ekspresja transgenów i wyciszanie genów u zbó¿ · agro-mediated transformation (i.e....

Ekspresja transgenów i wyciszaniegenów u zbó¿

Anna Nadolska-Orczyk

Zak³ad In¿ynierii Komórkowej i Transformacji,Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roœlin, Radzików

Transgene expression and gene silencing in cereals

S u m m a r y

Genetic transformation of cereal crops is a powerful research tool for analy-sis of gene function and varietal improvement. Application of the method ispossible when the expression of introduced transgene is on the desired leveland stable over several generations. The production of transgenic cereals wasmainly performed by microprojectile bombardment. However, some advancewas also achieved by application of Agrobacterium-mediated transformation. Forrice, which is the cereal model species, this method is routinely used, while formany others, especially polyploids, it has been developed very recently and onlyin a few laboratories. We still lack the knowledge whether the main features ofAgro-mediated transformation (i.e. integration of one or few copies usually notrearranged and well defined transgene cassette) influence the transgene expres-sion in polyploid cereal species. This review discusses known mechanisms pos-sibly involved in transgene silencing, using both transformation methods. Partof the discussion is focused on transgene expression / silencing in relation tolarge genomes of polyploid cereals.

Another application of genetic transformation, based on RNAi technology(RNA interference), is silencing of selected genes. This could be used to studygene function as well as to induce silencing of the native, single or family genesof cereals. Two strategies of silencing are discussed: a strategy of transcriptionalgene silencing (TGS) and posttranscriptional gene silencing (PTGS).

Key words:

genetic transformation, polyploids, wheat, triticale, oat.

P R A C E P R Z E G L ¥ D O W E

Adres do korespondencji

Anna Nadolska-Orczyk,Zak³ad In¿ynieriiKomórkoweji Transformacji,Instytut Hodowlii Aklimatyzacji Roœlin,Radzików, 05-870 B³onie;e-mail:[email protected]

4 (75) 168–180 2006

1. Metody transformacji zbó¿

Uzyskanie transgenicznych roœlin jest podstawowym etapem w badaniach funk-cji genów oraz otrzymywaniu nowych, genetycznie ulepszonych odmian. Drugim,niezbêdnym warunkiem jest uzyskanie stabilnej ekspresji wprowadzonej konstruk-cji genetycznej, niezmienionej w kolejnych pokoleniach generatywnych. Zastosowa-nie odpowiedniej metody transformacji genetycznej ma znaczenie nie tylko dla wy-dajnoœci, ale przede wszystkim dla jakoœci uzyskanych roœlin transgenicznych.

Pierwsze transgeniczne, p³odne roœliny zbó¿, tj. kukurydzy (1) i ry¿u (2,3) uzy-skano pod koniec lat 90. ubieg³ego wieku z protoplastów. Metoda ta jednak nie roz-powszechni³a siê, z powodu trudnoœci metodycznych oraz wystêpuj¹cych zaburzeñgenetycznych w otrzymywanych roœlinach. Ze wzglêdu na nieudane w tym czasiepróby transformacji zbó¿ za pomoc¹ Agrobacterium, opracowana zosta³a metodabiolistyczna (mikrowstrzeliwania) (4) z powodzeniem u¿yta do transformacji pszeni-cy (5-7). Do dziœ rozpowszechni³a siê ona w wielu laboratoriach na œwiecie. Próbywykorzystania naturalnego mechanizmu transformacji genetycznej przy u¿yciuAgrobacterium przynios³y pewien prze³om w 1994 r. w transformacji ry¿u (8)i w 1997 r. w transformacji pszenicy (9). W chwili obecnej u ry¿u, który jest diplo-idalnym gatunkiem modelowym wœród zbó¿, ta metoda transformacji jest ju¿ ru-tyn¹. U wielu pozosta³ych, zw³aszcza gatunków poliploidalnych (pszenica, pszen¿y-to, owies) transformacja za pomoc¹ Agrobacterium jest nadal bardzo trudna i niedo-pracowana. Najwiêcej doniesieñ dotyczy pszenicy, gatunku gospodarczo najwa¿-niejszego (9-13). Wiêkszoœæ z nich ukaza³a siê w okresie ostatnich trzech lat i po-chodzi z kilku laboratoriów. Nasz wk³ad w opracowanie metody transformacji gene-tycznej za pomoc¹ Agrobacterium u poliploidalnych zbó¿ jest bardzo istotny. Inten-sywne prace z ostatnich kilku lat (z du¿¹ pomoc¹ finansow¹ KBN) zaowocowa³yopracowaniem regeneracji in vitro i transformacji trzech odmian pszenicy (14,13),pszen¿yta (15) i owsa (Gasparis i in., w opracowaniu). Znajomoœæ tych technik umo¿-liwia nam prowadzenie badañ nad ekspresj¹ transgenów oraz wyciszaniem genównatywnych w zbo¿ach.

1.1. Metoda biolistyczna

Du¿e zainteresowanie metod¹ transformacji zbó¿ za pomoc¹ Agrobacterium nieby³o bezprzedmiotowe. Po kilku latach badañ i entuzjastycznych doniesieñ na te-mat mo¿liwoœci u¿ycia metody biolistycznej w kolejnych gatunkach zbó¿, rozpoczê-to analizê uzyskanych linii transgenicznych. Dotyczy³a ona liczby kopii, strukturytransgenicznych loci, ich lokalizacji, dziedziczenia i utrzymywania ekspresji w kolej-nych pokoleniach generatywnych, a w najnowszych pracach przeprowadzono anali-zê sekwencji. Wykazano, integracjê zazwyczaj wielu (do kilkudziesiêciu) kopii trans-genu zawieraj¹cego ponadto sekwencje wektora. Towarzyszy³y temu du¿e rearan-

Ekspresja transgenów i wyciszanie genów u zbó¿

BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 168-180 2006 169

¿acje. Zdecydowana wiêkszoœæ transgenicznych loci mia³a bardzo z³o¿on¹ strukturêsk³adaj¹c¹ siê z wielokrotnych kopii ca³ych, uszkodzonych i zrearan¿owanych se-kwencji, czêsto wbudowanych w postaci jednokierunkowych lub odwróconych po-wtórzeñ i rozdzielonych fragmentami genomowego DNA (16-18). Te zaburzeniaw budowie i strukturze transgenicznych loci maj¹ bezpoœredni lub poœredni wp³ywna brak ekspresji wprowadzonych transgenów lub ich wyciszanie w kolejnych poko-leniach. Srivastava i wsp. (19) opisali rearan¿acje a¿ w 5 z 6 testowanych linii trans-genicznych pszenicy. Tak du¿¹ liczbê linii z zaburzeniami transgenów autor t³uma-czy³ niestabilnoœci¹ u¿ytej do transformacji populacji. Cannell i wsp. (20) badalidziedziczenie genu reporterowego uidA i selekcyjnego bar w trzech pokoleniachroœlin transgenicznych pszenicy i tritordeum. Z 12 lini testowanych w pierwszympokoleniu generatywnym (T1) 67%, a z 9 analizowanych w T2 i T3 55% wykazywa³odziedziczenie zgodne z prawami Mendla. W niektórych liniach ekspresja genu re-porterowego uidA, znajduj¹cego siê pod silnym promotorem Ubi1/intron ulega³awyciszaniu w kolejnych trzech pokoleniach. Poniewa¿ linie te wyprowadzono z ro-dzica wykazuj¹cego dobr¹ ekspresjê, autorzy sugeruj¹ w³¹czenie wyciszania epige-netycznego. W podobny sposób t³umaczono brak zgodnoœci z segregacj¹ men-dlowsk¹ w pokoleniu F2 roœlin potomnych uzyskanych po krzy¿owaniu roœlin trans-genicznych, wykazuj¹cych dobr¹ ekspresjê genu uidA z nietransgenicznymi (21). Wy-ciszanie genu uidA opisano równie¿ w wielu innych pracach, miêdzy innymi u diplo-idalnego ry¿u (22). Obejmowa³y one od 5 do 49% potomstwa rodzica dobrze wyra-¿aj¹cego ekspresjê transgenu selekcyjnego bar pod promotorem Ubi1. W tym do-œwiadczeniu stwierdzono metylacjê sekwencji promotora, co sugeruje, ¿e inaktywa-cja nast¹pi³a na poziomie transkrypcji. Podobn¹, specyficzn¹ inaktywacjê genu uidAw liniach pszenicy zawieraj¹cych obydwa transgeny opisywali Srivastava i wsp. (19).Jakkolwiek w niektórych przypadkach gen bar ulega³ ekspresji nawet, je¿eli by³ zme-tylowany. Specyficzne wyciszanie uidA sugeruje, ¿e niestabilnoœæ transgenów mo¿ebyæ zwi¹zana z ich sekwencj¹. Szczegó³owa analiza sekwencji transgenicznych lociu owsa, charakteryzuj¹cych siê prostym wzorem integracji wykazanym za pomoc¹hybrydyzacji DNA, uwidoczni³a wielokrotne rearan¿acje transgenu i jego sekwencjiflankuj¹cych z genomowym DNA (23). Z tego wynika, ¿e czêstotliwoœæ wystêpowa-nia linii charakteryzuj¹cych siê prostym wzorem integracji jest jeszcze rzadsza ni¿wskazuj¹ na to hybrydyzacja Southern blot lub badania FISH.

Na inn¹ przyczynê zaburzeñ wskazuje Howarth i wsp. (24). Analizie poddanodwie transgeniczne linie pszenicy, wykazuj¹c¹ ekspresjê i ulegaj¹c¹ wyciszaniu. Wy-ciszanie ekspresji genu reporterowego uidA i genu bar by³o coraz silniejsze w kolej-nych pokoleniach generatywnych a¿ do T3 i zachodzi³o na poziomie transkrypcyj-nym. Zwi¹zana z tym by³a nasilaj¹ca siê w kolejnych pokoleniach metylacja promo-tora (Ubi1). Inserty linii wykazuj¹cej ekspresjê w pokoleniu T3 zlokalizowano w dy-stalnej czêœci chromosomu 5D, a w linii, gdzie transgeny uleg³y wyciszeniu w po-bli¿u centromeru chromosomu 5A (24). Z map fizycznych chromosomów pszenicyoraz innych gatunków wiadomo, ¿e geny zlokalizowane s¹ g³ównie w dystalnych,


170 PRACE PRZEGL¥DOWE

sybtelomerycznych rejonach chromosomów. Rejony znajduj¹ce siê blisko centrome-ru zawieraj¹ nieaktywn¹ transkrypcyjnie heterochromatynê (25), wp³ywaj¹c¹ na wy-ciszanie ulokowanych w niej transgenów. Efekt wyciszania tak zlokalizowanychtransgenów nazywany jest efektem pozycji (26), czyli w³aœciwoœciami strukturalny-mi i funkcjonalnymi obszaru chromatyny flankuj¹cej miejsce integracji transgenu(27). Opisano go w obydwu metodach transformacji, choæ ze wzglêdu na ró¿ny prze-bieg tych procesów czêœciej przypisywany by³ metodzie biolistycznej.

1.2. Metoda transformacji za pomoc¹ Agrobacterium

Integracja transgenicznych loci z genomowym DNA w metodzie Agrobacteriumzachodzi w naturalnym procesie infekcji komórek roœlinnych t¹ bakteri¹, w czasie,której dochodzi do przekazania T-DNA (praca przegl¹dowa 28). Wi¹¿e siê z tym ichznacznie prostsza organizacja polegaj¹ca na integracji pojedynczych lub ma³ej licz-by kopii transgenów z minimalnymi rearan¿acjami. Ponadto daje ona mo¿liwoœæwbudowania œciœle okreœlonego przez sekwencje graniczne fragmentu DNA (T-DNA).Integracja mo¿e zachodziæ w loci na ró¿nych chromosomach, co umo¿liwia zastoso-wanie metody transformacji dwoma ró¿nymi plazmidami/T-DNA w celu wysegrego-wania (usuniêcia) konstrukcji u¿ytej do selekcji (29,30). Dlatego korzyœci wynikaj¹cez u¿ycia metody transformacji genetycznej zbó¿ za pomoc¹ Agrobacterium mog¹ byæznaczne zarówno w badaniach podstawowych jak i w przypadku wprowadzaniaGMO do œrodowiska. Najlepiej zosta³y one udokumentowane u roœlin dwuliœcien-nych, u których ta metoda transformacji jest wykorzystywana w badaniach i do ce-lów aplikacyjnych od ponad dwudziestu lat. Zalety te potwierdzone zosta³y w pierw-szych doniesieniach dotycz¹cych zbó¿ (por. praca przegl¹dowa 31) oraz pracach po-równuj¹cych obydwie metody u diploidalnych zbó¿ (32,33). Na przyk³ad w wynikuu¿ycia metody Agrobacterium u jêczmienia uzyskano dwukrotnie wy¿sz¹ wydajnoœætransformacji ni¿ w metodzie biolistycznej i integracjê 1-3 kopii we wszystkich uzy-skanych liniach. Natomiast 60% linii uzyskanych w metodzie biolistycznej mia³o wiê-cej ni¿ 8 kopii. Czêœciej równie¿ obserwowano wyciszenie w pierwszym pokoleniugeneratywnym (33).

Najczêœciej wystêpuj¹ce zaburzenia w tej metodzie, to integracja sekwencji wek-tora spoza T-DNA, integracja wiêcej ni¿ jednej kopii, czasami niepe³nej T-DNA orazdrobne zaburzenia w sekwencjach nukleotydów granicz¹cych z genomowym DNA.Jednak nie wszystkie z nich, jak to sugerowano we wczeœniejszych badaniach, s¹ po-wodem wyciszania. Meza i wsp. (34) analizowali 37 jednokopiowych linii transge-nicznych wyprowadzonych z modelowej roœliny dwuliœciennej Arabidopsis thaliana.Prawie jedna trzecia (13) z nich wykazywa³a wyciszanie. W dok³adnej analizie trans-genicznych loci wykazano, ¿e piêæ linii zawiera³o sekwencje wektora, a trzy mia³yuciête kopie T-DNA w odwróconej orientacji do ca³ej kopii. Zarówno jedne jak i dru-gie nie odgrywa³y istotnej roli w indukcji wyciszania. Podobnie nie stwierdzono


BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 168-180 2006 171

zwi¹zku pomiêdzy metylacj¹ promotora a wyciszaniem transgenu. Autorzy t³uma-czyli wyciszenie transgenów w tych badaniach efektem pozycji. Nie jest to zgodnez wynikami opisanymi w innych pracach, sugeruj¹cymi rozdzia³ insertów T-DNAw miejscach aktywnej transkrypcyjnie euchromatyny (35). Na przyk³ad w genomieA. thaliana, gdzie zagêszczenie genów jest du¿e, stwierdzono równomierny rozdzia³insertów T-DNA. U ry¿u by³y one zlokalizowane jedynie w rejonach aktywnych tran-skrypcyjnie odpowiadaj¹cych tylko 10-25% genomowego DNA. Podobnie w analiziefluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) chromosomów metafazowych ry¿u wyka-zano, ¿e inserty T-DNA by³y ulokowane g³ównie w dystalnych, euchromatynowychczêœciach (36). Pewnym wyt³umaczeniem efektu pozycji, opisanym u roœlin transfor-mowanych za pomoc¹ Agrobacterium mo¿e byæ wystêpowanie interstycjalnych miejscheterochromatyny (knobs), po raz pierwszy opisanych w kukurydzy (37), ale wystê-puj¹cych równie¿ w genomach innych roœlin. W najnowszych badaniach u Arabidopsiswykazano, ¿e heterochromatyna jest determinowana przez elementy transpozono-we i zwi¹zane z nimi duplikacje tandemowe pod kontrol¹ genu DDM1 ATPazy remo-deluj¹cej chromatynê (38). Geny le¿¹ce blisko lub wewn¹trz tych rejonów mog¹ byæprzez nie regulowane epigenetycznie.

Z wczeœniejszych badañ wynika³o, ¿e wyciszanie by³o równie¿ czêsto zwi¹zanez wystêpowaniem powtarzalnych struktur T-DNA (praca przegl¹dowa 39), choæ nig-dy w konfiguracjach T-DNA jako sekwencje odwrócone lub tandemowe (40). Zwi¹-zek z transkrypcj¹ odwróconych powtórzeñ a wyciszaniem istnia³, wtedy gdy RNAformowa³o dwuniciowe RNA, ciête na siRNA i homologiczne mRNA by³o degradowa-ne (por. praca przegl¹dowa 41). Jednak¿e w niektórych badaniach podtrzymuje siêhipotezê, ¿e wyciszanie jest aktywowane przez przekroczenie pewnego stê¿eniatranskryptu lub innego produktu ekspresji transgenów (42). Na przyk³ad czêstotli-woœæ wyciszania by³a pozytywnie skorelowana z si³¹ promotora wprowadzanegogenu (43) i by³a bardziej jednoznaczna w roœlinach homo- ni¿ hemizygotycznych(44). Ta hipoteza zostanie szerzej omówiona w nastêpnym rozdziale.

W badaniach przeprowadzonych na modelowych roœlinach dwuliœciennychuzmys³owiono nam tylko ewentualne przyczyny i mechanizmy wyciszania transge-nów. Metoda transformacji zbó¿ heksaploidalnych za pomoc¹ Agrobacterium zosta³aopracowana dopiero w ostatnich latach (9-13,15,16), dlatego informacje na tematekspresji wprowadzonych transgenów ograniczaj¹ siê do pierwszego, najwy¿ej dru-giego pokolenia generatywnego. We wstêpnych wynikach tych badañ potwierdzasiê du¿o wy¿sz¹ czêstotliwoœæ wystêpowania pojedynczych kopii o prostym wzorzeintegracji. Brak na razie prac, w których prowadzono analizê stabilnoœci ekspresjii/lub ewentualnych mechanizmów wyciszania. Jednym z elementów mog¹cych od-grywaæ bardzo du¿¹ rolê w ekspresji transgenów jest du¿y i bardzo z³o¿ony genomtych roœlin. Diploidalne zbo¿a maj¹ genom wiêkszy ni¿ roœlina modelowa A. thalianaod ok. 3 razy u ry¿u do ponad 30 razy u jêczmienia. Zbo¿a poliploidalne, jak allo-heksaploidalna pszenica, pszen¿yto czy owies, maj¹ genomy prawie 100-krotniewiêksze (45). Wiêkszoœæ zajmuj¹ rozproszone wzd³u¿ chromosomów rejony hetero-



chromatynowe, zawieraj¹ce sekwencje repetytywne oraz ruchome elementy gene-tyczne. Elementy transpozonowe w roœlinach o du¿ych genomach zajmuj¹ wiêk-szoœæ obszaru (46). Udzia³ retrotranspozonów w genomach zbó¿ oceniany jest na-wet na 50 do 80% (47). Stwierdzono, ¿e w warunkach stresu mog¹ ulegaæ aktywacjii wp³ywaæ na ekspresjê i/lub rearan¿acje przylegaj¹cych genów. Na przyk³ad w nowosyntetyzowanym amfiploidzie pszenicy poziom transkryptów transpozonu Wis 2-1A,znajduj¹cy siê w dziesiatkach tysiêcy kopii by³ bardzo wysoki i zwi¹zany z wycisza-niem lub aktywacj¹ okreœlonych genów (48). U jêczmienia 12 z 46 miejsc integracjiT-DNA ulokowanych by³o wewn¹trz retrotranspozonu BARE-1, wystêpuj¹cego z czê-stotliwoœci¹ 2 × 105 w genomie (49). Miejsca integracji transgenu z genomowymDNA u³o¿one by³y zawsze w powtarzalnej duplikacji tandemowej.

2. Liczba kopii a ekspresja

Mimo prostego wzoru integracji, transgeniczne linie roœlin dwuliœciennych wypro-wadzone za pomoc¹ Agrobacterium mog¹ ró¿niæ siê nawet 100-krotnie w poziomieekspresji (50,51). To du¿e zró¿nicowanie pojawia siê równie¿ wœród linii transformo-wanych t¹ sam¹ konstrukcj¹. W niektórych laboratoriach stwierdzono bezpoœrednizwi¹zek pomiêdzy liczb¹ kopii transgenów a poziomem ekspresji (52-54). Przy czymw badaniach na ziemniaku (52) by³ on pozytywny, a np. u tytoniu pozytywnie lub nega-tywnie zwi¹zany z ekspresj¹ transgenu (53). W badaniach roœlin zbo¿owych dane do-tycz¹ce efektu liczby kopii transgenu s¹ nieliczne i sprzeczne. Opisano zarówno brakwp³ywu (55) jak i wzrost ekspresji zwi¹zany z homozygotyzacj¹ (56,57). W poliploidal-nych zbo¿ach, g³ównie pszenicy transformowanej metod¹ biolistyczn¹ mo¿na znaleŸæwiele przyk³adów pozytywnej korelacji liczby transgenów z ekspresj¹. Jednym z nichjest uzyskanie transgenicznej linii pszenicy zawieraj¹cej wed³ug szacunku autorówoko³o 90 w przeliczeniu na homozygotyczny genom 2C kopii transgenu koduj¹cegobia³ko p³aszcza wirusa paskowanej mozaiki pszenicy (58). Linia ta wykazywa³a jedno-czeœnie siln¹ odpornoœæ na tego wirusa. Tak jak przedstawiono za pomoc¹ hybrydyza-cji Northern, odpornoœæ nie wynika³a z ekspresji bia³ka p³aszcza wirusa, ale du¿ej iloœcizdegradowanego mRNA transkrybowanego genu. Wynik ten sugeruje typ odpornoœciwarunkowany przez potranskrypcyjne wyciszanie.

Inne przyk³ady dotycz¹ transformacji zbó¿ genami natywnymi, warunkuj¹cymicechy jakoœciowe. Jedn¹ z najwa¿niejszych jest sk³ad jakoœciowy gluteniny, bia³kazapasowego zbó¿. Sk³ada siê ona z dwóch podjednostek: wysokocz¹steczkowejHMW (ang. high-molecular-weight) i niskocz¹steczkowej LMW (ang. low-molecular-we-ight). HMW warunkuje elastycznoœæ glutenu. Ró¿nice w jakoœci zwi¹zane s¹ z liczb¹podjednostek i mog¹ byæ zale¿ne od efektu iloœciowego. Pszenica heksaploidalnazawiera szeœæ genów podjednostki HMW, ale w zale¿noœci od odmiany wystêpujeekspresja 3, 4 lub 5 z nich. Istnieje œcis³y zwi¹zek pomiêdzy liczb¹ genów ule-gaj¹cych ekspresji a jakoœci¹ (59). Dwa z nich: 1Dx5 i 1Ax1 koduj¹ce podjednostkê


BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 168-180 2006 173

HMW zosta³y wyizolowane i u¿yte do transformacji pszenicy (59,60). Rooke i wsp.(60), mimo uzyskania linii zawieraj¹cych od oko³o 6 do kilkudziesiêciu kopii trans-genów, nie stwierdzili pozytywnej korelacji pomiêdzy poziomem ekspresji a liczb¹insertów transgenu. Te same geny wprowadzone do odmiany pszenicy, u której wy-stêpuje ekspresja wszystkich piêciu podjednostek (59) da³a wynik odmienny. Z szeœ-ciu roœlin transgenicznych w dwóch odnotowano nadekspresjê genu 1Dx5, zwiêk-szaj¹c¹ udzia³ wysokocz¹steczkowej podjednostki gluteniny w bia³ku ca³kowitymdo 22%. Ekspresja 1Ax1 w dwóch roœlinach powodowa³a wyciszanie genu endogen-nego podjednostki 1Ax2*, kiedy transgen by³ w stadium homozygoty. Roœliny tezwiera³y nisk¹ liczbê kopii. Wyciszanie wszystkich podjednostek HMW obserwowa-no w dwóch innych roœlinach wykazuj¹cych ekspresjê transgenu podjednostki 1Ax1i nadekspresjê genu Dx1. Posiada³y one wysok¹ liczbê kopii transgenu (od 20 do 50)wbudowanego w wielu miejscach genomu. Wzór integracji i ekspresji by³y dziedzi-czone z wyj¹tkiem jednej linii, u której w pokoleniu T2 nast¹pi³a rewersja wycisza-nia. By³a ona zwi¹zana z drastyczn¹ strat¹ du¿ej liczby, ale nie wszystkich transge-nów. Rewertant wykazywa³ ekspresjê wszystkich piêciu podjednostek oraz transge-nu 1Ax1. W innym laboratorium te same geny wprowadzono do roœlin tritordeum(pszenica durum x jêczmieñ). Z 13 uzyskanych linii transgenicznych, 6 wykazywa³opodobn¹ lub wy¿sz¹ ekspresjê tych podjednostek. Masci i wsp. (61) transformowaliza pomoc¹ mikrowstrzeliwania odmianê Bobwhite pszenicy genem koduj¹cym pod-jednostkê LMW gluteniny pod jego w³asnym promotorem. Podjednostka ta jest dru-gim wa¿nym komponentem glutenu wp³ywaj¹cym na jego strukturê. U wiêkszoœcitransgenicznych roœlin, ekspresja transgenu by³a s³abo przekazywana do roœlin po-tomnych. U jednej z linii, wykazuj¹cej siln¹ ekspresjê transgenu, stwierdzono po-dwojenie udzia³u bia³ka w podjednostce. Zdaniem autorów nadekspresja tegotransgenu by³a prawdopodobnie efektem integracji wielu kopii, co wynika³o z anali-zy hybrydyzacji Southern.

Pozytywny efekt wielokrotnych kopii genów puroindolinowych Pina i Pinb, któ-rych ekspresja wp³ywa na miêkkoœæ ziaren wykazali See i wsp. (62) w liniach substy-tucyjnych pszenicy. Ekspresja tych genów wystêpuje w gatunkach diploidalnychpszenicy, ale jest wyciszona w pszenicy tetraploidalnej. Aktywne w heksaploidal-nych gatunkach geny puroindolinowe pochodz¹ z Aegilops tauschii, donora genomuD. Autorzy w³¹czyli za pomoc¹ linii substytucyjnych aktywne geny Pina i Pinb do ge-nomu A i B. Stwierdzili œcis³¹ zale¿noœæ miêkkoœci ziarna ze zwiêkszon¹ liczb¹ tychgenów. Podobny wynik zwiêkszenia miêkkoœci ziarna uzyskano w wyniku transfor-macji genetycznej ry¿u metod¹ mikrowstrzeliwania transgenów pinA i pinB umiesz-czonych pod kontrol¹ promotora ubiquityny (63). W tym przypadku ry¿ by³ tylkoroœlin¹ modelow¹, nie zawieraj¹c¹ w swoim genomie homologów tych genów. Au-torzy potwierdzili wp³yw produktów genów puroindolinowych na miêkkoœæ ziarna,choæ nie wykazali efektu addytywnego. Na podstawie uzyskanych wyników mo¿najednak przypuszczaæ, ¿e w wyniku zwiêkszenia liczby kopii tych genów poprzeztransformacjê genetyczn¹ poliploidalnych zbó¿ mo¿e wyst¹piæ efekt addytywny.



W badaniach dotycz¹cych roœlin dwuliœciennych najczêœciej wyra¿any by³ po-gl¹d, ¿e stabilna ekspresja jest wynikiem integracji pojedynczych kopii transgenów(64), a kopie wielokrotne prowadz¹ do kosupresji i wyciszania (65). Nowe danewnios³a praca Schubert i wsp. (66) na podstawie badañ przeprowadzonych u A. thaliana.Autorzy scharakteryzowali ekspresje jednokopiowego T-DNA, zwieraj¹cego ró¿n¹liczbê transgenu w 132 niezale¿nych liniach. Wyciszenie transgenów u ¿adnej z nichnie by³o wynikiem efektu pozycji (miejsca integracji). Natomiast poni¿ej pewnejliczby identycznych transgenów w genomie, korelacja pomiêdzy liczb¹ kopii trans-genu i ekspresj¹ by³a pozytywna. Wysoka i stabilna ekspresja kilku kopii transgenuutrzymywana by³a w dalszych pokoleniach i jej poziom by³ porównywalny pomiêdzyniezale¿nymi liniami maj¹cymi tyle samo kopii transgenu. Wyciszanie RNAi (zob. da-lej) na poziomie transkrypcji by³o w³¹czane, je¿eli liczba kopii przekroczy³a pewienpoziom. Autorzy zaproponowali istnienie mechanizmu ochronnego, w³¹czanego,kiedy transkrypcja RNA danego genu jest nadmierna. Pozytywna korelacja wiêkszejliczby kopii z ekspresj¹ jest dyskutowana z organizacj¹ genomu DNA tej roœliny. Napodstawie analizy sekwencji genomowego DNA wykazano, ¿e u A. thaliana tylko 35%genów koduj¹cych bia³ka jest jednokopiowych (67). Istniej¹cy, zatem pozytywnyzwi¹zek ekspresji z okreœlon¹ liczb¹ kopii transgenów mo¿e byæ odzwierciedleniemcharakterystyki genomu. Zmiany w liczbie kopii s¹ szczególnie czêste w trakcieewolucji genomów (por. praca przegl¹dowa 68).

Genomy alloheksaploidalnych zbó¿ s¹ z³o¿one z trzech genomów diploidalnychró¿nych gatunków. Zawieraj¹ zatem trzy zestawy chromosomów homeologicznych.Mechanizmy regulacji ekspresji w poliploidach, podobnie jak wskazuj¹ na to bada-nia z u¿yciem resyntezowanych poliploidów (69), musz¹ uwzglêdniaæ zwiêkszon¹liczbê genów homeologicznych i ortologicznych oraz elementów regulatorowych.Mo¿na, zatem przypuszczaæ, ¿e pozytywna zale¿noœæ liczby kopii z ekspresj¹ po-winna byæ w tych gatunkach jeszcze bardziej istotna. Paradoksalnie hipotezê tê po-twierdzono w pracach, w których wysoka ekspresja transgenu by³a zwi¹zana z du¿¹liczb¹ kopii wprowadzonych metod¹ biolistyczn¹. Brak korelacji pomiêdzy liczb¹kopii i poziomem ekspresji transgenów t³umaczono najczêœciej opisanym wczeœniejefektem pozycji.

3. Ukierunkowane wyciszanie genów natywnych zbó¿

3.1. Wykrycie regulatorowego RNA (RNAi)

Mimo ¿e RNAi bierze udzia³ w jednym z podstawowych mechanizmów regulacjiekspresji genów, jego pe³ne zrozumienie i wykorzystanie w badaniach sta³o siêmo¿liwe po wykryciu w 1999 r. krótkich interferuj¹cych RNA (siRNA) powoduj¹cychwyciszanie genów (70). Obecnie wiadomo, ¿e istniej¹ trzy naturalne mechanizmy in-


BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 168-180 2006 175

terferencji RNA (71). Reguluj¹ one mechanizmem obronnym roœliny przeciw wiru-som, ochron¹ genomu przed transpozonami i bior¹ udzia³ w regulacji ekspresji ge-nów. Ich wspólnym elementem jest ciêcie dwuniciowego RNA do krótkich 21-26 nu-kleotydowych, interferuj¹cych RNA (siRNAs i miRNAs) przez enzymy typu Dicer. Za-blokowanie ekspresji genów mo¿e zachodziæ na poziomie transkrypcji (TGS, tran-skrypcyjne wyciszanie genów). Zosta³o ono po raz pierwszy wykryte u roœlin trans-genicznych, w których RNA transgenu powodowa³o metylacjê DNA (72,73). TGS za-chodzi w wyniku metylacji promotora. Jest to proces dziedziczony aczkolwiek by³yobserwowane rewersje. Ostatnio zaobserwowano, ¿e wyciszanie tego typu ma rów-nie¿ zwi¹zek z modyfikacj¹ histonów (74). Innym mechanizmem jest wyciszanie ge-nów na poziomie mRNA (PTGS, potranskrypcyjne wyciszanie genów). W wynikutego procesu zachodzi degradacja transkryptu genu endogennego (lub transgenu),metylacja sekwencji koduj¹cej i tym samym wyciszenie ekspresji tego genu (trans-genu) (75). PTGS zachodzi podczas rozwoju roœliny i po mejozie jest resetowany.Istnieje bardzo obszerna literatura na temat procesów TGS i PTGS u roœlin modelo-wych (A. thaliana, petunia) (por. praca przegl¹dowa 76). Charakterystyczne dla tychprocesów jest systemiczne rozprzestrzenianie siê sygna³u wyciszaj¹cego w ca³ejroœlinie (77). Zarówno te badania jak i wykrycie krótkich interferuj¹cych RNA umo¿-liwi³y zaprojektowanie wektorów do wyciszania genów natywnych na poziomietranskrypcji lub do wyciszania potranskrypcyjnego (66,78). Wyciszaj¹ca konstrukcjazawiera pomiêdzy promotorem i terminatorem transkrypcji sekwencje odwróconeokreœlonego fragmentu DNA. Integracja tej konstrukcji z genomowym DNA i jejtranskrypcja prowadzi do powstania dwuniciowej spinki RNA, i w dalszej kolejnoœcido metylacji wybranych sekwencji regulatorowych/koduj¹cych. Odwrócone sekwen-cje promotora spowoduj¹ jego metylacjê i w konsekwencji wyciszenia ekspresjigenu na poziomie transkrypcji (nie dojdzie do transkrypcji sekwencji koduj¹cej).W przypadku u¿ycia sekwencji koduj¹cych, dwuniciowe fragmenty RNA tych se-kwencji doprowadz¹ do degradacji odpowiadaj¹cego im mRNA. Efektem bêdzie wy-ciszenie ekspresji na poziomie potranskrypcyjnym.

Wykrycie regulatorowego RNA (RNAi) umo¿liwi³o zrozumienie oraz ustaleniemechanizmów wyciszania ekspresji transgenów i sta³o siê jedn¹ z podstawowychmetod analizy funkcji genów. Umo¿liwia równie¿ ukierunkowane wyciszanie genównatywnych, warunkuj¹cych niekorzystne cechy.

3.2. Wykorzystanie procesu RNAi do wyciszania genów natywnych zbó¿

W zale¿noœci od u¿ycia okreœlonego fragmentu genu, promotora czy sekwencjireguluj¹cej w wektorze typu RNAi efekt wyciszania bêdzie ró¿ny. W najnowszychbadaniach Miki i wsp. (79) wykazali, ¿e u¿ywaj¹c sekwencji konserwatywnej rodzinygenów OsRac uzyskali wyciszanie w ca³ej rodzinie. Powstaj¹ce dwuniciowe RNA se-kwencji genowospecyficznych prowadzi³o do wyciszania poszczególnych genów tej



rodziny. Efektywnoœæ metody mo¿na by³o zwiêkszyæ przez zastosowanie odpowied-niego promotora i u¿ycie w³aœciwej d³ugoœci sekwencji. Ry¿ jest bardzo dobrymobiektem do analizy funkcji genów przy u¿yciu wektorów wyciszaj¹cych, poniewa¿jego genom jest zsekwencjonowany, istnieje du¿a kolekcja pe³nej d³ugoœci cDNA,ale z kolei brakuje mutantów typu knockout. W najbli¿szym czasie mo¿na siê zatemspodziewaæ wielu publikacji na ten temat.

Wiedza na temat ukierunkowanego wyciszania genów u gatunków poliploidalnychjest bardzo ograniczona. S¹ to gatunki, u których wyciszenie genów warunkuj¹cychniekorzystne cechy przy u¿yciu wektorów RNAi, jak siê wydaje, jest bardzo potrzebnei mo¿e mieæ ogromny wp³yw na ich ulepszenie. W wyniku zwielokrotnionego genomu,mutacja recesywna genu na jednym z chromosomów homeologicznych zazwyczaj niepowoduje eliminacji cechy fenotypowej. Natomiast u¿ycie wektorów RNAi umo¿liwiajednoczesne wyciszenie ekspresji danej grupy genów homeologicznych. Potwierdzilito w swoich badaniach Lawrence i Pikaard (80), w których u¿yli allotetraploidalnegogatunku Arabidopsis suecica, mieszañca A. thaliana i A. arenosa. Ekspresja dwuniciowegoRNA genu DDM1 (zmniejszenie metylacji DNA) A. thaliana spowodowa³a eliminacjêmRNA tego genu i brak metylacji w powtórzeniach centromerowych genomów oby-dwu gatunków w badanym mieszañcu (A. thaliana i A. arenosa). Te wyniki wskazuj¹, ¿epojedynczy transgen indukuj¹cy RNAi mo¿e w sposób dominuj¹cy wyciszaæ wielokrot-ne geny ortologiczne. W drugim i zarazem jedynym artykule dotycz¹cym pszenicy(twardej), transformowanej metod¹ biolistyczn¹, wprowadzono sekwencje genuVRN2, warunkuj¹cego hamowanie kwitnienia u zbó¿ ozimych (81). Mutacja w tym ge-nie powoduje, ¿e staj¹ siê one formami jarymi. Prawdopodobnie z powodu braku od-powiednich metod, autorzy u¿yli do transformacji metody biolistycznej oraz odmianyjarej pszenicy twardej (Jagger). Konstrukcja RNAi zawiera³a fragment 347 pz cDNAtego genu wyizolowanego z T. monococcum. Redukcja poziomu RNA genu VRN2 przy-spieszy³a czas kwitnienia transgenicznych roœlin o ponad miesi¹c.

4. Podsumowanie

Ekspresja transgenów w roœlinach jest uwarunkowana szeregiem czynnikówzwi¹zanych z metod¹ transformacji, w³aœciwoœciami wprowadzanego DNA, budow¹transgenicznej kasety jak i cechami samej roœliny. Sekwencja transgenu, budowai czêœci sk³adowe konstrukcji oraz sposób transformacji nale¿¹ do grupy elemen-tów, na które mamy wp³yw i mo¿emy je modyfikowaæ. To, jak dana konstrukcja zo-stanie zintegrowana z DNA roœliny zale¿y w du¿ej mierze od metody transformacjijak i od procesów odbywaj¹cych siê na poziomie komórki. Pomyœlna realizacja tychwszystkich etapów nie zapewnia jeszcze uzyskania w³aœciwej ekspresji transgenu.Wa¿nym elementem jest, ¿eby transgen zosta³ zintegrowany z w³aœciw¹ czêœci¹chromatyny, w odpowiedniej liczbie kopii, a jego struktura umo¿liwia³a stabiln¹ekspresjê w dalszych pokoleniach.


BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 168-180 2006 177

Uzyskanie ekspresji transgenu na odpowiednim poziomie jest znacznie trudniej-sze u zbó¿ ni¿ u roœlin dwuliœciennych. Przyczyn¹ tego, jak stara³am siê wykazaæ,mog¹ byæ dwa elementy. Pierwszym z nich jest ograniczone mo¿liwoœciami tech-nicznymi u¿ycie korzystniejszej metody transformacji za pomoc¹ Agrobacterium.Drugim jest ich du¿y genom, w którym prawie 80% zajmuje heterochromatyna.W gatunkach poliploidalnych zbó¿ wystêpuje ponadto zwielokrotnienie genów ho-meologicznych lub ortologicznych oraz ich elementów regulatorowych. Doprowa-dzi³o to prawdopodobnie do wykszta³cenia u tych roœlin jeszcze silniejszych mecha-nizmów regulacji ekspresji, w tym wyciszania na poziomie RNAi. Znacznie prostszaw zastosowaniu u poliploidalnych zbó¿, jak siê wydaje, jest technika wyciszaniaprzy u¿yciu mechanizmu RNAi. Zgodnie z ogóln¹ wiedz¹ na ten temat oraz wynika-mi pierwszych prac umo¿liwia ona wyciszenie wszystkich genów homologicznych,homeologicznych lub ich ortologów. Stwarza, zatem nowe mo¿liwoœci analizy funk-cjonalnej oraz ulepszania roœlin uprawnych.

Praca zosta³a opracowana w ramach projektu badawczego PBZ-KBN-089/P06/2003.

Literatura

1. Rhodes C. A., Pierce D. A., Mettler I. J., Mascarenhas D., Detmer J. J., (1988), Science, 240, 204-207.2. Toriyama K., Arimoto Y., Uchimiya H., Hinata K., (1988), Bio/Technol., 6, 1072-1074.3. Zhang W., Wu., (1988), Theor. Appl. Genet., 76, 835-840.4. Christou P., (1992), Plant J., 2, 275-281.5. Vasil V., Castillo A. M., Fromm M. E., Vasil I. K., (1992), Bio/Technology, 10, 667-674.6. Vasil V., Srivastava V., Castillo A. M., Fromm M. E., Vasil I. K., (1993), Bio/Technology, 11, 1553-1558.7. Weeks J. T., Anderson O. D., Blechl A. E., (1993), Plant Physiol., 102, 1077-1084.8. Hiei Y., Komari T., Kubo T., (1997), Plant Mol. Biol., 35, 205-218.9. Cheng M., Fry J. E., Pang S., Zhou H., Hironaka C. M., Duncan D. R., Conner T. W., Wan Y., (1997),

Plant Physiol., 115, 971-980.10. Hu T., Metz S., Chay C., Zhou H. P., Biest N., Chen G., Cheng M., Feng X., Radionenko M., Lu F., Fry

J., (2003), Plant Cell Rep., 21, 1010-1019.11. Khanna H. K., Daggard G. E., (2003), Plant Cell Rep., 21, 429-436.12. Wu H., Sparks C., Amoah B., Jones H. D., (2003), Plant Cell Rep., 21, 659-668.13. Przetakiewicz A., Karaœ A., Orczyk W., Nadolska-Orczyk A., (2004), Cell Mol. Biol. Lett., 9, 903-917.14. Przetakiewicz A., Orczyk W., Nadolska-Orczyk A., (2003), Plant Cell Tissue Org. Cult., 73, 245-256.15. Nadolska-Orczyk A., Przetakiewicz A., Kopera K., Binka A., Orczyk W., (2005), J. Plant Growth Re-

gul., 24, 2-10.16. Kohli A., Leech M., Vain P., Laurie D. A., Christou P., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 7203-7208.17. Pawlowski W. P., Somers D. A., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 12106-12110.18. Kohli A., Twyman R. M., Abranches R., Wegel E., Stoger E., Christou P., (2003), Plant Mol. Biol., 52,

247-258.19. Srivastava V., Anderson O. D., Ow D. W., (1999), Proc. Natl. Acad. Sci., 96, 11117-11121.20. Cannell M. E., Doherty A., Lazzeri P. A., Barcelo P., (1999), Theor. Appl. Genet., 99, 772-784.21. Demeke T., Hucl P., Baga M., Caswell K., Leung N., (1999), Theor. Appl. Genet., 99, 947-953.22. Kumpatla S. P., Eng W., Buchholz W. G., Hall T. C., (1997), Plant Physiol., 115, 361-373.23. Makarevitch I., Svitashev S. K., Somers D. A., (2003), Plant Mol. Biol., 52, 421-432.24. Howarth J., Jacquet J. N., Doherty A., Jones H. D., Cannell M. E., (2005), 146, 311-320.



25. Sandhu D., Gill K. S., (2002), Plant Physiol., 128, 803-811.26. Matzke A. J. M., Matzke M. A., (1998), Curr. Opin. Plant Biol., 1, 142-148.27. Iglesias V. A., Moscone E. A., Papp I., Neuhuber F., Michalowski S., Phelan T., Spiker S., Matzke M.,

Matzke A. J. M., (1997), Plant Cell, 9, 1251-1264.28. Nadolska-Orczyk A., (2001), Biotechnologia, 4, 100-107.29. de Framond A. J., Back E. W., Chilton W. S., Kayes L., Chilton M., (1986), Mol. Gen. Genet., 202, 125-131.30. Matthews P. R., Wang M-B., Waterhouse P. M., Thornton S., Fieg S. J., Gubler F., Jacobsen J. V.,

(2001), Mol. Breed., 7, 195-202.31. Nadolska-Orczyk A., Orczyk W., (2003), in: Plant Genetic Engineering, vol 2, Improvement of Food

Crops, Eds. Jaiwal P. K., Singh R. P., 1-25, Sci. Tech. Publishing LLC USA.32. Zhang Y., Yin X., Yang A., Li G., Zhang J., (2005), Euphytica, 144, 11-22.33. Travella S., Ross S. M., Harden J., Everett C., Snape J. W., Harwood W. A., (2005), Plant Cell Rep., 23,

780-789.34. Meza T. J., Stangeland B., Mercy I. S., Skarn M., Nymoen D. A., Berg A., Butenko M. A., Hakelien

A-M., Haslekas C., Meza-Zapeda L. A., Aalen R. B., (2002), Nucleic Acid Res., 30, 4556-4566.35. Barakat A., Gallois P., Raynal M., Mestre-Ortega D., Sallaud Ch., Guiderdoni E., Delseny M., Bernardi

G., (2000), FEBS Lett., 471, 161-164.36. Dong J. J, Kharb P., Teng W. M., Hall T. C., (2001), Mol. Breed., 7, 187-194.37. McClintock B., (1951), Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 16, 13-47.38. Lippman Z., Gendrel A-V., Black M., Vaughn M. W., Dedhia N., Mccombie W. R., Lavine K., Mittal V.,

May B., Kasschau K. D., Carrington J. C., Doerge R. W., Colot V., Martienssen R., (2004), Nature,430, 471-476.

39. Muskens M. W., Vissers A. P., Mol J. N., Kooter J. M., (2000), Plant Mol. Biol., 43, 243-260.40. Lechtenberg B., Schubert D., Forsbach A., Gils M., Schmidt R., (2003), Plant J., 34, 507-517.41. Matzke M. A., Matzke A. J. M., Pruss G. J., Vance V. B., (2001), Curr. Opin. Genet. Dev., 11, 221-227.42. Lindbo J. A., Silva-Rosales L., Proebsting W. M., Dougherty W. G., (1993), Plant Cell 5, 1749-1759.43. Que Q., Wang H-Y., English J. J., Jorgensen R. A., (1997), Plant Cell, 9, 1357-1368.44. Vaucheret H., Beclin C., Elmayan T., Feuerbach F., Godon C., Morel J. B., Mourrain P., Palauqui J. C.,

Vernhettes S., (1998), Plant J., 16, 651-659.45. Moore G., (2000), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 51, 195-222.46. Bennetzen J., (2000), Plant Mol. Biol., 42, 251-269.47. Feschotte C., Jiang N., Wessler S. R., (2002), Nat. Rev. Genet., 3, 329-341.48. Kashkush K., Feldman M., Levy A. A., (2003), Nature Genet., 33, 102-106.49. Stahl R., Horvath H., van Fleet J., Voetz M., von Wettstein D., Wolf N., (2002), Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 99, 2146-2151.50. Jones J. D. G., Dunsmuir P., Bedbrook J., (1985), EMBO J., 4, 2411-2418.51. Peach C., Velten J., (1991), Plant Mol. Biol., 17, 49-60.52. Stockhaus J., Eckes P., Blau A., Schell J., Willmitzer L., (1987), Nucleic Acid Res., 15, 3479-3491.53. Hobbs S. L. A., Warkentin T. D., DeLong C. M. O., (1993), Plant Mol. Biol., 21, 17-26.54. Ku M. S., Agarie S., Nomura M., Fukayama H., Tsuchida H., Ono H., Hirose S., Toki S., Miyao M.,

Matsuoka M., (1999), Nat. Biotechnol., 17, 76-80.55. Fearing P. L., Brown D., Vlachos D., Meghji M., Privalle L., (1997), Mol. Breed., 3, 169-176.56. Duan X., Li X., Xue Q., Abo-El-Saad M., Xu D., Wu R., (1996), Nature Biotechnol., 14, 494-498.57. James V. A., Avart C., Worland B., Snape J. W., Vain P., (2002), Theor. Appl. Genet., 104, 553-561.58. Sivamani E., Brey Ch. W., Talbert L. E., Young M. A., Dyer W. E., Kaniewski W. K., Qu R., (2002),

Transgenic Res., 11, 31-41.59. Alvarez M. L., Guelman S., Halford N. G., Lustig S., Reggiardo M. I., Ryabushkina N., Shewry P., Stein

J., Vallejos R. H., (2000), Theor. Appl. Genet., 100, 319-327.60. Rooke L., Barro F., Tatham A. S., Fido R., Steele S., Bekes F., Gras P., Martin A., Lazzeri P. A. Shewry

P. R., Barcelo P., (1999), Theor. Appl. Genet., 99, 851-858.61. Masci S., D’Ovidio R., Scossa F., Patacchini C., Lafiandra D., Anderson O. D., Blechl A. E., (2003),

Mol. Breed., 12, 209-222.


BIOTECHNOLOGIA 4 (75) 168-180 2006 179

62. See D. R., Giroux M., Gill B. S., (2004), Crop Sci., 44, 1248-1253.63. Krishnamurthy K., Giroux M. J., (2001), Nature Biotechnol., 19, 162-166.64. Wolffe A. P., Matzke M. A., (1999), Science, 286, 481-486.65. Vaucheret H., Beclin C., Elmayan T., Feuerbach F., Godon C., Morel J. B., Mourrain P., Palauqui J. C.,

Varnhettes S., (1998), Plant J., 16, 651-659.66. Schubert D., Lechtenberg B., Forsbach A., Gils M., Bahadur S., Schmidt R., (2004), 16, 2561-2571.67. Arabidopsis Genome Initiative, (2000), Nature, 408, 796-815.68. Schmidt R., (2002), Plant Mol. Biol., 48, 21-37.69. Ozkan H., Levy A. A., Feldman M., (2001), Plant Cell, 13, 1735-1747.70. Hamilton A. J, Baulcombe D. C., (1999), Sience, 286, 950-952.71. Baulcombe D., (2004), Nature, 431, 365-363.72. Wassenegger M., Heimes S., Riedel L., Sanger H. L., (1994), Cell, 76, 567-576.73. Mette M. F., Aufsatz W., van der Winden J., Matzke M. A., Matzke A. J. M., (2000), EMBO J., 19,

5194-5201.74. Zilberman D., Cao X., Jacobsen S. E., (2003), Science, 299, 716-719.75. Depicker A., van Montagu M., (1997), Curr. Opin. Cell Biol., 9, 373-382.76. Paszkowski J., Whitham S., (2001), Curr. Opin. Plant Biol., 4, 123-129.77. Palauqui J-C., Elmayan T., Pollien J-M., Vaucheret H., (1997), EMBO J., 16, 4739-4745.78. Sijen T., Vijn I., Rebocho A., van Blokland R., Roelofs D., Mol J. N., Kooter J. M., (2001), Curr. Biol.,

11, 436-440.79. Miki D., Itoh R., Shimamoto K., (2005), Plant Physiol., 138, 1903-1913.80. Lawrence R. J., Pikaard C. S., (2003), Plant J., 36, 114-121.81. Yan L., Loukoianov A., Blechl A., Tranquilli G., Ramakrishna W., SanMiquel P., Bennetzen J. L., Eche-

nique V., Dubcovsky J., (2004), Science, 303, 1640-1644.



ekspresja transgenów i wyciszanie genów u zbó¿ · agro-mediated transformation (i.e....

Documents