ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

1. INTRODUCCIÓN2. CARACTERÍSTICAS3. FUNCIONES4. ACTIVIDAD CATALÍTICA5. CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS6. APLICACIONES MÉDICAS.

1. INTRODUCCIÓN. Metabolismo enzimáticoEn todos los organismos es preciso sintetizar macromoléculas a partir de moléculas sencillas, y para establecer los enlaces entre éstas se necesita energía. Esta energía se consigue rompiendo los enlaces químicos internos de otras macromoléculas, sustancias de reserva o alimentos. Todo ello comporta una serie de reacciones coordinadas cuyo conjunto se denomina metabolismo. Dado que las sustancias que intervienen en estas reacciones son, generalmente, muy estables, se requeriría una gran cantidad de energía para que reaccionaran entre sí, ya que, si no, la velocidad de reacción sería nula o demasiado lenta. Para acelerar la reacción en un laboratorio bastaría con aumentar la temperatura o bien con añadir un catalizador, es decir, una sustancia que aumente la velocidad de la reacción.

METABOLISMO ENZIMÁTICOEn los seres vivos, un aumento de temperatura puede provocar la muerte, por lo que se opta por la otra posibilidad, es decir, el concurso de catalizadores biológicos o biocatalizadores. Las moléculas que desempeñan esta función son las enzimas. Las enzimas son, proteínas globulares capaces de catalizar las reacciones metabólicas. En su estructura globular, se entrelazan y se pliegan una o más cadenas polipeptídicas, que aportan un pequeño grupo de aminoácidos para formar el sitio activo, o lugar donde se adhiere el sustrato, y donde se realiza la reacción.Una enzima y un sustrato no llegan a adherirse si sus formas no encajan con exactitud. Este hecho asegura que la enzima no participa en reacciones equivocadas. La enzima misma no se ve afectada por la reacción. Cuando los productos se liberan, la enzima vuelve a unirse con un nuevo sustrato.

2. CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS

Son solubles en agua y se difunden bien en los líquidos orgánicos. Pueden actuar a nivel intracelular, es decir, en el interior de la célula donde se han formado, o a nivel extracelular, en la zona donde se segregan. Las enzimas cumplen las dos leyes comunes a todos los catalizadores: la primera es que durante la reacción no se alteran, y la segunda es que no desplazan la constante de equilibrio para que se obtenga más producto, sino que simplemente favorecen que la misma cantidad de producto se obtenga en menos tiempo. Las enzimas, a diferencia de los catalizadores no biológicos, presentan una gran especificidad, actúan a temperatura ambiente y consiguen un aumento de la velocidad de reacción de un millón a un trillón de veces.

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CONCEPTOS BÁSICOS DE CINÉTICA QUÍMICA En una reacción de orden cero, la velocidad de formación del producto es independiente de la concentración de

sustrato: v = kEn una reacción de primer orden la velocidad de formación de los productos es directamente proporcional a la concentración del sustrato: v = k [A]. Así, en la reacción:sacarosa + agua glucosa + fructosa.

La velocidad de hidrólisis de la sacarosa es, en todo momento, proporcional a la concentración de sacarosa. Dicho matemáticamente, donde [A] es la concentración de sacarosa a cada tiempo (t) y k es la constante de proporcionalidad. Se dice que ésta es una reacción de primer orden.

Una reacción de segundo orden es aquella en la que la velocidad de formación del producto depende de la concentración de dos sustratos (como en una reacción de condensación): v = k [A1] [A2] del cuadrado de la concentración de un único sustrato (reacción de dimerización): v = k [A]2

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inical del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.

Para explicar la relación oservada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre:

Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

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CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola (Figura de la izquierda). La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk (Figura de abajo). Es una recta en la cual:

- La pendiente es KM/Vmax.- La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM.- La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA Y DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION

Efecto del pH: afecta al estado de disociación de los grupos, aunque todas las proteínas no se ven afectadas de igual forma porque algunas no tienen grupos disociables. La mayor parte de los enzimas tienen un pH óptimo. Si hay pequeños cambios de pH no se desnaturaliza el enzima.La actividad enzimática se mide en µmol/t, y la unidad internacional en µmol/min, cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato en producto en un minuto en condiciones óptimas. Otra unidad es la cantidad enzimática que se requiere para transformar 1 mol/s y se la llama katal. La idea básica es que el centro activo de la enzima puede existir en tres estados de ionización dependiendo de la fuerza ácida,

MODOS DE ACCIÓNLas enzimas pueden actuar de dos formas: unas, fijándose mediante enlaces fuertes (covalentes) al sustrato, de modo que se debiliten sus enlaces y que no haga falta tanta energía para romperlos; y otras, atrayendo a las sustancias reaccionantes hacia su superficie de modo que aumente la posibilidad de encuentro y que la reacción se produzca más fácilmente. Las enzimas, una vez que han realizado la transformación del sustrato o sustratos en productos, se liberan rápidamente de ellos para permitir el acceso a otros sustratos.

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5. CLASIFICACIÓN DE LOS ENZIMAS

En función de su acción catalítica específica, los enzimas se clasifican en 6 grandes grupos o clases:Clase 1: OXIDORREDUCTASASClase 2: TRANSFERASASClase 3: HIDROLASASClase 4: LIASAS Clase 5: ISOMERASASClase 6: LIGASAS

Clase 1: OXIDORREDUCTASAS

Catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir, transferencia de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, según la reacción general: (Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo c oxidasa).

AH2 + B A + BH2

Ared + Box Aox + Bred

Clase 3: HIDROLASAS - Catalizan las reacciones de hidrólisis:

A-B + H2O AH + B-OH Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reacción: Lactosa + agua glucosa + galactosa Clase 4: LIASAS

- Catalizan reacciones de ruptura de sustratos o enlaces moleculares:A-B A + B

Un ejemplo es la acetacetato descarboxilasa, que cataliza la reacción: Ácido acetacético CO2 + acetona

Clase 5: ISOMERASAS - Catalizan la interconversión de isómeros:A B Son ejemplos la fosfotriosa isomerasa y la fosfoglucosa isomerasa, que catalizan las reacciones representadas en la tabla inferior:

Gliceraldehído-3-fosfato Dihidroxiacetona-fosfato 4

Gliceraldehído-3-fosfato dihidroxiacetona-fosfato

Clase 6: LIGASAS - Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.):

A + B + XTP A-B + XDP + Pi Un ejemplo es la piruvato carboxilasa, que cataliza la reacción: piruvato + CO2 + ATP oxaloacetato + ADP + Pi

Clase 2: TRANSFERASAS - Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro, según la reacción:

A-B + C A + C-BUn ejemplo es la glucoquinasa, que cataliza la reacción representada en la Figura: Glucosa + ATP ADP + glucosa-6-fosfato

6. APLICACIONES CLÍNICASLa medición de la actividad de las enzimas plasmáticas es una importante herramienta en el diagnóstico y monitoreo del tratamiento de diversas enfermedades.En la sangre se encuentran enzimas que tienen un papel fisiológico en la sangre, pero además, se pueden encontrar pequenas cantidades de las enzimas que aparecen normalmente en los tejidos.

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El nivel en sangre de estas enzimas intracelulares aumenta en algunas enfermedades. Como consecuencia de muerte celular o como cambios en la permeabilidad de las membranas, hay un incremento de la liberación de esas enzimas al plasma, por lo que su determinacion es un importante indicio de daño celular en algunos tejidos.

Enzimas cuyo estudio se ha mostrado util en el diagnóstico de enfermedades: Alanina aminotransferasa (ALT). Enfermedades hepaticas y cardiacas. Aldolasa. Enfermedades musculares. Amilasa. Enfermedades pancreáticas. Aspartato aminotransferasa (AST). Enfermedades hepaticas y cardiacas. Colinestarasa (pseudocolinestarasa). Intoxicación organofosforada aguda. Creatin Kinasa (CK o CPK). Enfermedades cardiacas y musculares. Enzima Convertidora de Angiotensina Sarcoidosis.

Enzimas cuyo estudio se ha mostrado útil en el diagnóstico de enfermedades: Fosfatasa ácida. Enfermedades prostáticas. Fosfatasa alcalina. Enfermedades hepaticas y osea. Gamma-Glutamyltransferase (GGT). Enfermedades hepaticas, monitoreo de reabilitacion alcohólica. Lactato Deshidrogenasa (LDH). Enfermedades hepaticas, cardiacas y daño cerebral. Lipasa. Pancreatitis. Lisozima Algunas leucemias agudas.

GRADIENTE DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

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