hidrodinâmico eletronicamente controlado desenvolvido durante esta
pesquisa permitiu a introdução de volumes controlados de amostra no capilar
eletroforético mediante o ajuste da pressão aplicada e do tempo de abertura das
válvulas solenóides para a pressurização do recipiente contendo a amostra, inserido
no injetor. Os efeitos de ambos parâmetros sobre o volume de amostra injetado são
apresentados na Tabela 5.2. Como observado nesta tabela o volume injetado
aumenta linearmente com o aumento do tempo de injeção, estes resultados
encontram-se em concordância com os resultados apresentados por Altria (1996).
Os dados desta tabela revelam também que variações no tempo de injeção resultam
em maior precisão do que variações na pressão aplicada. Estes resultados
confirmam a robustez do circuito eletrônico em termos de precisão no tempo de
injeção. Considerando que o volume de amostra injetada no capilar eletroforético
deve ser menor do que 10% do volume total do mesmo e que volumes maiores
injetados afetam a estabilidade da corrente elétrica (ALTRIA, 1996), desprende-se
dos resultados apresentados na Tabela 5.2 que unicamente 5 (cinco) combinações
de pressão e tempo aplicado podem ser empregadas visando respeitar os limites de
volume injetado.
114
Tabela 5.2 - Volumes em nL injetados no capilar empregando as diversas combinações de pressão aplicada e tempo de injeção. (n=3)
Pressão (kPa) 5 10 20 R2 Tempo de injeção (s)
5 46 ± 1 99 ± 1 230 ± 6 0.9972
10 142 ± 2 297 ± 8 662 ± 16 0.9985
20 327 ± 7 674 ± 17 1429 ± 19 0.9996
R2 0.9999 0.9998 0.9997
O fato de que na eletroforese capilar são empregados volumes muito
pequenos de solução, induziu-nos a supor pequenas variações de volume no
recipiente contendo as amostras a serem injetadas acarretaria variações no volume
das mesmas injetado no capilar. No entanto os resultados revelaram que variações
de volume de até 20% no interior do recipiente da amostra não apresentaram
variações significativas no volume de amostra injetado, com o qual pudemos
demonstrar a robustez do injetor hidrodinâmico desenvolvido.
Embora haja a necessidade de se reduzir o volume de resíduos líquidos
contendo arsênio, o volume de solução dentro do recipiente deve ser suficiente para
manter imersos a platina e o capilar eletroforético para garantir a estabilidade da
corrente elétrica durante a separação. O eletrodo de platina e o capilar eletroforético,
submersos na solução tampão, não devem ficar em contato entre si.
Comparando com outros trabalhos empregando o acoplamento em linha SIA-
CE, embora o volume injetado tenha sido apenas 50 µL, o volume total para
preencher o sistema foi de 100 µL, o que leva a pensar que a cada injeção 50 µL de
amostra são descartados (HORSTKOTTE et al., 2007).
115
A otimização do sistema SIA para preparar as soluções de forma
independente à separação eletroforética e dos processos de recondicionamento do
capilar, possibilitou a operação simultânea de ambos sistemas, minimizando-se o
tempo de análise como assim também os riscos de contaminação.
O volume de solução eletrolítica no recipiente de injeção no capilar foi de 50
µL, volume suficiente para mergulhar o eletrodo e o capilar nela garantindo o contato
elétrico do sistema eletroforético. Esta solução prove os eletrólitos necessários para
que ocorra a eletroforese, entretanto alguns íons têm mobilidade eletroforética maior
que outros, o que provoca um empobrecimento dos mesmos no volume residual. Por
esses motivos deve ser substituída freqüentemente, o que em nossos experimentos
ocorreu a cada três separações eletroforéticas, gerando-se um volume de descarte
menor do que os volumes descartados quando empregadas configurações em linha
FIA-CE ou SIA-CE.
Os parâmetros envolvidos na separação eletroforética das espécies de
arsênio detectadas a 185 nm e, a repetibilidade do volume de amostra injetado no
capilar eletroforético são apresentados na Tabela 5.3. Os resultados apresentaram
um desvio padrão relativo (SRD) menor do 1,6% para o tempo de migração e menor
do que 2,6% para as áreas dos picos.
Tabela 5.3 - Tempos de migração e áreas dos picos calculados após 5 (cinco) injeções, detectadas a 185 nm
As specie Migration time (s) Peak area (mV . s)
MMA 1,533 ± 0,021 546,54 ± 12,68
As(III) 1.707 ± 0,015 153,07 ± 3,95
As(V) 2,053 ± 0,032 261,29 ± 6,53
DMA 2,190 ± 0,031 367,27 ± 8,08
116
Quando se aplica injeção hidrodinâmica se injeta no capilar uma porção da
amostra, a relação das espécies na amostra se mantém na alíquota injetada. No
entanto quando se aplica injeção eletrocinética, ocorre uma discriminação de
espécies em função de suas mobilidades eletroforéticas, deste modo a amostra se
empobrece nas espécies com maior mobilidade eletroforético a cada injeção
realizada. A repetibilidade do volume de amostra injetado no capilar eletroforético e,
a precisão do sistema injetor em função da variação de volume no recipiente,
permitiu a reutilização de um mesmo recipiente contendo a amostra para realizar
repetidas injeções, uma vez que a composição da solução não se verá modificada
quando empregamos injeção hidrodinâmica. Este fato apresenta-se em absoluta
concordância com o intuito de diminuir os volumes de resíduos gerados.
A vantagem apresentada na manipulação do sistema CE-ICP-SFMS, de
forma independente do sistema SIA para o preparo das soluções a serem
analisadas, foi a possibilidade de determinar espécies de arsênio em extratos de
amostras naturais devido ao elevado poder de detecção do SFMS, além da geração
de reduzidos volumes de resíduos. Empregando esta combinação de técnicas, o
volume de resíduo contendo arsênio gerado após análise de 10 amostras foi de 1,5
mL, dos quais aproximadamente 185 µL representam a solução multiespécie
empregada para otimizar a separação eletroforética, 240 µL correspondem as
soluções das espécies individuais empregadas para preparar as soluções
multiespécies e otimizar o processo de adição de padrão, e o restante corresponde
ao volume de água empregado para lavar o sistema SIA.
O eletroferograma apresentado na Figura 5.4 corresponde à análise de uma
amostra de urina liofilizada contaminada com 200 µg/L de MMA e arsenato (As5+). A
117
separação das quatro espécies de arsênio apresentou-se com boa resolução em um
tempo inferior aos 5 minutos.
Figura 5.4 - Eletroferograma de uma amostra de urina liofilizada contendo arsenito (As3+),
arsenato (As5+), ácido monometilarsônico (MMA) e ácido dimetilarsínico
(DMA). 200 µg/L de As5+ e DMA foram adicionados à amostra.
Um extrato aquoso de camarão também foi analisado encontrando-se no
mesmo principalmente arsenobetaina, outras espécies de arsênio não foram
detectadas nestes extratos. Na Figura 5.5 se apresenta um eletroferograma do
extrato de camarão contaminado com 200 µg/L de arsenato (As5+).
118
Figura 5.5 - Eletroferograma de um extrato de camarão pelo sistema CE-ICP-MS detectado
na razão m/z= 75. De esquerda para a direita os picos correspondem à
arsenobetaina e ao arsenato (As5+) adicionado respectivamente.
5.5 Conclusões
A programação do sistema SIA para manipular micro-volumes de amostras e
soluções padrão das espécies de arsênio, operando em forma independente da
separação eletroforético, assim como a miniaturização do dispositivo utilizado para a
injeção hidrodinâmica das soluções no capilar eletroforético, possibilitou a redução
significativa do volume de resíduos contendo arsênio gerado durante o procedimento
analítico.
119
A implementação do sistema SIA para prepara in-situ micro-volumes de
soluções padrão e otimizar a adição de padrão nas amostras apresentou resultados
satisfatórios. Este procedimento permitiu ademais a redução considerável (em torno
de 87%) dos volumes resíduos de arsênio gerados durante o preparo dos padrões.
Outra vantagem deste sistema apresentado foi o desenvolvimento do micro-
injetor hidrodinâmico para eletroforese capilar que possibilitou a injeção precisa e
reprodutível de nanolitros de solução no capilar eletroforético. Além disto, os
eletroferogramas apresentaram boa resolução e baixa dispersão dos picos
separados num tempo menor do que 5 minutos. Por outro lado o emprego de um
nebulizador de alta eficiência (HEN) inserido numa câmara ciclônica de nebulização,
possibilitou a melhoria na eficiência de transporte das espécies separadas para o
plasma do MS.
120
6 Recuperação dos Resíduos Gerados Durante a Pesquisa
121
Resumo
As soluções de descarte resultantes da análise de especiação de arsênio,
empregando geração dos hidretos com birohidreto de sódio ou potássio, apresentam
elevadas concentrações de boro, principalmente na forma de ácido bórico. Por outro
lado, estas soluções apresentam resíduos de arsênio, provavelmente devido a
tempos de reação muito curtos, diferenças na cinética de reação de cada espécie
estudada ou o emprego de concentrações elevadas nos processos de otimização
dos métodos de análise. Neste trabalho, se realizou a remoção de boro e arsênio
dos resíduos líquidos gerados durante as pesquisas analíticas. Para a remoção de
arsênio se utilizou a técnica de extração no ponto nuvem, entretanto a remoção de
boro se realizou mediante a precipitação por mineralização hidrotérmica com
hidróxido de cálcio.
Após a otimização dos procedimentos de remoção, as soluções de descarte
laboratoriais foram submetidas a tratamento para a remoção dos respectivos
elementos químicos. Finalmente os resíduos líquidos foram analisados por
espectrometria de emissão ótica com fonte de plasma (ICP OES). A comparação
dos níveis de arsênio e boro entre as soluções tratadas e não tratadas evidenciou
satisfatórias porcentagens de remoção.
122
Abstract
Waste solution from arsenic speciation analysis in which hydride generation
method with sodium or potassium boron hydride are employed presents high
concentration of boron, mainly as boric acid. As well, these solutions probably
contains some arsenic residues, perhaps due to short time of reactions, disparity on
the reactivity of each specie or high concentration of those species used during
analytical performance processes. In this work, the recovery of arsenic and boron
from laboratories waste solutions after analytical developments is carried out.
Meaning decontamination procedures, cloud point extraction was employed as a
method for recovery of arsenic from these solutions. Also, boron precipitation by
hydrothermal mineralization with calcium hydroxide was carried out.
After optimization of the complexation and extraction conditions, waste
solution was treated by submitting its to this procedure. The amount of arsenic and
boron in treated and non-treated waste solution was analyzed with Inductively
Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP OES). The comparison of
arsenic and boron levels between both solutions showed satisfactory percentages of
extraction.
123
6.1 Introdução
O volume de resíduos gerados durante as análises de especiação química
costuma ser muito elevado. Quando empregamos técnicas de separação como a
cromatografia líquida ou a eletroforese capilar, acopladas com detectores como
espectrômetros de massas com fonte de plasma, existe a necessidade de se manter
vazões dos reagentes em torno a 1 ou 2 mL/min, para suprir a demanda dos
nebulizadores empregados na interface destes sistemas acoplados. Se
considerarmos que a eficiência de nebulização para a maioria dos nebulizadores
comumente utilizados encontra-se em torno de 5%, ou seja, apenas 5% do líquido
nebulizado atingirá a fonte de excitação e, conseqüentemente o 95% restante virará
impreterivelmente lixo. Isto é 95 % do arsênio empregado para preparar as soluções
padrão ou presente nas amostras estará sendo descartado como resíduos líquidos.
Por outro lado, quando empregamos derivatizações pós-coluna para geração
de espécies voláteis e, em ocasiões, prévio a este, mais um passo para a
decomposição das espécies não geradoras de hidretos, aumenta-se o número de
reagentes implicados e, por conseguinte a quantidade de resíduos gerados
aumentará ainda mais. Entretanto, por se tratar esta de uma técnica de separação
de fases, na qual as espécies voláteis geradas são separadas da fase líquida e
transportadas para a fonte de excitação, todos os reagentes líquidos envolvidos no
processo da análise constituirão as soluções de descarte. A técnica de geração dos
hidretos voláteis mediante a reação entre o borohidreto de sódio ou potássio em
meio ácido constitui uma das técnicas mais comumente usadas para a produção de
espécies voláteis de arsênio. Embora as espécies orgânicas de arsênio, como
arsenobetaina, arsenocolina, arsenoaçucares e arsenolipideos constituem espécies
124
que não formam hidretos voláteis na reação com borohidreto de sódio, estas
espécies são usualmente, após a separação cromatográfica, transformadas em
espécies capazes de formar hidretos mediante reações em linha como oxidação ou
foto-oxidação (HANSEN et al., 1992; LOPEZ et al., 1993; ZHANG et al., 1996a, b;
BURGUERA; BURGUERA, 1997; SLEJKOVEC et al., 2001). Entretanto,
recentemente foi reportada a geração de hidretos de arsênio a partir de
arsenoaçúcares por reação direta com o borohidreto de sódio sem prévio tratamento
de degradação das mesmas (SCHMEISSER et al., 2004; REGMI et al., 2007).
Subseqüentemente, resíduos líquidos derivados de processos analíticos de
especiação, constituídos por várias etapas de derivatização, podem conter resíduos
de arsênio, provavelmente devido a tempos de reação muito pequenos como para
completar a estequiometria total da reação, somados às concentrações elevadas
dos padrões empregadas durante as etapas de otimização da técnica desenvolvida
e, às diferenças na cinética de reação de cada espécie no processo de formação
dos hidretos. Por outro lado, estas soluções devem conter também elevadas
quantidades enxofre, provenientes da utilização do persulfato de potássio (K2S2O8)
empregado nos processos de foto-oxidação das espécies orgânicas de arsênio e,
grandes quantias de boro, geralmente na forma de ácido bórico, proveniente da
volatilização das espécies com borohidreto de sódio. Amplamente distribuído no
meio ambiente, principalmente na forma de ácido bórico ou sais de borato, embora
considerado um elemento essencial, a diferença entre a essencialidade e a
toxicidade deste elemento apresenta-se muito estreita. O excesso de boro
proporciona efeitos negativos à saúde humana, aos animais e aos vegetais, por
exemplo, o limite tolerável de boro para cítrus e alguns cereais de interesse
comercial encontra-se em torno a 2 ou 3 mg/L, por outro lado a União Européia
125
recomenda um limite tolerável de boro em água potável de 0,3 mg/L (ITAKURA et
al., 2005).
De tal modo, além de processos robustos e eficientes para análise de
especiação, encontramo-nos com a necessidade de implementar ou desenvolver
métodos que nos permitam recuperar, se não a totalidade, pelo menos grande parte
do resíduo gerado no processo todo, seja quando empregamos análise de rotina ou
realizamos pesquisa para desenvolvimento de novas técnicas analíticas.
6.2 Material e Métodos
6.2.1 Reagentes e soluções
Nesta etapa da pesquisa, um tratamento para recuperação de resíduos de
arsênio e boro foi aplicado às soluções de descarte geradas durante a análise de
especiação de arsenito (As3+), arsenato (As5+), ácido monometilarsônio (MMA) e
ácido dimetilarsínico (DMA), por geração de seus hidretos voláteis mediante a
reação com borohidreto de sódio em meio ácido, após a separação eletroforética.
Dentre os ácidos presentes nestas soluções de descarte encontram-se ácido nítrico,
ácido clorídrico e ácido tioglicólico.
Soluções estoque 20% m/v de Dietilditiofosfato de amônia (Aldrich Chemical
Company, Inc. Milwaukee, USA), empregado como complexante e, 5% m/v de
Triton® X-114 (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Germany) empregado como
surfactante.
Solução 5 mol/L de ácido clorídrico (Merck, Darmstadt, Alemanha).
Água purificada em sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) com uma
resistividade de 18,2 MΩ cm.
126
Hidróxido de cálcio (Merck, Darmstadt, Alemanha).
6.2.2 Equipamentos
Para os procedimentos de extração do arsênio pela técnica de extração no
ponto nuvem e de boro por co-precipitação com hidróxido de cálcio, foram
empregados tubos de digestão de 50 ml.
As temperaturas necessárias para os respectivos processos de extração de
arsênio e boro foram atingidas empregado um bloco de digestão da marca Tecnal
com controle de temperatura (Tecnal, Piracicaba-SP, Brasil).
Os teores de boro e arsênio nas soluções de descarte, antes e depois dos
respectivos tratamentos aplicados para recuperação destes elementos foram
determinados mediante um espectrômetro de emissão ótica com fonte de plasma
indutivo (ICP OES), Perkin Elmer, modelo Optima 3000 com vista axial e radial.
6.2.3 Recuperação de arsênio
A recuperação do arsênio presente nas soluções de descarte laboratoriais foi
realizada por aplicação do método de extração por ponto nuvem (CPE: do inglês
Cloud Point Extraction). Devido a sua relativa simplicidade, desde as primeiras
publicações aplicadas na determinação de manganês e zinco (GOTO et al., 1977;
WATANABE; TANAKA, 1978), esta técnica tem se transformado nos últimos anos
num dos principais métodos de pré-concentração e remoção para aplicação em
diversas áreas como ambiental, clínica, geológica e de alimentos dentre outras
(SILVA et al., 2006).
127
Os agentes surfactantes (ou tensoativos, também denominados detergentes)
podem formar, em solução aquosa, agregados coloidais denominados micelas. A
concentração mínima do surfactante requerida para a formação destas micelas
denomina-se concentração micelar crítica (CMC) e, neste ponto haverá um equilíbrio
entre a concentração das micelas formadas com os monômeros do surfactante em
solução (QUINA; HINZE, 1999).
A metodologia de extração no ponto nuvem consiste no ajuste de certas
condições do sistema, de forma a atingir a concentração micelar crítica CMC, seja
com modificação da temperatura ou pressão, ou até mesmo a adição de uma
substância apropriada a uma solução aquosa de um surfactante, provocando a
formação de micelas as quais apresentam uma face turba, o que se conhece como
ponto nuvem. Neste ponto a solução original se divide em duas fases, um pequeno
volume rico em surfactante, contendo os elementos de interesse retidos nas
estruturas micelares e, a fase aquosa empobrecida nos analitos separados
(BEZERRA et al., 2005).
Neste trabalho, a extração no ponto nuvem foi empregada para a
descontaminação das soluções de descarte, produzidas durante as pesquisas
analíticas de especiação de arsênio e geração de seus respectivos hidretos
mediante a reação com borohidreto de sódio em meio ácido. Tomaram-se como
base os procedimentos empregados por Da Silva e colaboradores para
determinação de arsênio em água do mar (DA SILVA et al., 2000).
Alíquotas de 40 mL das soluções de rejeito foram colocadas em tubos de
digestão de 50 mL, antes da adição do complexante DDTP procedeu-se à
acidificação da solução para pH 0,5 com HCl. Uma vez acidificadas as soluçõese,
adicionou-se alíquotas de DDTP a fim de atingir concentrações finais de 1,0; 1,5 e
128
2,0 % m/v do complexante, com o intuito de determinar as melhores condições para
a maior extração possível do arsênio presente nestas soluções, mantendo-se a
concentração do surfactante adicionado (Triton X-114) em 0,05% m/v. Todos os
tubos foram completados a volume de 50 mL e colocados em bloco de digestão até
atingir uma temperatura de 40°C, mantendo esta durante uma hora. Após este
procedimento os tubos contendo as soluções foram deixados a temperatura
ambiente durante 12 horas, ao termino deste período, os tubos foram introduzidos
em banho de água com gelo com a finalidade de incrementar a densidade dos
precipitados e, facilitar à separação de ambas as fases mediante inversão dos tubos.
Finalmente os precipitados separados (~0,5 mL) para cada uma das
concentrações empregadas do complexante foram digeridos com 0,5 mL de ácido
sulfúrico (H2SO4) concentrado e 0,5 mL de peróxido de hidrogênio (H2O2) 30%. As
soluções digeridas foram analisadas por espectrometria de emissão ótica com fonte
de plasma (ICP OES) para determinação do arsênio extraído.
6.2.4 Recuperação de boro
O ácido bórico é uma importante fonte de boro utilizado na indústria em
inúmeros processos, por tanto são gerados a cada dia altíssimas quantias de
soluções de descarte com elevadas concentrações de boro. Por tanto há uma
necessidade de contar com técnicas de recuperação que possam efetivamente
remover o boro destas soluções. Varias técnicas têm sido propostas para a remoção
do boro em águas residuais industriais, embora muitas delas apresentem algumas
importantes desvantagens. Por exemplo, a co-precipitação com hidróxidos metálicos
aparece como ineficiente e ecologicamente pouco efetiva devido à baixa taxa de
129
remoção e necessidade de grandes quantias de hidróxidos. A evaporação-
cristalização apresenta-se efetiva unicamente sob condições de elevadíssimas
concentrações de boro. A extração por solventes requer a utilização de alguns
reagentes muito caros além da maioria deles serem tóxicos. A remoção de boro por
intercambio iônico, embora seja uma das técnicas mais eficientes, requer processos
de regeneração das resinas tão freqüentes que permite o tratamento somente de
pequenos volumes de rejeitos. Outras das técnicas mais empregadas são, a osmose
reversa e a ultra-filtração, embora apresentem elevados custos de manufatura e
manutenção das membranas empregadas (ITAKURA et al., 2005).
Para a recuperação de boro das soluções residuais geradas nesta etapa da
pesquisa, foi empregada a precipitação por mineralização hidrotérmica empregando
hidróxido de cálcio [Ca(OH)2], descrita por (ITAKURA et al., 2005), estes autores
removeram mais de 99% do boro dissolvido em água, artificialmente preparada em
laboratório a uma concentração de 500 mg/L de boro.
O tratamento hidrotérmico consistiu na adição de 3 gramas de hidróxido de
cálcio, e 1,5 gramas de ácido fosfórico a cada 30 mL da solução de descarte,
posteriormente os recipientes foram aquecidos a 130°C durante 14 horas,
posteriormente foram esfriados a temperatura ambiente durante uma hora. Após
separação os sobrenadantes foram analisados por espectrômetro de emissão ótica
com fonte de plasma ICP OES. Segundo os autores deste trabalho de referência, o
precipitado obtido pelo tratamento hidrotérmico proposto corresponde a um minério
natural de boro.
130
6.3 Resultados e Discussão
6.3.1 Extração de arsênio
Como observado na Figura 6.1, o incremento na concentração do
complexante DDTP de 1% para 1,5% não apresentou diferenças significativas na
porcentagem de arsênio retido, entretanto quando uma concentração de 2% do
complexante foi empregada, observou-se um leve decréscimo na quantidade de
arsênio extraído. Como conseqüência destes resultados e, visando à utilização da
menor quantidade possível de reagentes, adotou-se 1% como concentração de
trabalho para o complexante DDTP. Por outro lado, em concordância com resultados
apresentados anteriormente por da Silva e colaboradores (DA SILVA et al., 1998),
empregou-se uma concentração final do surfactante Triton X-114 igual a 0,05% m/v.
0% 1% 1,5% 2%
0
20
40
60
80
100 Precipitado Digerido
78
,11
+/-
0,3
0
79
,79
+/-
0,4
5
79
,92
+/-
0,5
4
Tratamento
10
0,5
7 +
/- 0
,50
%A
s / R
es.P
uro
n=
3
Res.Puro
Figura 6.1 - Percentagens de arsênio extraído das soluções laboratoriais de descarte
mediante extração no ponto nuvem empregando diferentes concentrações
do complexante utilizado.
131
Como esperado, foi conseguida a complexação do arsênio presente nas
soluções de descarte e sua separação dos outros elementos como sódio ou boro
presentes nas mesmas.
Em torno de 80% do arsênio presente nas soluções de descarte foi
recuperado na fase orgânica precipitada, aproximadamente uns 0,5 mL. Assim o
volume de rejeitos líquidos, ricos em arsênio, produzidos após as pesquisas
analíticas foi reduzido 80 vezes uma vez que a cada 40 mL de resíduo gerado se
obteve em torno de 0,5 mL de precipitado contendo em torno de 80% do arsênio
presente nos resíduos líquidos sem tratamento.
6.3.2 Extração de boro
Os precipitados de boro obtidos pelo método de mineralização hidrotérmica
foram separados da fase líquida, secados e armazenados. Na Figura 6.2 se
apresenta a percentagem de recuperação do boro em função do empobrecimento da
fase líquida após o tratamento hidrotérmico, comparadas com o resíduo original sem
nenhum tipo de tratamento.
Tabela 6.1 - Resultados da % extraída do arsênio presente nas soluções de descarte originais e nos precipitados obtidos após o tratamento pelo método de extração no ponto nuvem. (n=3)
Tratamento Teor de Boro (cps) % Recuperada
Branco 372,57 ± 4,53 0,03
Resíduo Tratado 4,35e5 ± 7,67e3 65,75
Resíduo S/tratamento 1,27e6 ± 9,91e3 100,0
132
Foi conseguida uma recuperação de 75% do boro presente nas soluções
residuais geradas no nosso laboratório, estes resultados encontram-se distantes dos
de 99% recuperados de soluções de boro artificiais relatado por Itakura e
colaboradores (2005). No entanto, salienta-se que, com o intuito de evitar perdas de
arsênio por evaporação, as soluções de descarte receberam um primeiro tratamento
para extração do arsênio mediante a complexação com DDTP e extração no ponto
nuvem com Triton X-114. Com isto, a composição das soluções foi modificada pela
presença de resíduos dos reagentes aplicados na primeira etapa da
descontaminação. Por tanto, a menor porcentagem de recuperação do boro aqui
obtido, provavelmente se deva a interferências destes resíduos na formação dos
precipitados.
Embora a remoção do boro presente nas soluções de descarte haja sido
menor do que o esperado, o principal objetivo desta etapa da pesquisa, a remoção
do boro e, a minimização do volume de resíduos após os experimentos analíticos foi
conseguido satisfatoriamente, uma vez que por cada 30 mL de solução tratada
obteve-se um precipitado ocupando um volume final inferior a 4 mL, uma redução de
volume maior do que 7 vezes.
6.4 Conclusões
Majoritariamente utilizadas em química analítica como técnicas de pré-
concentração para determinação de elementos traços, as técnicas de extração de
arsênio no ponto nuvem e precipitação do boro com hidróxido de cálcio podem ser
perfeitamente empregadas para a descontaminação das soluções de descarte
133
geradas durante a pesquisa, ricas nestes elementos. Aplicando estes procedimentos
para a minimização dos resíduos perigosos gerados nos laboratórios, além de se
cumprir com as normas internas dos diversos conselhos de ética na pós-graduação,
contribui-se com a química limpa e redução de danos ocasionados ao meio
ambiente.
As fases orgânicas precipitada, ricas em arsênio, derivadas da extração no
ponto nuvem, assim como os precipitados sólidos de boro resultantes da
mineralização hidrotérmica, podem posteriormente ser liofilizadas e armazenadas,
ocupando assim um espaço muito menor do que os grandes volumes de rejeitos
líquidos gerados corriqueiramente.
Por outro lado, consideráveis quantias de arsênio e boro que, normalmente
seriam descartadas, agora podem ser reutilizadas, mediante a regeneração ou
reconstituição dos resíduos secos para preparar soluções padrão. Com isto, além de
contribuir com a minimização de efeitos adversos no meio ambiente, colabora-se
com a redução de gastos desnecessários com reagentes.
134
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