Di susun o leh :

A d e S r i m a r y a t i0 5 0 1 1 0 a 0 0 2A g u n g R e j e k i0 5 0 1 1 0 a 0 0 3A h m a d M u h z i d d i n 0 5 0 1 1 0 a 0 0 5A r i f a t u n N i ’ a m a h 0 5 0 1 1 0 a 0 0 8

EMIT

Enzyme-M

ultip

l ied I

mm

unoassay

Techniq

ue

Immunoassay• A number of immunological assay techniques

are commercially available for detecting drugs through antigen-antibody reaction.

• One such technique, the enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT), is used by toxicologists because of its speed and high sensitivity for detecting drugs in urine.

• In a typical EMIT analysis, antibodies that will bind to a specific drug are added to the subject’s urine.

Immunoassay

adalah uji untuk mengidentifikasi keberadaan suatu obat maupun metabolitnya dalam sampel biologis.merupakan metode analisis yang didasarkan pada interaksi antigen dan antibodi. Antibodi merupakan molekul protein (yang diproduksi oleh hewan) yang dapat mengenal antigen (obat) secara spesifik pada tingkat molekuler.Immunoassay merupakan teknik yang spesifik dan sensitif. Immunoassay lebih sering menggunakan sampel urin, karena dibutuhkan sampel bebas protein. Pada sampel lain yang masih mengandung protein perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu karena protein dapat mengganggu pembacaan absorbansi.

Jenis Immunoassay

1) Enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT)

2) Radioimmunoassay (RIA)3) Fluorescent polarization immunoassay (FPIA)4) Kinetic interaction of microparticles in

solution immunoassay (KIMS)5) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique

( EMIT )• adalah metode umum untuk penentuan kualitatif

dan kuantitatif obat dan protein tertentu dalam serum dan urin.

• EMIT merupakan teknik immunoassay, dimana digunakan dasar reaksi imunologik antara antigen dan antibodi dan untuk beberapa jenis obat yang reseptornya berupa enzim.

• Pengujian dengan metode ini didasarkan dari adanya kompetisi antara obat pada sampel dan obat yang telah dilabeli dengan enzim glukosa-6-fosfat dehidrogenase (G6P-DH) dengan sisi aktif dari suatu antibodi (immunoassay competitive).

Komponen dalam metode uji EMIT

Komponen yang digunakan dalam metode pengujian EMIT adalah :

a) Obat,b)Antibodi,c) Substrat, dand)Enzim yang akan berikatan dengan obat.

Contoh EMIT• Substrat : Glukosa-6-Phosphat• Enzim : Dehidrogenase G6P• Koenzim : NAD (Nicotinamid Adenin

Diphosphat)• Reaksi :

– substrat + enzim keilangan atom H– NAD + H NADH

• Pengamatan : λ 340-345 nm (NAD tidak memberikan absorbansi, NADH mengabsorbansi)

Peralatan EMIT

Seperangkat alat EMIT yang semi otomatis, terdiri atas :

• Pipet pengencer untuk mengambil serum, sekaligus mengencerkan dengan larutan dapar dan mencampurkan dengan pereaksi A dan B.

• Spektrofotometer yang dilengkapi dengan pompa vakum untuk aspirasi larutan.

• Alat perekam yang telah diprogram untuk mencatat besarnya resapan pada saat-saat tertentu.

* alat ini telah dirancang khusus untuk keperluan EMIT dan relatif lebih sederhana dibanding teknik lain.

Gambar EMIT Test(https://www.google.co.id/search)

Prinsip Reaksi EMIT

Prinsip Reaksi EMIT

Obat yang dilabel enzim (Ag- E) akan berkompetisi dengan obat dalam serum (Ag).Enzim pada Ag-E yang terikat antibodi (Ag-E-Ab) tidak aktif lagi, sedangkan yang tidak terikat masih aktif. Aktivitas enzim sisa inilah yang diukur melalui pengukuran resapan hasil reaksi enzim-substrat dengan spektrofotometcr.Pengukuran secara tidak langsung ini akan memperkecil kesalahan dan memperbesar sensitivitas.Kadar obat dihitung sebanding dengan besarnya resapan enzim-substrat, yang sebanding dengan aktivitas enzim sisa.

Mekanisme kerja EMIT

Kompleks antara

enzim-obat-antibody

merupakan kompleks

yang inaktif, sehingga substrat

tidak dapat masuk ke sisi aktif anzim.

Adanya obat bebas akan menyebabk

an terjadinya kompetisi

antara obat yang sudah

terikat dengan obat bebas untuk

berikatan dengan antibodi.

Obat bebas akan

berikatan dengan antibodi,

dan menyebabk

an enzim terlepas dari

komples sehingga sisi aktif

enzim bebas dan substrat tidak dapat

masuk.

Terjadi reaksi

enzimatis dan akan

menghasilkan suatu produk.

Types of Immunoassays Cont’d• In the Enzyme

Multiplied Immunoassay (EMIT), the drug in the sample and the drug labeled with G6PD compete for antibody binding sites.

• Binding inhibits enzyme activity, while free enzyme remains active to interact with.

• Enzyme activity/absorbance is directly proportional to drug concentration.

S + E (ES) (EP) E + PDiffusion & Affinity

CatalysisProduct release

Prosedur umum pengujian EMIT

Mencampur sampel yang mengandung obat dengan sejumlah obat diketahui konsentrasinya yang terikat pada enzim dan antibodi.

Kemudian substrat ditambahkan.

Absorbansi diukur pada detik ke 15 dan 45 setelah penambahan substrat.

Jumlah obat dapat diketahui dengan mengukur absorbansi hasil reaksi enzim dan substrat dengan spektrofotometri UV-Vis.

Perubahan absorbansi hasil reaksi menggambarkan konsentrasi obat dalam sampel.• Tidak ada hubungan yang linear antara

perubahan absorbansi dan konsentrasi obat.

(Sumber: Anonim, 2011 )

Tabel Perbandingan Beberapa Teknik

Penetapan Kadar Teofilin

Penjelasan Tabel 1

Spesifisitas EMIT dan RIA adalah baik, karena dapar reaksi adalah imunologik yang spesifik, sedangkan teknik lainnya berdasarkan reaksi kimia teofilin, sehingga zat lain yang mempunyai sifat mirip teofilin dapat mengganggu hasil pengukuran.

Sensitivitas adalah kemampuan suatu teknik dalam mendeteksi banyaknya obat dalam serum, yang juga ditentukan oleh tingkat ketrampilan teknisi dan kelengkapan sarana laboratorium.

Lanjutan ...

Sensitivitas HPLC lebih baik dari EMIT 4, sedangkan sensitivitas UV masih berada dibawah EMIT. Hasil pengukuran teofilin dengan HPLC mempunyai korelasi yang baik dengan EMIT 4,5. Meskipun demikian, kondisi ruang laboratorium, suhu, kelembaban dan lain-lain, seringkali tidak sesuai dengan batasan yang diberikan. Sehingga tiap laboratorium perlu menetapkan kemampuannya terhadap teknik yang digunakan, agar hasil pengukurannya dapat dipercaya.

Waktu untuk penetapan kadar dengan EMIT lebih singkat bila dibanding dengan teknik lain. Jangka waktu penetapan kadar ditentukan oleh tahapan kerja yang harus ditempuh, disamping ketrampilan teknisi dan waktu reaksi yang dibutuhkan oleh reaksi kimia yang mendasari teknik tersebut.

Kelebihan dan Kekurangan EMIT

Kelebihan

•Reaksi cepat•Mudah diautomatisasi•Tidak perlu dilabel radioaktif

Kekurangan

•Semikuantitatif•Ketersediaan antibodi dan konjugat enzim sukar didapat

Contoh Obat yang sudah dianalisa

menggunakan EMIT : Metode Urin :

1.Opiate2.Barbiturate3.Metadon4.Amfetamin5.Benzoilekgo

nin

Metode Serum :1.Fenitoin2.Pirimidone3.Karbamaz

ol4.Theofilin

Resensi :• Anonim, 2011, Immunoassay Basics, http://

www.enzolifesciences.com/ support/ immunoassay-kits/ immunoassay-basics/. Diakses tanggal 13 Mei 2012, 09.24 wib.

• Anonim, 1987, Cermin Dunia Kedokteran, 47. Ginjal dan Hipertensi.