espressione di abcb1 in linfociti t del sangue … · i trasportatori abc (atp-binding cassette...

Cattani Elia

Lavoro di diploma

Formazione Tecnico in Analisi Biomediche SSS

Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno

2006

ESPRESSIONE DI ABCB1 IN LINFOCITI T DEL SANGUE

PERIFERICO

Lavoro svolto presso:

Istituto di Ricerca in Biomedicina, Bellinzona

Con la collaborazione di:

David Jarrossay, PhD

Federica Sallusto, PhD

Cattani Elia, SSMT, TAB 2006

Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 2

Indice Riassunto, Abstract 3 Introduzione 4 Materiali e metodi 6 Risultati 12 Conclusioni 27 Bibliografia 28 Ringraziamenti 30 Allegato 31



Riassunto I trasportatori ABC (ATP-Binding Cassette Transporters) sono dei trasportatori di membrana presenti in molti organismi dai batteri all�uomo e sono caratterizzati da una sequenza peptidica conservata responsabile del legame e dell�idrolisi di ATP (1). Il prototipo dei trasportatori ABC è ABCB1 (chiamato anche MDR o PGP) che conferisce resistenza ai farmaci in tumori multiresistenti. Recentemente è stato dimostrato che ABCB1 è espresso selettivamente su cellule B naive e permette di discriminare queste ultime dalle cellule B memoria e transizionali (2). In questo lavoro si dimostra che il trasportatore ABCB1 é espresso su tutti i subsets di cellule T CD4+, che la sua espressione diminuisce in risposta ad uno stimolo specifico di attivazione ed aumenta se le cellule vengono tenute in coltura in assenza di stimoli ottimali (3). Inoltre lo studio dimostra che ABCB1 é un marcatore di cellule TH1, attraverso l�analisi della produzione di citochine e con analisi dell�espressione di recettori per chemochine. Bloccando ABCB1 si inibisce il rilascio di citochine da parte delle cellule della memoria CD4+. Ciò suggerisce che il recettore ABCB1 é implicato, direttamente o indirettamente nel processo, o più in generale nell�attivazione delle cellule T.

Abstract ATP-binding cassette (ABC) transporters are ubiquitously present in most organisms from bacteria to man. They are characterized by a domain responsible for the hydrolysis of ATP. The prototype of ABCB-transporters is ABCB1 (also called MDR or PGP) which confers multidrug-resistance in tumors. Recently, it has been demonstrated that ABCB1 is selectively expressed on naïve B cells, and discriminates naïve B cells from transitional and memory B cells. In this work we show that ABCB1 is expressed on every subset of T CD4+ cells and this expression on naïve CD4+ cells is downregulated by an optimal activation and is upregulated in absence of optimal stimulus. By analyzing the expression of chemokine receptors and the release of cytokines we also demonstrate that ABCB1 is a TH1 marker. Blocking ABCB1 down-regulated the cytokine release by Memory T CD4+ cells suggesting that this receptor may be implicated directly or indirectly in the cytokine production or more generally in the activation of CD4 T cells.



Introduzione I linfociti T e B del sangue comprendono cellule naive (ovvero indifferenziate che non hanno ancora incontrato l�antigene) e cellule della memoria (differenziate, in seguito ad una precedente stimolazione antigenica, a cellule in grado di diventare immediatamente effettrici in caso di una seconda stimolazione antigenica). La distinzione tra cellule naive e memoria e la definizione di sottopopolazione di cellule memoria con diverse funzioni è importante nel monitoraggio immunologico dopo vaccinazioni o in patologia. Recenti risultati ottenuti all�Istituto di Ricerca in Biomedicina hanno dimostrato che un trasportatore cellulare appartenente alla famiglia ABC (ATP-Binding Cassette Transporters), il cui prototipo è rappresentato dalla molecola ABCB1 o MDR-1 che conferisce resistenza ai farmaci in cellule tumorali, è espresso selettivamente su cellule B naive e permette di discriminare queste ultime dalle cellule B memoria e transizionali (2). L�obiettivo del lavoro di diploma qui proposto e quello di analizzare l�espressione di ABCB1 su linfociti T CD4+ naive e memoria del sangue periferico (vedi allegato). Per poter identificare le cellule che esprimono il trasportatore ABCB1 si sono usati dei coloranti, MTG o MTO, che entrano liberamente in tutte le cellule e che vengono attivamente espulsi in cellule ABCB1 positive. L�attività dei trasportatori può essere bloccata usando degli inibitori come ad esempio il verapamil (aspecifico), l�MK571 (specifico per ABCC1) o il PGP-4008 (specifico per ABCB1). Le cellule T CD4+ sono anche dette T Helper (TH) perché hanno la funzione di aiutare le altre cellule del sistema immunitario grazie alla produzione di citochine o all�interazione diretta tra le cellule mediante i loro recettori di superficie. Durante la risposta immunologica le cellule T CD4+ possono ricevere tre tipi di segnale da parte delle cellule dendritiche o altre cellule APC (cellule presentanti l�antigene ):

1. L�antigene processato viene presentato da una cellula APC su molecole MHC di classe II, per essere riconosciuto da una cellula T CD4+ per mezzo di un recettore per l�antigene formato dal TCR (Recettore della cellula T) e dal complesso CD3. In vitro la stimolazione con l�antigene delle cellule CD4+ può essere riprodotta incubando le cellule T CD4+ con anticorpi specifici diretti contro la molecola CD3.

2. Costimolazione: il segnale di attivazione per le cellule T CD4+ risulta più forte se oltre al TCR vengono attivati altri recettori, il più importante dei quali é il CD28. Il CD28 viene attivato in vivo dal CD80 e CD86 delle cellule APC. In vitro la situazione si può



riprodurre con anticorpi specifici anti-CD28 in grado di attivare, legandolo, il recettore.

3. Segnale polarizzante: la differenziazione della cellula T CD4+ può essere influenzata dalla cellula APC con la produzione di citochine. Le cellule TH possono essere distinte in 2 principali tipi a seconda delle funzioni che svolgono nella risposta immunitaria, TH1 e TH2, le cellule TH1 sono importanti nelle risposte immunitarie contro microbi intracellulari ed hanno la funzione di aiutare altre cellule T e macrofagi; le cellule TH2 sono coinvolte nelle risposte contro parassiti e microbi extracellulari ed aiutano le cellule B a produrre anticorpi (T-B-Help). Le cellule T naive si differenziano in TH1 in presenza di IL-12 ed in TH2 in presenza di IL-4. Questa caratteristica viene riprodotta in vitro, aggiungendo IL-12 e anticorpi anti-IL-4 per stimolare al differenziazione in TH1, e con aggiunta di IL-4 e anti-IL-12 per stimolare la differenziazione in TH2.

Le cellule TH1 e TH2 possono essere distinte tra loro grazie all�espressione di recettori per chemochine quali CCR5 e CXCR3 (espressi su TH1) o CCR3, CCR4 e CRTH2 (espresso su TH2) oppure grazie alla produzione di citochine da parte delle cellule, Le cellule TH1 producono soprattutto IFN-γ mentre le cellule TH2 producono soprattutto IL-4 (4-7). In questo lavoro si cerca una relazione tra l�espressione di ABCB1 e le cellule TH1 e TH2 e si valuta l�espressione del trasportatore in diverse condizioni.



Materiali e metodi Isolamento delle cellule mononucleate (PBMC) a partire da Buffy Coat I Buffy Coat, un concentrato di leucociti che si ottiene centrifugando il sangue intero anticoagulato, sono forniti dai centri trasfusionali della Croce Rossa di Lugano o di Basilea, hanno un volume compreso tra 60 e 80 ml. Il buffy coat viene diluito fino a raggiungere un volume di 180 ml con RPMI Complete Medium (RPMI 1640 Medium con 25 mM Hepes, GIBCO Invitrogen, Paislex, Scozia, cat. 42401-018). In sei tubi vengono pipettati 13 ml di Lymphocyte Separation Medium (LSM, 9,4 g di Diatrizoato di sodio e 6,2 g di Ficoll per 100ml, MP Biomedicals LLC, Thuringer Strasse 15, 37269 Eschwege, Germania, cat 50494) ai quali vengono aggiunti 30 ml della soluzione ottenuta diluendo il Buffy Coat, pipettando delicatamente evitando che il Buffy Coat diluito si mescoli con il LSM (8-10). I 6 tubi vengono centrifugati per 30 min a 2000 rpm a 18°C (con bassa accelerazione e decelerazione). Le fasi contenenti le cellule mononucleate vengono aspirate e unite in un nuovo tubo, le cellule vengono lavate due volte con Washing Medium (RPMI complete con 1% di FCS [Fetal Calf Serum, GIBCO Invitrogen, cat. 26140-111]). Isolamento di linfociti T CD4 I linfociti T CD4+ vengono isolati a partire da PBMC con il metodo MACS (MAgnetic Cell Sorting) CD4 MicroBeads (CD4 MicroBeads Human, Miltenyi Biotech Gmbh, 51429 Bergisch Gladbach, Germania, cat. 130-045-101). Le cellule vengono incubate con un anticorpo specifico anti-CD4 ad una concentrazione di 2.5 µg/ml marcato con particelle magnetiche per 20 min a 4°C, dopo un lavaggio le cellule vengono passate in una colonna posta all�interno di un magnete. Le cellule legate dall�anticorpo marcato magneticamente rimangono nella colonna e vengono eluite in seguito.



Colorazione con Mitotrackers per espressione di trasportatori ABC Le cellule CD4+ vengono colorate con un anticorpo specifico anti-CD45RA-PE (Monoclonal Antibody CD45RA-PE, Immunotech, cat. 1834) ad una concentrazione di 2.5 µg/ml incubate 20 min a 4° C e poi lavate 2 volte con Washing Medium. Le cellule vengono incubate a 37°C in RPMI 10% FCS per 20 minuti con aggiunta di MTG ad una concentrazione di 100 nM (Mito Tracker Green FM, Molecular Probes, cat. M7514), in 3 condizioni diverse: senza inibitori e con 2 inibitori specifici. Come inibitori specifici si sono usati MK571 (Alexis Biochemicals, Lausen CH, cat. 340-021-M005) ad una concentrazione di 25 nM per inibire specificamente ABCC1 e PGP-4008 (Alexis, cat: 270-290-M002) ad una concentrazione di 10 nM per inibire specificamente ABCB1. Dopo incubazione le cellule vengono lavate con Washing Medium e quindi risospese in PBS (PBS privo di CaCl2 e MgCl2, GIBCO Invitrogen, cat. 20012-019) con 1% FCS e analizzate al citofluorimetro. Stimolazione di cellule Naive CD4+ e analisi dell�espressione di ABCB1 Le cellule naive CD4+ sono ottenute a partire da Buffy coat con gradiente di Ficoll e CD4 MACS, colorate con anti-CD45RA-APC (APC-anti-human CD45RA, BD Pharmingen, cat. 550855) in PBS 1%FCS ad una concentrazione di 2.5 µg/ml, e sortate con FACSAria. Le cellule sono poi risospese ad una concentrazione di 106 cellule/ml. Le cellule vengono attivate in piastra con pozzetti ricoperti di anticorpi specifici, preparati in precedenza mettendo 50 µl di soluzione di anticorpi in PBS ( PBS con Cacl2 e MgCl2, GIBCO Invitrogen, cat. 14040-091). Le cellule sono attivate in 2 modi diversi, con anti-CD3 (clone TR66) o con anti CD3 e Anti CD28 (BD Pharmingen, cat. 553295), per diversi tempi. In ogni pozzetto vengono aggiunti 200 µl di sospensione cellulare, la piastra viene messa a 37°C e in tempi diversi viene effettuata la colorazione con MTG, con l�aggiunta di 10 µl di soluzione di biglie (6x105 beads/ml, 6000 beads, SPHERO Rainbow Calibration Particles, BD Biosciences Pharmingen, cat. 559123) viene contato il numero di cellule vive, contando 1500 beads. Ogni volta vengono contate le cellule vive e analizzata l�espressione di ABCB1. Le cellule sono analizzate al tempo 0, dopo 4, 24, 48, 72 e 144 ore. Le cellule dopo attivazione vengono tenute in coltura a 37°C in RPMI 10% FCS ed analizzate contemporaneamente alle altre in modo da seguire l�espressione di ABCB1 una volta cessato lo stimolo.



Analisi dell�espressione di recettori per chemochine. Le cellule CD4+ vengono risospese ad una concentrazione di 106 cellule/ml, Vengono pipettati 100 µl di sospensione in 8 pozzetti in una piastra, 4 per le colorazioni con anticorpi specifici per chemochine e 4 come controlli negativi. Dopo centrifugazione le cellule vengono risospese nella soluzione di PBS 1% FCS con l�anticorpo anti-recettore per chemochine ad una concentrazione di 2.5 µg/ml. Le cellule sono colorate rispettivamente con anti-CXCR3-PE (PE-anti-human-CD183 (CXCR3), BD Pharmingen, cat. 557185), anti-CCR5-PE (PE-anti-human-CCR5, R&D System, Minneapolis, cat. FAB155P), anti-CRTH2 (clone BM16, coniugato con biotina) e anti-CCR7-PE (PE-anti-human-CCR7, R&D System, cat. FAB197P), dopo un incubazione di 20 min a 4°C le cellule vengono lavate, nel pozzetto della colorazione con anti-CRTH2 viene aggiunta streptavidina coniugata con PE (Streptavidin-PE, Molecular Probes, cat. 5-866) ad una concentrazione di 2.5 µg/ml, incubate per altre 20 min a 4°C. Alla fine delle colorazioni le cellule vengono lavate 2 volte con PBS 1% FCS e risospese in 50 µl di PBS 1% FCS per essere analizzate al citofluorimetro. Colorazione intracellulare per produzione di citochine ex vivo Le cellule CD4+ sono isolate a partire da Buffy Coat su gradiente di Ficoll e con il metodo CD4 MicroBeads. Le cellule CD4 sono poi colorate con MTG, dopo lavaggio sono colorate con anticorpo anti-CD45RA-PE ad una concentrazione di 2.5 µg/ml, dopo 2 lavaggi con Washing Medium risospese in PBS 1% FCS. Le cellule vengono separate con FACSAria in 4 popolazioni: naive MTG+, naive MTG-, memory MTG+ e memory MTG-. Le quattro popolazioni cellulari vengono risospese ad una concentrazione di 106 cellule/ml, in una piastra vengono pipettati 2 volte 200 µl di ogni sospensione, un pozzetto verrà attivato e l�altro fungerà da controllo negativo. Le cellule vengono attivate in RPMI 10% FCS con PMA (1-metoxi-2-propilacetato, Invitrogen, cat. 108-65-6 ) ad una concentrazione di 10-7 M e ionomicina (Invitrogen, cat. 56092-82-1) ad una concentrazione di 1 µg/ml per 2 ore, poi viene aggiunta Brefeldina A (BFA, Invitrogen, cat. 20350-15-6) ad una concentrazione di 10 µg/ml ed incubate per altre 2 ore. Le cellule vengono poi lavate 2 volte con PBS 1% FCS vengono aggiunti 50 µl di soluzione di fissaggio di formaldeide (fix solution, Becton Dickinson, cat. 51-2090-KZ ) e incubate 15 min a 4°C, le cellule vengono poi lavate 2 volte con soluzione permeabilizzante (Perm/Wash, Becton Dickinson, cat. 51-2091-KZ), le cellule sono poi colorate con anticorpi specifici anticitochine: anti-IL-4 (PE-anti-human



IL-4 , BD Pharmingen, cat. 554485) e anti-IFN-γ (APC-anti-human IFN-γ, BD Pharmingen, cat. 554702), entrambi ad una concentrazione di 0.2 µg/ml, ed incubati per 30 min a 4°C. Dopo 2 lavaggi con Soluzione permeabilizzante le cellule sono risospese in PBS 1% FCS ed analizzate al citofluorimetro (11-12). Beads Array per produzione di citochine Le quattro popolazioni sortate (naive MTG-, naive MTG+, memory MTG- e memory MTG+) sono attivate in piastra in 4 pozzetti diversi ricoperti di anticorpi specifici, preparata in precedenza mettendo 50 µl di soluzione di anticorpi anti-CD3 (clone TR66) e anti-CD28 (BD Pharmingen, cat. 553295) in PBS ad una concentrazione di 2 µg/ml ( PBS con Cacl2 e MgCl2, GIBCO Invitrogen, cat. 14040-091) e lasciate a 4°C per una notte. Le cellule vengono incubate in RPMI 10% FCS per 48 ore a 37°C, dopo incubazione il sovranatante viene separato dalle e cellule e vi viene analizzata la concentrazione di IL-4 e IFN-γ µl con il metodo Beads Array (Becton Dickinson) al citofluorimetro. Viene preparata una serie di 8 standard a partire da una soluzione con concentrazione di IL-4 e di IFN-γ di 5000 pg/ml con una diluizione seriale 1:2. A 50 µl di sovranatante o standard vengono aggiunti 50 µl di capture beads solution, ottenuta miscelando 4 µl di Biglie anti-IL-4 (BD CBA Human-IL-4 Capture Bead A5, Becton Dickinson, cat. 51-9004035) e 4 µl di Biglie anti-IFNγ (BD CBA Human-IFNγ Capture Bead E7, Becton Dickinson, cat. 51-9004029) e 992 µl di wash Buffer (BD CBA Wash Buffer, Becton Dickinson, cat. 51-9003797). Dopo incubazione di 1 ora a TA vengono aggiunti 50 µl di detection reagent preparato con 992 µl di wash Buffer, 4 µl di anti-IL-4-PE (Human IL-4 PE Detection Reagent, Becton Dickinson, cat. 51-9004037) e 4 µl di anti-IFN-γ-PE (Human IFN-γ PE Detection Reagent, Becton Dickinson, cat. 51-9004031) ed incubate per 2 ore a TA e al riparo dalla luce. Le biglie vengono poi lavate con 150 µl di Wash Buffer e risospese in 150 µl di Wash Buffer per essere poi analizzate al citofluorimetro. Colorazione intracellulare per produzione di citochine in vitro Le cellule CD4+ sono colorate con anticorpi specifici anti-CD45RA-FITC (Monoclonal Antibody CD45RA-FITC, Immunotech, cat. 0584) ad una concentrazione di 2.5 µg/ml. Al FACSAria (Becton Dickinson) vengono sortate le cellule naive (CD45RA+).



Le cellule così separate sono lavate in PBS, colorate con CFSE ad una concentrazione di 0.5 µM in PBS per 8 min a TA, poi lavate 2 volte con RPMI 10 % FCS e risospese ad una concentrazione di 106 cellule/ml. Separatamente delle cellule dendritiche provenienti da un altro donatore sono attivate per 3 ore con LPS (lipopolisaccaridi, E. Coli 0111:B4 LPS, Invitrogen, cat. tlrl-pelps) ad una concentrazione di 100 ng/ml in RPMI 10% FCS. Dopo un lavaggio sono risospese anch�esse a 106 cellule/ml. In una piastra vengono pipettati 200 µl di sospensione cellulari sortate e 40 µl di cellule dendritiche (rapporto 5:1) per l�attivazione delle cellule T. Le cellule sono messe in diverse condizioni:

• Controllo senza aggiunte • Condizioni TH1; con aggiunta di IL-12 (Recombinant Human IL-

12, BD Pharmingen, cat. 554613) ad una concentrazione di 10 ng/ml e anti-IL4 (Purified Human anti-IL-42, BD Pharmingen, cat. 554434) ad una concentrazione di 2 µg/ml.

• Condizioni TH2; con aggiunta di IL-4 (Recombinant Human IL-4, BD Pharmingen, cat. 554605) ad una concentrazione di 10 ng/ml e anti-IL12 (Purified Human anti-IL-12, BD Pharmingen, cat. 551227) ad una concentrazione di 2 µg/ml.

Le cellule sono incubate per 5 giorni. Dopo incubazione le cellule sono sottoposte a colorazione intracellulare per l�analisi della produzione di citochine e una colorazione con MTO (Mito cracker Orange, CMTMRos, Molecular Probes, cat. M-7510). Le cellule vengono separate in 4 porzioni, attivate con PMA 10-7 M e ionomicina 1 µg/ml per 1.5 ore, poi viene aggiunta BFA 10 µg/ml ed incubate altre 1.5 ore. Durante gli ultimi 20 min viene aggiunto MTO ad una concentrazione di 50 nM . Alla metà delle cellule viene aggiunto Verapamil (Verapamil hydrochloride, Sigma, cat. V4629) ad una concentrazione di 50 µM per inibire ABCB1 e fungere quindi da controllo positivo (13). Le cellule vengono lavate 2 volte con PBS 1% FCS, vengono fissate per 15 min con fix solution in ghiaccio, le cellule vengono poi lavate 2 volte con soluzione permeabilizzante (Permeabilisation Buffer), poi nei diversi pozzetti vengono colorate con anticorpi specifici anti-citochine: anti-IL-4 (APC-anti-human IL-4 , BD Pharmingen, cat. 554486) o anti-IFN-γ (APC-anti-human IFN-γ, BD Pharmingen, cat. 554702), entrambi ad una concentrazione di 0.2 µg/ml, ed incubati per 30 min a 4 C. Dopo 2 lavaggi con soluzione permeabilizzante le cellule sono risospese in PBS 1% FCS ed analizzate al citofluorimetro.



Analisi della produzione di citochine da parte di cellule della memoria con inibizione di trasportatori ABC Le cellule della memoria CD4+ sono ottenute a partire da Buffy Coat con gradiente di Ficoll e CD4 MACS. Le cellule CD4+ sono poi colorate con anti-CD45RA-APC (APC-anti-human CD45RA, BD Pharmingen, cat. 550855) ed al sorter sono isolate le cellule negative. Le cellule della memoria vengono risospese ad una concentrazione di 106 cellule/ml ed in ogni pozzetto vengono pipettati 100 µl di sospensione cellulare. Le cellule sono attivate con PMA 10-7 M e ionomicina 1 µg/ml per 2 ore in diverse condizioni. un controllo negativo (senza PMA e ionomicina) e un controllo positivo. Negli altri pozzetti viene aggiunto un inibitore per trasportatori ABC, rispettivamente: Verapamil (Verapamil hydrochloride, Sigma, cat. V4629) ad una concentrazione di 50 µM, Ciclosporina A (Ciclosporine, Bedford Labs, Bedford OH 44146 USA, cat. 55390-122-10) ad una concentrazione di 25 µM, e PGP in 3 diverse concentrazioni 5, 10 e 20 nM (Alexis, cat. 270-290-M002). Dopo 2 ore le cellule vengono separate dal sovranatante e nel sovranatante viene misurata la concentrazione di IL-2, IL-4 e IFN-γ con il metodo Beads Array (già descritto sopra).



Risultati e discussione Colorazione con MTG per espressione di ABCB1 Il colorante MTG permea liberamente le cellule attraversandone la membrana ed è espulso da trasportatori ABC, per accertarne la presenza su linfociti T CD4+, le cellule ottenute da buffy coat con gradiente di Ficoll e purificazione con CD4 Microbeads, sono state risospese in RPMI 10% FCS, un mezzo in cui possono svolgere in vitro le loro normali funzioni, e vi è stato aggiunto il colorante MTG. Dopo un lavaggio per togliere il colorante in eccesso le cellule che non esprimono un trasportatore ABC in grado di espellere il colorante risultano positive all�analisi al citofluorimetro, mentre quelle che esprimono un trasportatore ABC risultano negative. Per identificare il subset cellulare che esprime il trasportatore ABC le cellule sono state colorate con CD45RA-PE per identificare le cellule T naive (CD45RA+) e memory (CD45RA-). Le cellule sono state colorate in 3 condizioni diverse: solo con MTG, o con l�aggiunta di un inibitore specifico per trasportatori ABC, con MK571 per inibire specificamente ABCC1 e con PGP-4008 per inibire specificamente ABCB1. L�analisi al citoflurimetro ha permesso di evidenziare due subset in tutte e due le popolazioni, la percentuale di cellule naive che esprimono un trasportatore in grado di espellere il colorante è risultata essere del 17%, mentre la percentuale di cellule della memoria che esprimono un trasportatore ABC è risultata essere del 15%. Con l�uso di inibitori, solo PGP-4008 (specifico per ABCB1) é stato in grado di inibire l�espulsione del colorante, mentre MK571 (specifico per ABCBC1 non é stato in grado di inibirla. Questo indica che il trasportatore ABC espresso su linfociti T CD4+ é ABCB1 (Figura 1).



Figura 1. Espressione funzionale di ABCB1 in cellule CD4. Inibizione con PGP-4008 (verde), con MK571 (blu) e senza inibitori (rosso) su cellule CD4+ della memoria (A) e naive (B) e percentuale di cellule MTG- (ABCB1+) con l�uso dei diversi inibitori (C).

MK571 PGP-4008 Controllo

MTG (FL1)

Percentuale di cellule MTG- (ABCB1+)

02468

1012141618

MK571

naive memory

Controllo PGP-4008

A

C

B



Stimolazione di cellule Naive CD4 e analisi dell�espressione di ABCB1 Le cellule naive CD4 sono isolate grazie alla colorazione con anticorpi specifici anti-CD45RA-APC a partire da Buffy Coat dopo purificazione con CD4 MACS, vengono attivate in coltura in piastra in due modi diversi: con anti-CD3 o con anti-CD3 e anti-CD28, le cellule vengono attivate per tempi diversi (4, 24, 48 e 72 ore) e dopo attivazione tenute in coltura in RPMI 10% FCS e sempre analizzate ai tempi seguenti per seguire l�espressione di ABCB1. Il numero di cellule presenti in ogni pozzetto viene misurato con l�aggiunta di Beads, il numero delle cellule è riferito a 1500 biglie, in quanto non si vuole seguire il numero effettivo di cellule presenti in ogni pozzetto, ma la variazione del loro numero nel tempo. L�espressione di ABCB1 è misurata con colorazione con MTG. Dai risultati si può vedere come il numero di cellule non aumenti dopo attivazione con solo anti-CD3 (Figura 2A), lo stimolo non è sufficientemente forte, ma aumenti in modo significativo con l�attivazione con anti-CD3 e anti-CD28 (Figura 2B), dove lo stimolo è sufficientemente forte. L�espressione di ABCB1 non varia in modo significativo dopo attivazione con anti-CD3 (Figura 3A). All�attivazione con anti-CD3 e anti CD28 (Figura 3B)si può però notare come l�espressione di ABCB1 (quindi la percentuale di cellule MTG-) diminuisca dopo un�attivazione di almeno 24 ore, si può notare come la percentuale di cellule MTG negative passi da più del 90% fino a circa il 50%. Se le cellule vengono poi tenute in coltura la percentuale di cellule negative ritorna a salire. Quindi l�espressione di ABCB1 diminuisce se le cellule ricevono uno stimolo specifico all�attivazione e aumenta se le cellule vengono tenute in coltura in assenza di stimoli ottimali.



A B

attivazione con CD3 CD28

0

50000

100000

150000

200000

0 20 40 60 80 100 120 140 160

ore

no c

ellu

le v

ive 4h CD3/28

24h CD3/28

48h CD3/28

72h CD3/28

no stimolo

Figura 2. Sopravvivenza cellulare dopo attivazione. Le cellule naive sono sortate e messe in coltura con anticorpi anti-CD3 (A) o anti-CD3 e anti-CD28 (B), il numero di cellule viene misurato con aggiunta di biglie e quantificate per 1500 biglie.

attivazione con CD3

0

10000

20000

30000

40000

0 20 40 60 80 100 120 140 160

ore

no c

ellu

le v

ive 4h CD3

24h CD3

48h CD3

72h CD3

no stimolo



A B Figura 3. Espressione di ABCB1 dopo attivazione. Le cellule naive sono sortate e messe in coltura con anticorpi anti-CD3 (A) o anti-CD3 e anti-CD28 (B), l�espressione di ABCB1 è misurata grazie a colorazione con MTG, nel grafico è riportato il numero di cellule MTG negative e che quindi esprimono ABCB1.

attivazione con CD3

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160

ore

% n

eg c

ells

nessun

4h CD3

24h CD3

48h CD3

72h CD3

attivazione con CD3 CD28

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160

ore

% n

egat

ive

cells nessun

4h CD3/28

24h CD3/28

48h CD3/28

72h CD3/28



Analisi dell�espressione di recettori per chemochine Per ulteriori analisi dell�espressione di ABCB1 su cellule T CD4+ si é cercato di correlare la sua espressione con l�espressione di recettori per chemochine. Nell�esperimento le cellule CD4+ sono state colorate con MTG e di seguito con anticorpi specifici anti-CD45RA-APC per distinguerle in Naive e Memory e in quattro pozzetti diversi con anticorpi specifici anti-recettori per chemochine: anti-CCR7, anti-CXCR3, anti-CCR5 tutti coniugati con PE e con anti-CRTH2-biotina cui ha seguito una colorazione con streptavidina-PE. Le cellule sono state poi analizzate al citofluorimetro per valutare l�espressione dei recettori nelle varie popolazioni (Figura 4). Le cellule naive si possono dividere in due popolazioni con la colorazione con MTG, tutte le cellule esprimono CCR7 e non esprimono altri recettori di quelli analizzati (risultati non mostrati). Le cellule della memoria hanno dato invece i seguenti risultati: le cellule MTG positive (che quindi non esprimono ABCB1) sono risultate essere in maggioranza CCR7 positive (Central Memory) mentre le cellule MTG negative (che quindi esprimono ABCB1) sono risultate essere in maggioranza CCR7 negative (Effector Memory). Quindi il trasportatore ABCB1 è espresso principalmente su Effector Memory e in minor quantità su Central Memory (12). Le cellule MTG negative esprimono in maggioranza CXCR3 (77%) rispetto alle cellule MTG positive (45%). CCR5 é espresso in percentuale maggiore sulle cellule MTG negative. Le uniche cellule che esprimono CRTH2 sono risultate essere MTG positive. CXCR3 e CCR5 sono espressi preferenzialmente su celllule TH1 (14-17) mentre CRTH2 é espresso selettivamente su TH2 (18). I risultati di questo esperimento suggeriscono che ABCB1 sia espresso preferibilmente su cellule TH1.



Figura 4. Espressione di recettori per chemochine su cellule della memoria CD4+. Doppia colorazione di cellule T CD4 totali, selezionando le cellule CD45RA-, mostrando la colorazione con MTG contro diversi recettori per chemochine.

45.2 18.3

12.723.8

64 2.0

4.129.9

59.3 4.1

0.236.5

16.9 46.4

20.9 15.7

MTG

CRTH2

CCR5 CXCR3

CCR7



Colorazione intracellulare per produzione di citochine ex vivo Per confermare il risultato ottenuto con i recettori per chemochine, é stata presa in considerazione la produzione di citochine da parte dei diversi subsets di cellule T CD4+. Le cellule CD4+ vengono sortate in quattro popolazioni: naive e memory MTG negative e positive, in modo da poterle attivare separatamente con PMA e ionomicina per 2 ore. Vengono poi incubate con BFA per altre due ore in modo da bloccare il rilascio delle citochine. Le cellule vengono poi fissate con una soluzione di formaldeide e colorate con anticorpi specifici anti-IL4-PE e anti-IFN-γ-APC in una soluzione di saponina che rende la membrana della cellula permeabile agli anticorpi, che possono penetrare all�interno della cellula e colorare le citochine prodotte. Le cellule sono poi analizzate al citofluorimetro (Figura 5A). Le cellule naive non producono, in pratica, IL-4 e IFN-γ nelle condizioni usate nell�esperimento. Le cellule della memoria invece producono diverse citochine. Delle cellule della memoria MTG positive (che non esprimono ABCB1) il 18.5% producono di IFN-γ, il 15% producono IL-4 e il 3.9% producono sia IL-4 che IFN-γ . Delle cellule della memoria MTG negative (che esprimono ABCB1) il 56.3% delle cellule producono IFNγ, il 4% sia IFNγ che IL-4 e solo l�1.4% IL-4. Come mostrato nei grafici (figura 5B) le cellule della memoria MTG positive (M+) producono molta IL-4 e poco IFN-γ, mentre le cellule della memoria MTG negative (M-) producono meno IL-4 ma più IFN-γ. Questo risultato conferma quelli ottenuti con l�espressione dei recettori per chemochine e suggerisce nuovamente che ABCB1 é espresso di preferenza su cellule TH1.



Figura 5. Produzione di citochine da parte di subset di cellule T CD4+. (A) Le cellule CD4 naive e memory sono sortate grazie a colorazione con MTG e poi analizzate per espressione di IL-4 e IFN-γ. (B) Percentuale di cellule positive per IL-4 e IFN-γ nelle cellule naive MTG+ e MTG-(N+ e N-) e memory MTG+ e MTG- (M+ e M-).

18.5 3.9

14.962.7

53.6 5.0

1.7 39.8

1.4 0.0

0.598.1

0.9 0.1

0.5 98.5

Naive MTG + Naive MTG -

Memory MTG - Memory MTG +

IL-4-PE

IFNγ-APC

IL4

0.02.04.06.08.0

10.012.014.016.018.020.0

M + M - N + N -

%

IFNg

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

M + M - N + N -

%

A

B



Beads Array per produzione di citochine Per confermare ulteriormente la produzione di citochine da parte dei subsets di csllule T CD4+, si é misurato il rilascio di citochine da parte delle cellule precedentemente sortate in naive e memory, MTG negative e positive. Sono state dapprima attivate in piastra con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28. La piastra é stata preparata in precedenza mettendo in ogni pozzetto 50 µl di soluzione di anticorpi in PBS con CaCl2 e MgCl2 con una concentrazione di ogni anticorpo di 2 µg/ml. La piastra viene tenuta a 4°C per una notte, durante la quale gli anticorpi aderiscono alla parete dei pozzetti. Dopo un lavaggio con RPMI 10% FCS vengono messe le sospensioni cellulari. Le cellule vengono incubate per 48 ore in modo che abbiano il tempo di attivarsi. Dopo 48 ore il sovranatante viene separato dalle cellule per il test Bead Array, detto anche ELISA in citometria. Grazie a delle biglie ricoperte di anticorpi specifici per citochine si può misurare, mediante una serie di standards, la concentrazione di diverse citochine. Le diverse biglie hanno una fluorescenza intrinseca di diversa intensità (FL3) che ne permette la discriminazione, gli anticorpi di cui sono ricoperte legano la citochine ed un secondo anticorpo coniugato con PE lega la citochine con una reazione a sandwich. L�intensità della fluorescenza in FL2 è direttamente proporzionale alla concentrazione delle citochine nel sovranatante. La concentrazione di IL-4 nel sovranatante delle cellule naive è risultata non misurabile, per le cellule memory MTG+ è risultata essere di 6552 pg/ml, per le cellule memory MTG- è risultata essere 284 pg/ml. La concentrazione di IFN-γ nel sovranatante delle cellule naive MTG+ è risultata non misurabile, per le cellule naive MTG- è risultata essere 551 pg/ml, per le cellule memory MTG+ è risultata essere di 52660 pg/ml, per le cellule memory MTG- è risultata essere 85580 pg/ml. (Figura 6). Come si vede dai grafici le cellule MTG+ producono più IL-4 e meno IFN-γ rispetto alle cellule della memoria MTG-.Questo risultato conferma i risultati fino a qui ottenuti, rinforzando le evidenze precedenti che ABCB1 sia espresso preferibilmente su cellule TH1.



Figura 6. Bead Array per produzione di citochine. Le cellule CD4 sono sortate in memory MTG+ e MTG- e naive MTG+ e MTG-, mediante colorazione con MTG e anti-CD45RA-PE. Le cellule sono poi attivate in piastra con anti-CD3 e anti-CD28 per 48 ore. Il grafico riporta la concentrazione (in pg/ml) di IL-4 e IFNγ misurata al citofluorimetro con il metodo Beads Array (BD).

IL4

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

M+ M- N+ N-

IFNg

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

M+ M- N+ N-



Colorazione intracellulare per produzione di citochine in vitro. Dopo gli esperimenti ex-vivo (attivazione con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 e attivazioni con PMA e ionomicina) si é voluta analizzare la produzione di citochine in una situazione che meglio rispecchia quella fisiologica. Per l�esperimento vengono usate cellule naive per vedere se con il priming delle cellule dendritiche prolifereranno cellule ABCB1+ che produrranno grandi quantità di IFN-γ. Dalle cellule CD4+ sono state isolate le cellule naive con colorazione con anticorpi specifici anti-CD45RA-FITC. Le cellule isolate al FACSAria sono colorate con CFSE, un colorante che si fissa a proteine citoplasmatiche e che permette di seguire le divisioni cellulari. Infatti una cellula con una data intensità di colorazione CFSE darà luogo, dopo divisione a due cellule con intensità di colorazione dimezzata e così via. Le cellule naive vengono attivate con cellule dendritiche provenienti da un donatore diverso attivate per 3 ore con lipopolisaccaridi. In ogni pozzetto vengono messe 200'000 CD4+ e 40'000 cellule dendritiche, in tre condizioni diverse: da una parte con aggiunta di IL-4 e anti IL-12 per stimolare la differenziazione di cellule TH2 e bloccare la differenziazione delle TH1 e dall�altra con aggiunta di IL-12 e anti-IL4 per stimolare la differenziazione di cellule TH1 e bloccare la differenziazione di TH2 e nella terza condizione senza aggiunta di citochine come controllo. Le cellule vengono tenute in coltura in queste condizioni per 5 giorni e poi vengono attivate con PMA e ionomicina per 1,5 ore, poi vi si aggiunge BFA per altre 1,5 ore e per gli ultimi 20 minuti di stimolazione le cellule sono divise in 2 e viene aggiunto MTO e ad una serie verapamil per inibire ABCB1 e fare quindi da controllo positivo, dopo lavaggio e fissazione le cellule vengono ulteriormente separate in due porzioni e colorate con due anticorpi specifici anti-IL4 e anti-IFN-γ entrambi coniugati con APC in soluzione di saponina per colorazione intracellulare e infine analizzate al citofluorimetro. Con la colorazione CFSE (FL1) vengono selezionate le cellule che sono state attivate dalle celllule dendritiche e che quindi hanno cominciato a proliferare, di queste si guarda poi MTO (FL2) contro la citochina (FL4). Le cellule Naive hanno prodotto IFN-γ nel 93% delle cellule in condizioni TH1 e queste sono soprattutto MTG- (86% delle cellule) mentre in condizioni TH2 le cellule non hanno prodotto IFN-γ, le cellule Naive non hanno in queste condizioni prodotto IL-4 (Figura 7). Quindi l�esperimento ci fornisce un ulteriore conferma dell�evidenza che ABCB1 sembra essere espresso di preferenza su cellule TH1.



Figura 7. Produzione di citochine dopo stimolazione in vitro su cellule Naive. Le cellule naive sono state sortate a partire da cellule CD4 totali, colorate con CFSE e messe in coltura con cellule dendritiche di un diverso donatore. Nel grafico sono riportate la produzione di IL-4 e IFNg da parte delle cellule che hanno ricevuto il priming da parte delle cellule dendritiche.

55.2 22.4

6.3 16.1

80.4 13.1

0.55.9

1.7 0.7

27.9 69.8

3.9 1.8

22.5 71.8

1.2 0.2

1484.6

0.7 0.2

25.4 73.7

MTO (FL2)

Controllo Condizioni

TH1 Condizioni

TH2

IFNγ−APC

IL-4-APC



Analisi della produzione di citochine da parte di cellule della memoria con inibizione di trasportatori ABC Per evidenziare se il trasportatore ABCB1 ha un influsso sul rilascio di citochine da parte delle cellule CD4+, le cellule CD4+ totali sono colorate con anticorpi specifici anti-CD45RA-APC ed al sorter sono state isolate le cellule negative, le cellule della memoria. Per mettere in evidenza la partecipazione del trasportatore ABCB1 nel rilascio di citochine da parte delle cellule, le stesse vengono attivate con PMA e ionomicina per 2 ore in presenza o assenza di inibitori dei trasportatori ABC (Verapamil, Ciclosporina e PGP 4008). Dopo l�attivazione il sovranatante viene separato dalle cellule ed in esso si é misurata la concentrazione di IL-2, IL-4 e IFNγ. Per controllare la sopravvivenza le cellule sono state risospese in PBS 1% FCS e con l�aggiunta di biglie si é valutata la concentrazione di cellule presenti (figura 8 A). Il grafico dimostra che glil inibitori non hanno indotto morte cellulare nelle concentrazioni utilizzate. La percentuale di inibizione riportata nei grafici (figura 8 BCD) é stata calcolata in base alla concentrazione misurata nel controllo positivo, sottraendo ad ogni campione la concentrazione di citochina misurata nel controllo negativo e normalizzandola con il numero di cellule vive (calcolate grazie all�aggiunta di biglie) . La produzione di citochine da parte delle cellule della memoria é risultata essere influenzata dall�attività dei trasportatori ABC. Come si vede dai grafici, la produzione di citochine risulta essere inferiore con l�uso di inibitori, l�inibitore più efficace risulta essere la ciclosporina (oltre a bloccare i trasportatori ABC inibisce anche la trascrizione dei geni codificanti per le citochine (19)), anche Verapamil inibisce la secrezione delle citochine analizzate, anche se in modo minore rispetto alla ciclosporina. L�inibitore specifico per ABCB1 (PGP 4008) inibisce anch�esso la liberazione di tutte le citochine analizzate, anche se in modo meno efficace, inoltre si può notare un effetto dose-dipendente, in quanto se si diminuisce la concentrazione di inibitore la secrezione di citochine aumenta. Questo indica un coinvolgimento del trasportatore ABCB1 nel rilascio di citochine da parte delle cellule della memoria. E� possibile ipotizzare che anche se non implicato direttamente nel rilascio delle citochine analizzate ABCB1 regola l�attività di altri trasportatori implicati nel rilascio di citochine. Alcuni trasportatori ABC sono infatti noti per regolare altri trasportatori con diverse funzioni (20). Inoltre non é escluso che i trasportatori ABC siano coinvolti, in maniera più generale, nell�attivazione delle cellule T.



Numero di cellule con inibitore PGP in diverse concentrazioni

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 5 10 15 20 25

Concentrazione (nM)

num

ero

di c

ellu

le

PGPVerapamil (50 µM)CsA (25 µM)

Percentuale di inibizione del rilascio di IL-2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25

Concentrazione (nM)

% d

i ini

bizi

one

PGPVerapamil (50 µM)CsA (25 µM)

Percentuale di inibizione del rilascio di IL-4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25

Concentrazione (nM)

% d

i ini

bizi

one

IL-4Verapamil (50 µM)CsA (25 µM)

Percentuale di inibizione del rilascio di IFNγ

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25

Concentrazione (nM)

% d

i ini

bizi

one

IFNgVerapamil (50 µM)CsA (25 µM)

Figura 6. Rilascio di citochine da parte di cellule della memoria con inibitori per trasportatori ABC. Le cellule della memoria sono state attivate con PMA e ionomicina per 2 ore. Le cellule sono state contate grazie all�aggiunta di biglie (A). Nel sovranatante sono state misurate IL-2, IL-4 e IFNγ (B, C e D) con il metodo Beads Array (BD). Il rilascio di citochine risulta inibito con l�uso di inibitori per trasportatori ABC aspecifici, Verapamil e CsA, e con PGP 4008 specifico per ABCB1 che mostra un effetto dipendente dalla dose.

A

C

D

B



Conclusioni Il trasportatore ABCB1 è espresso su ogni subset di cellule CD4. Questo si è dimostrato grazie all�uso di inibitori specifici di trasportatori ABC. L�espressione di ABCB1 può variare a seconda delle condizioni in cui si trovano le cellule, in questo lavoro si è visto che l�espressione di ABCB1 su cellule T Naive diminuisce quando le cellule ricevono uno stimolo specifico di attivazione dato da anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 e che l�espressione del trasportatore ritorna ai valori iniziali se le cellule vengono successivamente tenute in coltura in assenza di stimoli. Quindi l�espressione del trasportatore ABCB1 viene indotta se le cellule vengono tenute in coltura o attivate con solo anti-CD3, l�espressione di ABCB1 viene invece inibita se le cellule ricevono uno stimolo di attivazione dato da anticorpi anti-CD3 e anti-CD28. Il trasportatore potrebbe essere un marcatore di �stress�, visto che le cellule in coltura senza stimolo sufficientemente forte di attivazione subiscono una forma di �stress�. Le cellule che esprimono ABCB1 sono risultate essere arricchite in cellule TH1 e le cellule che non esprimono ABCB1 sono risultate essere arricchite in cellule TH2. Questo è stato dimostrato grazie all�espressione di recettori che caratterizzano le due sottopopolazioni, in particolare CCR5, che è espresso su cellule TH1, espresso su cellule ABCB1 positive mentre CRTH2, specifico per TH2 é espresso solamente su cellule ABCB1 negative. Gli stessi risultati si sono ottenuti con gli esperimenti per la produzione di citochine, sia con colorazione intracellulare che con Beads Array, si è dimostrato come le cellule che esprimono ABCB1 producano grandi quantità di IFNγ e minori quantità di IL-4 rispetto alle cellule che non esprimono ABCB1. Questo concorda nel dire che le cellule che esprimono ABCB1 sono prevalentemente di tipo TH1 e le cellule che non esprimono ABCB1 sono prevalentemente TH2. I dati quindi suggeriscono che l�espressione del trasportatore ABCB1 sia parte del programma di differenziazione in TH1. I dati ottenuti dimostrano anche che il trasportatore ABCB1 é coinvolto nel rilascio di citochine da parte delle cellule T della memoria. Non é chiaro però in che modo esso sia coinvolto. Probabilmente ABCB1 é coinvolto indirettamente nel rilascio di queste citochine, regolando l�attività del trasportatore direttamente responsabile per il loro rilascio o, in modo più generale, l�attivazione delle cellule T. Nel futuro si dovrà determinare più specificamente in quale processo cellulare delle cellule T CD4+ sono implicati i trasportatori ABC. Si può già affermare, in ogni caso, che non hanno funzioni esclusivamente di trasporto di sostanze attraverso la membrana cellulare.



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19. S. Ho, N. Clipstone, L. Timmerman, J. Northrop, I. Graef, D. Fiorentino, J. Nourse, G. R. Crabtree, The mechanism of action of cyclosporin A and FK506, Clin. Immunol. Immunopathol. 1996, 80, 40-45

20. C. F. Higgins, The ABC of channel regulation, Cell 1995, 82, 693-696



Ringraziamenti Vorrei ringraziare coloro che mi hanno aiutato in questo lavoro. In primo luogo ringrazio il direttore dell�Istituto di Ricerca in Biomedicina, il professor Antonio Lanzavecchia, per avermi permesso di svolgere il mio stage di formazione e quindi il lavoro di diploma in un laboratorio all�avanguardia nella ricerca. Ringrazio Federica Sallusto per avermi seguito nello svolgimento del mio lavoro e David Jarrossay per il continuo contributo. Ringrazio i docenti che mi hanno aiutato dal lato metodologico, Daniela Marcacci il direttore Andrea Boffini. Inoltre Susan Gilbert per la parte in inglese. Ringrazio Elena per l�aiuto nella stesura del lavoro e le correzioni delle bozze. Jole e Sara per la lettura delle bozze.



Allegato: I trasportatori ABC La membrana cellulare separa il reparto intracellulare da quello extracellulare, le sue funzioni principali sono definire I confini della cellula e mantenere l�omeostasi. Le membrane cellulari hanno tutte la stessa struttura: due strati lipidici che formano un doppio strato con un interno idrofobico e due superfici idrofile. A causa della sua parte interna idrofobica, la membrana cellulare funge da barriera per la maggioranza delle sostanze polari. Per questo le cellule hanno dovuto trovare il modo di trasportare le sostanze organiche idrosolubili attraverso la membrana in modo da importare nutrienti essenziali, esportare prodotti di scarto del metabolismo e regolare la concentrazione intracellulare di ioni. Il trasporto di ioni inorganici e sostanze organiche idrosolubili di piccole dimensioni attraverso il doppio strato lipidico é svolto da proteine di membrana specializzate, ognuna delle quali é responsabile del trasporto di uno ione specifico o di una molecola specifica (o un piccolo gruppo di molecole molto simili tra loro). Ci sono due classi principali di proteine di membrana che sono responsabili del trasporto di sostanze attraverso la membrana: proteine canale, che formano un poro idrofilo e permettono il libero passaggio di sostanze inorganiche e proteine carrier che hanno parti mobili per spostare molecole specifiche da una parte all�altra della membrana. Le proteine carrier legano il soluto specifico e compiono una serie di cambiamenti nelle loro conformazione in modo da spostare il soluto attraverso la membrana, il processo di trasporto può essere attivo o passivo, quando il movimento avviene nella direzione del gradiente elettrochimico il processo è passivo e non necessita di energia, quando il processo avviene invece nel senso contrario al gradiente elettrochimico il processo è attivo e necessita quindi di energia. Il trasporto attivo è sempre mediato da carrier e necessita di energia fornita dall�idrolisi di ATP (Figura 1). Le proteine carrier possono trasportare le sostanze in diversi modi, quelle che trasportano un singolo soluto da una parte all�altra sono chiamate uniporters, altre proteine possono trasportare simultaneamente due soluti, nella stessa direzione (symport) o nelle due diverse direzioni (antiport) (Figura 2)



La famiglia dei trasportatori ABC In questo allegato si focalizza l�attenzione su una famiglia di proteine carrier che svolgono un trasporto attivo chiamati ATP-Binding cassette (o ABC) transporters. I trasportatori ABC sono presenti in tutte le speci dai batteri all�uomo, la loro famiglia di geni é la più grande fino ad oggi conosciuta ed è in continua espansione a causa di nuove scoperte. I trasportatori ABC presentano tutti una comune struttura molecolare, ci sono due possibili strutture: o il trasportatore è formato da una singola proteina con 2 sequenze transmembrana e 2e ATP-binding, oppure da due proteine che dimerizzano, ognuna avente una sequenza transmembrana e una ATP-binding., ogni proteina contiene delle zone altamente conservate chiamate ATP-binding Cassette.(Figura 3).

Figura 1. Confronto tra trasporto passivo (seguendo il gradiente elettrochimico) e attivo (contro il gradiente elettrochimico). Diffusione semplice e trasporto passivo avvengono spontanea-mente, il trasporto attivo necessita invece di energia (3).

Figura 2. Tre tipi di trasporto mediato da carrier. Lo schema rappresenta proteine carrier che funzionano come uniporter, symporter e antiporter (3).



Finora sono stati descritti più di 50 appartenenti alla famiglia degli ABC transporters, ogni trasportatore é specifico per una sostanza (detta anche allocrite), che può essere: un aminoacido, zuccheri, ioni inorganici, polisaccaridi, peptidi o anche proteine. In alcuni casi la funzione e l�espressione nei vari tessuti dei diversi trasportatori non è ancora stata chiarita (Figura 4).

i trasportatori ABC sono stati trovati in tutte le speci e svolgono una serie di funzioni:

1. Trasportatori: spostano attivamente sostanze attraverso la membrana.

2. Proteine canale: spostano passivamente sostanze attraverso la membrana.

3. Recettori: legano sostanze trasmettono il segnale all�interno della cellula.

4. regolatori di altre proteine di membrana. ATP è il substrato dei trasportatori ABC nel vero senso del termine, ATP viene idrolizzato in ADP e P, e questo da l�energia necessaria al trasporto della sostanza attraverso la membrana. Il meccanismo di idrolisi di ATP può cambiare da un trasportatore all�altro, alcuni esempi sono:

1. ABCB1: entrambe le binding cassette idrolizzano ATP e interagiscono per trasportare il soluto.

2. ABCC7: entrambe le binding cassette idrolizzano ATP, una è responsabile dell�apertura del canale e l�altra per la chiusura

3. ABCC8: Una binding cassette lega ATP e l�altra ADP

Figure 3. Rappresentazione schematica di un tipico trasportatore ABC. (A) Topologia. (B) sistemazione ipotetica della catena polipeptidica attraverso la membrana. Il trasportatore è formato da 4 sequenze due altamente idrofobiche che si situano attraverso la membrana e due ATP-binding cassette. In alcuni casi la proteina è formata da una singola catena di aminoacidi (come nelle figura) e in altri da due catene che dimerizzano (3).



La famiglia dei trasportatori ABC comprende finora 53 proteine divise in 7 sottofamiglie, la loro organizzazione genomica suggerisce un�evoluzione autonoma, i dati molecolari di ogni trasportatore sono raffigurati nella figura 5. Figura 4: Allocriti ed espressione nei tessuti dei diversi trasportatori ABC nell�uomo.

Gene Allocrita Espressione nei tessuti ABCA1 Colesterolo, lipidi Utero, fegato ubiquitario a bassi livelli

ABCA2 Estramustine Cervello, fegato, reni polmoni, cuore, ubiquitario a bassi livelli

ABCA3 Xenobiotici Cervello, fegato, reni, pancreas, ubiquitario a bassi livelli

ABCA4 Retinoidi Retina ABCA7 Lipidi Milza, organi linfatici

ABCB1 Medicamenti citostatici, xenobiotici, steroidi, composti idrofobici

Surreni, cervello, tratto intestinale, reni, fegato, tumori multiresistenti

ABCB2 Peptidi Reticolo endoplasmatico

ABCB3 Peptidi Reticolo endoplasmatico, aorta, colon reni, polmoni, stomaco, utero

ABCB4 Fosfatidilcolina Seno, colon, cuore, fegato ABCB5 Fosfatidilcolina Ubiquitario ABCB6 Ferro Mitocondri, ubiquitario ABCB7 Ferro Mitocondri, ubiquitario ABCB8 Composti mitocondriali Mitocondri, ubiquitario

ABCB9 Lisosomi, cervello, cellule germinali, testicoli, tonsille utero

ABCB10 Peptidi Mitocondri, ossa, linfonodi, polmoni, stomaco

ABCB11 Sali biliari monovalenti Epatociti

ABCC1 Medicamenti citostatici, xenobiotici, leucotrieni, coniugati anionici Ubiquitario

ABCC2 Sali biliari Intestino, fegato, reni ABCC3 Sali biliari Intestino, fegato, reni

ABCC4 Anioni inorganici medicamenti antivirali Cistifellea, prostata, polmoni, ovaie, pancreas, muscoli scheletrici, testicoli

ABCC5 Anioni organici Ubiquitario

ABCC6 Medicamenti citostatici, xenobiotici, componenti della matrice extracellulare

Capillari, precursori emopoietici, reni, fegato, retina, pelle

ABCC7 Cloruro, anioni organici, glutatione Epididimo, intestino, reni, polmoni, pancreas, ghiandole salivari, testicoli

ABCC8 Potassio β-cells delle isole pancreatiche ABCC9 Potassio Ubiquitario ABCD1 Acidi grassi liberi o coniugati a CoA Ubiquitario ABCD2 Acidi grassi liberi o coniugati a CoA Surreni, cervello, cuore ABCD3 Acidi grassi liberi o coniugati a CoA Ubiquitario ABCD4 Acidi grassi liberi o coniugati a CoA Ubiquitario ABCE1 Regolatore di RNAse Ubiquitario ABCF1 Coinvolto nelle traslazione di MRNA Ubiquitario ABCF2 ferro Ubiquitario ABCF3 Fegato fetale, milza ABCG1 Colesterolo, fosfolipidi Cervello, milza, polmoni ABCG2 Medicamenti citostatici Placenta, seno, fegato, intestino



Figura 5 : molecular key data of human ABC Transporters

Sinonimi Chromosomal locus Exoni mRNA Proteina ABCA1 ABC1, TGD, HDLDT1, CERP 9q22-31 49/50 6,9 kb 2261 aa ABCA2 ABC2 9p34 48 8 kb 2436 aa ABCA3 ABC3, ABC-C 16p13.3 6.5 kb 1704 aa ABCA4 ABC10, ABCR, STGD1, RP19, FFM 1p22 50 7.3 kb 2273 aa ABCA5 ABC13 17q21-24 38 6.5 kb 1642 aa ABCA6 17q21 38 5.3 kb 1617 aa ABCA7 ABCX 19p13.3 > 37 6.6 kb 2146 aa ABCA8 17q24 38 5.7 kb 1581 aa ABCA9 17q24 38 6 kb 1624 aa ABCA10 17q24 38 6.2 kb 1543 aa ABCA11 4p16 ABCA12 2q35 7 kb 2595 aa ABCA13 7p11-q11 62 450 kb 5058 aa ABCB1 ABC20, MDR1, P-gp, PGY1, P-170 7q21 28 4.5 kb 1280 aa ABCB2 ABC17, TAP1, PSF1, RING4 6p21.3 11 2.5 kb 748 aa ABCB3 ABC18i, TAP2, PSF2, RING11 6p21.3 11 2.8 kb 703 aa ABCB4 ABC21, MDR2 (3), PGY3, PFIC-3 7q21 28 4.5 kb 1280 aa ABCB5 ABC19 7p14 2.5 kb 748 aa ABCB6 ABC14, MTABC3 2q33-36 19 3.5 kb 842 aa ABCB7 ABC7, ATM1P Xq131.1-131.3 2.4 kb 752 aa ABCB8 ABC2, M-ABC1 7q35-36 2.4 kb 718 aa ABCB9 ABC23, TAPL 12q24 3.5 kb 723 aa ABCB10 M-ABC2, MTABC2 1q42 4.1 kb 738 aa ABCB11 ABC16, BSEP, SPGP, PGY4 2q24 5.4 kb 1321 aa ABCC1 ABC29, MRP1, GS-X 16p13.1 31 6.5 kb 1531 aa ABCC2 ABC30, MRP2, cMOAT, cMRP 10q24 32 5.5 kb 1545 aa ABCC3 ABC31, MRP3, cMOAT2, MPL2,

MOAT-D 17q21.3 6.5 kb 1527 aa

ABCC4 ABC32, MRP4, MOAT-B 13q32 6.5 kb 1325 aa ABCC5 ABC33, MRP5, MOAT-C, pABC11 3q27 6.6 kb 1437 aa ABCC6 ABC34, MRP6, ARA, MLP1 16p13.1 6.5 kb 1503 aa ABCC7 ABC35, CFTR 7q31.2 27 6 kb 1480 aa ABCC8 ABC36, SUR1, PHHI, HI, HRINS 11p15.1 39 5 kb 1581 aa ABCC9 ABC37, SUR2 12p12.1 38 5 kb 1549 aa ABCC10 ABC26, MRP7 6p21 22 5.5 kb 1464 aa ABCC11 MRP8 28 4.6 kb 1382 aa ABCC12 16q12 29 5 kb 1359 aa ABCC13 21q11.2 14 325 aa ABCD1 ABC42, ALD, ALDP, AMN Xq28 2.8 kb 745 aa ABCD2 ABC39, ALDL1, ALDR, ALDRP 12q11 3.5 kb 740 aa ABCD3 ABC43, PMP70, PXMP1 1p21-22 3.3 kb 659 aa ABCD4 ABC41, PMP69, PXMP1L, P70R 14q24.3 2.9 kb 606 aa ABCE1 ABC38, RNAseLI, OABP 4q31 2.9 kb 402 aa ABCF1 ABC50 6p21.33 3.1 kb 807 aa ABCF2 ABC28 7q35-36 2.2 kb 623 aa ABCF3 ABC25 3q25.1-25.2 2.8 kb 709 aa ABCG1 ABC8, WHITE 21q22.3 2.7 kb 638 aa ABCG2 ABC15, BCRP1, MXR1, ABCP 4q22 2.4 kb 655 aa ABCG3 8p12 ABCG4 WHITE2 11q23.3 3.5 kb 627 aa ABCG5 WHITE3, Sterolin1 2p21 2.3 kb 651 aa ABCG6 7 ABCG7 15 ABCG8 WHITE4, Steroline2 2p21 2 kb 673 aa



ABC transporters umani nelle malattie

ABCA1 é localizzato nelle membrana plasmatica e nell�apparato di Golgi e trasporta il colesterolo intracellulare e i fosfolipidi fuori dai macrofagi. Una serie di diverse mutazioni e delezioni nel gene di ABCA1 sono state trovate in pazienti affetti da sindrome di Tangier (deficienza di HDL tipo I) e in pazienti con ipo-α-lipoproteinemia (deficienza di HDL tipo II).Sintomi clinici della sindrome di Tangier sono tonsille molto ingrossate, epatosplenomegalia, linfonodi ingrossati, rischio aumentato di aterosclerosi e neuropatie. La chimica clinica evidenzia ipercolesterolemia, diminuito HDL e aumento dei trigliceridi.

ABCA4 é un trasportatore organo-specifico della retina localizzato nei fotorecettori. Mutazioni nel gene sono state trovate in pazienti affetti da Stardgardt’s disease o la malattia ad esso associata il fundus flavimaculatus. Stardgardt�s disease è una distrofia maculare rapidamente progressiva e ha una pessima prognosi per la vista. Si presenta nella prima o seconda decade di vita, la sua frequenza è di 1:10'000. I sintomi clinici sono: perdita della visione centrale, perdita della visione a colori, dovuta all�atrofia della retina. Mutazioni del gene sono state trovate anche in pazienti affetti da retinite pigmentosa.

Il gene di ABCB1 é espresso ad alti livelli in vari organi normali come ghiandole surrenali, fegato, reni e tratto intestinale. Il trasportatore contribuisce alla barriera emato-encefalica, trasloca ormoni ed espelle xenobiotici assorbiti con I nutrienti. Il gene codificante per ABCB1 è stato il primo ad essere identificato, nel 1986 fu scoperto che le cellule di alcuni tumori con multiresistenze ai farmaci esprimevano in modo esagerato due geni correlati tra di loro che furono chiamati MDR1 e MDR2 (che sono poi stati identificati essere ABCB1 e ABCB4). Il gene, se espresso esageratamente è un fattore di rischio per il fallimento della chemioterapia e una prognosi negativa.ABCB1 conferisce resistenza ai farmaci abbassando il livello del medicamento all�interno della cellula a livelli non letali. ABCB2 (TAP1) e ABCB3 (TAP2) sono subunità di un complesso che trasporta peptidi dal compartimento intracellulare al reticolo endoplasmatico e da lì al sito di legame del MHC di classe I.Anomalie del trasportatore causano diverse malattie:

• Bare lymphocyte syndrome type I, una mutazione puntiforme causa una deficienza di HLA di classe I.



• Infezioni virali: Herpes simplex virus type I blocca il sito di legame dei trasportatore TAP, il Citomegalovirus ne inibisce invece la capacità di trasportare peptidi.

• L�inibizione dei TAP é stata osservata in carcinomi delle cellule renali, portando ad un Blocco della presentazioni di antigeni cancerogeni e quindi ad una tolleranza da parte del sistema immmunitario.

• Il polimorfismi del geneTAP2 contribuisce alla suscettibilità genetica della sclerosi multipla.

• E� stata osservata una relazione tra uno degli alleli del gene TAP1 con il diabete mellito insulino-dipendente.

ABCB4 é coinvolto nella traslocazioni della Fosfatidilcolina nella bile, mutazioni nel gene di ABCB4 sono state trovate in pazienti con colestasi intraepatica familiare progressiva (PFIC), la malattia consiste in una deficienza di sali biliary. La malattia può presentare anche mutazioni nel gene di ABCB11.

ABCB7 é coinvolto nel trasporto di heme dai mitocondri nel citoplasma, una mutazione del gene é stata trovata in pazienti affetti da X-linked anemia sideroblastica con atassia (ASAT).

Il trasportatore ABCC1 (MRP1) ha diverse funzioni: trasporto di allocriti esogeni (medicamenti antitumorali, anioni inorganici, mediatori della risposta infiammatoria) e trasporto di composti endogeni. Il contributo di ABCC1 nella resistenza tumorale ai farmaci é oggetto di discussione, il trasportatore é espresso su diversi tumori solidi e in proliferazioni ematologiche

ABCC7 o CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Receptor) é espresso nell�epitelio delle vie respiratorie, nel duodeno e digiuno e nei compartimenti cellulari delle cellule del tratto intestinale, il trasportatore é un canale di cloruro.Il 70% delle mutazioni nel gene consistono nella delezione di tre basi che causano la perdita di una fenilalanina nella posizioni 508 della proteina, l�altro 30% è costituito da tutta una serie di altre mutazioni.Le manifestazioni cliniche della fibrosi cistica sono dovute alla distruzione delle funzioni esocrine del pancreas (insufficienza pancreatica), delle ghiandole intestinali (occlusione intestinale), dell�albero biliare (ostruzione biliare e cirrosi), delle ghiandole bronchiali (infezioni broncopolmonari croniche con enfisemi). La riduzione delle funzioni polmonari e infezioni polmonari sono la causa della morbidità e della mortalità della fibrosi cistica, una colonizzazione delle vie aeree da Pseudomonas aeruginosa è tipica.

ABCC8 é una subunità di un canale di potassio espresso nelle isole pancreatiche. Mutazioni nel gene sono state trovate in pazienti affetti da ipoglicemia iperinsulinica infantile persistente(PHHI), un disordine caratterizzato da una elevata secrezione di insulina da parte delle



cellule β. PHHI si presenta durante il periodo prenatale o durante l�infanzia con stanchezza, coma e altri sintomi dell�ipoglicemia.

ABCC2 é responsabile dell�escrezione di acidi organici biliari nel fegato e nei reni. Mutazioni nel gene sono state trovate in pazienti affetti da sindrome di Dubin-Johnson. La malattia è caratterizzata da un disturbo della secrezione di bilirubina nei capillari biliari da parte degli epatociti, che causa un ristagno di bilirubina nel fegato.

ABCC3 può sostituire le funzioni di ABCC2 ed é espresso ad alti livelli in pazienti affetti da sindrome di Dubin-Johnson.

ABCC6 esporta composti dai reni e dal fegato e contribuisce alla deposizione di matrice extracellulare ed al turn-over del tessuto connettivo. Mutazioni nel gene sono state trovate in pazienti affetti da pseudoxanthoma elasticum, un disordine caratterizzato da cambiamenti nella pelle e complicazioni vascolari occlusive.

Mutazioni nel gene ABCD1 causano l�adrenoleucodistrofia, un disordine metabolico caratterizzato dall�accumulo di acidi grassi a catena molto lunga (VLCFA) nella sostanza bianca del cervello e nella corteccia cerebrale, questo accumulo causa una demielinazione del sistema nervoso centrale, portando ad un deterioramento mentale neuropatia. ABCD2 può compensare le funzioni di ABCD1.

ABCD3 é oggetto di discussione per causare la sindrome di Zellweger, una malattia caratterizzata da dismorfia facciale, epatomegalia, cisti renali, ritardo mentale dovute all�accumulo di VLCFA.

Terapie

Tumori multiresistenti Per contrastare la resistenza ai farmaci dei tumori sono stati trovati diversi antagonisti per ABCB1, la prima scoperta é stata che verapamil aumenta l�attività dei farmaci antitumorali. Il problema è dato dagli effetti collaterali dei medicamenti, infatti inibiscono l�attività di ABCB1 non solo delle cellule tumorali, ma di tutte le cellule che esprimono ABCB1, il blocco del trasportatore da solo non ha grandi effetti, ma in combinazione con i citostatici gli effetti possono essere molto tossici.



Fibrosi cistica Il medicamento ibuprofene inibisce la formazione di leucotrieni e può essere usato nel trattamento della fibrosi cistica, però il medicamento inibisce l�attività di CFTR e questo può contrastarne gli effetti benefici.

Adrenoleucodistrofia Peroxisome proliferation stimulator fenofibrate induce l�epressione di ABCD2 e ABCD3 questo ristabilisce la �-ossidazione di VLCFA deficiente nel fegato. Rolipram e lovastatin diminuiscono la produzione di citochine e stimolano la �-ossidazione.

Bibliografia

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2. A. K. Duttaroy, F. Spenser, Cellular Protein and their fatty acids in health and disease, Wiley-VCH verlag, Weinheim, 2003, ISBN 3527304371

3. B. Alberts, D. Bray, Molecular biology of the cell, , garland Publishing Inc., New York, 1994, ISBN 0815316208

4. Efferth T., The human ATP-Binding cassette transporter genes: from the bench to the bedside, Current molecular medicine 2001 (1), 45-65

5. Stefan Wirths and Antonio Lanzavecchia, ABCB1 transporter discriminates human resting naïve B cells from cycling transitional and memory B cells, Eur. J. Immunology, 2005 (35), 3433-3441

6. http://nutrigene.4t.com/humanabc.htm

espressione di abcb1 in linfociti t del sangue … · i trasportatori abc (atp-binding cassette...

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