eksperimentalni sistemi za otkrivawe na slo`enite kleto~ni me

Eksperimentalni sistemi

Za otkrivawe na sloènite kleto~ni me|udejstva od imunot odgovor sekoristat razli~ni eksperimentalni sistemi. In vivo sistemite, koivklu~uvaat celo ìvotno, obezbeduvaat najprirodni eksperimentalniuslovi. Sepak, in vivo sistemite imaat bezbroj nepoznati i nekontroliranikleto~ni me|udejstva koi moàt da dovedat do nejasnotii pri tolkuvawetona eksperimentalnite podatoci Na druga strana se nao|aat in vitrona eksperimentalnite podatoci. Na druga strana, se nao|aat in vitrosistemite, vo koi odredeni populacii od limfociti se prou~uvaat podkontrolirani uslovi koi postojano moè da se povtoruvaat; in vitrosistemite moè da se poednostavat do toj stepen {to efikasno moè da seprou~uvaat poedine~ni kleto~ni me|udejstva. Sepak, tie imaat svoiograni~uvawa, me|u koi najzna~ajna e nivnata neprirodnost. Na primer,ovozmoùvawe na kontakt pome|u protivgen i pro~isteni B kletki in vitrone stimulira maksimalno sozdavawe na protivtela dokolku ne se prisutni Tne stimulira maksimalno sozdavawe na protivtela, dokolku ne se prisutni Tkletki. Zatoa, prou~uvawe na sozdavaweto na protivtelata vo ve{ta~ki invitro sistem vo koj nedostasuvaat T kletki moè da dovede do nepravilenzaklu~ok deka B kletkite ne sintetiziraat visoki nivoa na protivtela.Mora da se zapra{ame dali kleto~niot odgovor koj se zabeleùva in vitro jaotslikuva realnosta ili toa e produkt od edinstvenite uslovi vo samiot invitro sistem.

1

Ova poglavje objasnuva nekoi od eksperimentalnite sistemi koi rutinski sekoristat za prou~uvawe na imuniot sistem i pokriva del odrekombinantnite DNK tehniki koi go preobrazija prou~uvaweto naimunologijata vo poslednite dve decenii. Vo drugite poglavja, isto taka sepokrieni nekoi eksperimentalni sistemi i tehniki. Tabelata 22-1 ginaveduva niv i go upatuva ~itatelot kon soodvetnata lokacija zaobjasnuvawe.

2

Eksperimentalni ìvotinski modeli

Z j b b bZa prou~uvawe na imuniot sistem kaj r'betnicite potrebni se soodvetni ìvotinski modeli. Izborot na ìvotno zavisi od negovata soodvetnost zapostignuvawe odredena cel pri istraùvaweto. Ako se baraat golemi koli~ini na protivserum, zajakot, kozata, ovcata ili kowot moè da bidatsoodvetno eksperimentalno ìvotno. Ako celta e razvoj na za{titna vakcina, izbranoto ìvotno mora da bide ~uvstvitelno na infektivniot agens, zada moè da se proceni efikasnosta na vakcinata. Ako gluvcite ili zajacite se ~uvstivtelni na toj protivgen, moàt da se koristat za sozdavawe navakcinata. No, ako razvojot na infektivniot agens e ograni~en na lu|eto i primati, sozdavaweto na vakcinata moè da naloì upotreba na majmuni,{impanza ili babuni.Za pove}eto osnovni istraùvawa vo imunologijata, gluvcite se eksperimentalni ìvotni od izbor. So niv lesno se raboti, genski se dobrokarakterizirani i imaat brz ciklus na razmnoùvawe. Imunot sistem na glu{ecot e najdobro karakteriziran, podobro otkolku imuniot sistem na bilokoj drug vid. Zna~eweto na osnovnite istraùvawa na gluvcite e naglaseno so ogromnoto vlijanie koe ovie istraùvawa go imale vrz klini~kiteintervencii na humanite bolesti.

Genetski ~istite soevi moè da gi namalat eksperimentalnite varijaciiZa da ja kontroliraat eksperimentalnata varijacija koja proizleguva od razlikite vo genetskata pozadina na eksperimentalnite ìvotni, imunolozite~esto rabotat so genetski ~isti soevi, - t.e. genetski identi~ni ìvotni koi nastanuvaat so rodninsko vkrstuvawe. Brziot ciklus na razmnoùvawe kajgluvcite gi pravi osobeno soodvetni za sozdavawe na genetski ~isti soevi, koi nastanuvaat so povtoruvano vkrstuvawe pome|u bra}a i sestri. Na ovojna~in, heterozigotnosta na alelite koja obi~no se sretnuva kaj gluvcite kaj koi nema rodninsko parewe, se zamenuva so homozigotnost vo site lokusi.

j jPovtoruva~ko vkrstuvawe vo tek na 20 generacii obi~no sozdava genetski ~isti soj ~ii pokolenija se homozigotni vo pove}e od 98% od site lokusi.Postojat okolu 500 razli~ni genetski ~isti soevi na gluvci, a sekoj se ozna~uva so serija na brojkite i/ili broevi (tabela 22-2). Pove}eto soevi moè dase kupat od nabavuva~i kako {to e Xekson laboratorijata vo Bar Harbor, Mein. Isto taka, genetski ~isti soevi se sozdavat kaj staorcite, zamor~iwata,hr~acite, zajacite i doma{nata ìvina. Bidej}i genetski ~istite soevi na ìvotni genetski se identi~ni (singeni~ni) vo ramkite na toj vid, nivniteimuni reakcii moè da se prou~uvaat bez prisustvo na promeni koi nastanuvaat kako rezultat od individualnite genski razliki, - {to pretstavuvaneproceliva pridobivka. Kaj genetski ~istite soevi, limfocitnite subpopulaci koi se izolirani od edno ìvotno moè da se vnesuvat vo drugoìvotno od istiot vid, bez da pottiknuvaat imun odgovor. Ovoj vid na eksperimentalen sistem im ovozmoì na imunolozite prvi da pokaàt dekalimfocitite od ìvotno koe bilo vo kontakt so protivgen moè da prenesat imunitet na singeni~en primatel koj ne bil vo kontakt so toj protivgen.

Sistemite za steknat prenos ovozmoùvaat in vivo ispituvawe na izolirani kleto~ni populaciiVo nekoi eksperimenti, va`no e da se otstrani imunolo{kata nereaktivnost na singeni~niot doma}in, za izolirano da moè da se prou~uva samoreakcijata na prenesenite limfociti. Ova moè da se postigne so tehnika nare~ena steknat prenost (zdobien transfer): prvo, singeni~niot doma}in seizloùva na rendgensko zra~ewe koe gi ubiva negovite limfociti, potoa se vnesuvaat imunite kletki od daritelot. Podloùvaweto na glu{ecot navisoki dozi na rendgensko zra~ewe (650-750 radi) moè da ubie 99,99% od negovite limfociti, po {to aktivnosta na limfocitite koi se presadeni odslezina na singeni~en daritel moè da se prou~uva bez me{awe na limfocitite na doma}inot. Ako hematopoetskite kletki na doma}inot moè davlijaat vrz eksperimentot so zdobien transfer, toga{ za otstranuvawe na celiot hematopoetskin sistem se koristat povisoki nivoa na rendgenskizraci (900 1000 radi) Gluvcite koi se ozra~eni so takvi dozi }e umrat dokolku ne primat koskena srcevina od singeni~en daritelzraci (900-1000 radi). Gluvcite koi se ozra~eni so takvi dozi }e umrat dokolku ne primat koskena srcevina od singeni~en daritel.Sistemot na zdobien transfer im ovomoì na imunolozite da go prou~uvaat razvojot na injektiranite limfoidni zarod{ni kletki vo razni organi naprimatelot i go olesni prou~uvaweto na razni populacii na limfociti i kleto~nite me|udejstva koi se potrebni za sozdavawe na imun odgovor. Naprimer, takvite eksperimenti za prvpat im ovozmoìja na imunolozite da pokaàt deka T pomaga~ka kletka e potrebna za aktivirawe na B kletki prihumoralniot odgovor. Vo ovie eksperimenti, zdobieniot transfer na pro~isteni B kletki ili pro~isteni T kletki ne dovede do sozdavawe protivtelakaj ozra~eniot doma}in. Samo koga dvete populacii bile preneseni se sozdale protivtela vo odgovor protiv protivgen.

3

Sistemi za kultivirawe na kletkiSloènosta na kleto~nite reakcii koi sozdavaat imun odgovor gi natera imunolozite mnogu ~esto da se potpiraat na raznite vidovi in vitro sistemi za kultivirawe na kletkite.Golem broj razli~ni kletki moè da se kultiviraat, vklu~uvaj}i gi prvi~nite limfoidni kletki, kloniranite limfoidni kletki i hibridnite kletki.r j r u r u u j r f r f r

Prvi~nite limfoidni kleto~ni kulturi potekuvaat od krv ili od limfoidni organiKleto~ni kulturi od prvi~ni limfoidni kletki moè da se dobijat so izolirawe na limfociti direktno od krvta ili limfata, ili pak od razni limfoidni organi so raskinuvawe natkivoto. Potoa limfocitite moè da se kultiviraat vo hemiski-definiran osnoven medium (koj sodrì rastvori na soli, {e}eri, amino kiselini, vitamini, elementi vo tragi i drugihranlivi materii) na koj se dodavaat razli~ni dodatoci od serum. Za odredeni eksperimenti, se upotrebuvaat mediumi koi ne vklu~uvaat serum. Bidej}i in vitro tehnikite zakultivirawe baraat od 10-100 pati pomalku limfociti od tipi~nite in vivo tehniki, tie im ovozmoìja na imunolozite da procenuvaat funkcionalni svojstva na pomali subpopulaciina limfociti. Na primer, imunolozite so pomo{ na tehnikite za kultivirawe na kletki najprvo gi otkrija funkcionalnite razliki pome|u KD4 T pomaga~kite kletki i KD8 Tcitotoksi~nite kletki.Isto taka, tehniki za kultivirawe na kletki bea koristeni za utvrduvawe na brojni citokini koi se vklu~eni so aktiviraweto, rastot i diferenciraweto na raznite kletki koi sevklu~eni vo imuniot odgovor. Ranite eksperimenti pokaàa deka mediumi koi se pod vlijanie, ili modificiran so rast na razni limfociti ili protivgen-prikaùva~ki kletki }e gopoddràt rasteweto na drugi limfoidni kletki. Modificiraniot medium sodrì produkti koi se la~at od kletkite koi aktivno rastat. Golem del od poedine~nite citokini koi gikarakteriziraat razli~nite modificirani mediumi, posledovatelno se utvrdeni i pro~isteni, a vo golem broj slu~ai klonirani se genite koi gi kodiraat ovie citokini. Citokinitekoi igraat centralna uloga vo aktiviraweto i reguliraweto na imunot odgovor, se objasneti vo poglavje 12 i niz celata kniga.

Kloniranite limfoidni kleto~ni linii se zna~ajni alatki vo imunologijataKleto~na kultura od prvi~ni limfoidni kletki pretstavuva heterogena grupa na kletki koi moè da se odrùvaat kratko vreme. Ovaa heterogenost moè da go kompliciratolkuvaweto na eksperimentalnite rezultati. Za da se izbegnat ovie problemi, imunolozite koristat klonirani limfoidni kleto~ni linii i hribridni kletki.Normalnite kletki na cica~ite, vo osnova, pri kultivirawe imaat ograni~en ìvoten vek. Toa zna~i deka po odrededen broj delbi, karakteristi~ni za vidot i kleto~niot tip,r r u r r r r j r rkletkite zapiraat so delewe. Nasproti niv, tumorskite kletki ili zdravi kletki koi pretrpele transformacija, pottiknata od hemiski karcinogeni ili virusi, moàt neograni~enoda se razmnoùvaat vo kleto~ni kulturi, pa zatoa, se veli deka se besmrtni. Takvite kletki se narekuvaat kleto~ni lozi.Prvata kleto~na loza, - L kletkata od fibroblast od glu{ec, - bila dobiena vo 1940 godina, od kultivirano potko`no svrzno tkivo od glu{ec, so izloùvawe na kletkite na hemiskikarcinogen, metilholantren, vo period od 4 meseci. Vo 50-te godini od dvaesettiot vek, druga va`na loza na kletki, kletkite HeLa, be{e dobiena so kultivirawe na kletki od humancerivkalen kancer. Od ovie rani studii navamu, utvrdeni se stotici kleto~ni lozi, pri {to sekoja sekoja se sostoi od populacija na genski identi~ni (singeni~ni) kletki koi, prikultivirawe, moàt neograni~eno da se razmnoùvaat.gRazvojot na kloniranite limfoidni kleto~ni lozi na imunolozite im ovozmoì da prou~uvaat odreden broj na procesi koi pred toa ne moèa da se ispituvaat. Na primer,istraùvaweto na molekulskite procesi koi se vklu~eni vo aktiviraweto na neiskusnite limfociti od protivgen be{e popre~eno od niskata frekfencija na neiskusni B i T kletkikoi se specifi~ni za odreden protivgen, vo heterogena populacija od limfociti, molekulskite promeni koi nastanuvaat kaj soodvetna kletka ne moè da se otkrijat koga se opkruèniso 10 do 10 nereagira~ki kletki. Kloniraweto na T i B kletki so poznata protivgena specifi~nost na imunolozite im ovozmoì golemi homogeni kleto~ni populacii vo koi moàt dase prou~uvaat procesite koi se vklu~eni vo prepoznavaweto na protivgenite. Isto taka, razli~ni genetski promeni koi odgovaraat na razli~ni fazi od diferenciraweto moàt da seprou~uvaat kaj kleto~ni lozi koi se üzamrznatiû vo odredeni fazi od razvojot. Kleto~nite lozi isto taka se polezni za prou~uvawe na rastvorlivite faktori koi gi sozdavaatlimfoidnite kletki. Odredeni kleto~ni lozi la~at golemo koli~estvo na razni citokini, drugi vidovi prikaùvaat membranski receptori za odredeni citokini. Imunolozite gikoristat ovie kleto~ni lozi za pro~istuvawe na raznite citokini i nivnite receptori i podocna za klonirawe na genite koi gi kodiraat.So napredocite vo sozdavaweto na limfoidnite kleto~ni lozi doa|aat i odredeni ograni~uvawa. Vo tekot na prodolènoto kultivirawe spontano nastanuvaat varijanti, pri {to ~estoe poterbno subklonirawe za ograni~uvawe na kleto~nata heterogenost koja moè da se razvie. Ako so subklonirawe se selektiraat dve varijanti, mo`no e dvata subklona dobieni odistiot roditelski klon da pretstavuvaat razli~ni subpopulacii. Pokraj toa, sekoja kleto~na loza koja poteknuva od tumorskite kletki ili transformiranite kletki moè da imanepoznat genski pridones koj e karakteristi~en za tumorot ili transformiranite kletki. Spored toa, istraùva~ite mora da bidat vnimatelni koga izveduvaat rezultati dobieni odkleto~ni lozi za normalna, in vivo situacija. Me|utoa, transformiranite kleto~ni lozi ovozmoìja golem pridones za prou~uvaweto na imunot odgovor, a se pokaà deka golem broj namolekulski procesi koi bea otkrieni pri eksperimentite so transformirani kleto~ni lozi se slu~uvaat vo zdravite limfociti.u r c r r r r f r r u u dr f c

4

(slika 22-1 Sozdavawe na B- i T-kleto~ni hibridomi so hibridizacija na somatski kletki.Hibridomite koi se sozdavaat prikaùvaat del od genite na originalnite B i T kletki, noHibridomite koi se sozdavaat prikaùvaat del od genite na originalnite B i T kletki, noisto taka pokaùvaat svojstva na besmrtnost od tumorskata kletka. Ovaa postapka sekoristi za sozdavawe na B-kleto~ni hibridomi koi la~at monoklonski protivtela i T-kleto~ni hibridomi koi la~at razni faktori za rast.

Pripremawe hibridni limofoidni kleto~ni loziSo hibridizacijata na somatski kletki, imunolozite fuziraat zdravi B ili T limfociti sotumorski kletki, pri {to dobivaat hibridni kletki, ili heterokarioni, koi sodràt jadraod dvete roditelski kletki. Zagubata na del od hromozomite po slu~aen izbor iposledovatelnoto kleto~no razmnoùvawe sozdava klon od kletki koi sodràt edno jadro so

f bhromozomi od dvete fuzirani kletki; takviot klon e nare~en hibridom.Istoriski gledano, kleto~noto fuzirawe bilo pottiknato so virusot Sendai, no denesgeneralno se pravi so polietilen glikol. Normalni B kletki koi se tretirani so protivgenmoè da se fuziraat so tumorski plazma kletki, nare~eni mielomski kletki (slika 22-1).Hibridomota koja se formira na toj na~in prodolùva so prikaùvawe na geni zaprotivtelata od normalniot B limfocit, no e sposoben za neograni~en rast,karakteristika na mielomskata kletka. B-kleto~nite hibridomi koi la~at protivtela soedinstvena protivgena specifi~nost, nare~eni monoklonski protivtela poradi nivnotopoteklo od eden klon, temelno ja preobrazija imunologijata, no i biomedicinskiteistraùvawa i klini~kata laboratoriska rutina. Poglavjeto 4 vo detali gi opi{uva

( 4 25)postapkite za sozdavawe i primenite na monoklonskite protivtela (vidi slika 4-25).T-kleto~nite hibridomi, isto taka moè da se dobijat so fuzirawe na T limfociti sotumorski T-kleto~ni limfomi, kako {to e timomot kaj gluvci, BW5147. Povtorno,sozdadeniot hibridom prodolùva so prikaùvawe na genite od normalnata T kletka, no gisteknuva svojstvata za besmrten rast na tumorskata T limfomska kletka. Imunoloziteimaat sozdadeno odreden broj na stabilni hibridomski kleto~ni linii koi gi pretstavuvaatT-pomaga~kite i T-citotoksi~nite linii.

5

Biohemija na proteiniteStrukturata i funkciite na golem broj zna~ajni molekuli od imuniot sistem se odredeni soStrukturata i funkciite na golem broj zna~ajni molekuli od imuniot sistem se odredeni sobiohemiski proteinski tehniki i golem broj od ovie tehniki postojano se upotrebuvaat voeksperimentalnata imunologija. Na primer, fluorescentnoto i radioaktivnotoobeleùvawe na imunolozite im ovozmoùva da gi lokaliziraat i vizueliziraatmolekulskite aktivnosti, a mo`nosta za odreduvawe na takvi biohemiski osobini naproteinite kako {to se negovata golemina, forma i tri-dimenzionalna strukturaovozmoìja dobivawe zna~ajni informacii za razbirawe na funkciite na imunolo{kizna~ajnite molekuli.

Tehnikite so radioobeleùvawe ovozmoùvaat ~uvstvitelno otkrivawe na protivgeni iliprotivtelaRadioaktivnite obeleùva~i na protivgenot ili protivteloto se mo{ne ~uvstvitelni zaotkrivawe ili kvantifikacija. Postojat brojni na~ini za vnesuvawe na radioaktivniizotopi vo proteinite ili peptidite. Na primer, tirozinskite ostatoci moè da se ozna~atso radio-jod preku hemiski ili enzimski postapki. Ovie reakcii go prika~uvaat atomot najod na fenolskiot prsten od tirozinskata molekula. Edna od enzimskite tehniki zajodizacija, koja upotrebuva laktoperoksidaza, moè da obeleì proteini vrz plazmatskatamembrana od ìva kletka bez da gi obeleì proteinite od citoplazmata, {to ovozmoùvaprou~uvawe na proteinite od povr{inata na kletkite bez nivna izolacija od drugitekleto~ni sostojki.Obi~no radioobeleùvawe na kleto~nite proteini moè da se izvr{i so kultivirawekletki vo sredina koja sodrì edna ili pove}e radioobeleèni amino kiselini. Aminokiselinite koi se izbrani za ovaa upotreba se amino kiselinite koi se najmalku podlo`nina metabolna modifikacija za vreme na razvojot na kletkite, taka {to radioaktivniotobeleùva~ }e se pojavi vo kleto~niot protein namesto vo site kleto~ni sostavni delovi.Leucin koj e obeleèn so C ili H i cistein ili metionin ozna~en so S, se naj~estoupotrebuvanite amino kiselini za metabolno obeleùvawe na proteinite. Vo tabela 22-4 senavedeni del od svojstvata na radioizotopite koi se koristat vo imunite istraùvawa.

6

(slika 22-2 Ozna~uvawe na protivtelo so biotin. Podgotvenoto protivtelo seme{a so ester od biotin koj reagira so protivteloto Protivteloto koe na vakovme{a so ester od biotin, koj reagira so protivteloto. Protivteloto koe na vakovna~in e obeleèno so biotin moè da se koristi za otkrivawe na protivgeni vocvrst supstrat kako {to e bunar~eto na mikrotitrira~kata plo~ka. Pootstranuvaweto na nevrzanoto protivtelo so izmivawe, vrzanoto protivtelo moèda se otkrie so obeleèn avidin. Avidinot moè da e radioaktivno obeleèn ilipak da se povrze so enzim koj katalizira nekoja oboena reakcija, kako priprocedurata ELISA (vidi slika 6-10).

Obeleùvaweto so biotin go olesnuva otkrivaweto na mali koli~estva naproteiniproteiniVo odredeni slu~ai direktnoto obeleùvawe na protienite, osobeno so enzimi ilidrugi golemi molekuli, kako {to objasnivme vo poglavje 6, moè da predizvikadenaturacija i gubewe na aktivnosta. Zatoa, be{e sozdaden soodveten sistem zaobeleùvawe koj moè da se koristi vo kombinacija so tehnikite ELISA iELISPOT koi se objasneti vo poglavje 6. Ovaa tehnika za obeleùvawe go koristivisokiot afinitet na reakcijata pome|u vitaminot biotin i avidinot, golemamolekula koja moè da se obeleì so radioaktivni izotopi, so fluorescentnimolekuli ili so enzimi. Biotinot e mala molekula (244 Da) koja moè da se povrzeso protivtelo (ili so koja bilo proteinska molekula) so fina hemiska reakcijaso protivtelo (ili so koja bilo proteinska molekula) so fina hemiska reakcijakoja ne predizvikuva zaguba na aktivnosta na protivteloto. Po reagiraweto naprotivteloto so vrzan biotin vo sistemot za analiza, se vnesuva obeleèniotavidin, a vrzuvaweto se meri so otkrivawe na obeleùva~ot na molekulata naavidinot (slika 22-2). Reakcijata pome|u biotinot i avidinot e mnogu specifi~na iso tolku visok afinitet {to vrzuvaweto na dvete molekuli vo najgolem del odeksperimentalni uslovi e re~isi nepovratno.

7

(slika 22-3 Elektroforeza na gel. (a) Sandardna PAGE aparatura so katoda na vrvot i anoda na dnoto.Primerocite se apliciraat na vrvot na gelot, se polnat vo bunar~iwata za primerok, ar r c c r r , u r r r ,elektroforeza se postignuva so prenesuvawe struja od katodata kon anodata. (b) Elektroforetskatapodvi`nost, ili rastojanieto koe proteinite go pominuvaat za vreme na NDS-PAGE, e obratno-proporcionalno so logaritamot od negovata molekulska teìna. Molekulskata teìna na proteinotlesno se odreduva so logaritamot na negovoto rastojanie pri migracija so standardna kriva na koja senaneseni rastojanijata na migracija na grupa standardni proteini nasproti logaritmite na nivnitemolekulski teìni. (c) Izoleektri~noto fokusirawe, ili IEF, gi razdeluva proteinite samo popolne`. Protinite se stavaat vo stabilen rN gradient i elektroforetski se razdeluvaat. Sekojprotein migrira do negovata izoelektri~na to~ka, to~kata kade negoviot neto polne` e nula.

Elektroforezata na gel gi oddeluva proteinite po golemina i polne`Koga edna naelektrizirana molekula e podloèna na elektri~no pole vo komora za elektroforezaKoga edna naelektrizirana molekula e podloèna na elektri~no pole vo komora za elektroforeza,taa }e se pomesti kon sprotivno-naelektriziranata elektroda. Brzinata so koja naelektriziranatamolekula se pomestuva vo postojano elektri~no pole (nejzinata elektroforetska podvi`nost) zavisiod dva faktori koi se specifi~ni za molekulata: prviot e znakot i goleminata na nejziniot netoelektri~en polne`, a drugiot e nejzinata golemina i forma. Ako site drugi faktori se ednakvi, oddve molekuli so ednakva golemina, onaa so povisok neto polne`, poradi molekulskite svojstva zapresejuvawe na cvrstata sredina, }e se dviì pobrzo vo postojnoto elektri~no pole. Isto taka, sledideka malite molekuli }e se dviàt pobrzo od golemite so ist neto polne`. Iako postojat isklu~oci,kade formata na molekulata moè da go zgolemi ili namali trieweto pri dvièweto i da bidepri~ina za atipi~na migracija, ovie op{ti principi vaàt za site elektroforetski razdeluvawa.Pove}eto elektroforetski razdeluvawa ne se sproveduvat vo sloboden rastvor, tuku vo stabilnapotporna sredina, kako {to e gelot. Najpopularniot gel vo laboratoriite za istraùvawepotporna sredina, kako {to e gelot. Najpopularniot gel vo laboratoriite za istraùvawepretstavuva polimerizirana i vkrsteno-povrzana forma na akrilamid. Razdeluvaweto napoliakrimidnite gelovi, koe obi~no se narekuva poliakrilamid gel elektroforeza (PAGE), moè dase koristi za analiza na proteini ili nukleinski kiselini (slika 22-3a).

8

SLIKA 22-4 Dvodimenzionalna gel elektroforeza na vkupni kleto~ni proteini od timociti na glu{ec obeleàni so 35S-metionin. Na ovie proteini prvo im bilo izvr{eno izoelektri~no fokusirawe (nasokata na migracijata e ozna~ena so crvenar r r r f u r ( r c j crstrelka), a potoa fokusiranite proteini bile razdvoeni so NDS-PAGE (nasokata na migracijata e ozna~ena so sina strelka).Gelot bil izloèn na rendgenski zraci za da se otkrijat obeleànite proteini.[Prezemeno od B. A. Ozborn (B. A. Osborne.]

Pri edna voobi~aena primena, elektroforezata na proteini vrz poliakrilamidniot gel se izvr{uva vo prisustvo na detergentotnatrium deodecil sulfat (NDS). Ovoj metod, poznat kako NDS-PAGE, e relativno prost, no visoko efikasen na~in za razdeluvawena me{avinite na protini vrz osnova na goleminata. NDS pretstavuva negativno-naelektriziran detergent koj se vrzuva zaproteinot vo koli~estva koi se proporcionalni so dolìnata na proteinot. Ova vrzuvawe ja uni{tuva karakteristi~natavtori~na i treti~naa struktura na proteinot, transformiraj}i go vo negativno-naelektrizirana pra~ka. Proteinot se vrzuva zatolku mnogu negativno naelektrizirani NDS molekuli, {to negoviot vnatre{en polne` stanuva nezna~itelen vo sporedba so netopolneòt na molekulite NDS. Zatoa, tretman na me{avina od proteini so NDS gi transformira vo grupa od pra~ki ~ijelektri~en polne` e proporcionalen so nivnata molekulska teìna. Ova ima dve isklu~itelno polezni posledici. Prvo, moè da

V fse razdelat delovite od me{avinata na proteinite spored nivnata molekulska teìna. Vtoro, poradi elektroforetskatapodvi`nost, rastojanieto koe go minuvaat razli~nite proteini za vreme na NDS-PAGE, e obratno-proporcionalno so logaritamotna negovata molekulska teìna, toa rastojanie pretstavuva merka za negovata molekulska teìna. Za vizualizirawe na lokaciitena protinite, gelot se boi so boja koja reagira so proteinot. Potoa, rastojanieto koe go pominal proteinot se sporeduva sorastojanijata koi gi pominala grupa na standardni proteini (slika 22-3b).

So druga elektroforetska tehnika, izoelektri~no fokusirawe (IEF), proteinite se odvojuvaat samo vrz baza na nivniot polne`.Ovoj metod za zasnova na faktot deka edna molekula }e se dviì vo elektri~noto pole sè dodeka ima neto pozitiven ili negativenpolne`; molekulite so ednakov broj negativni i pozitivni polneì, odnosno molekulite koi imaat neto polne` ednakov na nula,nema da se dviàt. Pri pove}eto pH vrednosti, proteinite (koi karakteristi~no imaat opredelen broj negativni i pozitivnipolneì) imaat ili neto pozitiven ili neto negativen polne`. Me|utoa, za sekoj protein postoi opredelena pH vrednost, nare~enanegova izoelektri~na to~ka (pI), pri koja toj protein ima ednakov broj pozitivni i negativni polneì. Vo izoelektri~notofokusirawe se koristat supstancii {to sodràt gel, nare~eni transportni amfoliti, koi se rasporeduvaat vo kontinuiran pHf u r r u r r r r f r r u u rgradient koga }e se najdat vo elektri~no pole. Koga edna me{avina od proteini }e se stavi vo takov gel i }e se izvr{ielektroforeza, sekoj protein se dviì sè dodeka ne ja dostigne to~kata vo gradientot koga pH na gelot }e bide ednakva na negovataizoelektri~na to~ka. Potoa proteinot prestanuva da se dviì zatoa {to negoviot neto polne` e nula. Izoelektri~notofokusirawe e mnogu neèn i efikasen na~in za odvojuvawe na razli~ni proteini (slika 22-3v).

Vo eden metod poznat kako dvodimenzionalna gel elektroforeza se kombiniraat pridobivkite od NDS-PAGE i odizoelektri~noto fokusirawe vo eden od najsenzitivnite i najdiskriminatorni na~ini za analizirawe na me{avina od proteini.Vo ovoj metod, me{avinata prvo se podloùva na izoelektri~no fokusirawe na IEF gel, so {to se odvojuvaat molekulite vrz bazana nivnite izoelektri~ni to~ki bez ogled na molekulskata masa. Ova e prvata dimenzija. Sleden ~ekor e da se postavi IEF gelotpo dolìnata na NDS-poliakrilamid plo~ata (t.e. namesto bunar~iwata so primeroci od slika 22-3a) i da se izvr{i NDS-PAGE.Vo podgotovkata za ovoj ~ekor, site proteini reagiraat so NDS i zatoa migriraat nadvor od gelot i niz NDS-PAGE plo~ata vozavisnost od nivnite molekulski masi. Ova e vtorata dimenzija. Pozicijata na proteinite vo dobieniot dvodimenzionalen gelmoè da se vizuelizira na razli~ni na~ini Vo najmalku senzitivnoto testirawe gelot se boi so boja {to se vrzuva za proteinimoè da se vizuelizira na razli~ni na~ini. Vo najmalku senzitivnoto testirawe, gelot se boi so boja {to se vrzuva za proteini(kako {to e Kumasi (Coomassie) sino). Ako proteinite se obeleèni so radioaktiven obeleùva~, moè da se koristiposenzitivniot metod avtoradiografija. Kako alternativa, boeweto so srebro e metod so golema senzitivnost vo koj se koristisposobnosta na proteinite da gi reduciraat jonite na srebroto do lesno vidlivi depoziti od metalno srebro. Na kraj, moè da seprimeni imunodamkosuvawe-damkosuvawe na proteinite vrz membrana i nivna detekcija so protivtelo (v. sl. 6-12) za da se locirapozicijata na specifi~nite proteini vo dvodimenzionalni gelovi dokolku ima dostapno soodvetno protivtelo. Na slika 22-4 edadena avtoradiografija na dvodimenzionalen gel na obeleàni proteini od timociti na glu{ec.

9

Slika 22-5 Rendgenska kristalografija. (a) [ematski dijagram na eksperiment so rendgenska kristalografija vo koj snop od rendgenski zraci go bombardira kristalot i se otkrivaatrasprskanite zraci. (b) Del od obrazec na difrakcija na rendgenski zraci od kristal na IgG2a na glu{ec. (v) Del od mapa na elektronska gustina na IgG2a od glu{ec. [Del a od L. Styer,1995 Biochemistry 4th ed ; del b i del c prezemeni od A McPherson ]1995, Biochemistry, 4th ed.; del b i del c prezemeni od A. McPherson.]

Rendgenskata kristalografija obezbeduva strukturni informacii

So svetlosna mikroskopija se dobieni golem broj informacii za strukturata na kletkite, delovi od kletkite, pa duri i za molekulite. Mikroskopot koristi le}a za da se fokusirazra~eweto i da se formira slika otkako toa }e pomine niz primerokot. Me|utoa, prakti~no ograni~uvawe na svetlosnata mikroskopija pretstavuva ograni~enata rezolucija. Sozra~ewe so odredena branova dolìna ne moàt da se prikaàt strukturnite karakteristiki koi se za okolu edna polovina pomali od negovata branova dolìna. Poradi toa {tonajkratkata branova dolìna na vidlivata svetlina iznesuva okolu 400 nm, duri i najdobrite svetlosni mikroskopi imaat teoretsko ograni~uvawe na rezolucijata na ne pomalku od 200nm.

Poradi mnogu pokratkata branova dolìna (0,004 nm) na elektronot pri voltaì {to obi~no se koristat kaj elektronskata mikroskopija, teoretskoto ograni~uvawe na rezolucijata naelektronskiot mikroskop iznesuva okolu 0,002 nm. Ako be{e mo`no da se izgradi instrument {to vsu{nost bi se pribliìl na ovaa granica, elektronskiot mikroskop }e moè{elesno da se koristi za da se utvrdi detalnata atomska struktura na biolo{kite molekuli, zatoa {to sostavnite atomi se odvoeni so rastojanie od 0,1 nm do 0,2 nm. Vo praksa, aberaciitekarakteristi~ni za funkcioniraweto na magnetnite le}i {to se koristat za vizuelizacija na elektronskiot snop ja ograni~uvaat rezolucijata na okolu 0,1 nm (1 Å). Ovaa prakti~nagranica moè da se dostigne pri ispituvawe na odredeni primeroci, osobeno na metali. Me|utoa, i drugi faktori, kako {to e podgotovkata na primerokot i kontrastot, ja ograni~uvaatrezolucijata za biolo{ki materii na okolu 2 nm (20 Å). Zatoa, za da ja utvrdime strukturata na molekulskite atomi mora da se osvrneme na rendgenskite zraci, forma naelektromagnetna radijacija {to se generira vo branovi dolìni so golemina na me|uatomskite rastojanija. Iako ne postojat mikroskopi so le}i {to moè da gi fokusiraatrendgenskite zraci vo sliki, so rendgenskata kristalografija moè da se otkrie molekulskata struktura na isklu~itelno detalno nivo.

Rendgenskata kristalografija se bazira na analiza na difrakcijata {to se sozdava so rasprskuvaweto na snop od rendgenski zraci koga tie pominuvaat niz kristal. Stepenot do kojodreden atom gi rasprskuva rendgenskite zraci zavisi od negovata golemina. Atomite kako jaglerod, kislorod ili azot gi rasprskuvaat rendgenskite zraci pove}e otkolku atomite navodorod, a pogolemite atomi, kako èlezoto, jodot ili ìvata, davaat pogolemo rasprskuvawe. Rendgenskite zraci se forma na elektromagnetni branovi; kako {to se preklopuvaatrasprskanite branovi, taka naizmeni~no interferiraat eden so drug i se zasiluvaat eden so drug. So soodvetno postaven detektor se registrira obrazec na to~ki (obrazec nadifrakcija) ~ija rasprostranetost i intenzitet zavisi od strukturata na difraktira~kiot kristal. Ovaa vrska pome|u strukturata na kristalot i obrazecot na difrakcijata e osnovaza rendgenskata kristalografska analiza. Sleduva pregled na postapkite {to se koristat:

Dobivawe na kristali na odnosniot protein. Za onie lica koi ne gi iskusile frustraciite na kristalizacijata na proteini, ova moè da izgleda kako bezna~aen i sporeden ~ekor nainaku visoko sofisticiran proces. No, ne e taka. Postoi golema razlika od eden do drug protein vo odnos na uslovite koi se potrebni za da se sozdadat kristali so soodvetna goleminai geometriska forma pogodni za rendgenska difrakciska analiza. Na primer, mioglobinot formira kristali vo period od nekolku dena pri pH = 7 vo 3 M rastvor na amonium sulfat,no za human IgG1 dobro funkcionira 1,5 M amonium sulfat pri pH = 4. Ne moè da se primeni nitu edna odredena formula, a licata {to se konzistentno uspe{ni vo ovaa oblast seistrajni, odlu~ni i, kako i poznatite gotva~i, umeat da go podgotvat vistinskiot „sos”.

Izbor i postavuvawe. Najmalata dimenzija na kristalnite primeroci mora da iznesuva barem 0,1 mm i retko treba da se nadminuvaat nekolku milimetri vo koja bilo dimenzija. Otkako}e se izbere, kristalot se stava vo kapilarna cevka zaedno so rastvorot od koj e dobien kristalot („mati~na te~nost”). So ova se spre~uva su{ewe na kristalot i se odrùva sodrìnatana rastvoruva~ot, a toa e va`no za odrùvawe na vnatre{nata organiziranost na primerokot. Potoa kapilarnata cevka se stava vo uredot za difrakcija.

Generirawe i registrirawe na obrazec na distrakcija. Precizno postaveniot kristal potoa se ozra~uva so rendgenski zraci so poznata branova dolìna sozdadeni od zabrzanielektroni kon bakarna povr{ina na rendgenska cevka. Koga snopot rendgenski zraci }e se sudri so kristalot, del od zracite prodolùvaat pravo niz nego, a drug del se rasprskuvaat; sor r r r d c r d r c udr r , d d r c r d u r , dru d r r u ;senzitivni detektori se registrira pozicijata i intenzitetot na rasprskaniot snop zraci kako obrazec od to~ki (sl. 22-5a, b).

Tolkuvawe na obrazecot na difrakcija. Centralen del na analizata na difrakcijata e matemati~kata dedukcija na detalnata struktura {to bi go predizvikala zabeleàniot obrazecna difrakcija. Mora da se presmeta do koj stepen rasprskanite branovi od sekoj atom se kombinirani za da se zasilat ili poni{tat eden so drug i da go predizvikaat neto intenzitetotzabeleàn za sekoja to~ka vo nizata. Sloènite obrasci na difrakcija predizvikuvaat te{kotii vo tolkuvaweto zatoa {to branovite se razlikuvaat vo odnos na fazata, vremeto me|umaksimumite i minimumite. Poradi toa {to zabeleàniot obrazec e neto rezultat od interakcija na mnogu branovi, informaciite za fazata se mnogu va`ni za da se presmetaraspredelenosta na elektronskite gustini koja odgovara na ovoj rezultat. Re{enieto na ovoj „fazen problem” se pojavuva kako glavna pre~ka vo derivacijata na struktura na sekojasloèna molekula so visoka rezolucija.

Problemot se re{ava so derivatizacija na proteinot- so negovo modificirawe preku dodavawe na te{ki atomi, kako na primer ìva, a potoa so dobivawe na kristali koi imaatednakva geometrija (koi se izomorfni) so kristalite od nederivatiziraniot protein. Se dobiva obrazecot na difrakcija na izomorfniot kristal i se sporeduva so obrazecot naprvobitniot protein. Obi~no, ako eden istraùva~ ima golemo znaewe za obrascite na difrakcija na dva ili pove}e izomorfni derivati na te{ki atomi, toj moè da gi presmetafazite na prvobitniot protein spored karakteristi~nite obrasci na difrakcija sozdadeni od strukturata na te{kite atomi. Otkako }e se utvrdat fazite, moè da se premine napresmetuvawe na raspredelbata na gustinata na elektronite. Toa se pravi so Furierova (Fourier) sinteza, matemati~ka postapka osobeno soodvetna za analiza na periodi~nifenomeni, kako fenomenite koi se odnesuvaat na branovi. Vo na{iot slu~aj se koristi za da se presmeta raspredelenosta na elektronskata gustina po x, y i z oskata vo elementarnatakletka na kristalot. Izvedenata elektronska gustina potoa moè da se vizuelizira na kompjuter. (sl. 22-5v).

Izveduvawe na strukturata. Rezolucijata na eden model zavisi od golem broj faktori. Prvo, krajnata mo`na rezolucija e odredena od kvalitetot na kristalot i od vnatre{natastruktura na kristalot Duri i najkvalitetnite kristali imaat mal stepen na vnatre{no naru{uvawe koe ja ograni~uva rezolucijata za okolu 2 Å Vtoro mnogu vaèn faktor e brojotstruktura na kristalot. Duri i najkvalitetnite kristali imaat mal stepen na vnatre{no naru{uvawe koe ja ograni~uva rezolucijata za okolu 2 Å. Vtoro, mnogu vaèn faktor e brojotna intenzitetite vo Furierovata sinteza. Relativno mal broj to~ki moè da sozdadat slika so niska rezolucija (6 Å) na koja se gleda pravecot na polipeptidnata veriga, no koja davamal broj dopolnitelni strukturni informacii. Od druga strana, so obrabotka na podatocite dobieni od desetici iljadi to~ki se ovozmoùva iscrtuvawe na mnogu detalni mapi zaelektronskata gustina. Ako pretpostavime deka edno lice ja poznava aminokiselinskata sekvenca na proteinot, ovie mapi }e go naso~at da izgradi trodimenzionalni modeli so visokarezolucija. Podatocite za aminokiselinskite sekvenci se neophodni zatoa {to moè da bide te{ko, a vo nekoi slu~ai i nevozmo`no, jasno da se napravi razlika me|u nekoi strani~nisinxiri na aminokiselinite duri i na najdetalnite mapi za elektronskata gustina.

Od 1960 g. navamu, koga bea dobieni prvite detalni strukturi na proteinite, otkrieni se strukturite na iljadnici proteini. Vo niv spa|aat od mnogu mali i (relativno) ednostavniproteini, kako {to e lizozimot, so edna polipeptidna veriga, do poliovirusot od 8 500 000 daltoni, za~uduva~ki sloèn nukleoprotein sostaven od RNK obvitkana so brojni kopii na~etiri razli~ni polipeptidni podedinici. Od osobeno zna~ewe za imunolozite e golemiot broj na imunolo{ki zna~ajni molekuli za koi sega ima dostapni detalni kristalnistrukturi. Vo niv spa|aat imunoglobulinite, pove}eto glavni i sporedni proteini vo GTK i T-receptorskite kompleksi i mnogu drugi zna~ajni imunolo{ki makromolekuli, a sekojmesec se pojavuvaat novi strukturi i strukturni varijanti.

10

Tehnologija na rekombinantna DNKRazli~nite tehniki nare~eni tehnologija na rekombinantna DNK imaat vlijaanie vrz site sferi odRazli~nite tehniki nare~eni tehnologija na rekombinantna DNK imaat vlijaanie vrz site sferi odimunite istraùvawa. Genite moè da se kloniraat, DNK moè da se sekvencionira, a rekombinantniproteini moè da se sozdadat, so {to na imunolozite im se ovzomoùvaat definirani komponenti zaispituvawe na strukturata i funkcijata na imuniot sistem na molekulsko nivo. Vo ovoj del nakratkose opi{uvaat nekoi od rekombinantnite DNK tehniki {to voobi~aeno se primenuvaat voimunolo{kite istraùvawa; niz knigata se dadeni konkretni primeri za nivnata primena.

Restrikciskite enzimi ja rascepuvaat DNK vo specifi~ni sekvenciGolem broj bakterii sozdavaat enzimi nare~eni restrikciski endonukleazi koi ja razgraduvaattu|ata DNK (na pr. bakteriofagna DNK), no ja za~uvuvaat DNK od bakteriskite kletki, koja sodrìmetilirani ostatoci. Otkrivaweto na ovie bakteriski enzimi vo 1970-ite otvorilo pat za golem

j jtehnolo{ki napredok na poleto na molekulskata biologija. Pred da se otkrijat restrikciskiteendonukleazi, dvoveri`nata DNK (dsDNA) moèla da se rasekuva samo so DN-azi. Ovie enzimi neprepoznavaat definirani mesta i zatoa proizvolno ja raskinuvaat DNK na razli~ni serii od malifragmenti, koi ne moè da se rasporedat spored golemina ili sekvenca. Od druga strana,restrikciskite endonukleazi ja prepoznavaat i ja rascepuvaat DNK na specifi~ni mesta, nare~enirestrikciski mesta, koi se kratki dvoveri`ni segmenti so specifi~na sekvenca koja sodrì ~etirido osum nukleotidi (tabela 22-5).Restrikciskata endonukleaza gi se~e dvete DNK ni{ki vo specifi~na to~ka vo ramkite narestrikciskoto mesto. Nekoi enzimi, kako {to e HpaI, ja se~at centralnata oska i taka sozdavaatfragmenti so tap kraj. Drugi enzimi, kako {to e EcoRI, ja se~at DNK vo razdvoeni to~ki vo mestoto naprepoznavawe. Vo ovoj slu~aj, krajniot del na sekoj prese~en fragment e kratok segment naednoveri`na DNK nare~en lepliv” kraj Koga }e se prese~at dve razli~ni DNK molekuli so istiotednoveri`na DNK, nare~en „lepliv kraj. Koga }e se prese~at dve razli~ni DNK molekuli so istiotrestrikciski enzim koj pravi razdvoeno presekuvawe, leplivite kraevi na fragmentite sekomplementarni; vo soodvetni uslovi, fragmentite od dvete molekuli moè da se povrzat sosparuvawe na bazite za da se sozdade rekombinantna DNK molekula. Izolirani se nekolku stoticirazli~ni restrikciski endonukleazi, a mnogu od niv se dostapni na pazarot, so {to im se ovozmoùvana istraùva~ite da kupuvaat enzimi {to ja se~at DNK na definirani restrikciski mesta.

11

SLIKA 22-6 Klonirawe na cDNA so primena na plazmiden vektor. Plazmid {to sodrì mesto za po~etok na replikacija i gen za rezistentnost naampicilin e prese~en so restrikciska endonukleaza {to sozdava tapi kraevi. Po dodavawe na poli-C opa{ka na 3´ kraevite na kDNK i na

G 3´ DNK DNKkomplementarna poli-G opa{ka na 3´ kraevite na prese~eniot plazmid, dvete DNK se me{aat, se prilepuvaat i se povrzuvaat so DNK ligaza so {to seformira rekombinantniot plazmid. Apsorpcijata na rekombinantniot plazmid vo kletkite na E. coli se stimulira so visoki koncentracii na CaCl2.Transformacijata e so niska stapka, no transformiranite kletki moè da se selektiraat vo prisustvo na ampicilin. [Prilagodeno od H. Lodish et al.,1995, Molecular Cell Biology, 3rd ed. Scientific American Books.]

DNK sekvencite se kloniraat vo vektori

Razvojot na tehnologijata za DNK klonirawe vo 1970-ite ovozmoìl amplifikacija na daden DNK fragment do stepen do koj moè da se sozdadatneograni~eni koli~ini na identi~ni DNK fragmenti (klonirana DNK).

Vektorite za klonirawe se korisni za replikacija na definirani DNK sekvenci

Pri DNK klonirawe, daden DNK fragment se vmetnuva vo avtonomno replicira~ka DNK molekula, nare~ena klonira~ki vektor, taka {to vmetnatataDNK se replicira so vektorot. Kako vektori se koristat razli~ni virusi, me|u koi bakteriski virusi, virusi od insekti i retrovirusi od cica~i.Bakteriski virus {to ~esto se koristi kako vektor e bakteriofagot lambda (λ) Dokolku vo bakteriofagot lambda se insertira gen i dobieniotBakteriski virus {to ~esto se koristi kako vektor e bakteriofagot lambda (λ). Dokolku vo bakteriofagot lambda se insertira gen i dobieniotrekombinanten lambda bakteriofag se koristi za inficirawe na E. coli, bakteriite }e go prikaùvaat vmetnatiot gen.

Drug ~est vid na klonira~ki vektori se plazmidite. Plazmid e mala, kru`na, ekstrahromozomska DNK molekula {to nezavisno se replicira vo ednakletka-doma}in; za DNK klonirawe, kako doma}in naj~esto se koristi E. coli. Op{to zemeno, DNK {to treba da se klonira se vmetnuva vo plazmid {tosodrì gen za antibiotska otpornost (rezistentnost). Otkako rekombinantniot plazmid }e se inkubira so bakteriskite kletki, kletkite {to gosodràt rekombinantniot plazmid moè da se selektiraat spored nivnata sposobnost da rastat koga ima prisustvo na antibiotik.

Drug vid na vektor {to ~esto se koristi za klonirawe e kozmidniot vektor. Ovoj vid vektor e plazmid na koj mu e izvr{eno genetsko inènerstvo za dasodrì KOS mesta na lambda bakteriofagnata DNK, gen za antibiotska rezistentnost i mesto za po~etok na replikacijata. KOS mestata se DNKsekvenci koi ovozmoùvaat sekoja DNK so dolìna do 50 kb da se spakuva vo glavata na lambda bakteriofagot.

So klonirawe na kDNK i genomska DNK se ovozmoùva izolirawe na definirani sekvenci

Informaciskata RNK (mRNK) izolirana od kletki moè da se prepi{e vo komplementarna DNK (kDNK) so enzimot reverzna transkriptaza. kDNKmoè da se klonira ako se vmetne vo plazmiden vektor {to nosi gen koj prenesuva otpornost kon antibiotici, kako na primer ampicilin. Dobienatad r d r j r u r c , r r c Drekombinantna plazmidna DNK potoa se prenesuva vo specijalno tretirani kletki na E. coli so edna od nekolkute tehniki; procesot na prenesuvawe senarekuva transfekcija. Dokolku tu|ata DNK se vgradi vo kletkata-doma}in i se prikaè, za kletkata se veli deka e transformirana. Koga kletkite sekultiviraat na plo~i so agar {to sodràt ampicilin, }e preìveat i }e porasnat samo transformiranite kletki {to sodràt gen za rezistentnost konampicilin (sl. 22-6). Kolekcijata na DNK sekvenci vo plazmidnite vektori {to gi pretstavuvaat site mRNK sekvenci dobieni od kletka ili tkivo senarekuvaat kDNK biblioteka. kDNK bibliotekata se razlikuva od genomskata biblioteka zatoa {to gi sodrì samo sekvencite dobieni od mRNK,sekvencite {to pretstavuvaat prikaàni geni.

12

SLIKA 22-7 Klonirawe na genomska DNK so primena na bakteriofag lambda kakoS Avektor. Genomskata DNK delumno se digestira so Sau3A, so {to se sozdavaat

fragmenti so leplivi kraevi. Centralniot 15 kb region na lambdabakteriofagnata DNK se otsekuva so BamHI i se isfrla. Ovie dva restrikciskienzima sozdavaat komplementarni leplivi kraevi, taka {to genomskite i DNKfragmentite moè da se zdruàt i povrzat. Otkako dobienata rekombinantna DNK}e se spakuva vo glavata na lambda bakteriofagot, taa moè da se razmnoì vo E.coli.

Za genomsko klonirawe, klonirawe na celiot genom na edno ìvotno, se potrebnispecijalizirani vektori. Plazmidnite vektori od E. coli ne se prakti~ni zaklonirawe na site genomski DNK fragmenti {to so~inuvaat golem genom poradimalata efikasnost na transformiraweto na E. coli i maliot broj natransformirani kolonii {to moè da se otkrijat vo tipi~na petrieva plo~a.Namesto toa, se koristat klonira~ki vektori od bakteriofagot lambda zaklonirawe na genomski DNK fragmenti dobieni so se~ewe na hromozomskata DNKr D fr d r Dso restrikciski enzimi (sl. 22-7). Bakteriofagnata lambda DNKe dolga 48,5 kb isodrì centralen del od okolu 15 kb {to ne e neohoden za replikacija na lambdakaj E. coli i zatoa moè da se zameni so tu|a genomska DNK. Sè dodekarekombinantnata DNK ne ja nadmine so mnogu dolìnata na originalnata lambdabakteriofagna DNK, taa moè da se spakuva vo glavata na lambda bakteriofagot ida se razmnoì vo E. coli. Toa zna~i deka vo edna ~estica na lambda bakteriofagmoè da se kloniraat ne{to pove}e od 2,0 x 104 bazni parovi. Grupa lambda klonoviso site DNK sekvenci na daden vid se narekuva genomska biblioteka Potrebni seso site DNK sekvenci na daden vid se narekuva genomska biblioteka. Potrebni seokolu 1 milion razli~ni rekombinantni lambda bakteriofagni ~estici za da seformira genomska DNK biblioteka koja go pretstavuva celiot genom na cica~ite,koj sodrì 3 x 109 bazni parovi.

13

êsto, delot od DNK od 20 do 25 kb {to moè da se klonira vobakteriofagot lambda ne e dovolno dolg za da gi opfatiregulatornite sekvenci {to se protegaat nadvor od 5´ i 3´ krajot nadirektnite kodira~ki sekvenci na eden gen. Kako {to ve}e be{ekaàno, pogolemite genomski DNK fragmenti (so dolìna od 30 do 50kb) moè da se kloniraat vo kozmiden vektor. Rekombinantniotkozmiden vektor, iako ne e celosno funkcionalen bakteriofag, moàda ja inficira E coli i da se replicira kako plazmid so {to }e seda ja inficira E. coli i da se replicira kako plazmid, so {to }e sesozdade kozmidna biblioteka. Od neodamna, za pakuvawe na DNKfragmenti dolgi do 100 kb se koristi pogolem virus na E. coli, nare~enbakteriofag P1. Moè da se kloniraat i pogolemi DNK fragmenti,podolgi duri od 2000 kbp, vo kvasni ve{ta~ki hromozomi (YAC), koi selinearni DNK segmenti {to moè da se repliciraat vo kvasni kletki(tabela 22-6). Drug korisen vektor e BAC ili bakteriski ve{ta~ki( ) Dru r r rhromozom. BAC moàt da prifatat delovi od DNK dolgi od 100 do 300kb. Iako YAC prifa}aat pogolemi delovi na tu|a DNK, BAC polesnose razmnoùvaat i pretstavuvaat vektor od prv izbor vo mnogu obidiza klonirawe na golemi fragmenti.

14

SLIKA 22-8 Izbirawe na specifi~ni klonovi od kDNK ili od genomska DNK bibliotekaso in situ hibridizacija. Na plo~kata se postavuva nitroceluloza ili najlonski filter zaso in situ hibridizacija. Na plo~kata se postavuva nitroceluloza ili najlonski filter zada se soberat bakteriskite kolonii ili bakteriofagnite plaki {to gi sodràtkloniranite geni. Otkako filterot se stavi vo rastvor na NaOH i se zagree,denaturiranata evDNK se fiksira za filterot. So filterot se inkubira radioaktivnaproba specifi~na za odnosniot gen. Mestoto na koloniite ili plakite {to go sodràtposakuvaniot gen se otkriva so avtoradiografija.

DNK klonovite se selektiraat so hibridizacijaOtkako }e se podgotvi kDNK ili genomska DNK biblioteka, moè da se napravi skrining zada se utvrdi odreden DNK fragment so tehnika nare~ena in situ hibridizacija.K b b f jKloniranite bakteriski kolonii, kvasni kolonii ili bakteriofagnite plaki {to jasodràt rekombinantnata DNK se prenesuvaat na nitroceluloza ili na najlonski filtri soogledalno zasaduvawe (replica plating) (sl. 22-8). Filterot potoa se tretira so NaOH, {to gilizira bakteriite i ja denaturira DNK, so {to ovozmoùva ednoveri`nata DNK (ssDNA) dase vrze za filterot. Filterot so vrzanata DNK potoa se inkubira so radioaktivna probaspecifi~na za odnosniot gen. Probata }e hibridizira so DNK vo koloniite ili plakite nafilterot {to go sodràt baraniot gen i tie moè da se identifikuvaat soavtoradiografija. Mestoto na pozitivnite kolonii ili plaki na filterot pokaùva kademoè da se otkrijat soodvetnite klonovi na prvi~nata agar plo~a.Za skrining na bibliotekite moè da se koristat razli~ni radioaktivni probi. Vo nekoi

b RNK DNK D jslu~ai, kako proba sluì radiolo{ki markirana mRNK ili kDNK. Dokolku proteinot koj ekodiran od odnosniot gen e pro~isten i delumno sekvenciran, moè da se izvr{i obratnapostapka po~nuvaj}i od aminokiselinskata sekvenca za da se odredi verojatnatanukleotidna sekvenca na soodvetniot gen. Sè {to e potrebno za sintetizirawe naradiolo{ki markirani oligonukleotidni probi so koi se pravi skrining na kDNK ili nagenomskata biblioteka na odreden gen e poznata sekvenca od pet do {est aminokiselinskiostatoci. Za da se sovlada degeneriranosta na genetskiot kod, obi~no se izbiraat peptidnisegmenti {to sodràt aminokiselini kodirani od ograni~en broj kodoni. Potoa sesintetiziraat oligonukleotidi koi gi pretstavuvaat site mo`ni kodoni za peptidot i tiese koristat kako probi za skrining na DNK bibliotekata.

15

SLIKA 22-9 Sadernovoto damkosuvawe e tehnika za otkrivawe specifi~ni sekvenci vo DNKfragmenti. DNK fragmentite sozdadeni so se~ewe so restrikciska endonukelaza se odvojuvaat sporedfr D fr d d r r c d u d ju r dgoleminata so elektroforeza na agarozen gel. Agarozniot gel se pokriva so nitroceluloza ili sonajlonski filter i so debel plast hartija. Gelot potoa se stava vo rastvor od alkalni soli koi jadenaturiraat DNK. Kako {to hartijata ja vpiva vlagata, rastvorot odi niz gelot vo filterot i mu goprenesuva sekoj evDNK del na filterot. Ovoj proces se narekuva damkosuvawe (blotting). Otkako }e sezagree, filterot se inkubira so radiolo{ki markirana proba specifi~na za odnosnata sekvenca;DNK fragmentite {to hibridiziraat so probata se otkrivaat so avtoradiografija. [Prilagodenood J. Darnell et al., 1990,Molecular Cell Biology, 2nd ed., Scientific American Books.]

So Sadernovo damkosuvawe „Southern blotting” se otkriva DNK na dadena sekvencaDNK fragmentite sozdadeni so digestija so restrikciska endonukleaza moè da se odvojat vrz baza nadolìnata so elektroforeza na agarozen gel Kolku e pokratok fragmentot toj tolku pobrzo sedolìnata so elektroforeza na agarozen gel. Kolku e pokratok fragmentot, toj tolku pobrzo sedviì niz gelot. Za da se utvrdi sekoj del od DNK {to sodrì fragment so dadena genska sekvencamoè da se primeni elegantna tehnika razviena od E. M. Sadern (E. M. Southern) (sl. 22-9). Vo ovaatehnika, nare~ena Sadernovo damkosuvawe „Southern blotting”, DNK se rasekuva so restrikciskienzimi i fragmentite se odvojuvaat spored goleminata so elektroforeza na agarozen gel. Potoa gelotse natopuva vo NaOH za da se denaturira dvDNK, a dobienite evDNK fragmenti se prenesuvaat nanitroceluloza ili na najlonski filter preku kapilarno dejstvo. Po prenesuvaweto, filterot seinkubira so soodvetna radiolo{ki markirana proba specifi~na za odnosniot gen. Probata sehibridizira so fragment od evDNK {to go sodrì odnosniot gen i potoa so avtoradiografija seutvrduva mestoto {to gi sodrì ovie hibridizirani fragmenti. Analizata Sadernovo damkosuvaweigrala zna~ajna uloga vo otkrivawe na mehanizmot preku koj se sozdavaat raznovidni protivtela i T-kleto~ni receptori (v. sl. 5-2 i sl. 9-2).

So Nordernovo damkosuvawe „Northern blotting” se detektira mRNKNordernovo (severno) damkosuvawe „Nothern blotting” (imenuvano poradi sli~nosta so Sadernovodamkosuvawe) se koristi za da se detektiraat specifi~ni mRNK molekuli. Vo ovaa postapka, mRNKmolekulite prvo se denaturiraat za da se odvitkaat i da dobijat linearna forma. Potoa, mRNKmolekulite se odvojuvaat spored goleminana so elektroforeza i se prenesuvaat na nitrocelulozenfilter za koj mRNK se prilepuva. Filterot potoa se inkubira so obeleèna DNK proba i se praviavtoradiografija. Nordernovoto damkosuvawe ~esto se koristi za da se utvrdi kolku specifi~namRNK se prikaùva vo kletkite vo razli~ni uslovi. Zgolemeni nivoa na mRNK }e vrzatproporcionalno pogolem del od obeleènata DNK proba.

16

SLIKA 22-10 Polimerazno veri`na reakcija (PVR). DNK se denaturira voedine~ni verigi so kratok tretman so toplina a potoa se razladuva vo prisustvo naedine~ni verigi so kratok tretman so toplina, a potoa se razladuva vo prisustvo navi{ok od oligonukleotidni zapo~nuva~i komplementarni na DNK sekvencite {tose vo blizina na posakuvaniot DNK segment. Za da se kopira DNK od 3’ kraevite nazapo~nuv~ite se koristi DNK polimeraza rezistentna na toplina. Poradi toa {tosite komponenti vo reakcijata se stabilni na toplina, ciklusot na zagrevawe irazladuvawe moè da se povtoruva pove}e pati, a toa }e rezultira so naizmeni~notopewe i sinteza na DNK i brza amplifikacija na dadena sekvenca. [Prilagodenood H. Lodish et al., 1995,Molecular Cell Biology, 3rd ed., Scientific American Books.]

Polimerazno veri`nata reakcija amplificira mali koli~ini na DNKPolimerazno ver`nata reakcija (PVR) e mo}na tehnika za amplifikacija naspecifi~ni DNK sekvenci duri i koga tie se prisutni vo premnogu mali koli~iniili vo kompleksni me{avini (sl. 22-10). Za postapkata e potrebno da se znaat DNKsekvencite koi se nao|aat vo blizina na celnata DNK sekvenca za da moè da sesintetiziraat kratki oligonukleotidni zapo~nuva~i (prajmeri). DNK sme{atapotoa se denaturira vo edine~ni verigi so kratko zagrevawe. Potoa DNK serazladuva vo prisustvo na oligonukleotidni zapo~nuva~i vo vi{ok, koi sehibridiziraat so komplementarnata evDNK. Se dodava DNK polimerazarezistentna na toplina, zaedno so ~etirite deoksiribonukleotidni trifosfati isekoja veriga se kopira. Dvete verigi od novo-sintetiziraniot DNK dupleks serazdvojuvaat so zagrevawe i ciklusot se povtoruva. Vo sekoj ciklus doa|a doudvojuvawe na celnata DNK sekvenca; vo samo 25 ciklusi, posakuvanata DNKsekvenca moè da se amplificira okolu milion pati.Amplificiranata DNK so PVR potoa moè da se karakterizira so Sadernovodamkosuvawe so mapirawe so restrikciski enzimi i so direktno DNKdamkosuvawe, so mapirawe so restrikciski enzimi i so direktno DNKsekvencirawe. PVR tehnikata im ovozmoì na imunolozite da amplificiraat genikoi kodiraat proteini koi se va`ni za imuniot odgovor, kako {to se GTKmolekulite, T-kleto~niot receptor i imunoglobulinite.

17

SLIKA 22-11 Identifikacija na DNK sekvenci {to se vrzuvaat za protein so DNK otisoci i elektroforetsko ispituvawe na mobilnost. (a) Vo otios~nata tehnika, obeleènite DNKfragmenti {to sodràt pretpostavena promotorna ili zasiluva~ka sekvenca se inkubirani so i bez DNK-vrzuva~ki protein (na pr. Sp 1 protein, koj se vrzuva za „GC kutija”, region naDNK bogat so GC) Po tretiraweto na primerocite so DN-aza i po odvojuvaweto na verigite na dobienite fragmenti im se vr{i elektroforeza; potoa gelot se avtoradiografiraDNK bogat so GC). Po tretiraweto na primerocite so DN aza i po odvojuvaweto na verigite, na dobienite fragmenti im se vr{i elektroforeza; potoa, gelot se avtoradiografira.Prazno podra~je (stapalka) vo obrazecot na gelot e znak deka proteinot se vrzal za DNK. (b) Vo elektroforetskoto ispituvawe na mobilnosta, obeleàniot DNK fragment seinkubira so kleto~en ekstrakt {to sodrì prepi{uva~ki faktori. Elektroforetskata mobilnost na kompleksot DNK-protein e pobavna od mobilnosta na slobodnite DNKfragmenti.[Prilagodeno od J. D. Watson et al., 1992, Recombinant DNA, 2nd ed.,W. H. Freeman and Company.]

Analiza na DNK regulatorni sekvenci

Prepi{uva~kata aktivnost na genite e regulirana od promotornite i zasiluva~kite sekvenci. Ovie sekvenci se cis-dejstvuva~ki, a toa zna~i deka gi reguliraat samo genite na istaDNK molekula. Promotornata sekvenca se nao|a vo pred po~etokot na genot {to go regulira i sodrì TATA kutija, kade se vrzuva prepi{uva~kata ma{inerija, koja vklu~uva RNKpolimeraza 2 i zapo~nuva prepi{uvawe. Zasiluva~kata sekvenca ovozmoùva visoka stapka na prepi{uvawe so promotorot. Za razlika od promotorot, koj sekoga{ se nao|a pred genot{to go kontrolira, zasiluva~kiot element moè da se nao|a bilo kade vo odnos na genot (vo 5´ nasoka od promotorot, 3´ nasoka od genot, pa duri i vo intron na genot).

Aktivnosta na zasiluva~kite i promotornite sekvenci e kontrolirana od prepi{uva~kite faktori, koi se DNK-vrzuva~ki proteini. Ovie proteini se vrzuvaat za specifi~ninukleotidni sekvenci vo promotorite i zasiluva~ite i deluvaat ili za da ja zasilat ili za da ja namalat nivnata aktivnost. Zasiluva~kite i promotornite sekvenci i nivnite DNK-vrzuva~ki proteini se identifikuvaat so razli~ni tehniki, me|u koi so DNK otisoci (DNA footprinting), so elektroforetsko ispituvawe na mobilnost i so CAT analiza.

So DNK otisocite se identifikuvaat mestata kade proteinite se vrzuvaat za DNK

M DNK DNK ( 22 11 ) V j 32PMestata za vrzuvawe na DNK-vrzuva~kite proteini za zasiluva~ite i promotorite moè da se utvrdat so tehnika nare~ena DNK otisoci. (sl 22-11a). Vo ovaa tehnika, najprvo so 32P na5´ krajot radioaktivno se obeleùva kloniran DNK fragment {to sodrì pretpostavena zasiluva~ka ili promotorna sekvenca. Obeleànata DNK potoa se deli na dve frakcii:ednata frakcija se inkubira so jadren ekstrakt {to sodrì DNK-vrzuva~ki protein; drugata DNK frakcija ne se inkubira so ekstraktot. Potoa, dvata DNK primeroka se digestiraatso nukleaza ili so hemisko soedinenie {to proizvolno gi raskinuva fosfodiesternite vrski na DNK i verigite se odvojuvaat. Dobienite DNK fragmenti se stavaat na gel za da seodvojat fragmentite so razli~na golemina. Ako nema DNK-vrzuva~ki proteini, na elektroforezniot gel se dobiva celosna skala na lenti. Koga ima protein {to se vrzuva za nekoemesto na DNK fragmentot, toj pokriva del od nukleotidite i go za{tituva toj DNK del od digestija. Elektroforezniot obrazec na ovaa za{titena DNK }e sodrì prazni regioni (ilistapalki (otisoci = footprints). Sekoj otisok go pretstavuva mestoto vo ramkite na eden zasiluva~ ili promotor kade se vrzuva odreden DNK-vrzuva~ki protein.

So elektroforetsko ispituvawe na mobilnosta se identifikuvaat kompleksi DNK-protein

Koga proteinot }e se vrze za DNK fragment i formira kompleks DNK-protein, elektroforetskata mobilnost na DNK fragmentot vo gelot e namalena i predizvikuva promena vopozicijata na trakata {to go sodrì toj fragment. Ovoj fenomen e osnova za ispituvaweto na elektroforetskata mobilnost. Vo ovaa tehnika, radioaktivno obeleèna klonirana DNK{to sodrì zasiluva~ka ili promotorna sekvenca se inkubira so jadren ekstrakt {to sodrì DNK-vrzuva~ki protein (sl. 22-11b). Potoa se vr{i elektroforeza na kompleksot DNK-protein i negovata elektroforetska mobilnost se sporeduva so mobilnosta na kloniranata DNK bez vrzan protein. Promena na mobilnosta e znak deka proteinot se vrzal za DNK,zabavuvaj}i ja nejzinata mobilnost na elektroforezniot gel.

So analizi na luciferaza se meri prepi{uva~kata aktivnostSo analizi na luciferaza se meri prepi{uva~kata aktivnost

Eden na~in da se proceni aktivnosta na promotorot e preku genetski inènering i klonirawe na DNK sekvenca {to sodrì t.n. glasni~ki gen (reporter gene) prika~en za promotorotkoj se analizira. Koga ovaa sekvenca, ili konstrukt, }e se vnese vo eukariotskite kletki, prepi{uvaweto }e po~ne od promotorot ako e toj aktiven, a glasni~kiot gen }e se prepi{e inegoviot proteinski proizvod }e se sintetizira. So merewe na koli~inata na ovoj sozdaden protein moè da se odredi aktivnosta na promotorot. So predizvikuvawe na mutacii vosekvencata na promotorot, a potoa so ispituvawe na aktivnosta na promotorot so soodvetniot glasni~ki gen, vo promotorite se identifikuvani za~uvanite sekvencni motivi.

Pove}eto glasni~ki geni se izbiraat zatoa {to kodiraat proteini {to lesno moè da se izmerat, kako {to e svetkaviot enzim luciferaza, enzim {to katalizira reakcija vo koja seemituva svetlina - reakcija koja gi pottiknuva svetulkite da svetkaat vo temno. Kolku e promotorot poaktiven, tolku pove}e luciferaza }e se proizvede vo transfektiranata kletka.Aktivnosta na luciferazata se meri so dodavawe na nejzinot substrat, luciferin, i so merewe na emitiranata svetlina so luminometar. Drug poznat glasni~ki gen kodira zelenfluorescenten protein (GFP) a za nego se govori na krajot od ova poglavje.

18

SLIKA 22-12 Transfekcija na geni {to jo kodiraat alfa verigata i beta verigata od GTK klasa 2 vo fibroblastni L kletki na glu{ec {to normalnone gi sozdavaat ovie proteini. Sozdadeni se dva konstrukti {to sodràt eden GTK gen i izbran gen: genot za alfa verigata so genot za gvaninfosforibozil transferaza (gpt), koj prenesuva otpornost kon lekot G418, i genot za beta verigata so genot za neomicin (neo), koj prenesuva otpornostf f r r f r ( ), j r u r , r c ( ), j r u rkon mikofenolna kiselina. Po transfekcijata, kletkite se stavaat vo medium {to sodrì i G418 i mikofenolna kiselina. Ovaa selekcija }e japreìveat samo onie fibroblasti {to sodràt i neo i gpt geni (a posledovatelno i genite {to gi kodiraat alfa i beta verigite od GTK klasa 2). Vrznivnite membrani, ovie fibroblasti }e gi prikaùvaat dvete verigi na GTK na klasa 2.

Transfer na geni vo kletki od cica~iRazli~ni geni {to u~estvuvaat vo imuniot odgovor se izolirani i klonirani so primena na rekombinantni DNK tehniki. Prikaùvaweto iregulacijata na ovie geni e ispituvano so nivno vnesuvawe vo kultivirani kletki od cica~i i, od neodamna, vo zarodi{ni kletki od ìvotni.

Kloniranite geni koi se preneseni vo kultivirani kletki ovozmoùvaat in vitro analiza na funkcijata na geniteRazvieni se razli~ni tehniki za transfekcija na geni vo kletki. Edna od voobi~aenite tehniki vklu~uva koristewe na retrovirus vo koj virusenstrukturen gen e zamenet so kloniran gen {to treba da se transfektira. Izmenetiot retrovirus potoa se koristi kako vektor za vnesuvawe nakloniraniot gen vo kultiviranite kletki. Poradi karakteristikite na retrovirusite, rekombinantnata DNK se integrira vo kleto~niot genom sovisoka efikasnost. Vo drug alternativen metod, se pravi kompleks od odnosniot kloniran gen i kalcium fosfat. Kompleksot od kalcium fosfat i DNKbavno se precipitira vrz kletkite i mal procent od niv ja apsorbiraat DNK. So drug metod na transfekcija, nare~en elektroporacija, elektri~nastruja sozdava pori vo kleto~nite membrani niz koi se apsorbira kloniranata DNK. Vo dvata posledni metoda, transfektiranata DNK se integrira, voproizvolni mesta, vo DNK na mal procent tretirani kletki.Op{to zemeno, kloniranata DNK {to e transfektirana genetski se modifikuva za taa da sodrì gen- obeleùva~, kako na primer genot {to prenesuvaotpornost na neomicin. Po transfekcijata, kletkite se kultiviraat so neomicin. Poradi toa {to moè da porasnat samo transfektiranite kletki,maliot broj na transfektirani kletki vo vkupnata kleto~na populacija moè da se utvrdi i selektira.Transfekcijata na kloniranite geni vo kletkite se pokaà kako mnogu efikasna vo imunolo{kite istraùvawa. So transfekcija na geni {tou~estvuvaat vo imuniot odgovor vo kletkite koi imaat nedostig na tie geni moè da se ispituva produktot na eden specifi~en gen oddelno odproteinite koi se vo interakcija, a se kodirani od drugi geni. Na primer, transfekcijata na GTK geni, kontrolirana od soodvetni promotori, vofibroblastna kleto~na linija od glu{ec (L929, ili ednostavno L kletki) im ovozmoì na imunolozite da ja ispituvaat ulogata na GTK molekulite voprezentacijata na protivgeni na T kletkite (sl. 22-12). So transfekcija na genot {to go kodira T-kleto~niot receptor se obezbeduvaat informacii zaprotivgen- GTK specifi~nosta na T-kleto~niot receptor.Retrovirusite, koi moàt da go inficiraat re~isi sekoj tip na kletka od cica~, se voobi~aen vektor {to se koristi za da se vnese DNK vo kletka odcica~, osobeno vo limfoidni kletki. Retrovirusite se RNK virusi {to sodràt reverzna transkriptaza, enzim koj go katalizira pretvoraweto navirusniot RNK genom vo DNK. Potoa virusnata DNK se integrira vo hromozomskata DNK na doma}inot, kade se zadrùva kako provirus i se repliciraso hromozomskata DNK od doma}inot pri sekoja kleto~na delba. Koga eden retrovirus se koristi kako vektor vo istraùvawe, pove}eto retrovirusnigeni se otstranuvaat za vektorot da ne sozdava virusni ~estici; retrovirusnite geni koi ostanuvaat sodràt silen promotorski region, lociran na 5´krajot na virusniot genom, vo sekvenca nare~ena dolgo terminalno povtoruvawe (LTR). Ako eden gen se insertira vo eden takov retrovirusen vektor ivektorot potoa se iskoristi za da se inficiraat kletki od cica~ prikaùvaweto na genot }e go kontrolira retrovirusniot promotoren regionvektorot potoa se iskoristi za da se inficiraat kletki od cica~, prikaùvaweto na genot }e go kontrolira retrovirusniot promotoren region.Poradi toa {to limfocitite se osobeno rezistentni na mnogu metodi za transfekcija, za imunolozite e od golema korist upotrebata na retrovirusnivektori za da se vnesat geni vo limfoidnite kletki.

19

SLIKA 22-13 Op{ta procedura za sozdavawe na transgeni gluvci.Od bremena ènka-glu{ec se sobiraat oplodenite jajce kletki. Klonirana DNK (ozna~ena kako transgen) se mikroinjektira vo

j j j j jeden od pronukleusite na oplodenata jajce-kletka. Jajce kletkite potoa se implantiraat vo jajcevodot na psevdobremeni surogat-majki (dobieni so parewe na normalni ènki so sterilen ma`jak). Transgenot se inkubira vo hromozomskata DNK kaj okolu 10% do30% od potomstvoto i se prikaùva vo site nivni somatski kletki. Ako eden tkivno-specifi~en promotor e povrzan so transgen, }edojde do tkivno-specifi~no prikaùvawe na transgenot.

Kloniranite geni koi se preneseni vo embrioni od glu{ec ovozmoùvaat in vivo analiza na funkcijata na geniteRazvojot na tehniki za vnesuvawe klonirani tu|i geni (nare~eni transgeni) vo embrioni na glu{ec im ovozmoì na imunolozite dagi prou~uvaat efektite na genite vrz imuniot sistem in vivo. Ako vneseniot gen stabilno se integrira vo zarodi{nite kletki, toj}e se prenese vo potomstvoto.Prv ~ekor za sozdavawe na transgeni~ni gluvci e injekcija na tu|a klonirana DNK vo oplodena jajce-kletka. Vo ovoj tehni~kisloèn proces, oplodenite gluv~e{ki jajce-kletki se dràt v{mukani vo krajniot del od pipeta, a transgenot se mikroinjektiravo eden od pronukleusite so tenka igla. Transgenot se integrira vo hromozomskata DNK na pronukleusot i se prenesuva nakletkite-}erki na jajce-kletkite {to }e go preìveat procesot. Jajcekletkite potoa se implantiraat vo jajcevodot napsevdobremenite” ènki i po 19 ili 20 gestaciski denovi se ra|aat transgeni~ni gluv~iwa (sl 22-13) Op{to zemeno efikasnosta„psevdobremenite ènki i po 19 ili 20 gestaciski denovi se ra|aat transgeni~ni gluv~iwa (sl. 22-13). Op{to zemeno, efikasnosta

na ovaa procedura e mala i se sozdavaat samo eden ili dva transgeni~ni gluvci na sekoi sto zemeni oplodeni jajce-kletki.So transgeni~nite gluvci, imunolozite moàt da go prou~uvaat prikaùvaweto na daden gen kaj ìvo ìvotno. Iako site kletkikaj edno transgeni~no ìvotno go sodràt transgenot, razlikite vo prikaùvaweto na transgenot vo razli~ni tkiva gi razjasnijamehanizmite za genskoto prikaùvawe specifi~no za tkivata. So konstruirawe na transgen so poseben promotor, istraùva~itemoàt da go kontroliraat prikaùvaweto na daden transgen. Na primer, metalotioninskiot promotor se aktivira so cink.Transgeni~nite gluvci koi nosat transgen povrzan so metalotioninski promotor go prikaùvaat transgenot samo ako vo vodata{to ja pijat se dodade cink. Drugi promotori se funkcionalni samo vo odredeni tkiva; na primer, insulinskiot promotorpottiknuva prikaùvawe samo vo kletkite na pankreasot. Spored toa, transgeni~nite gluvci koi nosat transgen povrzan soinsulinskiot promotor }e go prikaùvaat transgenot vo pankreasot, no ne i vo drugi tkiva.Poradi toa {to eden transgen se integrira vo hromozomskata DNK vo ednokleto~en embrion od glu{ec, toj }e se integrira i vosomatskite kletki i vo zarod{nite kletki. Zatoa, dobienite transgeni~ni gluvci moàt da go prenesat transgenot kaj nivniotpotomok kako Mendeleeva nasledna osobina. Na ovoj na~in moè da se sozdadat linii od transgeni~ni gluvci vo koi sekoj ~len naedna linija }e go sodrì istiot transgen. Tekovno se dostapni razli~ni takvi transgeni linii i tie {iroko se upotrebuvaat voimunolo{kite istraùvawa. Me|u niv se liniite {to nosat transgeni koi kodiraat molekuli na imunoglobulini, molekuli na T-imunolo{kite istraùvawa. Me|u niv se liniite {to nosat transgeni koi kodiraat molekuli na imunoglobulini, molekuli na Tkleto~ni receptori i molekuli od GTK klasa 1 i 2, razli~ni tu|i protivgeni i nekoi citokini. Sozdadeni se i nekolku linii {tonosat onkogeni kako transgeni.

20

Kaj gluvcite so otstranet gen (nokaut), celnite geni se prekinati

Edno od ograni~uvawata na transgeni~nite gluvci e toa {to transgenot se integrira voproizvolno mesto vo genomot. Toa zna~i deka nekoi transgeni se vmetnuvaat vo regioni odDNK koi ne se prepi{uva~ki aktivni i zatoa genot ne se prepi{uva. Za da go nadminat ovaograni~uvawe, istraùva~ite razvija tehnika vo koja posakuvaniot gen se naso~uva konspecifi~ni mesta vo zarodi{na kleto~na linija od glu{ecot. Glavna cel na ovaa tehnika eda go zameni normalniot gen so mutiran alel ili so prekinata forma na genot i na toj na~inda ja onesposobi funkcijata na genot. Transgeni~nite gluvci {to nosat takov otse~en gen,nare~eni nokaut gluvci, im se od golema pomo{ na imunolozite koi se obiduvaat da sfatatkako otstranuvaweto na odreden genski proizvod vlijae vrz imuniot sistem. Vo tabela 22-7 edadena sporedba me|u transgeni gluvci i gluvci so otstranet gendadena sporedba me|u transgeni gluvci i gluvci so otstranet gen.Sozdavaweto na gluvci so genski otsraneti geni gi opfa}a slednite ~ekori:■ Izolirawe i kultivirawe na embrionski zarodi{ni (EZ) kletki od vnatre{natakleto~nata masa na blastocista od glu{ec■ Vnesuvawe na mutiran ili prekinat gen vo kultiviranite EZ kletki i selekcija nahomologni rekombinantni kletki vo koi odnosniot gen e onesposoben (t.e. zamenet sonefunkcionalna forma od genot)■ Injektirawe na homologni rekombinantni EZ kletki vo blastocista na glu{ecot-recipient i hirur{ka implantacija na blastocistata vo psevdobremen glu{ec

S■ Sparuvawe na himerni potomci heterozigoti za prekinatiot gen, za da se sozdadathomozigotni nokaut gluvci

EZ kletkite {to se koristat vo ovaa procedura se dobivaat so kultivirawe na vnatre{natakleto~na masa na blastocista od glu{ec na hranliva podloga na fibroblasti ili soprisustvo na leukemija-inhibitoren faktor. Vo vakvi uslovi, zarodi{nite kletki rastat,no ostanuvaat pluripotentni i sposobni potoa da se diferenciraat vo razli~ni nasoki, pri{to se sozdavaat razli~ni kleto~ni linii (na pr. germinativni kletki, miokard, krvnisadovi, mioblasti, nervni kletki). Edna od prednostite na EZ kletkite e toa {to so nivlesno se manipulira genetski. Kloniranata DNK {to sodrì posakuvan gen moè da seles o se a ul ra e e s . lo ra a a D o sodr osa u a e o e da sevnese vo EZ kletki koi se kultiviraat so razli~ni tehniki na transfekcija. VnesenataDNK potoa preku rekombinacija se insertira vo hromozomskata DNK na mal broj EZkletki.

21

SLIKA 22-14 Formirawe i selekcija na rekombinantni EZ kletki odj j ( ) Vglu{ec kaj koj e prekinat odreden celen gen. (a) Vo konstruktot za

vmetnuvawe, celniot gen e prekinat od neoR genot, a timidin kinaza tkHSVgenot se nao|a nadvor od celniot gen. Konstruktot se transfektira vokultivirani EZ kletki. Ako se javi homologna rekombinacija, samo celniotgen i neoR gen }e se vmetnat vo hromozomskata DNK od EZ kletkite. Ako sejavi nehomologna rekombinacija, }e se vmetnat site tri geni. Rekombinacijase javuva kaj okolu 1% od kletkite, a nehomologna rekombinacija se javuvamnogu po~esto od homolognata rekombinacija. (b) So selekcija so G418, leksli~en na neomicin }e ja ubie sekoja nerekombinantna EZ kletka zatoa {toovie kletki imaat nedostig od genot neoR. So selekcija so ganciklovir, }e seubijat nehomolognite rekombinanti koi go nosat tkHSV genot koj prenesuvasenzitivnost za gancikovir. Ovoj model na selekcija }e go preìveat samohomolognite EZ rekombinanti. [Prilagodeno od H. Lodish et al., 1995,Molecular Cell Biology, 3rd ed., Scientific American Books.]

Konstruktite koi se insertiraat vo EZ kletkite sodràt tri geni:odnosniot targetiran gen i dva geni za selekcija, kako {to e neoR, kojprenesuva otpornost kon neomicin, i timidin kinaza genot od herpessimpleks virus (tkHSV), koj prenesuva senzitivnost na ganciklovir,citotoksi~en nukleotiden analog (sl. 22-14a). Konstruktot ~esto semodifikuva a celnata genska sekvenca e prekinata od neoR genot ili tkHSVgenot na eden kraj, pod sekvencata na celniot gen. Pove}eto konstruktiproizvolno se insertiraat so nehomologna rekombinacija, a ne so genskar r r r c j ,celeno vmetnuvawe preku homologna rekombinacija. Kako {to e pokaànona slika 22-14b, se koristi model na selekcija vo dva ~ekori za da se dobijatonie EZ kletki koi pretrpele homologna rekombinacija, pri {toprekinatiot gen go zamenuva celniot gen.

22

SLIKA 22-15 Op{ta procedura za sozdavawe homozigotni gluvci so otse~enEZ b ( b j )gen. EZ kletki homozigotni za obeleùva~ki gen (na pr. crna boja na krzno)

i heterozigotni za otse~en celen gen (v. sl. 22-16) se injektiraat vo ranembrion homozigoten za alternativen obeleùva~ki gen (na pr, bela boja nakrzno). Himernite transgeni potomci, koi imaat crno i belo krzno, potoa sesparuvaat so homozigotni beli gluvci. Celosno crnite potomci od ovasparuvawe imaat kletki dobieni od EZ vo nivnata zarodi{na kleto~nalinija, koi se heterozigotni za otse~eniot celen gen. So sparuvawe na oviegluvci eden so drug se sozdavaat ìvotni koi se homozigotni za otse~eniotcelen gen, odnosno nokaut gluvci. [Prilagodeno od M.R. Capecchi, 1989,Trends in Genetics 5:70.]

EZ kletkite dobieni so ovaa procedura se heterozigotni za mutacijata naotstranet vo celniot gen. Ovie kletki klonalno se razmnoùvaat vokleto~na kultura, a potoa se injektiraat vo blastocista od glu{ec, {to seimplantira vo psevdobremena ènka. Transgeni~nite potomci {to sedobivaat se himeri~ni, sostaveni od kletki dobieni od genetski izmenetiEZ kletki i kletki dobieni od normalni kletki na blastocista nadoma}inot. Koga zarodi{nite kletki poteknuvaat od genetski izmeneti EZkletki, genetskata promena moè da se prenese na potomcite. Akorekombinantnite EZ kletki se homozigotni za crna boja na krznoto (ilidrug vidliv obeleùva~) i se injektiraat vo blastocista homozigotna zabela boja na krznoto, toga{ lesno }e moè da se identifikuva himeri~notopotomstvo {to ja nosi heterozigotnata mutacija vo svojata zarodi{na linijaj r u c j j r d j(sl. 22-15). Koga ovie potomci }e se sparat eden so drug, del od niv }e bidathomozigotni za mutacijata so otstranet gen.

23

SLIKA 22-16 Targetirawe na geni so Cre/loxP. (a) Uslovno otse~uvawe so Cre rekombinaza. Celeniot DNK polimeraza beta gen e modificiran so negovovmetnuvawe me|u dve loxP mesta (za poednostavuvawe e daden samo edniot alel). Od EZ kletkite se sozdavaat transgeni gluvci so standardni proceduri.vmetnuvawe me|u dve loxP mesta (za poednostavuvawe e daden samo edniot alel). Od EZ kletkite se sozdavaat transgeni gluvci so standardni proceduri.So sparuvawe na loxP-modificiranite gluvci so Cre transgen glu{ec }e se sozdadat dvojno transgeni gluvci kaj koi DNK polimeraza beta genot {to senao|a me|u dva lloxP }e se otstrani vo tkivoto vo koe se prikaùva Cre. Vo na{iot primer, Cre se prikaùva vo timusnoto tkivo (prugasto) i zatoaotse~uvaweto na genot {to se nao|a me|u dva loxP se javuva samo vo timusot (so belo) na dvojno transgenite gluvci. No, drugi tkiva i organi sepak goprikaùvaat genot {to se nao|a me|u dva loxP (so portokalovo). (b) Aktivacija na gensko prikaùvawe so primena na Cre/loxP. Me|u promotorot ipotencijalno toksi~niot gen se vmetnuva preveduva~ka STOP kaseta {to se nao|a me|u promoterot i potencijalno toksi~niot gen i od EZ kletkite sesozdavaat gluvci so primena na standardni proceduri. Ovie gluvci se sparuvaat so transgena linija {to go nosi Cre genot upravuvan od promotorspecifi~en za odredeno tkivo. Vo na{iot primer, Cre se prikaùva vo timusot, taka {to sparuvaweto doveduva do prikaùvawe na toksi~niot gen (sosino) samo vo timusot. So primena na ovaa strategija moè da se utvrdat efektite od prikaùvaweto na potencijalno toksi~niot gen na na~in koj especifi~en za odredeno tkivo. [Prilagodeno od B. Sauer, 1998, Methods 14:381]

„Vmetnuva~ka” (“Knock-In”) tehnologijata ovozmoùva zamena na endogen genPokraj otsranuvaweto na odreden gen, isto taka e mo`no endogen gen da se zameni so mutirana forma od toj gen ili celosno da se zameni so druga izbranaDNK sekvenca. Na primer, vo eden neodamne{na studija, KD4 genot bil zamenet so genot za beta-galaktozidaza. Vo ovie eksperimenti, KD4 promotorotbil ostaven intakten, za da go upravuva prikaùvaweto na beta-galaktozidazata, koja ja katalizira promenata na bojata na odredeni glasni~ki reagensivo sina boja. Poradi toa {to KD4 promotorot go upravuval prikaùvaweto na beta-galaktozidazata, sini stanale samo onie timusni kletkipredodredeni da prikaùvaat KD4 vo prisustvo na glasni~ki reagensi. Podatocite od ovie eksperimenti bile korisni za otkrivawe na obvrzuvawetokon KD4/ KD8 na kleto~nite linii kaj T-kletkite vo razvoj.

Inducibilnoto gensko celewe, Cre/lox sistemot, celi gensko bri{ewePokraj otstranuvaweto na geni so gensko celewe, razvieni se novi eksperimentalni strategii koi ovozmoùvaat specifi~no otstranuvawe naodnosniot gen vo to~no izbrano tkivo. Ovie tehnologii se potpiraat vrz upotrebata na rekombinazi od bakterii ili kvasni gabi specifi~ni zaodredeno mesto. Rekombinaza {to naj~esto se koristi e Cre, izolirana od bakteriofagot P1. Cre prepoznava specifi~no mesto od 34-bp vo DNK poznatokako loxP i, koga }e go prepoznae, katalizira rekombinacija. Spored toa, Cre gi prepoznava DNK sekvencite koi se nao|aat vo neposredna blizina naloxP i procesot na rekombinacija rezultira so delecija na vklu~enite DNK sekvenci. So drugi zborovi, ìvotnite {to nasekade prikaùvaat Crerekombinaza gi bri{at site sekvenci {to se nao|aat me|u dva loxP. Vistinskata inovacija vo ovaa tehnika e toa {to prikaùvaweto na genot na Crerekombinazata moè da se kontrolira so upotreba na promotor specifi~en za odredeno tkivo. Ova ovozmoùva prikaùvawe na rekombinaza proteinotvo specifi~no tkivo, pa ottuka i otstranuvaweto na DNK pome|u dva loxP vo specifi~noto tkivo. Na primer, Cre moè da se ekspresira vo B-kletkiteso upotreba na imunoglobulinski promotor i toa }e rezultira so celeno otstranuvawe na DNK sekvencite me|u dva loxP samo vo B-kletkite.Ovaa tehnologija e osobeno korisna koga celnoto otstranuvawe na odreden gen e smrtonosna. Na primer, DNK polimeraza beta genot e neophoden zaembrionalen razvoj . Vo eksperimenti nameneti za ispituvawe na sistemot Cre/lox, nau~nici stavile gluv~e{ki DNK polimeraza beta gen me|u dva LoxPi gi sparile ovie gluvci so gluvci koi nosele Cre transgen kontroliran od T-kleto~en promotor (sl. 22-16a). Kako rezultat na sparuvaweto bilesozdadeni potomci koi prikaùvaat Cre rekombinaza specifi~no vo T-kletkite i toa im ovozmoìlo na nau~nicite da gi ispitaat efektite odr u r r f u fbri{ewe na enzimot DNK polimeraza beta specifi~no vo T-kletkite. Efektite od bri{eweto na ovoj gen ne moàt da se ispitaat so konvencionaleneksperiment na gensko celewe zatoa {to otse~uvaweto na DNK polimeraza beta vo ìvotnoto bi bila smrtonosna. So sistemot Cre/lox moè da seispitaat efektite na genskoto bri{ewe samo vo specifi~no tkivo.Sistemot Cre/lox moè da se iskoristi za da se pottikne gensko prikaùvawe vo odredeno tkivo. Isto kako {to nedostigot na odreden gen moè da bidesmrtonosen vo embrionalniot razvoj, taka i prikaùvaweto na nekoj gen moè da bide toksi~no. Za da se ispita prikaùvaweto na takov gen vospecifi~no tkivo moè da se vmetne preveduva~ka stop sekvenca {to se nao|a me|u dva loxP vo intron na po~etokot na genot (sl. 22-16b). So primena napromotor specifi~en za odredeno tkivo koj go upravuva Cre prikaùvaweto, stop sekvencata moè da se izbri{e vo izbranoto tkivo i da se ispitaprikaùvaweto na potencijalno toksi~niot gen vo ova tkivo. Ovie modifikacii na tehnologijata na gensko celewe se mnogu korisni za utvrduvawe naefektite na odredeni geni vo kletkite i tkivata od imuniot sistem.

24

SLIKA 22-17 Analiza na DNK so primena na kDNK mikronizi (a) ili na oligonukleotidni mikronizi so golema gustina (b). Kako {to be{e opi{ano vo tekstot, analizata so mikronizi se potpira na izolacijata na RNK odtkivata ili kletkite {to treba da se analiziraat, pretvorawe na RNK vo kDNK i na obeleùvaweto na DNK pri podgotvuvaweto na celeniot proizvod. Obeleànite celeni sekvenci se hibridiziraat ili so kDNK mikronizi(a)ili so oligo mikronizi (b).

Mikronizi - pristap za analizirawe na modeli od gensko prikaùvaweVo izminatite nekolku godini se pojavi nov pristap namenet za procenka na razlikite vo genskoto prikaùvawe kaj razli~ni tipovi kletki ili vo isti kletki, no vo razli~ni uslovi. So ovaa tehnologija, nare~ena tehnologija namikronizi ili profilirawe na gensko prikaùvawe, moè brzo i sigurno da se skeniraat golem broj razli~ni mRNK. Principot e ednostaven i e izveden od ona {to ve}e go znaeme za RNK i DNK hibridizacijata: mRNK seizolira od daden primerok; potoa, koga }e se po~ne sinteza na kDNK, prvata kDNK ni{ka se obeleùva so obeleùva~ za da se formiraat celeni sekvenci.Sleden ~ekor e da se hibridizira obeleànata kDNK so nukleinska kiselina fiksirana vrz mikroniza. Na pazarot se dostapni mnogu vidovi mikronizi i tie glavno moè da se podelat na dve klasi: mikronizi koi sodràt kDNKi mikronizi koi sodràt oligonukleotidi. Mikronizite so kDNK, kako {to pokaùva i nivnoto ime, se kolekcii od kDNK koi se postaveni i izloèni na cvrst supstrat vo definirani lokacii (sl. 22-17a). Supstratot varira,no obi~no e najlonska membrana ili predmetno staklo. To~kite na supstratot na koi e postavena kDNK moè da bidat mnogu mali, od 5 do 10 mkm (mikrometri), taka {to pove}e od milion to~ki moè da se postavat na ~ipovi koise golemi samo nekolku santimetri. Procesot na podreduvawe na kDNK se izveduva so primena na robotika. kDNK naj~esto se dobivaat od dostapnite biblioteki od kDNK i, vo nekoi slu~ai, tie se PVR proizvodi amplificiraniod kDNK biblioteka so zapo~nuva~i specifi~ni za odredeni poznati geni.Oligonukleotidnite mikronizi obi~no pretstavuvaat zbir od oligonukleotidi so golemina od 20 do 30 nukleotidi (sl. 22-17b) koi se sintetiziraat direktno vrz povr{inata na ~ipot so fotolitografska tehnika so koja brzo ievtino na sekoe mesto moè da se sintetiziraat razli~ni oligonukleotidi specifi~ni za odredena sekvenca. Prednosta na ovoj vid na mikronizi e toa {to se potrebni samo sekvenci za genite od interes; ne e potrebna kDNKbiblioteka.Iako izvorot na celeni delovi koi se koristat i za kDNK mikronizi i za oligonukleotidnite mikronizi e kDNK, podgotvuvaweto na celeniot del se razlikuva vo zavisnost od mikronizata. Pripremaweto na celnite sekvenci zakDNK mikronizite opfa}a obeleùvawe na kDNK so razli~ni fluorescentni boi kako {to se Cy3 i Cy5 (v. sl. 22-17a). Ovie boi koi se bazirani na cijanin, lesno se konjugiraat so nukleinskite kiselini, mnogu se stabilni iemitiraat pomalku pozadinska fluorescencija otkolku konvencionalnite fluorescentni boi. Da pretpostavime deka sakate da napravite sporedba me|u dva razli~ni kleto~ni tipa ili eden kleto~en tip vo dve razli~ni sostojbina aktivacija. kDNK od edna populacija se podgotvuva so primena na mRNK kako obrazec. Prvo, sintezata na nova ni{ka na iRNK se pravi so koristewe na eden nukleotid konjugiran so Cy3. Potoa, so primena na mRNK od vtoratakleto~na populacija, kDNK se podgotvuva so koristewe na nukleotid konjugiran so Cy5. Ovie dve populacii na kDNK, ednata obeleàna so Cy3, a drugata so Cy5, se hibridiziraat na mikronizata. Ako eden od celenite prozivodise hibridizira so kDNK na mikronizata, se otkriva zelena (Cy3) ili crvena (Cy5) fluorescentna emisija (boja). Ako dvata targetirani proizvodi se hibridiziraat so kDNK, se otkriva òlta fluorescencija (kombinacijata odcrvenite i zelenite emisii od dvete boi). Mikronizite se analiziraat so skenirawe na preparatot pri dve razli~ni branovi dolìni za da se napravi razlika pome|u Cy3 i Cy5 signalite. Intenzitetot na signalot za sekoja bojase utvrduva i se sporeduva, a potoa rezultatite se prikaùvaat kako soodnos me|u dvata primeroka.Koga se raboti za mikronizi {to se baziraat na oligonukleotidi, voobi~aen pristap e da se obeleì celenata kDNK so nukleotid obeleèn so biotin za vreme na sintezata na prvata ni{ka na mRNK. kDNK koja e obeleàna sobiotin se hibridizira so oligo-mikronizata i se otkriva so fluorescenten streptavidin (v. sl. 22-17b). Postapkata potoa se povtoruva so kDNK od drugiot kleto~en tip i se koristi druga mikroniza. Dobienite mikronizi seanaliziraat ili so fsfoprikaùvawe (fosfoimixing) ili so skenirawe bazirano na fluorescencija so primena na specijalizirani senzori za skenirawe na mikronizi.Prakti~nata primena na tehnologijata na mikronizi vo imunologijata e o~igledna Nekoj moè da se zapra{a: Koja e razlikata vo genskoto prikaùvawe pome|u T kletkite i B kletkite?” Ili koja e razlikata me|u aktiviranaPrakti~nata primena na tehnologijata na mikronizi vo imunologijata e o~igledna. Nekoj moè da se zapra{a: „Koja e razlikata vo genskoto prikaùvawe pome|u T-kletkite i B-kletkite? Ili, koja e razlikata me|u aktiviranaT-kletka i T-kletka vo miruvawe? Listata na mo`ni sporedbi e ogromna. Za da po~nat da se odgovaraat nekoi od interesnite imunolo{ki pra{awa, Luis Staud (Louis Staudt) i negovite kolegi vo NIH razvile mikronizenpreparat nare~en „Limfo~ip” koj se sostoi od nad 10 000 ~ove~ki geni, osobeno zbogaten so geni koi se prikaùvaat vo limfoidnite kletki. Limfo~ipot vklu~uva geni i od normalni i od transformirani limfociti. Ovaaposebna mikroniza ovozmoì dobivawe na mnogu korisni informacii, kako na primer profilirawe na T kletki sporedeni so B kletki, plazma kletki sporedeni so B-kletki od zarodi{nite centri i modeli na genskoprikaùvawe pottiknato od razli~ni signalni pati{ta. Limfo~ipot i drugi klini~ki primeni na mikronizite se opi{ani vo Klini~kiot fokus na stranica 568.

Dvofotonska mikroskopija za in vivo prikaùvawe na imuniot sistemSè do neodamna, za mikroskopsko ispituvawe na kletkite od imuniot sistem bea koristeni tehniki vo koi kletkite se izoliraa od okolnata sredina i vo mnogu slu~ai, kletkite ili tkivata se fiksiraa . Podatocite sobrani odovie pristapi se ekstremno korisni, no tie ovozmoùvaat pretstava vo odredeno vreme, a ne dinami~na slika za interakciite kletka-kletka vo teloto za vreme na imuniot odgovor. Edno neodamne{no otkritie, dvofotonskalaserska mikroskopija, ovozmoùva direktna vizuelizacija vo realno vreme na in vivo interakcii me|u kletki od imuniot sistem.Razvojot na dvofotonskata mikroskopija poteknuva od konfokalnata mikroskopija. Iako so standardnata fluorescentna mikroskopija moè da se otkrijat obeleèni ili ozna~eni kletki vo monosloj na predmetno staklo ili sadza kultivirawe, golema prednost na konfokalnata mikroskopija e toa {to moè da „pogledne” dlaboko vo delovite od tkivoto so {to se eliminira potrebata da se odvojuvaat tkiva ili izoliraat kletki na predmetno staklo. Sokonfokalnata mikroskopija moè duri da se prikaùvaat i ìvi kletki vo tkivo, no rezultat na upotrebenata laserska svetlina e fotoobeluvaweto i fototoksi~nite efekti. Fluorescentnite molekuli se ekscitirani odlaserskata svetlina koja e fokusirana preku le}a vo fokalnata to~ka, celta za prikaùvawe. Emisijata od fluorohromot se sobira preku istata le}a i se refokusira vo to~ka vo sredinata na mal otvor postaven pred detektor.Energijata {to se sozdava po patekata na ekscitacijata moè da gi o{teti i uni{ti kletkite koi }e se najdat na patot na snopot zraci. Pokraj toa, dlabo~inata na detekcija vo edno tkivo e ograni~ena na samo nekolku desetinkimkm.Isto kako i konfokalnata mikroskopija, so dvofotonskata mikroskopija moè „opti~ki da se odvoi” materijalot {to se ispituva bez da nastane fototoksi~no o{tetuvawe. So dvofotonska mikroskopija moè da se vizueliziratkivo na dlabo~ina od nekolku stotici mikroni do pove}e od eden milimetar, a toa vo golema mera go nadminuva opsegot na konfokalnata mikroskopija.Razlikite vo mo`nostite na ovie dve tehniki moè da se razberat preku sporeduvawe na tehnologiite vrz koi se baziraat. Vo konfokalnata mikroskopija se koristi eden foton svetlina za da se ekscitira fluorohromot. Zarazlika od nea, vo dvofotonskata mikroskopija, kako {to poso~uva i imeto, fluorohromot se ekscitira so dva fotoni svetlina, pri {to sekoj od niv nosi polovina od energijata na poedine~niot foton {to se koristi vostandardnata fluorescentna mikroskopija. Fluorohromite se ekscitiraat so visoko fokusirano i ekstremno brzo ispra}awe na dva mnogu kratki impulsa (okolu 100 femtosekundi) na laserska svetlina. Pri konfokalnatamikroskopija, fluorohrom kako {to e fluoresceinot se ekscitira so foton od laserska svetlina na 400 nm; istiot fluorohrom moè da se ekscitira so dva impulsi na svetlina od 800 nm branova dolìna bliska doinfracrvenata (polovina od energijata na foton od 400 nm) ako impulsite stignat do fluorohromot re~isi istovremeno. Celiot intenzitet se postignuva samo vo fokalnata to~ka, a drugite delovi od tkivoto ne se zasegnati odfotonite so pogolema branova dolìna. Nakratko kaàno, glavna prednost na ovoj sistem e toa {to ekscitacijata e ograni~ena na fokalnata ramnina, a ostatokot od primerokot e izloèn na relativno bezbedni i ekstremnokratki impulsi na svetlina bliska do infracrvenata Pokraj toa poradi toa {to podolgite branovi dolìni koi se koristat za ekscitacija ne se apsorbiraat efikasno vo tkivoto mo`no e podlaboko prodirawe vo biolo{kiotkratki impulsi na svetlina bliska do infracrvenata. Pokraj toa, poradi toa {to podolgite branovi dolìni koi se koristat za ekscitacija ne se apsorbiraat efikasno vo tkivoto, mo`no e podlaboko prodirawe vo biolo{kiotprimerok. Vsu{nost, kako {to vidovme na slika 11-19, sega postoi mo`nost da se vizuelizira limfen jazol vo neo{teteno tkivo na ìvo ìvotno po injektirawe na protivgen.

Napredok vo fluorescentnata tehnologijaPokraj fluorohromite {to rutinski se koristat vo mikroskopijata i proto~nata citometrija, kako {to e fluorescein izotiocijanat, „Teksas crveno”, rodamin izotiocijanat i fikoeriterin, dostapni se i nekolku drugifluorescentni alatki. Osobeno korisen za analiza na ìvi i fiksirani kletki i tkiva e zeleniot fluorescenten protein (GFP) i negovite mnogubrojni derivati. GFP e priroden bioluminesceten protein {to za prv pat bilizoliran od meduza. Ekspertite po kleto~na biologija gi iskoristile negovite prirodni fluorescentni svojstva za da gi obeleàt genskite proizodi. Koga genot za GFP ili edna od negovite spektralni varijanti, kako {to eòltiot fluorescenten protein (YFP), }e mu se dodade na genot od interes, genskiot proizvod }e bide fluorescenten ako se ekscitira so laserska svetlina. Na primer, lesnata imunoglobulinska kapa veriga fuzirana so GFPfluorescentno }e gi obeleì site kletki {to prikaùvaat lesni kapa verigi. Emisijata od ovaa ekscitacija moè da se vizuelizira so fluorescentna mikroskopija ili moè da se otkrie so proto~na citometrija i sluì kakoobeleùva~ za kletki {to go prikaùvaat obelèniot gen. Postoi mo`nost da se sozdadat i transgeni ìvotni {to prikaùvaat GFP pod kontrola na promotor specifi~en za odredeno tkivo.Drug korisen fluorohrom, 5,6-karboksifluorescein-diacetat sukcinimidil ester, ili CFSE, moè da se vnese vo kletkite eks vivo. Na primer, moè da se otstranat limfoidni kletki od ìvotni, vo niv da se vnese CFSE i pak dase vratat vo istoto ìvotno ili vo genetski identi~en ~len na istiot vid ìvotni. Otkako }e se stacioniraat vo razli~ni mesta od imuniot sistem, ovie kletki moè da se vizueliziraat so fluorescencija. CFSE moè da seiskoristi za da se proceni dali edna kletka se podelila. Pri kleto~nata delba, CFSE podednakvo se raspredeluva kaj kletkite-}erki, a sekoja generacija stanuva progresivno pomalku fluorescentna. So primena na CFSE iproto~na citometrija lesno moè da se utvrdi dali kaj edna populacija kletki nastanala kleto~na delba, pa duri moè da se utvrdi i kolku pati se podelila edna kletka.

25

eksperimentalni sistemi za otkrivawe na slo`enite kleto~ni me

Documents