enzyme teil 1: grundlagen und substratbestimmungen
TRANSCRIPT
ENZYME
Teil 1: Grundlagen und Substratbestimmungen
Metastabiler ZustandBeispiel:
Glucose-6-Phosphat + H2O Glucose + Pi
[Glc6P] [H20]
[Glc] [Pi]• K = = 1.135 x 10-3
Gleichgewicht stark auf Seite von Glc + Pi
• Go‘ = - 4.02 kcal mol-1 (Exergonische Reaktion)
Reaktion läuft freiwillig ab!
ABER: Beim Lösen von Glc6P in Wasser passiert aber scheinbar nichts!
Vorrausetzungen für den Ablauf einer Reaktion
Zusammenstoß der Moleküle:
• Räumlich richtig !
• Energiereich genug !
25 °C
notwendigeEnergie
Aktivierungsenergiedie Energie, die man einem Systemzuführen muß, damit die Reaktion
messbar schnell abläuft
Energiezufuhr (Temperaturer-höhung) steigert die Reaktions-
geschwindigkeit !
75 °C
Energieprofil(unkatalysierte Reaktion)
GH
GR
G
A+ B
C+ D
Aktivierungsenergie
Energieprofil(enzymkatalysierte Reaktion)
GH
E+C+D
E+A+B
GR
G
EA
B
EC
DA+B+E EAB ECD C+D+E
EAB = Enzym-Substrat Komplex
ECD = Enzym-Produkt Komplex
Enzymkatalysierte Reaktionen
benötigen geringere Aktivierungsenergie, weil:
• Nährungseffekträumlich richtige Ausrichtung der Substrate durch Bindung an Enzym
• Milleueffektoptimale Bedingungen für Reaktion am Enzym (pH, Solvatisierung, etc)
• Konformationsstreckungseffektdurch Substratbindung Gestaltänerung des Enzyms (Übergangszustand)
Enzymkatalysierte Reaktionen
• GleichgewichtEin Enzym verändert die Geschwindigkeit einer Reaktion in Richtung des Gleichgewichts.Das Gleichgewicht selbst kann aber nicht verändert werden!Wenn das Gleichgewicht einer Reaktion stark auf einer Seite liegt spricht man von einer nicht umkehrbaren Reaktion.
• Hin- und RückreaktionEin Enzym kann eine Reaktion in beide Richtungen beschleunigen. Die Reaktion läuft aber immer in Richtung Gleichgewicht ab.
Was sind Enzyme
Enzyme sind Biokatalysatoren, die die Aktivierungs-energie einer Reaktion herabsetzen können!
Unterschiede zu anderen Katalysatoren sind:
• Spezifitätfür die Substrate (Gruppen) und Reaktionen
• Kapazitätsehr hohe Effizienz (Beschleunigung bis zu 1014-fach)
• RegulationAktivität kann an Umweltbedingungen angepasst werden.
Regulation von Enzymen• Proteinsynthese und Proteinabbau
Neusynthese des gewünschten Enzyms; Aktivierung oder Deaktivierung von Genen
• Konformationsänderung(a) Allosterische Effekte Effektoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) binden an regulatorisches Zentrum des Proteins
Allosterische Effekte
Inhibitor Aktivator
Enzyminaktiv
Enzymaktiv
Regulation von Enzymen• Proteinsynthese und Proteinabbau
Neusynthese des gewünschten Enzyms; Aktivierung oder Deaktivierung von Genen
• Konformationsänderung(a) Allosterische Effekte Effektoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) binden an regulatorisches Zentrum des Proteins(b) Kompetitive Hemmung „Konkurenz“ um das aktive Zentrum
• Chemische VeränderungPhosphorylierungen (Protein-Kinasen) oder Dephosphorylierungen (Phosphatasen)
Einteilung von Enzymen
1. OxidoreduktasenTransfer von H, O oder e- von einem Substrat auf ein anderes
2. TransferasenTransfer von chem. Gruppen zwischen Substraten
3. Hydrolasen hydrolytischer Abbau
4. Lyasen nicht-hydrolytische Spaltung von Bindungen
5. Isomerasen Intramolekulare Umlagerungen
6. Ligasen Knüpfung von kovalenten Bindungen unter ATP-Verbrauch
Benennung von EnzymenBeispiel:
Fructose + NADP+ 5-Anhydro-D-Fruktose + NADH + H+
Bezeichnung Fructose 5-DehydrogenaseFructose:NADP 5-Oxidoreduktase
EinteilungEC-Nummer, hier EC 1.1.1.124(Oxidoreduktase, wirkt an CH-OH Donoren, NAD oder NADP als Akzeptor, Enzymnummer)
Analytisches Arbeiten mit Enzymen
1. EnzymbestimmungBestimmung der Biologische Aktivität Bestimmung der EnzymaktivitätDaneben kann auch der Proteingehalt bestimmt werden (z.B. mit Immunologischen Methoden)
2. Substratbestimmung
Bestimmung eines Analyten (eines Substrates) mit Hilfe eines EnzymsDas Enzym muß dazu aber käuflich erhältlich sein, oder selbst gereinigt werden.
Enzymreaktionen
Zeit
Kon
zent
ratio
nS
ubst
rat o
d. P
rodu
kt
Enzymreaktionen
Zeit
Kon
zent
ratio
nS
ubst
rat o
d. P
rodu
kt
Enzymatische Substratbestimmung
1. Spezifisches EnzymEnzym sollte nur das Substrat umsetzen
2. Co-Substratewo notwendig muß man Co-Substrate (Co-Enzyme) einsetzen
3. ReaktionsmilleupH-Wert, Pufferung, Aktivatoren, etc
4. Detektionsmöglichkeit(a) Direkte Messung mittels Extinktion Produkt absorbiert, Substrat nicht (oder umgekehrt); Co-Substrat oder Co-Produkt absorbiert(b) Produktnachweis chemisch
5. Abfangreaktionensind notwendig wenn das Gleichgewicht ungünstig liegt.
Aufbau eines Testsystems
Das NAD(P)H-System
Die reduzierte Form des Co-Substrats NADH oder NADPH absorbiert Licht im UV-Bereich bei 340 nm.
Die oxidierte Form NAD+ oder NADP+ aber nicht.
Universell mit Oxido-reduktasen anwendbar!
Bespiel: Sorbitbestimmung
D-Sorbit + NAD+ D-Fruktose + NADH + H+ SDH
Zeit
Ext
inkt
ion
(340
nm
)
Probe + NAD+
SDH
E (NADH)
Allgemeine Überlegungen 1
Zeit
Ext
inkt
ion
(340
nm
) Vorraussetzungen
• Gleichgewicht der Reaktion liegt auf Seite von C +D
• [Cosubstrat] > [Probe]sonst kann nicht alles an Probe verbraucht werden
A + B C + D
Allgemeine Überlegungen 2
Zeit
Extinktion
(340
nm
)
Steigung =Geschwindigkeit
Regeln
• v nimmt ab, wenn [c] kleiner wird.
• Wenn A+B mit C+D im Gleichgewicht, dann v = 0 (kein Netto-Umsatz)
• Konzentration (Aktivität) des
Enzyms ändert v, hat aber keinen Einfluß auf den Endpunkt (E bleibt gleich)
A + B C + D
Bestimmung von Glu & Frc
1. Glukose + ATP Glukose-6-P + ADPReaktion nicht umkehrbar (vollständig)Auch Fruktose wird umgesetzt
2. Glu-6-P + NADP+ Glukonat-6P + NADPH + H+
Indikatorreaktion
3. Fructose-6-P Glucose-6-PZusatzreaktion
HK
G6PDH
PGI
E
t
HK
GDHPGI
Frc
Glu
Fehlersuche
t
E
• [NAD+] hoch
• [Enzym] hoch
• Probe A
• Reaktion nicht umkehrbar
Ared + NAD+ + E Aox + NADH + H+ + E
Fehlersuche
t
E
• [NAD+] nicht aus- reichend• [Enzym] hoch
• Probe A
• Reaktion nicht umkehrbar
Ared + NAD+ + E Aox + NADH + H+ + E
Fehlersuche
t
E
• [NAD+] hoch
• [Enzym] gering
• Probe A
• Reaktion nicht umkehrbar
Ared + NAD+ + E Aox + NADH + H+ + E
Fehlersuche
t
E
• [NAD+] hoch
• [Enzym] hoch
• Keine Probe A
• Reaktion nicht umkehrbar
Ared + NAD+ + E Aox + NADH + H+ + E
Fehlersuche
t
E
• [NAD+] hoch
• [Enzym] hoch
• Keine Probe A
• Reaktion nicht umkehrbar
Ared + NAD+ + E Aox + NADH + H+ + E