El exceso de CO2la oferta inhibe el crecimiento de mixotrficoprotothecoides ChlorellayNannochloropsis salina Eleonora Sforzauna,,, Renato Ciprianiuna, Tomas Morosinottob, Alberto Bertuccouna, Giorgio M. GiacomettibMostrar mshttp://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2011.10.025Recibe los derechos y contenidos

AbstractoMixotrofa puede ser explotado para apoyar el crecimiento de algas durante la noche o en la oscuridad-zonas de un fotobiorreactor.Con el fin de lograr la mxima productividad, sin embargo, es fundamental tambin para proporcionar CO2en exceso para maximizar la actividad fotosinttica y la produccin de biomasa fototrpica.El objetivo de este trabajo es verificar la posibilidad de explotar mixotrofa en combinacin con el exceso de CO2.Se seleccionaron dos especies con una alta productividad de biomasa,Nannochloropsis salinayprotothecoides Chlorella.Diferentes sustratos orgnicos disponibles a escala industrial se ensayaron, y glicerol elegidos por su capacidad para apoyar el crecimiento de ambas especies.En condiciones mixotrficos, el exceso de CO2estimula la fotosntesis, pero bloque la metabolizacin del sustrato orgnico, anulando de esta manera las ventajas de mixotrofa.Mediante el cultivo de microalgas bajo ciclo da-noche, sustrato orgnico apoyado el crecimiento durante la noche, pero slo si CO2no se proporcion alimentacin.Este representa por lo tanto un posible mtodo para reconciliar CO2estimulacin de la fotosntesis con mixotrofa.

Reflejos Las microalgas pueden crecer mixotrficamente con sustratos ms baratos que la glucosa. El glicerol es conveniente porque es un subproducto de la reaccin de transesterificacin en la produccin de biodiesel. CO2en exceso aumenta el crecimiento de microalgas auttrofos, pero inhibe el uso de sustratos orgnicos. Durante el ciclo de luz de la noche-da, las microalgas exploit glicerol durante la noche slo si CO2no es en exceso. Glicerol estimula una acumulacin de lpidos superior.Palabras clave Mixotrofa; Glicerol; El dixido de carbono; Biodiesel; Microalgas

1.IntroduccinLa produccin de petrleo a partir de microalgas es una alternativa prometedora para complementar y sustituir los combustibles fsiles en los prximos decenios.Las microalgas, de hecho, son organismos unicelulares fotosintticos que pueden crecer a un ritmo mucho ms rpido que las plantas y alcanzar productividades ms altas (Chisti, 2008).El cultivo de microalgas tienen un nmero de ventajas adicionales en comparacin con otras fuentes renovables de base biolgica.En primer lugar, a diferencia de los biocombustibles de primera generacin, extensos cultivos de microalgas no compiten con los cultivos alimentarios por la tierra de cultivo, ya que pueden ser cultivadas en zonas marginales o en los sistemas acuticos (Chisti, 2008).Adems, las microalgas pueden reducir las emisiones de dixido de carbono, mediante la adsorcin de CO2de los gases de combustin.De hecho, el CO2concentracin es limitante para el crecimiento de algas y de combustin de gas puede ser utilizado como una fuente barata con el doble objetivo de apoyar el crecimiento de algas y reducir el dixido de carbono liberado a la atmsfera, aunque SO2y NOxpodra causar la inhibicin del crecimiento de microalgas (Lee et al., 2002).Cuando las algas se cultivan con el CO2como fuente de carbono nica, la luz proporciona toda la energa necesaria para la produccin de biomasa.En condiciones auttrofos, sin embargo, el crecimiento est limitado por la disponibilidad de luz y, durante la noche, la productividad se reduce an ms debido a las prdidas de respiracin.Sin embargo, algunas algas fottrofas tambin puede utilizar fuentes de carbono orgnico para apoyar su crecimiento y fotoheterotrofa, o mixotrofa, se define ampliamente como un rgimen de crecimiento en la que el CO2y el carbono orgnico se asimilan de forma simultnea, tanto con el metabolismo respiratorio y fotosinttica operar simultneamente.Una fuente de carbono orgnico puede apoyar el crecimiento principio activo dentro de un fotobiorreactor, durante la noche, o en las zonas oscuras del proceso de aumento de la productividad global de la biomasa.Si los compuestos orgnicos que soporten el crecimiento se derivan de desechos industriales o agrcolas, tambin se consigue un aumento de la productividad a bajo costo.Beneficios ambientales potenciales adicionales que considerar tambin si las aguas residuales de actividades municipales, agrcolas o industriales son explotados como fuente de molculas orgnicas (Pittman et al., 2011).Adems de los beneficios en trminos de acumulacin de biomasa, tambin se inform que la adicin de una fuente de carbono orgnico para estimular la acumulacin de lpidos (Heredia-Arroyo et al., 2010).Vale la pena mencionar, sin embargo, que todos los estudios que analizan la biomasa mixotrfico y la produccin de lpidos se realizaron en condiciones de laboratorio y de la posibilidad de que el rendimiento de biomasa reportados se puede mantener durante perodos largos de cultivo sigue siendo no demostrada (Pittman et al., 2011).Especialmente en la escala industrial, mixotrofa es probable que aumente la contaminacin de bacterias y hongos, un problema que puede ser controlado slo en sistemas cerrados y fuertemente controlados como fotobiorreactores (Lee y Zhang, 1999).El uso de cloracin, antibiticos y herbicidas podra potencialmente reducir la contaminacin, pero en muchos casos tambin inhibir el crecimiento de microalgas.Culturas hetertrofos y mixotrficos de microalgas se han reportado el uso de diferentes fuentes de carbono.La glucosa es ms comnmente utilizado para el sostenimiento de las microalgas que crecen en la oscuridad (Prez-Garca et al., 2011) y fue empleado como fuente de carbono en cultivos hetertrofos o mixotrfico de varias especies de microalgas (Santos et al., 2011), llegando a la alta produccin de ambos biomasa y lpidos (Xiong et al., 2010yWan et al., 2011).Desde un punto de vista industrial, sin embargo, la glucosa no es una buena opcin debido a su alto costo y fuentes de carbono alternativas, derivada como subproductos de otros procesos industriales, son preferibles: (este es el caso para el acetato. Goksan et al, 2010), etanol (Lee, 2004) y glicerol (Heredia-Arroyo et al., 2010).Crecimiento hetertrofos y mixotrfico utilizando glicerol se ha demostrado durante varias algas, aunque el conocimiento del metabolismo del glicerol es an limitada, tal como fue revisado porPrez-Garca et al.(2011).En este trabajo, la capacidad deprotothecoides ChlorellayNannochloropsis salinade la utilizacin de sustratos orgnicos (glicerol, en particular) como fuente de carbono se puso a prueba, midiendo y comparando los parmetros cinticos de crecimiento, acumulacin de concentracin de biomasa y de los lpidos mxima bajo auttrofa y condiciones mixotrficos.Particular atencin se dedica a los efectos de suministrar CO2en exceso durante mixotrofa.De hecho, el dixido de carbono es un factor limitante importante para el crecimiento de algas y su exceso de potencia fuertemente la productividad fotosinttica (Sforza et al., 2010), y por lo tanto, de CO2es necesaria de suministro para lograr la mejor productividad global incluso en condiciones mixotrficos.Curiosamente, los resultados muestran que con el exceso de CO2concentracin de microalgas no consumen el sustrato orgnico.Por lo tanto, CO2y el suministro de compuestos orgnicos necesitan ser optimizado finamente para lograr los mejores productividades en condiciones mixotrofa.2.Mtodos2.1.Microalgas y medios composicinC. protothecoides33,80 yN.salina40.85 cepas se obtuvieron de SAG-Goettingen, Alemania.C.protothecoides, una especie de agua dulce, se cultiv en medio BG11 (Rippka et al., 1979), con la adicin de peptona 0,1% W / V, siguientes indicaciones SAG.N.Salina, una especie marina, se cultiv en sales esterilizados mar de solucin 22 g / L enriquecidos con F / 2 Guillard solucin como se describe porGuillard y Ryther (1962), modificados por la adicin de fuente de nitrgeno en exceso (1,5 g / L de la nano3) y tampn Tris HCl 40 mM.Para los experimentos con diferentes fuentes de carbono orgnicas, los medios de comunicacin bsica se modific mediante la adicin de sustrato orgnico (porC. protothecoides: etanol 0,4% W / V, glicerol 1% W / V, acetato de sodio 0,8% W / V; paraN. Salina: etanol 0,4% W / V, glicerol 1% W / V, acetato de sodio 0,75% W / V).Las concentraciones de sustratos orgnicos se seleccionan sobre la base de los datos reportados en la literatura para cada especie (Liang et al., 2009,Xu et al., 2004,Li et al., 2007,Wood et al., 1999,Prez-Garca et al., 2011,Heredia-Arroyo et al., 2010yde Swaaf et al., 2003).2.2.Anlisis del crecimientoCrecimiento experimentos se llevaron a cabo tanto en matraces Erlenmeyer (sistema por lotes) y en botellas de vidrio de 0,25 L bajo una CO enriquecido continua2flujo de alimentacin (sistema semicontinuo).En el sistema de lotes, no se aadieron nutrientes despus de comenzar inculos.Por el contrario, en el sistema semicontinuo, CO2se alimenta continuamente en el reactor.Cada lote de cultivo autotrfico (250 ml) se llev a cabo por duplicado.El medio y los matraces se esterilizaron en un autoclave durante 20 min a 121 C con el fin de prevenir cualquier contaminacin.La temperatura de crecimiento fue de 24 1 C, con una iluminacin artificial (tubos fluorescentes) con una densidad de flujo de fotones continua de 100 10 E m-2s-1, medida por un photoradiometer (LI-COR, modelo LI-189).Experimentos de duracin depende de la tasa de crecimiento.Cintica de crecimiento de algas se midieron por los cambios diarios en la densidad ptica (medidos a 750 nm, con un Perkin Elmer-Lambda Bio 40 espectrofotmetro) y nmero de clulas.En la fase de crecimiento logartmica en el nmero de clulas fue correlacionada con la densidad ptica.Para el peso seco (PS) Determinaciones clulas fueron cosechadas con un filtro de 0,22 micras.DW se midi gravimtricamente al secar los filtros a 100 C durante 4 h en un horno de laboratorio.La tasa de crecimiento especfico se calcula a partir de la pendiente de la fase logartmica en trminos de nmero de clulas.Con el fin de estudiar el efecto de CO2concentracin en el crecimiento, se llevaron a cabo una serie de experimentos en el sistema semicontinuo, alimentado por una corriente que contiene diferentes CO2fracciones y distribuido a travs de una frita de cermica.La fraccin de CO2en el aire de alimentacin (que es CO2libre) se regula mediante un sistema de medicin de flujo y una vlvula de control de encendido y apagado.El flujo total de gas fue de 1 L / h para cada cultura.El efecto de CO2sobre el pH en los medios de comunicacin se limita debido a la presencia de Tris HCl tampn en el medio de cultivo, que mantiene el pH en el rango de la vitalidad de las especies.2.3.Los mtodos de anlisisEl contenido de lpidos se determin mediante la tincin de la suspensin de clulas de algas con Rojo Nilo (NR) de colorante a una concentracin final de 2,5 mg / ml, durante 10 min a 37 C (Chen et al., 2009).La fluorescencia se midi usando un espectrofluormetro (OLIS DM45), con longitud de onda de excitacin a 488 nm y longitud de onda de emisin en el intervalo de 500-700 nm.La fluorescencia relativa de Rojo Nilo para los lpidos se obtuvo despus de la sustraccin de la autofluorescencia de las clulas de algas y Rojo Nilo solo.Los lpidos totales se extrajeron a partir de clulas secas uso de etanol-hexano (2,5:1 vol. / Vol.) Como disolvente (Molina Grima et al., 1994) en un aparato Soxhlet durante 10 h.La masa total de lpidos y pigmentos se midi gravimtricamente despus de la eliminacin del disolvente mediante un evaporador rotatorio.La intensidad de fluorescencia de las clulas teidas por NR se correlacion linealmente con la cuantificacin gravimtrica de lpidos celulares.El consumo de glicerol en el medio se determin como la concentracin residual en medio filtrado mediante el uso de un kit de anlisis espectrofotomtrico proporcionado por Steroglass Srl, Italia, basado en la fosforilacin de glicerol por la glicerol quinasa y la oxidacin subsiguiente por la glicerol-3-fosfato oxidasa a dihidroxiacetona fosfato y perxido de hidrgeno .La reaccin de perxido de hidrgeno con 4-aminofenazone y TOOS, catalizada por la peroxidasa, genera un color prpura (Beutler, 1984).3.Resultados y discusin3.1.Efecto de sustratos orgnicos sobre el crecimientoEste estudio sobre mixotrofa microalgas se realiz en dos especies diferentes:C.protothecoidesyN.Salina.El primero ya se ha demostrado que tienen una alta productividad de biomasa en automtico, hetero, y las condiciones mixotrficos y la capacidad de acumulacin de altas cantidades de lpidos (Santos et al., 2011).N.salina, por el contrario, se sabe que tiene una buena biomasa y la productividad de los lpidos en las condiciones de foto-auttrofos (Rodolfi et al., 2009ySforza et al., 2010), pero el crecimiento mixotrfico deN.Salinase inform slo con glucosa (Wood et al., 1999yDas et al., 2011).C. protothecoidesse cultiv inicialmente en matraces Erlenmeyer bajo diferentes condiciones mixotrficos utilizando etanol, acetato y glicerol como sustratos orgnicos, para poner a prueba su capacidad de importar y asimilar estas molculas.Enla fig.1, las curvas de crecimiento con glicerol se reportan y se compararon con una curva de control con ningn sustrato aadido.Es de destacar que este control no puede ser considerada completamente autotrfico, desde peptona estaba presente en el medio, como se recomienda por la coleccin de cultivos (SAG-Goettingen, Alemania).

La figura.1.(A) Curvas de crecimiento deC.protothecoidesen condiciones mixotrficos con glicerol (1% W / V) como sustrato, bajo mixotrfico () y () condiciones heterotrficas, en comparacin con el control ().En todas las condiciones de peptona (0,1% W / V) se aadi al medio de cultivo.(B) Curvas de crecimiento deN.Salinaen condiciones mixotrficos con glicerol (1% W / V) como sustrato, bajo mixotrfico () y () condiciones heterotrficas, en comparacin con el control ().Todos los experimentos se realizaron en matraces Erlenmeyer.Opciones FiguraIndependientemente de esto, la adicin de glicerol increment el crecimiento, que enC.protothecoidesfue de tres pliegues ms rpido que el control, como se informa enla figura.1A yla Tabla 1.El glicerol fue de hecho asimilada por el alga segn lo demostrado por el hecho de que se haba consumido hasta el 60% de la glicerol inicialmente presente en el medio (Tabla 1).Tabla 1.Tasa de crecimiento especfica () deC.protothecoidesyN.salinaen frascos experimentos.El consumo de glicerol y los datos mximos de concentracin de biomasa se refieren a la cantidad obtenida al final de la fase estacionaria de crecimiento.Mixotrfico y experimentos hetertrofos se realizaron mediante la adicin de glicerol al 1% W / V como sustrato orgnico.Las condiciones de crecimientoC. protothecoides

N. salina

(d -1)Max.conc biomasa.(G / L)El consumo de Glicerol (%)(d -1)Max.conc biomasa.(G / L)El consumo de Glicerol (%)

Mixotrofa (glicerol al 1%)0,91 0,12,67 0,367.10,36 0,20,43 0,285.3

Heterotrofa (glicerol al 1%)0,87 0,011,10 0,240.40.010.050

Opciones de la tablaC. protothecoidestambin se cultivan en la oscuridad bajo condiciones totalmente hetertrofos con glicerol como fuente de carbono (. Figura 1A yla Tabla 1).Los resultados mostraron una tasa de crecimiento en la oscuridad similar al control de auttrofos (= 0,87 d-1), pero un rendimiento de biomasa inferior, con una concentracin final de slo 1,1 g / L.Este hallazgo es consistente con un consumo de sustrato ms pequeo (alrededor de 40%, como se informa enla Tabla 1) en ausencia de luz, como se inform tambin para otras especies tales comoChlorella vulgaris(Martnez y Orus, 1991).Por lo tanto, el crecimiento mixotrfico era ms fuerte que tanto auttrofos y hetertrofos.El glicerol (. Fig. 1B) tambin fue eficaz en el apoyo aN.Salinacrecimiento, que mostr una tasa similar a la de control auttrofa pero con una concentracin final ms alta (Tabla 1).A diferencia deC.protothecoides,N.Salinase encontr incapaz de crecer en la oscuridad, bajo condiciones totalmente heterotrficas, a cada concentracin ensayada de la fuente de carbono.Adems, se verific que una mayor concentracin de glicerol (2% W / V) indujo inhibicin del crecimiento deN.salina.Crecimiento mixotrfico con otros sustratos, etanol y acetato de sodio, tambin se ensay.Como se inform enel material complementario,C.protothecoidesculturas en la presencia de etanol y acetato de sodio mostraron un crecimiento mejorado.En particular, las tasas de crecimiento especficas fueron 0,93 d-1con etanol y 1,45 d-1con acetato en comparacin con 0,30 d-1para el control.Tambin la concentracin de biomasa final fue mayor, especialmente en el caso de etilo (3,29 g / L vs 0,52 g / l de control).Por el contrario, en el caso deN.Salina, culturas suministrados etanol mostr un pequeo aumento en la tasa de crecimiento especfico con respecto al control autotrfico, pero con la concentracin celular final inferior.En lugar de ello,N.Salinacrecimiento fue fuertemente inhibida por el acetato, que era txico para las clulas a la concentracin ensayada.Estos sustratos, por lo menos a la concentracin ensayada, no parece adecuado para apoyar el crecimiento mixotrfico deN.salinay por esta razn todos los siguientes anlisis se centrar en glicerol.Una razn adicional es que desde una perspectiva de glicerol industrial es una fuente de carbono altamente adecuado, ya que es un subproducto de la reaccin de transesterificacin en el proceso de produccin de biodiesel.Por lo tanto, un reciclo externo de glicerol podra contribuir a la viabilidad econmica de la produccin de biomasa de algas y sera evitar la devaluacin en el mercado de este compuesto orgnico.3.2.Mixotrficos crecimiento en la presencia de un exceso de CO2Los resultados presentados ms arriba mostraron que ambas especies investigadas son capaces de crecer mixotrficamente con glicerol.En experimentos anteriores, CO2estaba presente en la concentracin atmosfrica, mientras que es bien sabido que el dixido de carbono en exceso mejora notablemente la productividad de la biomasa de algas en fotobiorreactores auttrofos.La mejora de la eficiencia fotosinttica debe conducir a una mejora adicional de la tasa de crecimiento y la productividad y, por esta razn, las dos especies de algas fueron cultivadas con aire enriquecido con el exceso de CO2(5% v / v), segn las pruebas realizadas previamente porSforza et al.(2010).Como era de esperar para ambas especies, el exceso de CO2estimula el crecimiento auttrofos, con tasas especficas de crecimiento (superior. Fig. 2,Tabla 2).

La figura.2.Efecto de CO2(5% v / v en burbujas de aire) en las curvas de crecimiento deC.protothecoides (A) yN.salina(B) bajo diferentes condiciones de cultivo: auttrofa () y glicerol al 1% W / V ().ParaC.protothecoidescurvas de crecimiento con peptona 0,1% W / V (), tambin se reportan peptona 0,1% W / V-glicerol 1% W / V ().Todos los experimentos descritos se realizaron en el sistema de burbujeo.Opciones FiguraTabla 2.Tasa de crecimiento especfica () deC.protothecoidesyN.salinacultivada en sistema de burbujeo.El consumo de glicerol y los datos mximos de concentracin de biomasa se refieren a la cantidad obtenida al final de la fase estacionaria de crecimiento.Mixotrfico y experimentos hetertrofos se realizaron mediante la adicin de glicerol al 1% W / V como sustrato orgnico.Condiciones de cultivo(d -1)El consumo de Glicerol (%)Max.conc biomasa.(G / L)

C. protothecoides

Autotrophic1,26 0,10-3,60 0,10

Peptona1,67 0,08-2,78 0,10

Glicerol0,92 0,0917.62,08 0,03

Glicerol + Peptona1,72 0,204.23,22 0,20

N. salina

Autotrophic0,55 0,05-2,53 0,01

Mixotrfico0,36 0,13.22,10 0,2

Opciones de la tablaC. protothecoidesen CO2experimentos enriquecidos, sin embargo, mostraron tasas de crecimiento muy similares tanto en presencia (mixotrfico) y en ausencia (auttrofos) de glicerol (1,72 d-1y 1,67 d-1, respectivamente).La presencia de sustrato orgnico y la adicin de glicerol tambin caus una pequea reduccin en la concentracin de biomasa final.Consistentemente con el pequeo efecto en la tasa de crecimiento, slo una fraccin muy pequea del glicerol presente en el medio (4%) fue consumido, como se informa enla Tabla 2.Estos resultados pueden explicarse por la presencia de peptona en el medio que puede ser metabolizado preferentemente ms de glicerol.Para verificar este puntoC.protothecoidesse cultivan sin peptona; con un exceso de CO2se observ un crecimiento significativo (. Fig. 2A), aunque las tasas fueron significativamente ms pequeos que los de la peptona (0,92 d aadido medio-1y 1,26 d-1, respectivamente), probablemente porque peptona es tambin una fuente de nitrgeno, otro nutriente clave para el crecimiento de algas.Independientemente de esto, sin embargo, tambin en ausencia de peptona, la adicin de glicerol no aument la tasa de crecimiento ni la concentracin de biomasa final.As pues, estos datos muestran que el CO2en exceso estimula el crecimiento de microalgas photoautotrophic, maximizando reacciones fotosintticas, sino que tambin reduce la eficiencia de la captacin de sustrato orgnico, que permanece en el medio de cultivo.Se obtuvieron resultados similares conN.salinapara que el CO2en exceso de la mejora del crecimiento autotrfico pero el glicerol presente en el medio no se asimil y hasta una concentracin final de biomasa ligeramente ms baja se observ (. Fig. 2B,cuadro 2).3.3.Explotacin de mixotrofa para apoyar el crecimiento con un ciclo de luz de la noche / daLos resultados presentados ms arriba mostraron queN.salinayC.protothecoidesson capaces de metabolizar el glicerol, pero esta capacidad se inhibe por un fuerte CO2superiores.Estos experimentos se realizaron bajo luz continua si bien debe tenerse en cuenta que en fotobiorreactores de microalgas al aire libre fijar CO2slo durante el da.Incluso si no asimilada durante el da, proporcionando una fuente de carbono orgnico, sin embargo, podran maximizar la productividad de biomasa de algas por sostener el crecimiento durante la noche.Para verificar esta posibilidad, las algas se cultivan bajo ciclo noche-da de 12:12 h, tanto en condiciones de auttrofos y mixotrficos, con CO2en exceso (. Fig. 3).Como era de esperar, las tasas de crecimiento especficas auttrofos eran ms lentos para ambas especies con respecto a aquellos con luz continua (0,68 d-1paraC. protothecoidesy 0.367 d-1paraN. Salina, en comparacin con 1,26 d-1y 0,55 d-1, respectivamente,Tabla 3yTabla 4).Sin embargo, la presencia de glicerol en el medio no aument cualquiera de estos valores, y el crecimiento fue ms bien inhibida por su presencia.De hecho, tantoC.protothecoides(. Fig. 3A) yN.Salina(. Fig. 3B), alcanz una concentracin final inferior de la biomasa en presencia de glicerol con respecto a la cultura auttrofa en un ciclo de da-noche 12:12 h.Consistentemente, el sustrato orgnico no se consuma, de manera similar a lo que se observ previamente con iluminacin continua.

La figura.3.Curvas de crecimiento deC.protothecoides (A) yN.salina(B) en el marco del ciclo noche-da (12-12 h) en el sistema de burbujeo con agregado CO2(5% v / v) en el aire en auttrofos () y () Condiciones mixotrficos.En auttrofos () y curvas mixotrfico (), CO2(5% v / v) se suministra slo durante el perodo de luz.Durante la noche, los cultivos se burbujea con CO2del aire privados.Todos los experimentos descritos se realizaron en el sistema de burbujeo y experimentos mixotrficos se realizaron mediante la adicin de glicerol 1% W / V para el medio de cultivo.PorN.salinatambin se reportan experimentos en autotrofia () y mixotrofa () en condiciones atmosfricas.Opciones FiguraTabla 3.Tasa de crecimiento especfica () deC.protothecoidescultivados en sistema de burbujeo bajo ciclo noche-da y diferente ciclo de CO2el suministro.El consumo de glicerol y los datos mximos de concentracin de biomasa se refieren a la cantidad obtenida al final de la fase estacionaria de crecimiento.Experimentos mixotrficos se realizaron mediante la adicin de glicerol al 1% W / V como sustrato orgnico.CO2las condiciones de flujo (% v / v en el aire)Condiciones de cultivo(d -1)El consumo de Glicerol (%)Max.conc biomasa.(G / L)

CO25% 24 hAutotrophic0,680 0,04-3,12 0,05

Mixotrfico0,640 0,0502,01 0.1

CO2al 5% en la luz-el 0,03% en la oscuridadAutotrophic0,664 0,06-2,99 0,01

Mixotrfico0,627 0,0822,13 0.1

CO2al 5% en la luz 0% en la oscuridadAutotrophic0,868 0,09-2,78 0,1

Mixotrfico0.867 0,182,67 0,2

Opciones de la tablaTabla 4.Tasa de crecimiento especfica () deN.salinacultivada en sistema de burbujeo bajo ciclo noche-da y diferente ciclo de CO2suministradora.El consumo de glicerol y los datos mximos de concentracin de biomasa se refieren a la cantidad obtenida al final de la fase estacionaria de crecimiento.Experimentos mixotrficos se realizaron mediante la adicin de glicerol al 1% W / V como sustrato orgnico.CO2las condiciones de flujo (% v / v en el aire)Condiciones de cultivo(d -1)El consumo de Glicerol (%)Max.conc biomasa.(G / L)

CO25% 24 hAutotrophic0,367 0,01-1,40 0,1

Mixotrfico0,354 0,0101,01 0,14

CO2al 5% en el perodo de luz-un 0,03% en la oscuridadAutotrophic0,399 0,01-0,99 0,01

Mixotrfico0,335 0,0120,7 0,12

CO2al 5% en la luz 0% v / v en la oscuridadAutotrophic0,53 0,01-1,30 0,2

Mixotrfico0,613 0,0119.82,05 0,2

Opciones de la tablaEstas observaciones sugieren la presencia de un co2efecto inhibidor sobre la capacidad de importacin y algas metabolizan glicerol.Esto es cierto para ambas especies consideradas y, ya que no son evolutivamente relacionados, esto podra ser una propiedad generalizada de algas.Para investigar ms este punto, el CO2concentracin en burbujear aire durante la noche se redujo a la concentracin atmosfrica de 0,03%, para verificar si la capacidad de metabolizar el glicerol podra ser restaurado.Para ambas especies, incluso con bajas emisiones de CO2concentracin no hubo absorcin sustancial de glicerol (Tabla 3yTabla 4).Este resultado est en aparente contraste con lo que se informa enla figura.1, pero esto puede ser explicado por teniendo en cuenta que mientras el primero experimentos se llevaron a cabo en matraces, en el aire este ltimo caso, se burbuje a travs de la cultura.Por lo tanto, aunque CO2concentracin es la misma, su transferencia de masa en el medio es mucho mayor en este ltimo caso.Para verificar esta hiptesis experimentos se repitieron utilizando CO2del aire libre durante la noche y en este caso, ambas especies fueron capaces de cambiar su metabolismo para heterotrofa durante la noche y asimilar activamente glicerol.En este caso,CprotothecoidesyN.salinaaument su ritmo de crecimiento hasta 0.867 d-1y 0,61 d-1, respectivamente, y un consumo significativo de glicerol se observ (alrededor del 8% un 20%, respectivamente,Tabla 3yTabla 4).Estos resultados muestran que en presencia de un ciclo de da / noche, la adicin de glicerol estimula el crecimiento durante las fases oscuras pero slo si CO2no est presente.La presencia de CO2durante el perodo oscuro parece influir en la tasa de crecimiento tambin en plena autotrofia.De hecho, en virtud 12:12 culturas ciclo noche-da h burbujear con CO2del aire libre durante la noche (. Fig. 3) mostraron mejores tasas de crecimiento que las previstas continuamente con 5% de CO2.Estos resultados sugieren que el CO2efecto inhibidor no se limita al glicerol sino ms bien un efecto inhibitorio ms general sobre la respiracin.La inhibicin de la respiracin por el exceso de CO2es conocido por las plantas (Amthor et al., 1992), pero nunca se ha informado de las microalgas.La observacin de que la inhibicin de la respiracin puede reducir la acumulacin de biomasa podra parecer contrario a la intuicin ya la respiracin debe consumir molculas orgnicas de carbono fijos durante el da.Sin embargo, se debe considerar que el metabolismo respiratorio y fotosinttica estn fuertemente conectados y se ha demostrado que la inhibicin de la respiracin tambin reduce la eficiencia fotosinttica, especialmente en la transicin de la oscuridad a la iluminacin (Noctor et al., 2004).Es evidente que este punto necesita ms investigaciones para conducir conclusiones ms firmes ya que las explicaciones alternativas tambin pueden ser vlidas.Por ejemplo, aunque en condiciones auttrofos se comprob el pH a ser estabilizado por el amortiguador contra la acidificacin debido a un exceso de CO2(Sforza et al., 2010), sin embargo, ya que durante la noche CO2no es consumido pero aument, un fuerte acidificacin del medio es posible con sus efectos adversos sobre el crecimiento.3.4.Efecto de mixotrofa en la acumulacin de lpidosEn la perspectiva de desarrollar una produccin de biodiesel a gran escala a partir de microalgas, el efecto de mixotrofa se investig no slo en la productividad de la biomasa, sino tambin sobre la acumulacin de lpidos.Ya se ha demostrado que heterotrofa o mixotrofa podra aumentar significativamente la cantidad de lpidos en las clulas deC.protothecoidescuando se utiliza la glucosa como sustrato (Xiong et al., 2010).Nuestros experimentos confirman queC.protothecoidesacumula ms lpidos en condiciones mixotrficos (21% bajo mixotrofa en lugar de 12% en autotrofia, como se informa enla Tabla 5), aunque el contenido de lpidos se mantuvo mucho menor que la obtenida anteriormente (alrededor de 55%, segn lo informado porXu et al., 2006), donde la concentracin sin embargo masiva de glucosa se utiliza como sustrato.Tambin, mixotrofa fue menos eficaz que la limitacin de nitrgeno para inducir la acumulacin de lpidos que, en este ltimo, caso lleg a 35% DW (Tabla 5).Tabla 5.El contenido de lpidos deC.protothecoidesbajo diferentes condiciones de crecimiento.La concentracin mxima de lpidos se refiere a los resultados obtenidos al final de la fase estacionaria.Max.conc lpidos.(% DW)

Mixotrfico (glicerol al 1%)21.3 2.5

Autotrophic11.5 3.1

Autotrophic N privados-35.8 1.5

Opciones de la tablaLa acumulacin de lpidos tambin es bien sabido que es inducida por la limitacin de nitrgeno tambin porN.salina(Rodolfi et al., 2009ySforza et al., 2010).Nuestros resultados mostraron que mixotrofa podra inducir la acumulacin de lpidos enN.Salinaincluso cuando el nitrgeno es en exceso (1,5 g / L de la nano3): cerca de 15 das despus de lainoculacin, el contenido de lpidos aument hasta aproximadamente 50% de DW, como se informa enla figura.4.Desde el punto de vista industrial, esto podra simplificar el proceso de la produccin de petrleo a partir de microalgas, porque se necesitara slo un paso para producir simultneamente la biomasa y de los lpidos, en lugar de un proceso de dos etapas propuesto en el caso de los sistemas auttrofos (Rodolfi et al., 2009ySforza et al., 2010).En consecuencia, aunque el contenido de lpidos ms altos se han obtenido con la privacin de nitrgeno, la adicin de un sustrato orgnico es preferible para el diseo de un proceso industrial.Cabe sealar, sin embargo, que el glicerol es capaz de afectar a la acumulacin de lpidos slo cuando se consume activamente, es decir, slo cuando el CO2est ausente o a muy baja concentracin.Por lo tanto, el compromiso ideal para un fotobiorreactor al aire libre, el trabajo con un ciclo noche-da, para llegar a la biomasa y de los lpidos mxima productividad sera la de crecimiento autotrfico con el exceso de CO2durante el da y el crecimiento hetertrofos en glicerol sin adicin de CO2durante la noche .Este es probablemente el mejor compromiso entre el crecimiento rpido y alto contenido de lpidos enN.salinayC.protothecoides.

La figura.4.Valores de intensidad de fluorescencia de las clulas del Nilo-Red manchadas deN.Salinadurante las curvas de crecimiento bajo autotrfico () y las condiciones de mixotrficos () (glicerol 1% W / V).Los datos se refieren a las curvas de crecimiento bajo atmsfera de CO2concentracin.Opciones Figura4.ConclusionesC. protothecoidesyN.Salinason capaces de crecer en cultivos de mixotrficos la explotacin de diferentes sustratos orgnicos alternativa a la glucosa.Entre ellos, el glicerol es particularmente interesante, ya que es un subproducto de la produccin de biodiesel.Los datos presentados demostraron que la adicin de glicerol estimula el crecimiento y la acumulacin de lpidos en ambas especies.CO2en exceso, que estimula fuertemente la productividad fotosinttica de algas, tambin deteriora ventajas obtenidas a partir de mixotrofa, probablemente debido a la inhibicin de la respiracin.Adems de glicerol, sin embargo, podra ser explotado en la presencia de un ciclo de da / noche para sostener el crecimiento en la oscuridad, a condicin de que el CO2se mantiene baja durante esta fase.