流式细胞仪 基本原理和应用
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流式细胞仪 基本原理和应用. 秦鸿雁 第四军医大学 医学遗传学与发育生物学教研室. 概念特点. 1. 操作流程. 2. 流式应用. 3. 注意事项. 4. FACScalibur 4 colors. FACScantoII 8 colors. FACS Aria cell sorter 8~16 colors. 流式细胞仪的概念. 流式细胞术( Flow Cytometry , 简称 FCM )是一种可以快速、准确、客观,并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性,加以定量分析的技术,同时可以对特定群体加以分选。. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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2
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Longpass(LP) Shortpass(SP) Bandpass(BP)
460 500 540460 500 540 460 500 540
SP 500SP 500LP 500LP 500 BP 500/50BP 500/50
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检测器组(激光器) PMT位置 带通 /长通透镜 适用染料
488nm蓝色激光
FL1 530/30 FITC
FL2 585/42 PE, PI
FL3 670 LPPerCP,
PerCP-Cy5.5, PE-Cy7
635nm红色激光 FL4 661/16 APC
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空白对照( unstained cell ) : 消除自发荧光的干扰 * * 自发荧光自发荧光:即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发:即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发
荧光信号为噪声信号。一般说来,细胞成分中能产生自发荧光的分子(核黄荧光信号为噪声信号。一般说来,细胞成分中能产生自发荧光的分子(核黄
素、细胞色素等)的含量越高,自发荧光越强,如肿瘤细胞、粒细胞等;样素、细胞色素等)的含量越高,自发荧光越强,如肿瘤细胞、粒细胞等;样
本死细胞比例越高自发荧光越强本死细胞比例越高自发荧光越强 单色荧光染色( single color staining ):特异荧光染色和非特异荧光染色 * 特异荧光:抗体 F(ab’)2 段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光; * 非特异荧光:即抗体 Fc 段与细胞表面的 Fc 受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光。 NRS block or FcγR inhibitor
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同型对照( Isotype Control ) – 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 (即(即 FcFc 段相同, 段相同, F(ab’)2F(ab’)2 段不同)段不同)– 与染色的单克隆抗体与染色的单克隆抗体 ① ① 相同种属来源相同种属来源 ② ② 相同免疫球蛋白及亚型相同免疫球蛋白及亚型 ③ ③ 相同荧光素标记相同荧光素标记 ④ ④ 相同剂量和浓度相同剂量和浓度 ⑤ ⑤ 但由未免疫动物血清纯化而来但由未免疫动物血清纯化而来– 用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的 FcFc 受体而产生的背受体而产生的背
景染色景染色– 例如,例如,标记标记 FITCFITC 的单克隆抗体为小鼠的单克隆抗体为小鼠 IgG1IgG1 亚类抗体,标记亚类抗体,标记 PEPE
的单克隆抗体为小鼠的单克隆抗体为小鼠 IgG2aIgG2a 亚类抗体,同型对照应用相同浓度和亚类抗体,同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化剂量的未免疫小鼠血清的纯化 IgG1IgG1 (( γ1γ1 )和)和 IgG2aIgG2a ( ( γ2γ2aa ),并分别标记),并分别标记 FITCFITC 和和 PEPE
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0 102 103 104 105
0
102
103
104
105 1.16 7.21
9.5682.1
AP
C
FITC
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荧光补偿( compensation ):是指在流式细胞多色分析中,纠正荧
光素发射光谱重叠( spectral overlap )的过程,即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。
使用单种荧光素标记的单克隆抗体和 / 或其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行细胞染色
分析类型 管 功能 加入的抗体
双色分析
1 Isotype γ1-FITC γ2a-PE
2 Compensation1 A-FITC γ2a-PE
3 Compensation2 γ1-FITC B-PE
4 Sample1,2…… A-FITC B-PE
No.
Antibody Isotype
Mouse anti-human
未免疫Mouse
血清纯化而来1 A-FITC ( γ1) γ1-FITC
2 B-PE ( γ2a) γ2a-PE
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BD FACS AriaII FACSDiva software
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Setting High Medium Low
Frequency (kHZ) 87 60 30
Attenuation off on On
Gap 6 6 10-12
Drop1 4th drop 3rd drop 3rd drop
Purity Continuous
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Pre sort gating and hierarchy
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Spleen +LN
Pre-sorted CD4+
0 50K 100K 150K 200K 250K
0
102
103
104
105
87.9
0 102 103 104 105
0
102
103
104
105
33.7
33.6
CD44
CD62L
0 102 103 104 105
0
102
103
104
105
99
0
After-sorted memory T
0 102 103 104 105
0
102
103
104
105
0
90.5
After-sorted naive TCD4+7AAD-
CD4
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200 400 600 800 1000
GG00/G/G11
ss GG22/M/M
DNADNA 分析分析
DNA含量
细胞数量
2N2N 4N4N
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PI staining
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RFP+ T cells
RFP- T cells
0 102 103 104 105
<APC-A>:Il-2
0
20
40
60
80
100
% o
f M
ax
0 102 103 104 105
<APC-A>:Il-2
0
20
40
60
80
100
% o
f M
ax
Without stimulation PMA + Ionomycin
IL-2
0 102 103 104 105
<APC-A>:Il-4
0
20
40
60
80
100
% o
f M
ax
0 102 103 104 105
<APC-A>:Il-4
0
20
40
60
80
100
% o
f M
ax
IL-4
0 102 103 104 105
<APC-A>:IFN-r
0
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40
60
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100
% o
f M
ax
0 102 103 104 105
<APC-A>:IFN-r
0
20
40
60
80
100
% o
f M
ax
IFN-r
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