ELISA 基本原理

ELISA( Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay ):酵素免疫分析法

ELISA 用的檢測盤

polystylene

抗原 (sample)

鏈結酵素之抗體

呈色劑

ELISA 實驗原理

Coated 抗體

(Direct)Antigen detection

polystylene

Coated 抗原

鏈結酵素之抗體

呈色劑

ELISA 實驗原理

(Indirect)Antibody detection

抗體 (sample)

Virus A

Host:human IgG

Host:Mouse IgG

Label:HRP

Human anti-virus A

Mouse anti-human IgG , HRP Labeled

Antibody? Name?

ELISA 實驗步驟• 先將抗原 coating 在檢測盤的表面上 4℃overnight ，

再進行 blocking buffer 處理• 加入 100ul sample, incubat 1hr

• 用 wash buffer 清洗 3 次 ( 每次 200-300ul)

• 加入 100ul 鍵結酵素之抗體 , incubate 1hr

• 用 wash buffer 清洗 3 次 ( 每次 200-300ul)

• 加入 100ul 呈色劑 ( substrate )

• 10-15min 後，加入 50ul 終止液 (stop solution)

• ELISA reader 進行 OD(optical density) 判讀

酵素與呈色劑的種類

Enzyme

HRP(Horseradish Peroxidase)

Substrate

ABTS(405nm)

TMB(450nm)

AP(Alkaline Phosphatase) pNPP(490nm)

Immunoassay

酵素免疫分析法 ( Enzyme Immunoassay ; EIA )

螢光免疫分析法 ( Fluorescence Immunoassay ; FIA )

冷光免疫分析法 ( Luminescence Immunoassay ; LIA )

ELISA

呈色劑 冷光劑

螢光劑

FIALIAEIA

吸光值light

激發光 放射光

ELISA Reader 判讀原理

( I( I00))

BEER`S LAW

A = -logI/I0 = -logT =log1/TA: 吸光值 T: 穿透率

filter

( I )( I )

LightLight DetectorDetector

BEER`S LAW 啤酒定律

A = -logI/I0 = -logT = log1/T

A = abcA = 吸光值

a = 常數

b = 光徑 ( 1 cm )

c = 濃度 ( g / L )

原理利用每一種物質皆有其獨特吸收波峰 如 : Protein 280 nm DNA ,RNA 260 nm pNPP 405 nm TMB 450 nm

H2O 977 nm

原理

利用分光光度計在 260 nm 直接定量若 OD( 吸光值 ) = 0.8 , 已知 a( 常數 ) = 0.02 mg/ml b( 光徑 ) = 1 cm

公式 A=abc

因此 0.8 = 0.02 x 1 x c

C = 0.8 x 50ug/ml = 40 ug/ml

A = abc

DNA Concentration Curve

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Concentration (ug/ml)

Ab

sorb

an

ce

Standard Curve(標準曲線 )

應用 1.

DNA RNA 定量 260 / 280 Ratio DNA RNA / Phenol Ratio Lowry Protein Quant ( 660 nm ) Bradford Protein Quant ( 595 nm ) BCA Protein Quant ( 562 nm )

應用 2.

ß-Galactosidase 定量 ( 420 nm ) NADH ( 340 nm ) ABTS ( 405 nm ) OPD ( 492 nm ) TMB ( 450 nm ) pNPP ( 405 nm )

應用 3.

Urease 定量 ( 588 nm ) MTT ( 570 / 690 nm ) XTT ( 492 / 690 nm ) WST-1 ( 450 / 690 nm ) Methylene Blue ( 658 nm ) 專一測定樣本內 , 血清蛋白 , 荷爾蒙 , 藥物 , 細

菌和病毒或其誘發之抗體的含量 ( 須搭配 ELISA實驗及 ELISA reader)

Photometry 分類

photometry

Spectrophotometer

分光光度計

ELISA Reader

免疫酵素判讀儀

Filter 濾鏡

連續波長

Horizontal Photometry

LightSource

Detector

Absorbing solution

Vessel

Vertical Photometry

LightSource

Detector

Absorbing solution

DataData

DataData

ELISA Reader 基本原理

Spectrophotometer 分光光度計

優點 :

連續性波長 ( 190 ~ 1100 nm )

準確度高 , 可達 0.0001 Abs

1 cm 光徑 cuvette , 可直接換算濃度

Spectrophotometer 分光光度計

缺點 :

一次只能操作一個 sample

需要較多的 sample 量 無法進行真正的 ELISA assay

ELISA Reader 酵素免疫分析儀

優點 :

一次可處理大量 sample ( 96 , 384 well plate )

應用範圍廣

所需 sample 體積小 ( 100~200 ul )

ELISA Reader 酵素免疫分析儀

缺點 :

精準度不及分光光度計

無法做快速光譜掃瞄工作

每個 well 光徑並不是 1cm

ELISA 實驗步驟 ( 競爭型 )

• 取出已 coating 上抗原的 96 孔檢測盤• 加入 sample 100ul , incubate 90 mim

• 清洗 ( washing 200ul)3 次• 加入鍵結酵素之抗體 (conjugate) 100ul , incubate 60min

• 清洗 ( washing 200ul ) 3 次• 加入基質 ( substrate ) 100ul 15min , 使之呈色• 加入終止液 50ul

• ELISA reader 進行 450 nm 吸光值判讀

Coated 抗原

鏈結酵素之抗體

基質

抗體 (sample)