ograni~uvawena sopstveniot-gtkna...

T - kleto~en receptor

f j j fProtivgen-speciifi~nata priroda na T-kleto~nite odgovori jasno pokùva deka T kletkite poseduvaat receptor koj e specifi~en za protivgen ireceptor koj e klonalno ograni~en. Sepak, identitetot na ovoj receptor ostanal nepoznat dolgo vreme po utvrduvaweto na B-kleto~niot receptor(imunoglobulinska molekula). Relevantnite eksperimentalni rezultati bea kontradiktorni i te{ki za koncepirawe vo eden model bidej}i T-kleto~niot receptor (TKR) na zna~ajni na~ini se razlikuva od B-kleto~niot receptor koj se vrzuva za protivgen. Prvo, T-kleto~niot receptor e vrzanza membranata i ne se pojavuva vo rastvorliva forma kako B-kleto~niot receptor. Spored toa, utvrduvaweto na negovata struktura so klasi~nibiohemiski metodi be{e sloèno, pa za da se odrededi negovata specifi~nost bea potrebni kompleksni kleto~ni analizi. Vtoro, me|udejstvoto navrzuvawe na T-kleto~niot receptor za protivgenot e poslabo od ona kaj protivtelata, {to bara po~uvstvitelni analizi. Na krajot, pove}eto T-kleto~ni receptori ne se specifi~ni samo za protivgen, tuku i za protivgen vo kombinacija so molekula koja e kodirana od strana na glavniottkivnosovpadliv kompleks (GTK). Ovaa osobina ne dozvoluva pro~istuvawe na T-kleto~niot receptor so voobi~aeni tehniki za vrzuvawe naprotivgenot i go uslo`nuva sekoj eksperimentalen sistem koj e sozdaden za istraùvawe na receptorot.Kombinacijata od imunolo{kite, biohemiskite i molekularno-biolo{kite postapki gi nadmina ovie problemi. Molekulata koja e odgovorna zaspecifi~nosta na T-kletkite e heterodimer sostaven ili od alfa i beta verigi ili od gama i delta verigi. Pronajdeno e deka genomskata organizacijana genskata familijata od T-kleto~niot receptor i na~inite na koi se sozdava razli~ieto na sostavnite verigi se sli~ni kako kaj genite od B-kleto~niot receptor. Osven toa, T-kleto~niot receptor e povrzan vrz membranata so pove}ekomponten signal-prenesuva~ki kompleks, KD3, ~iifunkcii se sli~ni so onie na Ig-alfa/Ig-beta kaj B-kleto~niot receptor.Od neodamne{nite prou~uvawa se dobija novi zna~ajni informacii koi se odnesuvaat na T-kleto~nite receptori, vklu~uvaj}i go i novoto soznanie zagolemite razliki pome|u kletkite koi imaat receptori sostaveni od alfa i beta verigi i kletkite so gama i delta verigi. Alfa-beta TKR, kako ile e razl e u le e aa rece r s s a e d alfa be a er le e s a a del a er lfa be a , aprotivteloto, se karakterizira so visok stepen na specifi~nost i poradi toa se smeta za zna~ajna molekula na steknatiot imun sistem. Nasproti toa,odredeni receptori na gama-delta T kletkite izgleda prepoznavaat klasi na protivgeni koi se prisutni i vo grupi na patogeni i spored toafunkcioniraat na na~in koj e dosleden na vrodeniot imun sistem.Strukturnite ispituvawa so upotreba na rendgenska kristalografija otkrija razliki za toa kako alfa-beta TKR se vrzuva za protivgeni koi sepretstaveni od strana na klasa 1 molekulite od GTK nasproti klasa 2 i dadoa rezultati za toa kako gama-delta TKR prepoznava odredeni protivgeni vonivnata prirodna forma. Ova poglavje }e ja istraì prirodata na molekulite na T-kleto~niot receptor i genite koi gi kodiraat i }e go diskutirameprepoznavaweto na TKR na tu|ite i sopstvenite protivgeni.

Porane{ni prou~uvawa na T-kleto~niot receptor

Do ranite 80-ti godini od dvaesettiot vek, istraùva~ite nau~ija mnogu za funkcijata na T-kletkata, no bea spre~eni vo nivnite obidi za utvrduvawe iizolirawe na nejziniot receptor koj se vrzuva za protivgen. O~iglednite paraleli pome|u funkciite za prepoznavawe na T i B kletkite stimuliraagolem eksperimentalen napor za iskoristuvaweto na predvidenite strukturni sli~nosti pome|u imunoglobulinite i T-kleto~nite receptori.Izve{taite objaveni vo 70-tite godini od dvaesettiot vek tvrdea deka se otkrieni izotipovite na imunoglobulinite koi se povrzani isklu~ivo so Tkletkite (IgT) i od protivserumot koj prepoznava obeleùva~i (idiotipovi) so promenlivi podra~ja voobi~aeni za protivtelata i T-kleto~nitereceptori so sli~na specifi~nost Ovie eksperimenti ne moàt da se povtorat i se dokaàa kako neto~ni koga se pokaà deka T kleto~niot receptor ireceptori so sli~na specifi~nost. Ovie eksperimenti ne moàt da se povtorat i se dokaàa kako neto~ni koga se pokaà deka T-kleto~niot receptor iimunoglobulinite nemaat zaedni~ki elementi za prepoznavawe i se kodirani od potpolno razli~ni familii na geni. Kako {to }e vidite vo slednivedelovi, za pravilno da se odgovorat pra{awata za strukturata na T-kleto~niot receptor, genite koi go kodiraat i na~inot na koj toj prepoznavaprotivgeni bea potrebni dobro-organizirani eksperimenti koi gi koristea toga{nite razvojni tehnologii za sozdavawe na monoklonsko protivtelo imolekulska biologija.

1

(slika 9-1 Ograni~uvawe na sopstveniot-GTK na T-kleto~niot receptor (TKR)Opredelen TKR koj e specifi~en i za protivgeniot peptid i za molekulata od sopstveniot GTK. Vo ovoj primer, Tct H-2 e

f j ( )specifi~en za virusniot peptid A koj e pretstaven na H-2 celnata kletka (a). Prepoznavaweto na protivgenot ne nastanuva kogapepetidot B e pretstaven na H-2 celnata kletka (b) nitu koga peptidot A e prikaàn na -2 celnata kletka (v).T-kleto~nite receptori bea izolirani so upotreba na klonotipskii protivtela

Klasi~nite eksprimenti go pokaàa ograni~uvaweto na sopstveniot-GTK kaj T-kleto~niot receptorDo ranite 70-ti godini od dvaesettiot vek, imunolozite nau~ija da proizvedat citotoksi~ni T limfociti (Tct) koi se specifi~niza virusno-zarazenite celni kletki. Na primer, koga gluvcite bea zarazeni so virus od limfociten horiomeningitis (LCM), tiesozdavaat Tct koi moàt in vitro da gi razloàt zarazenite so LCM celni kletki. Sepak, ovie Tct ne moèa da se vrzat zaslobodniot LCM virus ili za virusnite protivgeni. Zo{to Tct ne se vrzuvaat za virusot ili za virusnite protivgeni dirketnokako {to se vrzuvaat imunoglobulinite? Odogovorot zapo~na da se pojavuva pri klasi~nite eksperimenti na R.M. Cinkernagel iP.C.Doerti vo 1974 godina (vidi slika 8-15). Ovie prou~uvawa pokaàa deka prepoznavaweto na protivgenot od strana na Tkletkite ne e specifi~no samo za virusen protivgen, tuku i za protivgen povrzan so molekula od GTK (slika 9-1). Se pokaà deka Tkletkite go prepoznavaat protivgenot samo koga e pretstaven vrz membranata na kletkata od strana na sopstvenite-GTK molekuli.Ovaa karakteristika nare~ena ograni~uvawe na sopstveniot-GTK pravi razlika pome|u prepoznavaweto na protivgenot odOvaa karakteristika, nare~ena ograni~uvawe na sopstveniot-GTK, pravi razlika pome|u prepoznavaweto na protivgenot odstrana na T kletkite i B kletkite. Vo 1996 godina, Cinkernagel i Doerti bea nagradeni so Nobelova nagrada za nivnata rabota.Za objasnuvawe na ograni~uvaweto na GTK kaj T-kleto~niot receptor bea predolèni dva modeli. Modelot na dvoen receptor kojpretpostavuva deka T kletkata e so dva oddelni receptori, eden za protivgenot i eden za molekulata od klasa 1 ili klasa 2 od GTK.Modelot na samo-o{tetuvawe predlaga{e deka edine~en receptor prepoznava promena kaj sopstvenite molekuli od GTKpredizvikana od nivnoto povrzuvawe so tu|i protivgeni. Pove}e godini se vode{e debata pome|u zastapnicite na dvata modela, s#dodeka privle~niot eksperiment na X. Kepler i P. Marak pokaà deka specifi~nosta i za GTK i za protivgenot leì vo edenreceptor. Ottoga{, ogromen broj na strukturni i funkcionalni podatoci se dodadeni kako poddr{ka na modelot na samo-o{tetuvawe.Identifikacijata i izolacijata na T-kleto~niot receptor se izvr{i so sozdavawe golem broj monoklonski protivtela za razli~niklonovi od T-kletkata, a potoa se ispitaa protivtelata za da se pronajde edno protivtelo koe e specifi~no za klon, iliklonotipsko. Ovoj priod pretpostavuva{e deka {tom T-kleto~niot receptor e specifi~en i za protivgenot i za molekulata odGTK, toga{ treba da ima zna~ajni strukturni promeni kaj receptorot od klon do klon. Sekoj klon na T-kletkata treba da imaprotivgenski ozna~uva~ koj e sli~en na ozna~uva~ot na idiotipovite koi gi karakteriziraat monoklonskite protivtela. Soupotreba na ovoj pristap, istraùva~ite vo ranite 80-ti godini od dvaesettiot vek go izoliraa receptorot i otkrija deka eupotreba na ovoj pristap, istraùva~ite vo ranite 80 ti godini od dvaesettiot vek go izoliraa receptorot i otkrija deka eheterodimer koj se sostoi od alfa i beta verigi.Koga se podgotvuva{e protivserum so upotreba na alfa-beta heterodimeri izolirani od membranite za razli~ni T-kleto~niklonovi, del od protivserumot se vrza za alfa-beta heterodimerite od site klonovi, dodeka drugiot del be{e klonski specifi~en.Ovoj naod predlaga{e deka amino kiselinskite sekvenci od alfa i beta verigite kaj TKR, kako i sekvencite od te{kite i lesniteverigi od imunoglobulinite, imaat konstantno i varijabilno podra~je koi se raspoznavaat od protivtelata koi prepoznavaatizotipski ili idiotipski odrednici (odrednica - determinanta). Podocna, se identifikuva{e vtor vid na TKR heterodimer kojsodrì gama i delta verigi. Kaj lu|eto i gluvcite, pogolemiot del od T kletkite go prikaùvaat alfa-beta heterodimerot, aostanatite T kletki go prikaùvaat gama-delta heterodimerot. Kako {to e objasneto podolu, to~niot soodnos na T kletkite koiprikaùvaat TKR so alfa-beta ili gama-delta verigi se razlikuva kaj razli~ni organi i vidovi, no obi~no preovladuvaat alfa-beta T kletkite . Poradi preovladuvaweto na kletkite koi poseduvaat alfa-beta TKR i mnogute dostapni informacii za niv,idnite diskusii za T-kleto~niot receptor }e zemaat vo predvid deka se misli na alfa-beta TKR dokolku posebno ne e nazna~enogama-delta.

2

(slika 9-2 Sozdavawe i identifikuvawe na kDNK klonot koj go kodira T-kleto~niot receptor. Slikata ja prikaùva procedurata koja ja koristele S.M. Hedrick i M.M. Davis za da dobijat klonovi od kDNK ozna~ena so P koi odgovaraat na mRNK od T kletkata. Tehnikata odzema~ka hibridizacija naDNK im ozmozmoì da ja izoliraat [ P] kDNK koja e edinstvena za T kletkata. Ozna~enite Tpo-kleto~ni kDNK klonovi bea koristeni kako probiD d j r D j d D r r(dodatok) pri analizite na Sadernovoto damkosuvawe na genomskata DNK od hepatocotite, kletkite od B-limfomot i {est razli~ni Tpo-kleto~niklonovi (a-f). Koristeweto na kDNK klon 1 dade razli~en oblik za otkrivawe na sekoj T-kleto~en klon, dodeka ispituvaweto so kDNK klon 2 nerazli~en oblik. Koga se pretpostavi deka kletkite od crniot drob i B kletkite sodràt neizmeneta DNK od zarodi{nata linija na TKR i deka sekoj T-kleto~en klon sodrì razli~no preuredeni TKR geni, rezultatite so upotreba na kDNK od klon 1 kako proba go identifikuvaa klonot 1 kako T-kleto~en receptoren gen. kDNK od klonot 2 go identifikuva genot za druga T-kleto~na membranska molekula koja e kodirana od strana na DNK i koja nepodleì na preureduvawe. referenca

Genot za TKR so beta veriga be{e kloniran so upotreba na odzema~ka hibridizacijaSo cel da se identifikuvaat i izoliraat genite od TKR S. M. Hedrik i M.M. Dejvis se trudea da izoliraat mRNK koja gi kodira alfa i beta verigite odklonot na Tpo kletki. Ova ne be{e lesna zada~a bidej}i receptorot na mRNK pretstavuva samo mal del od vkupnata kleto~na mRNK. Nasproti toa, voplazma kletkite imunoglobulinot e glavniot kleto~en produkt koj se la~i, a iRNK koi gi kodiraat te{kata i lesnata veriga se sre}avaat vo izobilstvoi se lesni za pro~istuvawe.Uspe{nata metoda na Hedrick i Davis pretpostavuva deka mRNK na TKR kako i mRNK koja gi kodira drugite sostavni membranski proteini - }e bidepovrzana so poliribozomite vrzani za membranata namesto so slobodnite citoplazmatski ribozomi. Zatoa tie ja izoliraa poliribozomnata mRNKvrzana za membranata od klonot na Tpo kletka i koristea reverzna transkriptaza za da gi sintetiziraat kDNK ozna~ena so P (slika 9-2). Bidej}i samo3% od mRNK na limfocitite e poliribozomen del koj se vrzuva za membrana ovoj ~ekor eliminira{e 97% od iRNK na kletkata.3% d a l f c e e l r b z e del j se rzu a za e bra a j e r el ra e 97% d a le a aHedrick i Davis potoa koristea tehnika nare~ena odzema~ka hibridizacija na DNK za da ja otstranat kDNK ozna~ena so P koja ne be{e edinstvena za Tkletkite od nivniot preparat. Nivniot osnoven princip za ovoj ~ekor se bazira{e vrz prethodnite merewa na Davis koi pokaàle deka 98% od geniteprikaàni na limfocitite se zaedni~ki i za B i za T kletkite. 2% od genite koi se edinstveni za T kletkite treba da vklu~uvaat geni koi kodiraat T-kleto~en receptor. Zatoa, so hibridizirawe na B-kleto~nata mRNK so nivnata Tpo -kleto~na kDNK ozna~ena so P, tie moèa da ja otstranat, iliodzemat, cela kDNK koja be{e zaedni~ka za B i T kletkite. Nehibridiziranata kDNK ozna~ena so P koja ostana po ovoj ~ekor verojatno japretstavuva{e prikaànata poliribozomska mRNK koja be{e edinstvena za Tpo kleto~niot klon, vklu~uvaj}i ja mRNK koja go kodira negoviot T-kleto~en receptor.Kloniraweto na nehibridiziranata kDNK ozna~ena so P sozdade biblioteka od koja se identifikuvaa 10 razli~ni klonovi na kDNK. Za da se utvrdi kojod ovie T-kleto~no specifi~ni kDNK klonovi go prikaùvaat T-kleto~niot receptor, site se upotrebuvaa kako probi za da se najdat genite koi sepreuredeni vo zrelite T kletki. Ovoj pristap se bazira na pretpostavkata deka alfa-beta T-kleto~niot receptor se pokaà deka ima konstantni ivarijabilni podra~ja, negovite geni treba da podloàt na preureduvawe na DNK kako kaj genite na Ig od B kletkite. Dvajcata istraùva~i testiraaDNK od T kletki, B kletki, kletki od crn drob i makrofagi so analizata na Sadernovo damkosuvawe so upotreba na 10 probi od kDNK ozna~ena so P zada se utvrdat edinstvenite T-kleto~ni genomski DNK sekvenci. Eden klon pokaà lenti koi ukaùvaat na preureduvawe na DNK vo T kletkite, no ne ikaj drugite vidovi na kletki. Ovaa kDNK proba otkri {est razli~ni lenti za DNK od {est razli~ni zreli T kletki (vidi slika 9-2, dodatok na dolniotdel od slikata). Ovie razli~ni lenti verojatno pretstavuvaat preuredeni TKR geni. Takvi rezultati }e se o~ekuvaat ako preuredenite TKR geninastanuvaat samo kaj zrelite T kletki. Zabele{kata deka sekoj od {estte T-kletki pokaàla razli~ni lenti pri Sadernovot testirawe be{e vo sklad sopretpostavenite razliki za specifi~nosta na TKR od sekoja T kleto~na linijapretpostavenite razliki za specifi~nosta na TKR od sekoja T kleto~na linija.kDNK klonot 1 koj be{e otkrien so analizata na Sadernovo damkosuvawe prikaàn na slika 9-2 gi ima{e site znaci na navoden TKR gen: toapretstavuva genska sekvenca koja se prerureduva, prikaàna e od membranski-vrzan protein i se prikaùva samo kaj T kletkite. Se pokaà deka ovojkDNK klon ja kodira beta verigata od T-kleto~niot receptor. Podocna, bea utvrdeni kDNK klonovite koi ja kodiraat alfa verigata, gama verigata ina krajot delta verigata. Ovie naodi go otvorija patot za razbirawe na T-kleto~niot receptor i ovozmoìja ponatamo{ni strukturni i funkcionalniprou~uvawa.

3

(slika 9-3 [ematsko prikaùvawe na strukturnata sli~nost pome|u alfa-beta T-kleto~niot receptor i IgM koj se vrzuva za membranata na B kletkite.Alfa i beta verigite od TKR sodràt dva domeni so struktura koja e imunoglobulinovidno zdiplena. Amino krajnite-domeni (Valfa i Vbeta)prikaàuvaat varijacija vo sekvencata i sodràt tri hipervarijabilni podra~ja koi se ekvivalentni na KOP kaj protivtelata. Sekvencata nar u r j c j c dr r r r j dr j j r ckonstantnite podra~ja (Kalfa i Kbeta) ne variraat. Dvaete verigi od TKR se povrzani so disulfidna vrska pome|u postojanite sekvenci. T verigite odIgM me|usebno se povrzani so disulfidna vrska vo zglobnoto podra~je od T veriga, a verigite L se povrzani so verigite T so disulfidni vrski pome|u Kkraevite od verigite L i regionot Kmi. TKR molekulite so KD3 stapuvaat vo me|udejstvo preku pozitivno naelektrizirani ostatoci od amino kiselini(ozna~eni so +) vo nivnite transmembranski podra~ja. Broevite ja ozna~uvaat dolìnata na verigite vo TKR molekulata. Za razlika od protivtelnatamolekulata, koja e bivalentna, TKR e monovalenten.

Alfa-beta i gama-delta T kleto~ni receptori: Struktura i funkcijaStrukturata na domenite na alfa-beta i gama-delta TKR heterodimerite se vo golema mera sli~ni so domenite od imunoglobulinite. Spored toa, tie seklasificiraat kako ~lenovi na imunoglobulinskata superfamilija (vidi slika 4-24). Sekoj veriga vo TKR ima dva domeni koi sodràat vnatre{nadisulfidna vrska koja opfa}a 60 do 75 amino kiselini. Amino krajniot domen kaj dvete verigi pokaùva zna~ajna varijacija vo sekvencata, no zadrànise sekvencite od ostatokot na sekoja veriga. Spored toa, TKR domenite - eden varijabilen (V) i eden konstanten (K) - se strukturno homologni na V i Kdomenite na imunoglobulinite, a TKR molekulata e sli~na na Fab fragmentot koj e prika~en za kleto~nata membrana namesto za konstantnoto podra~jena imunoglobulinskata molekula. (slika 9-3). Varijabilnite podra~ja na TKR imaat tri hipervarijabilni podra~ja, koi se ekvivalentni nakomplementarno odreduva~ki podra~ja (KOP) vo lesnite i te{kite verigi od imunoglobulinite.Vo odnos na konstantnoto podra~je sekoja veriga od TKR sodrì kratka povrzuva~ka sekvenca kade cisteinskiot ostatok formira disulfidna vrska soVo odnos na konstantnoto podra~je, sekoja veriga od TKR sodrì kratka povrzuva~ka sekvenca, kade cisteinskiot ostatok formira disulfidna vrska sodrugata veriga od heterodimerot. Po podra~jeto na povrzuvawe sleduva transmembransko podra~je od 21 do 22 amino kiselini, koe ja povrzuva sekojaveriga za plazminata membrana. Transmembranskite domeni od dveta verigi se neobi~ni po toa {to sodràt pozitivno naelektrizirani ostatoci odamino kiselini. Kako {to }e objasnime podolu, ovie ostatoci pottiknuvaat me|udejstvo pome|u verigite od TKR heterodimer i verigite od signalnosproveduva~kiot KD3 kompleks. Na krajot, sekoja veriga od TKR sodrì kratka citoplazmatska opa{ka od pet do 12 amino kiselini na karboksilnoiotkraj.Na po~etokot be{e te{ko da se istraùvaat alfa-beta i gama-delta T-kleto~nite receptori bidej}i. kako i site transmembranski proteini, tie senerastvorlivi. Ovoj problem be{e nadminat so prikaùvawe na modificirani formi od proteinot in vitro koj e modificiran da sozdrì nezrelivnatreramkovni stop kodoni koi spre~uvaat preveduvawe na membranski vrzanata sekvenca {to ja pravi molekulata nerastvorliva.

Pogolemiot del od cirkulira~kite T kletki kaj lu|eto i gluvcite prikaùvaat T-kleto~ni receptori kodirani od alfa-beta genite. Ovie receptoristapuvaat vo me|udejstvo so peptidnite protivgeni koi se preraboteni i pretstaveni vrz povr{inata od protivgen-prikaùva~kite kletki. Prvi~nitepokazateli deka odredeni T kletki reagirale so nepeptidnite protivgeni ne bea jasni dodeka problemot ne po~na da se razjasnuva koga se otkri dekaproduktite od familijata na KD1 genite pretstavuvaat nepeptidni protivgeni kako {to se glikolipidite i fosfolipidite. Od neodamna, otkrieno edeka odredeni gama-delta kletki reagiraat so proteinskite protivgeni koi nitu se preraboteni nitu prika`ni vo GTK molekulite.Razlikite vo protivgen-vrzuva~kite podra~ja od alfa-beta i gama-delta TKR bea o~ekuvani poradi razli~nite protivgeni koi tie gi prepoznavaat, none bea o~ekuvani golemi razliki Sepak trodimenzionalnata struktura na gama delta receptorot koja reagira so fosfolipidniot protivgen objavenane bea o~ekuvani golemi razliki. Sepak, trodimenzionalnata struktura na gama-delta receptorot koja reagira so fosfolipidniot protivgen, objavenaod Tim Alison, Dave Garboczi i nivnite sorabotnici, otkriva zna~itelni razliki vo celosnata struktura na dvata tipa receptori, ukaùvaj}i namo`nite razliki vo funkcijata. Receptorot koj tie go prou~uvaa be{e dimer so gama i delta verigi (gama9 i delta2), a tie se naj~esto prika`ni voperifernata krv na lu|eto. Dlabok `leb vrz povr{inata od molekulata go prilagoduva mikrobniot fosfolipid za koj gama-delta receptorot especifi~en. Ovoj protivgen se prepoznava bez prikaùvawe so GTK.

4

(slika 9-4 Sporedba na kristalnite strukturi od gama-delta TKR i alfa-beta TKR. (a) ôvekovata gama-deltamolekula ja pokaùva razlikata (ozna~eno so crni linii) vo agolot na laktot vo sporedba so agolot na laktot na

f b (b) G TKR G8 GTK T22 Oalfa-beta molekulata. (b) Gama-delta od TKR od glu{ec G8 vo kompleks so neklasi~nata GTK molekula T22. Ovapovrzuvawe nastanuva nezavisno od oblasta za povrzuvawe peptidi kaj T22. Zabeleète kako povrzuvawetovklu~uva glavno kontakt so KOP3 od verigata delta vo receptorot.

Najgolemata karakteristika na ovaa struktura e kako taa se razlikuva od alfa-beta receptorot vo nasoka nanegovite B i K podra~ja . Taka nare~eniot agol na laktot pome|u dolgite oski na B i K podra~je vo gama-delta TKRe 111º. Vo alfa-beta TKR agolot na laktot iznesuva 147º, davaj}i i na molekulata poseben oblik (slika 9-4a).Celosnoto zna~ewe na ovaa razlika ne e poznato, no moè da pridonese za razlikite kaj signalnite mehanizmi i zatoa kako molekulite stapuvaat vo me|udejstvo so koreceptornite molekuli.Neodmne{na rendgenska kristalografska struktura, od Garsija i kolegite, na glu{ec so gama-delta receptor vokompleks so neklasi~na molekula od klasa 1 koja e nare~ena T22 ukaùva na faktot deka gama-delta receptorot sevrzuva direktno za T22, bez potreba od prisustvo na peptiden protivgen (slika 9-4b). Posledovatelno tie, so

b ( 6) | TKRupotreba na povr{na plazmonska rezonanca (vidi slika 6), pokaàa deka vrzuvaweto pome|u gama-delta od TKR soT22 be{e dosta cvrsto (K = 0,10 M). Strukturata na kompleksot otkri deka glavniot kontakt pome}u protivgenoti gama-delta od TKR vklu~uva KOP3 jamka od delta verigata. Pri me|udejstvoto pome|u alfa-beta TKR iprotivgenot, KOP3 go ovozmoùva prvi~niot kontakt so protivgeniot peptid pretstaven od strana na GTKmolekulite. KOP1 i 2 jamkite stapuvaat vo me|udejstvo so za~uvanite povr{inski osobini od GTK molekulata.Pri me|udejstvota na gama-deltaTKR so T22 , KOP3 povtorno go ovozmoùva glavniot kontakt so protivgenot, nokontaktot ne e so pretstaveniot peptid vo GTK molekulata, tuku so oblast nadvor od podra~jeto za povrzuvawe napeptid vrz samata neklasi~na GTK molekula (T22). Ova prepoznavawe na molekulata T22 vo otsustvo naprikaàniot peptid ukaùva na faktot deka gama-delta receptorot e posli~en na receptorot za prepoznavaweoblici (RPO, vidi poglavje 3) otkolku na alfa-beta receptorot.Dodeka alfa-beta T kletkite prepoznavaat preraboten protivgen i go pretstavuvaat vo kontekst na GTKmolekulata, golem broj podatoci pokùvaat deka gama-delta T kletkite ne baraat GTK prerabotuvawe iliprikaùavawe za prepoznavawe protivgenot. Preciznite funkcii na gama-delta T kletkite s#u{te ne se poznati,r u r r r c fu c d u ,a nivnata uloga vo imunitetot treba da se prou~i. Prepoznavaweto na protivgenite koi se zaedni~ki za klasite namikroorganizmite, isto kako i sposobnosta na gama-delta TKR da se vrzuva za neklasi~ni molekuli odsopstveniot-GTK, kako {to e objasneto prethodno, ukaùva na ulogata za brz odgovor koja e pokarakteristi~na zavrodeniot otkolku za steknatiot imunitet.

5

Brojot na gama-delta T kletki vo cirkulacijata e mal vo sporedba so kletkite koi imaat alfa-betareceptori, a V genskite segmenti od gama-delta receptorite prikaùvaat ograni~eno razli~ie. Kakor c r , d d r c r r u r r{to se gleda od podatocite vo tabela 9-1, pogolemiot del od gama-delta kletkite imaat nedostatok ina KD4 i na KD8 i pogolemiot del prikaùvaat ist par na gama-delta verigi. Kaj lu|eto dominantniotreceptor koj e prikaàn kaj cirkulira~kite gama-delta kletki prepoznava mikroben fosfolipidenprotivgen, pirofosfat 3-formil-1-butil, koj se sre}ava kaj Mycobacterium tuberculosis i drugi bakteriii paraziti. Ovaa specifi~nost za protivgenite koja ~esto se sre}ava ja poddrùva pretpostavkatadeka gama-delta kletkite moè da funkcioniraat kako del od odgovorot na vrodeniot imunitet,ovozmoùvaj}i brza reaktivnost kon odredeni protivgeni bez potrebata za prerabotuvawe. Interesnoe toa {to, specifi~nosta na gama-delta cirkulira~kite kletki kaj gluvcite i drugite vidovi koi seprou~uvaat ne e paralelna so specifi~nosta kaj lu|eto, {to ukaùva na faktot deka odgovorot nagama-delta moè da bide naso~en protiv patogenite so koi ~esto se sre}avaat razli~ni vidovi. Kajodredeni vidovi infekcii, procentot na gama-delta T kletki vo krvta ili vo specifi~en organ moèzna~itelno da porasne Infekciite so razli~ni bakterii vklu~uvaj}i gi dosta ~estite Mzna~itelno da porasne. Infekciite so razli~ni bakterii, vklu~uvaj}i gi dosta ~estite M.tuberkolozis i Hemofilius infulenca isto kako i paraziti od malarija i lei{manija, dovedoa dozgolemen broj na gama-delta kletki. Gama-delta kletkite moè da ubijat zarazeni kletki iliorganizmi so upotreba na mehanizmi koi se sli~ni na mehaznimite od Tct (granulizin i perforin,vidi poglavje 14). Dopolnitelni podatoci za gama-delta kletkite gi vklu~uvaat kletkite vohroni~nite avtoimuni bolesti, vklu~uvaj}i lupus, miozitis i multipla skleroza. Spored toa,podatocite koi pokaùvaat deka gama-delta kletkite moàt da la~at spektar od hemokini i citokiniukaùvaat na faktot deka tie moè da igraat regulatorna uloga vo regrutiraweto na alfa-beta Tkletkite vo oblasta na invazija od patogenite. Regrutiranite alfa-beta T kletki prvenstveno }eprikaàt {irok spektar na receptori. Onie kletki so najvisok afinitet selektivno }e se ativiraati zasilat za da se spravat so patogenot.Ulogite i mehaznimite na funkcijata na gama-delta T kletkata pretstavuvaat aktivna istraùva~kafu c j d r u r uoblast i dosta ostanuva da se nau~i. Od poseben interes e poprecizniot profil na opsegot naprotivgenite koi moàt da bidat prepoznaeni od strana na gama-delta receptorot i dali toj moè daprepoznae protivegen vo smisla na neklasi~nite GTK molekuli. Neodmane{nite prou~uvawa istotaka pokaàa deka samite gama-delta kletki moè da sluàt kako protivgen prikaùva~ki kletki(PPK), na toj na~in vo golema mera dopolnuvaj}i go nivniot funkcionalen potencijal.

6

(slika 9-5 Organizacija na zarodi{nata linija kaj TKR genski segmenti so alfa,beta gama i delta verigata kaj glu{ec Sekoj genski segment K e sostaven od serijabeta, gama i delta verigata kaj glu{ec. Sekoj genski segment K e sostaven od serijaegzoni i introni, koi ne se prikaàni. Organizacijata na TKR genskite segmentikaj lu|eto e sli~na iako brojot na razli~nite genski segmenti vo odredeni slu~aise razlikuva (vidi tabela 9-2). Brojot na genskite segmenti koj e ovde prikaàn sesrednite vrednosti za razli~nite vidovi na glu{ec, a vklu~eni se i psevdogeni.

Organizacija i preureduvawe na genite od TKR

Genite koi gi kodiraat alfa-beta i gama-delta T-kleto~nite receptori seprikaàni samo vo kletkite od T-kleto~nata linija. êtirite TKR podra~ja (alfa,beta, gama i delta) vo zarodi{nata linija se organizirani na na~in koj e dostasli~en so pove}egenskata organizacija na imunoglobulinskite (Ig) geni (slika 9-5). Kako vo slu~ajot na Ig genite, funkcionalnite TKR geni se sozdavaat sopreureduvawe na V i J segmentite vo familiite so alfa i gama veriga i V, D i Jsegmentite vo familiite so beta i delta veriga. Kaj glu{ecot, genskite segmentiso alfa, beta i gama veriga se nao|aat vo hromozomite 14, 6 i 13. Genskite segmentif r rso delta veriga se loklizirani na hromozomot 14 pome|u segmentite Valfa i Jalfa.Mestopolo`bata na genskiot segment so delta veriga e zna~ajna: produktivnotopreureduvawe na genskite segmenti so alfa veriga go bri{e Kdelta, taka {to, kajdadena T kletka, TKR receptorot so alfa-beta ne moè da se ko-prikaùva soreceptorot gama-delta. Za otkrivawe na drugite funkcii na T kletkite so alfa-beta i delta-gama zna~ajno e re{itelnoto posvetuvawe na kletkite.

7

DNK od zarodi{nata linija na glu{ecot sodrì okolu 80 genski segmentiValfa i 40 genski segmenti Jalfai eden genski segment Kalfa. Familijatana genite so delta veriga sodrì okolu 10 genski segmenti V, koi se dostarazli~ni od genskite segmenti Valfa, iako zabeleàno e odredeno delewena segmentite V kaj preuredenite geni so alfa i delta veriga. Isto takautvrdeni se dva genski segmenti Ddelta i Jdelta i eden segment Kdelta.Familijata na genite na beta verigata ima od 20 do 30 genski segmenti V idve skoro identi~ni povtoruvawa na segmentite D, J i K, pri {to sekoepovtoruvawe se sostoi od eden Dbeta, {est Jbeta i eden Kbeta. Familijatana genite od gama verigata se sostoi od sedum segmenti Vgamai tri razli~nifunkcionalni povtoruvawa Jgama- Kgama. Organizacijata na familiite naTKR od pove}e geni kaj lu|eto e sli~na so onaa kaj gluvcite, iako serazlikuva vo brojot na segmenti (tabela 9-2). Pri site slu~ai, familiite nageni moè da vklu~uat ~lenovi so mutacii koi gi pravat nefunkcionalni(psevdogeni) i ovie geni normalno se vklu~eni vo brojot na genite vofamilijata osven ako ne se nazna~at funkcionalni geni. Na primer, tabela9-3 vklu~uva samo funkcionalni geni bidej}i psevdogenite ne pridonesuvaatza razli~ieto, dodeka slika 9-5 gi vklu~uva site geni od zarodi{nata linija.

8

TKR genite so varijabilno podra~je se preureduvaat na na~in koj e sli~en naprotivtelnite geni

Verigata alfa, kako i verigata L od imunoglobulinot, e kodirana sogenskite segmenti V, J i K. Verigata beta, kako i verigata T odimunoglobulinot, e kodirana od genskite segmenti V, D, J i K.Preureduvaweto na TKR genskite segmenti so veriga alfa i beta doveduva dopovrzuvawe VJ za verigata alfa i povrzuvawe VDJ za verigata beta (slika 9povrzuvawe VJ za verigata alfa i povrzuvawe VDJ za verigata beta (slika 9-6).

9

(slika 9-6Primer za preureduvawe na genite koi ovozmoùvaat kodirawe na alfa-beta T-kleto~niot receptor od strana na funkcionalniot genDNK od alfa verigata, koja e analogna na DNK od lesnata veriga na imunoglobulinot, podleì na povrzuvawe na promenlivite podra~ja Valfa i Jalfa. DNK od beta verigata, koja eanalogna na DNK od te{kata veriga na imunoglobulinot, podleì na dve povrzuvawa vo promenlivoto podra~je: prvo Dbeta so Jbeta a potoa Vbeta za DbetaJbeta. Prepi{uvaweto nar u u r u r r j r r upreuredenite geni dava prvi~ni prepi{uvawa, koi se prerabotuvaat za da dadat mRNK koj gi kodira alfa i beta verigite na TKR koj se vrzuva za membrana. Liderskata sekvenca serazgraduva od strana na po~etnata polipeptidna veriga i ne e prisutna vo krajniot protein. Zemaj}i predvid deka nema sozdavawe na izla~en TKR, ne nastanuva diferenciskoprerabotuvawe na prvi~nite prepi{uvawa za da se sozdadat formi koi se la~at na ili se vrzuvaat za membranata. Iako DNK od beta verigata sodrì dva geni K, genskite produkti odovie dva K geni ne prikaùvaat poznati funkcionalni razliki. Genite K se sostaveni od odreden broj egzoni i introni, koi ovde ne se poedine~no prikaàni (vidi slika 9-7).

Po prepi{uvaweto na preuredenite TKR geni, prerabotuvaweto i preveduvaweto na RNK, alfa i beta verigite se prikaàni kako disulfidno-povrzan hetrodimer vrz membranata od Tkletkata. Za razlika od imunoglobulinite, koi moàt da bidat izla~eni ili prikaàni vrz membranata, heterodimerot alfa se prikaùva samo vo forma koja e vrzana za membranata.Spored toa, nema diferencijalno prerabotuvawe na RNK za sozdavawe formi koi se la~at na ili se vrzuvaat vrz membranata. Sekoj TKR so konstantno podra~je vklu~uva konstantendomen, sekvenca za povrzuvawe, transmembranska sekvenca i citoplazmatska sekvenca.DNK od zarodi{nata linija koja gi kodira konstantnite podra~ja od verigite alfa i beta od TKR e podnostavna od DNK za te{kata veriga od zarodi{nata linija kaj imunoglobulinite,koja ima pove}e genski segmenti K koi kodiraat razli~ni izotipovi so razli~ni efektorni funkcii. DNK od verigata alfa na TKR ima samo eden genski segment K, DNK od verigabeta vklu~uva dupli genski segmenti J i K. Proteinskite segmenti od dvete grupi se razlikuvaat samo po odreden broj amino kiselini i nemaat poznati funkcionalni razliki.

Mehanizam na preureduvawe na DNK za TKRMehanizamite preku koi DNK od zarodi{nata linija na TKR se prerureduva za da se sozdadat funkcionalni receptorni geni e sli~na na mehanizmite za preureduvawa na Ig genite. Naprimer, za rekombinaciskite signalni sekvenci (RSS) kaj heptamerite i nonamerite, koi sodràt oddeluva~ki sevenci ili od 12-bp (edno-pomestuvawe) ili od 23-bp (dve pomestuvawa),r r r ( ) j r r r u ( u ) ( u )utvrdeno e deka go popre~uvaat sekoj genski segment V, D i J vo DNK od zarodi{nata linija kaj TKR (vidi slika 5-6). Site preureduvawa na genite kaj TKR go sledat praviloto zapovrzuvawe od edno/dve pomestuvawa koe sre}ava kaj Ig geni, taka {to rekombinacijata moè da nastane samo pome|u dva razli~ni tipovi na RSS.Kako i pre-B kletkata, pre-T kletkata gi prikaùva genite koi se aktiviraat so rekombinacija (RAG-1 i RAG-2). Rekombinatorskiot enzim RAG-1/2 gi prepoznava signalite zaprepoznavawe kaj heptamerot i nonamerot i go katalizira povrzuvaweto V-J i V-D-J pri preureduvawe na genite od TKR preku istite mehanizmi za bri{ewe i inverzija koi sepojavuvaat kaj Ig geni (vidi slika 5-7). Kako {to e objasneto vo poglavje 5 za imunoglobulinskite geni, RAG-1/2 zapo~nuva so zasek na del na DNK pome|u kodnite i signalnite sekvencii prodolùva da gi se~e jamkite na DNK koi se formiraat pri procesot. Produktite od trkaleznoto se~ewe za koi se veruva deka nastanuvaat so otstranuvawe i bri{ewe pripreureduvawe na genite od TKR se utvrdeni kaj timocitite (vidi slika 5-8).Prou~uvawata so SCID gluvcite, koi imaat nedostatok na funkcionalni T i B kletki, ovozmoùvaat dokaz za sli~nosta na mehanizmite za preureduvaweto na Ig-geni i TKR genite.Kako {to e objasneto vo poglavje 20, SCID gluvcite imaat defekt vo genot koj e potreben za popravka na procepite kaj dvoveri`nata DNK. Kako rezultat na ovoj defekt, genskitesegmenti D i J ne se povrzani pri preureduvawe na DNK od Ig ili od TKR (vidi slika 5-10). Ovoj naod ukaùva na faktot deka istite enzimi koi popravaat procep kaj dvojnite verigi sevklu~eni vo preureduvawata V-D-J kaj B kletkite i T kletkite.Iako B i T kletkite koristat dosta sli~ni mehanizmi za gensko preureduvawe na varijabilnoto podra~je, kaj T kletkite ne nastanuva celosno preureduvawe na Ig genite i kaj Bkletkite ne nastanuva celosno preureduvawe na TKR genite. Ne samo {to rekombinantniot enzimski sistem e razli~no reguliran kaj sekoja loza, tuku hromatinot e posebnorekonfiguriran kaj B i T kletkite za da $ ovozmoì na rekombinazata vlez do sodvetnite receptorni geni koi se specifi~ni za protivgen. Preureduvawata na genskite segmenti kaj Ti B kletkite sozdava sekvenci od DNK koi se edinstveni za taa kletka i za nejziniot potomok. Golemiot broj na mo`ni konfiguracii za preuredenite geni ovaa nova sekvenca ja praviozna~uva~ koj e specifi~en za klonot na kletkata. Ovie unikatni sekvenci od DNK se koristat za postavuvawe dijagnozata i lekuvaweto na limfoidnite leukemii i limfomi, kancerikoi vklu~uvaat razmnoùvawe na klonovite od T i B kletkite (vidi klini~ki fokus na strana 232).

Alelsko isklu£uvawe kaj TKR geniteKako {to spomenavme prethodno, delta genite se postaveni vo kompeleksot na alfa genot i se bri{at so preureduvawe na alfa verigata. Ovoj proces ovozmoùva nezamenliv na~in naisklu~uvawe na delta genite koi se postaveni na istiot hromozom kako i prerureduva~kite geni alfa. Isto taka nastanuva i alelsko isklu£uvawe kaj alfa i beta TKR genite , no ima iisklu~oci.Organizacijata na genskite segmenti J i K so beta verigata vo dve dupli grupi zna~i deka ako nastane neproduktivno preureduvawe, timocitot moè da proba da napravi vtoropreureduvawe. Ova ja zgolemuva mo`nosta za produktivno preureduvawe na V-J za verigata beta. [tom nastane produktivno preureduvawe za eden alel od beta verigata, preureduvawetona drugiot beta alel ne moè da se spre~i.Isklu~ocite za alelsko isklu£uvawe naj~esto se sre}avaat kaj TKR geni so alfa verigite. Na primer, analizite na T-kleto~nite klonovi koi prikaùvaat funkcionalen alfa-beta T-kleto~en receptor otkrija odreden broj na klonovi so produktivni preureduvawa kaj dvata alela od alfa verigata. Pokraj toa, koga nezrel T-kleto~na limfom koj prikaùva posebenalfa-beta T-kleto~en receptor e podklon, dobieni se odreden broj na podklonovi koi go prikaùvaat istiot alel od beta verigata, no alelot od alfa verigata koj e razli~en od alelotprikaàn od klonot na originalniot roditel. Prou~uvawata so transgeni~nite gluvci isto taka ukaùvaat na faktot deka alelskoto isklu£uvawe e pomalku ograni~eno za TKR geniteza alfa verigata otkolku za genite za beta verigata. Sepak, endogenite geni so alfa verigata ponekoga{ se prikaùvaat na razli~ni nivoa na mestoto od transgenot so alfa veriga koje ve}e preureden.Zemaj}i predvid deka alelskoto isklu£uvawe ne e celosno za TKR so alfa veriga, vo odredeni slu~ai vrz membranata od dadena T kletka se prkaàni pove}e od edna alfa veriga.Neizbe`no pra{awe e, kako retkite T kletki koi prikaùvaat dva alfa-beta T-kleto~ni receptori odrùvaat ista specifi~nost za povrzuvawe protivgen? Eden predlog tvrdi dekakoga T kletkata prikaùva dva razli~ni alfa-beta T-kleto~ni receptori, samo edniot receptor moè da bide so ograni~uvawe kon sopstveniot-GTK i na toj na~in taa e funkcionalna.

10

(slika 9-7 [ematski prikaz na preuredeni alfa-beta T-kleto~ni geni koipokaùvaat egzoni koi gi kodiraat razli~nite domeni od T kleto~niot receptorpokaùvaat egzoni koi gi kodiraat razli~nite domeni od T-kleto~niot receptoralfa-beta i pribli`nata pozcija na KOP. Raznovidnosta pri povrzuvawe(vertikanlnite strelki) sozdavaat KOP3 (vidi slika 9-8). Strukturite napreurednite geni so gama i delta veriga se sli~ni, iako kaj genite so delta verigamoè da nastane dopolnitelelna raznovidnost pri povrzuvawe.

Preuredenite geni od TKR se grupiraat od genskite segmenti V, J i D

Osnovanata struktura na preuredenite geni kaj TKR se prikaàni na slika 9-7.Promenlivite podra~ja od T-kleto~nite receptori se, se razbira, kodirani odstrana na preuredenite sekvenci VDJ i VJ. Kaj genite od TKR, kombinatorskotopovrzuvawe na genskite segmenti V so alfa i beta verigi gi sozdava KOP1 iKOP2, dodeka fleksibilnosta pri povrzuvawe i dodavaweto na nukleotidnotopodra~je N sozdava KOP3. Preuredenite geni od TKR isto taka sodràt kratokliderski (L) egzon od gorniot kraj od povrznite sekvenci VJ i VDJ. Aminokiselinite koi se kodirani od liderskiot egzon se razloùvaat koga prvi~niotr r r u rpolipeptid navleguva vo endoplazmatskiot retikulum.Konstantnoto podra~je od sekoja veriga od TKR e kodirano od strana na genskiotsegment K koja ima pove}e egzoni (vidi slika 9-7), koi odgovaraat na strukturnitedomeni vo proteinot (vidi slika 9-3). Prviot egzon vo genskiot segment K gokodira pogolemiot del od domenot K vo soodvetnata veriga. Sleden e kratok egzonkoj ja kodira povrzuva~kata sekvenca, po {to sledat egzoni koi go kodiraattransmembranskoto podra~je i citoplazminiot kraj.

11

(slika 9-8 Sporedba na mehanzimite za sozdavawe razli~ie kaj genite od TKR i imunoglobulinskite geni. Vo prilog na mehanizmite koi se prikaàni ovde dodavaweto nanukleotidnoto P-podra~je nastanuva i kaj genite od TKR i kaj genite od Ig, a kaj Ig geni nastanuva somatska mutacija. Kombinatorskoto povrzuvawe na prikaànite verigi sozdavadopolnitelno razli~ie kaj molekulite na TKR i Ig.

Razli~ieto na TKR se sozdava sli~no kako razli~ieto na protivteloto, no bez somatska mutacija

Iako DNK od TKR vo zarodi{nata linija sodrì dosta pomalku genski segmenti V otkolku DNK vo zarodi{nata linija na Ig, nekolku mehanizmi koi rabotat pri preurduvaweto naTKR genite pridonesuvaat za visok stepen na razli~ie kaj T-kleto~nite receptori. Tabela 9-3 i slika 9-8 pravat sporeba na sozdavaweto i raznovidnosta na molekulite od protivtelatai molekulite od TKR.Kombinatorsko povrzuvawe na varijabilnoto podra~je na genskite segmenti sozdava golem broj na slu~ajni kombinacii na geni za site verigi od TKR, kako {to toa go pravi kajte{kite i lesnite verigi vo Ig geni. Na primer, kaj gluvcite 79 funkcionalni Valfa i 38 Jalfa genski segmenti moè da sozdadat 3,0 h 10 mo`ni kombinacii na VJ za alfa verigatavo TKR. Sli~no na toa, 21 genski segment Vbeta 2 genski segmenti Dbeta i 11 genski segmenti Jbeta moàt da dadat 4,6 h 10 mo`ni kombinacii za beta verigata. Iako ima pomalkugenski segmenti Valfai Vbeta otkolku segmenti VT i VL kaj imunoglobulinite ovaa razlika e nadminata so pogolem broj genski segmenti J vo DNK od zarodi{nata linija kaj TKR. Akose pretpostavi deka specifi~nosta za vrzuvawe protivgen kaj daden T-kleto~en receptor zavisi do varijabilnoto podra~je vo dvete verigi, povrzuvaweto po slu~aen izbor na 3 h 10kombinacii na Valfa so 4,6 h 10 kombinacii na Vbeta moè da sozdade 1,4 h 10 mo`ni kombinacii za alfa-beta T kleto~niot receptor. Dopolnitelnite na~ini za sozdavawe razli~iekaj V genite vo TKR se ponatamu objasneti, koi pravat 1,4 milioni kombinacii kako minimalna presmetka.Kako {to e prikaàno na slika 9-8b, lokacijata na rekombinaciskite signalni sekvenci (RSS) od edno (12-bp) i dve pomestuvawa (23-bp) vo TKR vo beta i delta verigite od DNK serazlikuva od DNK vo te{kata veriga kaj Ig. Poradi rasporeduvaweto na RSS vo DNK od zarodi{nata linija na TKR se zabeleùva alternativno spojuvawe na D genskite segmenti koemoè da se javi pri praviloto za spojuvawe od edno ili dve pomestuvawa. Spored toa, mo`no e genskite segmenti Vbeta direktno da se povrzat so genskiot segment Jbeta ili Dbeta,sozdavaj}i edinica (VJ)beta ili (VDJ)beta.Alternativnoto povrzuvawe na genskite segmenti od delta verigata sozdava sli~ni ednici Spored toa eden Ddelta moè da se povrze so drug davaj}i (VDDJ)beta i kaj lu|etoAlternativnoto povrzuvawe na genskite segmenti od delta verigata sozdava sli~ni ednici. Spored toa, eden Ddelta moè da se povrze so drug davaj}i (VDDJ)beta i kaj lu|eto(VDDDJ)beta. Ovoj mehanizam, koj ne moè da funkcionira vo DNK od te{kata veriga kaj Ig sozdava zna~ajno dopolnitelno razli~ie kaj genite od TKR.

Povrzuvaweto na genskite segmenti pri preureduavweto na genite od TKR pokaùva fleksibilnost pri povrzuvawe. Kako i so genite od Ig fleksibilnosta moè da sozdade mnoguneproduktivni preureduvawa, no isto taka go zgolemuva razli~ieto so kodiraweto na nekolku aleternativni amino kiselini pri sekoe povrzuvawet (vidi slika 9-8v). I kaj genite odIg i kaj genite od TKR na spoevite moè da se dodadat nukleotidi pome|u odreden broj genski segmenti pri preureduvaweto (vidi slika 5-13). Varijacijata vo endonukleaznotorase~uvawe vodi kon dodavawe na ponatamo{ni nukleotidi koi se palindromini. Takvo dodavawe vo nukleotidno podra~je-P moè da nastane kaj genite koi gi kodiraat site verigi odTKR i Ig. Dodavaweto na nukleotidite vo podra~je N, koe e katalizirano od strana na terminalnata deoksinukleotidna transferaza sozdava dopolnitelno razli~ie pri povrzuvaweto.Dodeka dodavaweto na nukleotidite vo podra~jeto N vo imunoglobulinite nastanuva samo kaj genite od Ig te{ka veriga toa nastanuva vo genite koi gi kodiraat site verigi od TKR.Pribli`no {est nukleotidi moè da se dodadat so ovoj mehanizam pri sekoj spoj, sozdavaj}i do 5461 mo`ni kombinacii, so izbor na nukleotidi po slu~aen izbor (vidi slika 9-8d).Sepak, del od ovie kombinacii vodi kon neproduktivni preureduvawa so momentalno vmetnuvawe na stop kodoni koi predvremeno ja prekinuvaat verigata od TKR ili preku zamena naamino kiselinite go pravat prozivodot nefunkcionalen. Iako sekoe povrzuva~ko podra~je vo genot na TKR kodira samo 10 do 20 amino kiselini, vo ovie podra~ja moè da se sozdadeogromno razli~ie. Procenkite pokaùvaat deka kombiniranite efekti pri dodavaweto na nukleotidite vo podra~jata N i P i fleksibilnosta pri povrzuvawe moè da sozdadat do 10mo`ni sekvenci od amino kiselini vo povrzuva~kite podra~ja od TKR.Mehanizamot so koj se sozdava rzli~ieto vo TKR mora da mu ovozmoì na receptorot da prepoznae golem broj na razli~ni preraboteni protivgeni istovremeno ograni~uvaj}i gonegovoto razli~ie za prepoznavawe na repertoarot na GTK na dosta pomal broj na molekuli od sopstveniot GTK. DNK od TKR ima dosta pomalku genski segemnti V od DNK kaj Ig (viditabela 9-3). Istraùva~ite predpostavile deka za kodirawe ograni~eniot broj na podra~ja na KOP1 i KOP2 so afinitet za podra~ja od molekulite od GTK so alfa spirali e izbranpomal broj na genski segmenti V vo DNK od TKR. Najverojatno ovaa privle~na ideja e neto~na spored najnovite podatoci od strukturata na kompleksot TKR-peptid-GTK koj pokaùvakontakt pome|u peptidot i KOP1 isto kako i KOP3. Spored toa, ostatocite od TKR koi se vrzuvaat za peptidot nasproti ostatocite koi se vrzuvaat za GTK ne se samo na visokotovarijabilno podra~je KOP3.Nasproti ograni~enoto razli~ie na KOP1 i KOP2, KOP3 od TKR sepak ima pogolemo razli~ie otkolku razli~ieto koe se sre}ava kaj imunoglobulinite. Raznovidnosta na KOP3 sesozdava so razli~ieto pri povrzuvaweto na segmentite V, D i J, povrzuvaweto na pove}e genski segmenti D i vklu~uvaweto na P i N nukleotidite pri povrzuvaweto na V-D-J i V-J (vidislika 9-7).Za razlika od genite na Ig, genite od TKR ne pretrpuvaat somatska mutacija. Odnosno, funkcionalnite TKR geni koi se sozdavaat preku gensko preureduvawe pri zreeweto na T-kletkite vo timusot gi imaat istite sekvenci kako sekvencite koi se sre}avaat kaj populacijata na zrelite periferni T kletki. Otsustvoto na somatskata mutacija kaj T kletkiteobezbeduva specifi~nosta na T kletkite da ne se menuva po izborot na timusot i so toa ja namaluva mo`nosta mutacijata po slu~aen izbor da sozdade T kletka koja e samo-reaktivna.Iako nekolku eksperimenti ovozmoìja dokaz za somatskata mutacija na receptornite geni vo T kletkite od zarodi{niot centar, ova e isklu~ok, a ne pravilo.

12

(slika 9-9 [ematski prikaz na TKR-KD3 komleksot, koj go so~inuva T-kleto~niot protivgen vrzuva~ki receptor. (a) Delovite na KD3 kompleksot govklu~uvaat homodimerot zetazeta (alternativno i heterodimerot zetaeta) plus heterodimerite gamaepsilon i deltaepsilon. Nadvore{nite domeni nagama, delta i epsilon verigite vo KD3 se sostojat od ovbitkuvawa so imunoglobulin, {to go olesnuva nivnoto me|udejstvo so T-kleto~niot receptor i, d r D j d u u u , u ud j r c rme|usebno. Dolgite citoplazmatski opa{ki na verigite od KD3 sodràt zaedni~ka sekvenca, imunoreceptoren tirozin aktivira~ki motif (ITAM), kojima funkcija vo prenesuvaweto na signalot; ovie sekvenci se prikaàni kako sini pregradi. (b) Isto taka, pome|u sprotivno naelektriziranitetransmembranski podra~ja vo verigite od TKR i KD4 moè da nastanat jonski me|udejstva. Prikaàni se ponudenite me|udejstva pome|u sostavnitedelovi od KD3 i alfa-beta TKR.

T kleto~en receptoren kompleks: TKR-KD3Kako {to objasnivme vo poglavje 4, membranski vrzaniot imunoglobulin vo B kletkite se povrzuva so drug membranski protein, heterodimerot Ig-alfa/Ig-beta, za da go fomira B-kleto~niot protivgen receptor (vidi slika 4-22). Sli~no na toa, T-kleto~niot receptor se povrzuva so KD3,formiraj}i membranski kompleks TKR-KD3. I vo dvata slu~ai, pomo{nata molekula u~estvuva vo prenesuvaweto na signalot po me|udejstvoto na B i Tkletkata so protivgenot. Toj ne vlijae na me|udejstvoto so protivgenot.Prviot dokaz koj predlaga deka T-kleto~niot receptor e povrzan so druga membranska molekula doa|a od eksperimentite pri koi fluorescentnotoprotivtelo za receptorot predizvikuva nasobirawe na drug membranski protein, nare~en KD3. Podocne`nite eksperimenti od strana na X. P. Alison iL. Lanier koi koristat reagensi za vkrsteno-povrzuvawe pokaàa deka dvete verigi mora da bidat vo 12Å. Ponatamo{nite eksperimenti pokaàa dekane samo {to KD3 e tesno povrzan so alfa-beta heterodimerot, tuku isto taka negovoto prikaùvawe e potrebno za membranskoto prikaùvawe na alfa-beta i gama delta T kleto~nite receptori sekoj heterodimer formira komleks so KD3 na T kleto~nata membrana Zagubata na genite koi go kodiraatbeta i gama-delta T kleto~nite receptori - sekoj heterodimer formira komleks so KD3 na T kleto~nata membrana. Zagubata na genite koi go kodiraatKD3 ili verigite od TKR rezultira so zaguba na celiot molekulski kompleks od membranata.KD3 e soedinenie od pet nepromenlivi polipeptidni verigi koi se povrzuvaat za da formiraat tri dimeri: heterodimer so verigi gama i epsilon(gamaepsilon), heterodimer so verigi delta i epsilon (deltaepsilon) i homodimer od dva zeta verigi (zetazeta) ili heterodimer so verigi zeta i eta(zetaeta) (slika 9-9A). Verigite zeta i eta se kodirani od strana na istiot gen, no se razlikuvaat vo nivnite karboksilno-terminalni kraevi zaradirazlikite vo prekrojuvaweto na prvi~niot zapis od RNK. Pribli`no 90% od KD3 kompleksite koi do denes se ispitani go vklu~uvaat zetazetahomodimerot, a ostatokot imaat heterodimer zetaena. Na toj na~in T-kleto~niot kompleks moè da se zamisli kako ~etiri dimeri: alfa-beta ili gama-delta TKR heterodimer ja odreduva ligand vrzuva~kata specifi~nost, dodeka KD3 dimerite (gamaepsilon, deltaepsilon i zetazeta ili zetaena) sepotrebni za membransko prikaùvawe na T-kleto~niot receptor i za prenesuvawe na signalot.Gama, delta i epsilon verigite od KD3 se ~lenovi na imunoglobulinskata superfamilija, pri {to sekoj sodrì imunoglobulinski-sli~en vonkleto~endomen po koj sledi transmembransko podra~je i citoplazmatski domen so pove}e od 40 amino kiselini. Verigata zeta ima posebno razli~na struktura, sodosta kratko nadvore{no podra~je od samo devet amino kiselini, transmembransko podra~je i dolga citoplazmatska opa{ka koja sodrì 113 aminokiselini. Transmembranskoto podra~je od site KD3 polipeptidni verigi sodràt negativno naelektrizirani ostatoci od amino kiselini (asparginskaili glutaminska kiselina) koja stapuva vo me|udejstvo so edna ili dve pozitivno naelektrizirani amino kiselini vo transmembranskoto podra~je nasekoja veriga od TKR. Delovite od KD3 kompleksot i sredstvata preku koi tie stapuvaat vo me|udejstvo so alfa-beta TKR se prikaàni na slika 9-9b.Citoplazmatskite opa{ki na verigite vo KD3 sozdràt motif nare~en imunoreceptoren tirozin aktivira~ki motif (ITAM). ITAM se sre}avat kajbrojni drugi receptori, vklu~uvaj}i go i Ig-alfa/Ig-beta heterodimerot od B-kleto~no receptorniot kompleks i Fk receptorite od IgE i IgG. Sebrojni drugi receptori, vklu~uvaj}i go i Ig alfa/Ig beta heterodimerot od B kleto~no receptorniot kompleks i Fk receptorite od IgE i IgG. Sepokaà deka oblastite na ITAM stapuvaat vo me|udejstvo so tirozin kinazata i igraat zna~ajna uloga vo prenesuvaweto na signalot. Kaj KD3, gama,delta i epsilon verigite sodràt eden ITAM, dodeka verigite zeta i eta sodràt tri kopii (vidi slika 9-9a). Funkcijata na KD3 vo prenesuvaweto nasignalot e podetalno objasneta vo poglavje 10.

13

T-kleto~ni pomaga~ki membranski molekuli

Iako prepoznavaweto na protivgen-GTK kompleksite e posreduvano samo odstrana na TKR-KD3 kompleksot, razni drugi membranski molekuli igraatzna~ajni pomaga~ki ulogi vo prepoznavaweto na protivgenot i aktivirawetona T-kletkata (tabela 9-4). Del od ovie molekuli go zajaknuvaatme|udejstvoto pome|u T kletkite i protivgen prika`uva~kite kletki ilicelnite kletki nekoi od niv imaat uloga vo prenesuvaweta na signalot acelnite kletki, nekoi od niv imaat uloga vo prenesuvaweta na signalot,anekoi u~estvuvaat i vo dvata procesa.

14

(slika 9-10 Osnovna struktura na koreceptorite KD4 i KD8;imunoglobulinovidnite domeni se prikaàni kako krugovi KD8 ja zema formataimunoglobulinovidnite domeni se prikaàni kako krugovi. KD8 ja zema formatana alfa-beta heterodimerot ili na alfaalfa heterodimerot. Monomernata KD4molekula sodrì ~etiri domeni obvitkani so imunoglobulini; sekoja veriga vomolekulata KD4 sodrì eden domen.

Koreceptorite KD4 i KD8 se vrzuvaat za za~uvanite podra~ja od molekulite odklasa 1 i klasa 2 od GTKT kletkite moàt da se podelat na dve subpopulacii spored nivnoto prikaùvawed d d u u c r d r uvrz membranskite molekuli KD4 i KD8. Kako {to e objasneto vo predhodnitepoglavja, KD4 T kletkite prepoznavaat protivgen koj e spoen so molekulite odklasa 2 od GTK i vo golem del funkcionirat kako pomaga~ki kletki, dodeka KD8 Tkletkite prepoznavaat protivgen koj e povrzan so molekulite od klasa 1 od GTK ivo golem del funkcioniraat kako citotoksi~ni kletki. KD4 e monomerenmembranski glikoprotein od 55 kDa koj sodrì ~etiri vonkleto~ni sli~ni naimunoglobulinite domeni (D -D ), hidrofobno transmembransko podra~je i dolgacitoplazmatskna opa{ka (slika 9-10) koja se sostoi od tri ostatoci na serin vrz

f f j V KD8 j fkoi moè da se izvr{i fosforilacija. Vo osnova KD8 ja zema formata nadisulfidno povrzan alfa-beta heterodimer ili na homodimer alfaalfa. I alfa ibeta verigata od KD8 se mali glikoproteini od pribli`no 30 do 38 kDa. Sekojaveriga sodrì eden vonkleto~en imunoglobulinski sli~en domen, podra~je koelovi, hidrofobno trabsmembransko podra~je i citoplazmatska opa{ka (slika 9-10)koja sodrì 25 do 27 ostatoci, pri {to vrz del od niv moè da se izvr{ifosforilacija.

15

(slika 9-11 Me|udejstvoto na koreceptorite so TKR i GTK molekulite. (a) Spiralnata {emapokaùva tridimenzionalna struktura na molekulata od klasa 1 HLA-A2 od GTK vrzana zau r d ru ur u d d rhomodimerot KD8 alfaalfa. Te{kata veriga na HLA-A2 e prikaàna so zelena boja,mikroglobulinot-beta so òlta boja, KD8 alfa1 so crvena boja, KD8 alfa2 so sina boja, a vrzaniotpeptid so bela boja. Podvi`nata jamka na alfa3 domenot (ostatoci 223-229) e vo kontakt so dvetepodedinici na KD8. Vo ovoj model, desnata strana na KD8 }e se priklu~i za T-kleto~nata membrana, adolniot lev kraj od molekulata od klasa 1 (domenot alfa3) od GTK e prika~en za povr{inata nacelnata kletka. (b) Me|udejstvoto na vonkleto~niot domen na KD4 so kompleksot klasa 2 od GTKpeptid (pGTK2).

KD4 i KD8 se klasificiriaat kako koreceptori bazirano na nivnite sposobnosti da go prepoznaatkompleksot peptid-GTK i nivnata funkcija vo prenesuvaweto na signalot. Vonkleto~nite domeni naKD4 i KD8 se vrzuvaat za za~uvanite podra~ja na molekulite od GTK na protivgen prikaùva~kiteD D8 se rzu aa za za u a e odra ja a ole ul e od a ro e r a u a ekletki (PPK) ili na celnite kletki. Kristalografskite prou~uvawa na komleksot koj e sostaven odmolekulite od klasa 1 HLA-A2 od GTK, protivgenskiot peptid i KD8 homodimerot alfaalfapokaùvaat deka KD8 se vrzuva za molekuli od klasa 1 preku stapuvawe vo kontakt so domenite odklasa 1 alfa2 i alfa3 od GTK isto kako i ostvaruvaweto kontakt so mikroglobulinot beta (slika 9-11a). Naso~uvaweto na klasa 1 alfa3 domenot pri povrzuvawe so KD8 malku se menuva. Ovaa strukturae vo skladnost so edinstvena GTK molekula vrzana za KD8. Ne se zabeleì nikakov dokaz za mo`nostana pove}emeri~nite klasa 1 do KD8 komleksi. Sli~ni strukturni podatoci go potvrduvaat na~inot nakoj KD4 se vrzuva za molekulata od klasa 2. Me|udejstvoto pome|u KD4 i GTK 2 vklu~uva kontakt nakrajnite domeni od membranata na KD4 so hidrofobnata pregrada koja se formira so ostatoci odalfa2 i beta2 domenite od GTK 2 (slika 9-11b). KD4 go olesnuva prenesuvaweto na signalot i T-kleto~noto aktivirawe na kletkite koi gi prepoznavaat kompleksite klasa 2-peptid.D KD4 KD8 jDali ima razlika vo ulogite koi gi igraat koreceptorite KD4 i KD8 ostanuva otvoreno za diskusija.Pokraj sli~nostite vo strukturata, setete se deka prirodata na povrzuvaweto na peptidot za klasa 1 iklasa 2 molekulite se razlikuva po toa deka molekulata od klasa 1 ima zatvoren `leb koj se vrzuva zakratok peptid so povisok stepen na specifi~nost. Neodamne{nite podatoci pokaùvaat deka agolotpod koj TKR mu pristapuva na kompleksot peptid- GTK se razlikuva pome|u klasa 1 i klasa 2.Razlikite vo ulogite koi gi igraat koreceptorite KD4 i KD8 moè da proizleguvaat od razlikite vopotrebite za povrzuvawe. Kako {to }e objasnime vo poglavje 10, povrzuvaweto na molekulite KD4 iKD8 sluì za prenesuvawe na stimulatorni signali do T kletkite; svojstvata na prenesuvaweto nasignalot kaj KD4 i KD8 se posreduvani preku nivnite citoplazmini domeni.

16

(slika 9-12 Ulogata na koreceptorite vo vrzuva~kiot afinitet na TKR. (a) Razdvojuvawetoe postojano vo razli~ni biolo{ki sistemi. (b) [ematsko prikaùvawe na me|udejstvatae postojano vo razli~ni biolo{ki sistemi. (b) [ematsko prikaùvawe na me|udejstvatapome|u T-kleto~niot receptor i peptid-GTK kompleksot i razli~ni pomaga~ki molekuli sonivnite ligandi na protivgen-prikaùva~kata kletka (levo) ili celnata kletka (desno).Povrzuvaweto na koreceptorite KD4 i KD8 i drugite pomaga~ki molekuli za nivniteligandi ja zajaknuva vrskata pome|u kletkite koi stapuvaat vo me|udejstvo i/ili go olesnuvaprenesuvaweto na signalot {to vodi do aktivirawe na T kletkata.

Afinitetot na TKR za kompleksot peptid-GTK e zasilen preku koreceptoriteAfinitetot (sklonosta) na T-kleto~nite receptori za kompleksot peptid-GTK e nizok dosreden, kade vrednostite na K se dviàt od 10 do 10 M. Ova nivo na afinitet e slabo vo

b | j K 10 10 Msporedba so me|udejstvoto protivgen-protivtelo koi imaat vrednosti za K od 10 do 10 M(slika 9-12a). Sepak, me|udejstvata na T kletkata ne zavisat edinstveno od vrzuvaweto naTKR. Kleto~no-prilepuva~kite molekuli ja zacvrstuvaat vrskata pome|u T kletkata iprotivgen-prikaùva~kata kletka ili celnata kletka. Nekolku drugi pomaga~kimembranski molekuli, vklu~uvaj}i gi KD2, LFA-1, KD28 i KD45R nezavisno se povrzuvaatza drugi ligandi na protivgen-prikaùva~kite kletki ili na celnite kletki (vidi tabela 9-4 i slika 9-12b). [tom prilepuva~kite molekuli }e go ostvarat kontaktot kletka-so-kletka,T-kleto~niot receptor moè da ja prebaruva membranata za kompleksi peptid-GTK. Priaktiviraweto na T kletkata od strana na peptid-GTK kompleksot doa|a do kratkotraenporast vo membranskoto prikaùvawe na kleto~no prilepuva~kite moelkuli,predizvikuvaj}i poblizok kontakt pome|u kletkite koi stapuvaat vo me|udejstvo i koipredizvikuvaj}i poblizok kontakt pome|u kletkite koi stapuvaat vo me|udejstvo i koiovozmoùvaat poefikasen prenos na citokinite ili citokinskite substanci. Nabrzo poaktiviraweto, stepenot na prilepuvawe se namaluva i T kletkata se odvojuva od protivgen-prikaùva~kata kletka ili od celnata kletka. Kako i KD4 i KD8, del od ovie drugimolekuli funkcioniraat kako signalni prenesuva~i. Zna~eweto na nivnata uloga eprikaàno so sposobnosta na monoklonskite protivtela koi se specifi~ni za vrzuva~kitemesta na kleto~nite prilepuva~ki molekuli da go blokiraat aktiviraweto na T kletkata.

17

(slika 9-13 Ulogata na KD4 pri stabiliziraweto na me|udejstvoto pome|u Tkletkata i protivgen prikaùva~kata kletka e zna~itelno olesneta sokontaktot na dve to~ki koj ne gi vklu~uva samo vonkleto~nite delovi od KD4i GTK molekulite od klasa 2 (vidi slika 9-11), tuku isto taka ivnatrekleto~noto me|udejstvo na KD4 i povrzanata molekulata zaprenesuvawe na signalot p56 so zeta verigata od KD3 kompleksot.

Najnovite podatoci za me|udejstvoto pome|u vonkleto~nite delovi na KD4 iNajnovite podatoci za me|udejstvoto pome|u vonkleto~nite delovi na KD4 ikompleksot peptid-klasa 2 pokaùvaat deka pome|u niv ima mal afinitet, apri nekoi eksperimenti nema vrzuvawe. Ovoj naod ne e dosleden na dokazotkoj pokaùva bliskost na KD4 so molekulite od klasa 2 (vidi slika 9-11).Soodvetno objasnuvawe za ovaa razlika e dadeno na slika 9-13, kade eprikaàno me|udejstvoto vo pove}e ~ekori pome|u KD4 i TKR kompleksot.Slikata pokaùva deka me|udejstvoto pome|u kompleksot TKR i molekulataKD4 e stabilizirano preku dvojni me|udejstva pome|u molekulata zaKD4 e stabilizirano preku dvojni me|udejstva pome|u molekulata zasproveduvawe na signalot p56 i KD4 i homodimerot ζζ od KD3 kompleksot.Slikata pokaùva i deka vklu~uvaweto na molekulite koi se vklu~eni vosproveduvaweto na signalot moè da imaat glavnata uloga za KD4 vrz T-kleto~nata membrana.

18

(slika 9-14 Tridimenzionalni struktri na kompleksot TKR-GTK-peptid. (a) Model koj pokaùva me|udejstvopome|u ~ove~kiot TKR (gore, òlta boja) i molekulata od klasa 1 HLA-A2 od GTK (dolu, sina boja) so vrzaniotHTLV 1 T (b b j ) (b) P j TKRHTLV-1 Taks peptid (bela i crvena boja). (b) Potporno cev~esta {ema na trojnoto soedinenie od TKR na glu{eckoj e vrzan za molekulata od klasa 1 od GTK H-2Kbeta i peptidot (zelenoto cev~e ozna~eno so P1-P8). KOP1 i 2 vovarijabilniot domen od alfa verigata kaj TKR (Valfa) se oboeni so rozeva boja. KOP1 i 2 vo varijabilniot domenod beta verigata kaj TKR (Vbeta) se oboeni so sina boja i KOP3 od dvata verigi se so zelena boja. HV4 od betaverigata e so portokalova boja. (v) Molekulata od GTK gledana odozgora, odnosno, od vrvot na del a, sohipervarijabilnite jamki (1-4) od varijabilnite verigi alfa (crvena boja) i beta (òlta boja) od humaniot TKRpostaveni vrz Taks peptidot (bela boja) i alfa1 i alfa2 domenite od molekulata od klasa 1 HLA-A2 od GTK (sinaboja).

Tridimenzionalni strukturi na kompleksite TKR-peptid-GTKMe|udejstvoto pome|u T-kleto~niot receptor i protivgenot vrzan za GTK molekulata e glavno i za humoralnite iMe|udejstvoto pome|u T kleto~niot receptor i protivgenot vrzan za GTK molekulata e glavno i za humoralnite iza kleto~no-posreduvanite odgovori. Molekulskite elementi od ova me|udejstvo se detalno objasneti sorendgenska kristalografija za molekulite na TKR koi vrzuvaat peptidi koi se vrzani za molekuli od klasa 1 iklasa 2 od GTK. Tridimenzionalnata struktura na trimolekulskiot kompleks najprvo be{e objavena od DejvGarboci, Don Vili i nivnite kolegi. Ovaa originalna struktura vklu~u~uva TKR so alfa i beta verigi i HLA-A2molekula za koja e vrzan protivgeniot peptid od ~ove~kiot retrovirus HTLV-1. Sporedbite na TKR vo kompleksod molekulite ili od klasa 1 ili od klasa 2 pokaùvaat deka postoi razlika vo toa kako TKR kontaktira sokompleksot GTK-peptid. Ovie strukturi na TKR zna~itelno se razlikuvaat od strukturite na gama-deltareceptorot, koj e relativno ednostaven i moè da bide vrzan za protivgen koj ne bara prerabotuvawe ili za GTKmolekula koja e nezavisna od vrzuva~kiot peptid (vidi slika 9-4).Rendgenskata analiza pokaùva deka kompleksot alfa-beta TKR-peptid-GTK se sostoi od edna TKR molekula kojae vrzana za edna molekula od GTK i nejziniot peptid. TKR kontaktira so GTK molekulata preku varijabilnitedomeni na TKR (slika 9-14 a, b). Dokolku ja pogledneme GTK molekulata so nejziniot vrzan peptid od gore moèmeda vidime deka TKR e dijagonalno postavena {to odgovara na dolgata oska na peptidot (vidi slika 9 14v) Jamkiteda vidime deka TKR e dijagonalno postavena {to odgovara na dolgata oska na peptidot (vidi slika 9-14v). Jamkitena KOP3 na alfa i beta verigite od TKR se sre}avaat vo sredinata na peptidot, a jamkata na KOP1 od alfaverigata od TKR se nao|a na N terminalniot kraj od peptidot, dodeka KOP1 od beta verigata se nao|a na Cterminalniot kraj od peptidot. Jamkite od KOP2 se vo kontakt so GTK molekulata; KOP2alfa se nao|a nadalfa2 domenot od alfa spiralata, a KOP2beta nad alfa1 domenot od alfa spiralata (slika 9-14v).Kako {to se predivduva od podatocite za imunoglobulinite, prepoznavaweto na kompleksot peptid-GTKnastanuva preku varijabilnite jamki vo strukturata na TKR. KOP1 i KOP3 i od alfa i od beta verigata vo TKRkontaktiraat so peptidot i so golem del od GTK molekulata. Peptidot e podlaboko postaven vo GTK molekulataotkolku {to e vo TKR (vidi slika 9-14a, b), a molekulata na TKR se postavuva nasproti molekulata na GTKstapuvaj}i vo kontakt preku maznata povr{ina od TKR so üvisokite to~kiû na GTK molekulata. Faktot {toregionot KOP1 stapuva vo kontakt i so peptidot i so GTK pokaùva deka podra~jata koi ne se od KOP3 sevklu~eni vo vrzuvaweto na peptidot.

19

(slika 9-15 Sporedba na me|udejstvata pome|u alfa-beta TKR (a) i klasa 1GTK (b) 2 GTK TKR ( )GTK- peptid (b) i klasa 2 GTK- peptid. TKR (prikazot so ìcite) e vocrvena boja vo (a), sino-zelena boja vo (b); GTK molekulite se prikaànikako povr{inski modeli; peptidot e prikaàn kako topka i pra~ka.

TKR-i razli~no stapuvaat vo me|udejstvo so molekulite od klasa 1 i klasa 2Dali od zaklu~ocite doneseni od tridimenzionalnata struktura nakompleksite TKR-peptid-klasa 1 moè da se donese zaklu~ok zame|udejstvata na TKR so kompleksite od klasa 2? Elis Rajnherc i negovitekolegi ova pra{awe go odgovorile so analiza na molekulata na TKR vokompleks so molekuli od klasa 2 kaj glu{ec i nivniot specifi~enprotivgen. Iako strukturata na peptid-vrzuva~kite podra~ja vo molekuliteod klasa 1 i klasa 2 se sli~ni, vo poglavje 8 vidovme deka postojat razliki vona~inot na koj ovie molekuli se prilagoduvaat na vrzaniot peptid (vidislika 8-7a, b). Sporedbata na me|udejstvata na TKR so klasa 1 GTK peptid iklasa 2 - peptid otkriva zna~itelna razlika vo agolot vo koj molekulata nalasa e d o r a z a el a razl a o a olo o oj ole ula a aTKR leì vo GTK kompleksot (slika 9-15). Isto taka, se zabeleùva pogolembroj na kontaktni ostatoci pome|u TKR i klasa 2 od GTK, koj e vo sklad sopoznatiot povisok afinitet na me|udejstvo. Sepak, ostanuva da se vidi dalizabele`livata razlika vo brojot na kontaktni to~ki }e postoi vo site klasa1 i klasa 2 strukturi.

20

(slika 9-16 Aloreaktivnosta na T kletkite moè da nastane kako rezultat od direktnoto ili indirektnoto prepoznavawe na aloprotivgenite. Vodirektniot model, molekulata od tu|iot GTK e prepoznaena vo nejzinata nepromeneta prirodna forma. Indireknoto prepoznavawe proizleguva odpeptidite koi proizleguvaat od prerabotenata GTK molekula koja e pretstavena vo kontekst na molekulite od sopstveniot GTK.d r u d r r u j r u d

Aloreaktivnost na T kletkitePredhodnite delovi se fokusiraa vrz ulogata na molekulite od GTK vo prikaùvawe na protivgenot od T kletkite i me|udejstvata na T kleto~nitereceptori so pepetid-GTK kompleksot. Sepak, kako {to objasnivme vo poglavje 8, prvo bea identifikuvani molekulite od GTK poradi nivnata uloga vootfrlaweto na tu|oto tkivo. Reakciite na otfrlawe na presadok se rezultat od prepoznavaweto na molekulite na GTK od strana na T kletkite koifunkcioniraat kako tkivnosovpadlivi protivgeni. Poradi izvonredniot polimorfizam na GTK pove}eto poedinci od ist vid imaat edinstveni(unikatni) setovi od GTK molekuli ili tkivnosovpadlivi protivgeni i se smetaat za alogenski, izraz koj se koristi za objasnuvawe na genetskirazli~nite poedinci od istiot vid (vidi poglavje 17). Spored toa, T kletkite reagiraat silno na alotransplantanti (presadoci od ~lenovi od ist vid), amolekulite od GTK se smetaat za aloprotivgeni. Vo osnova, KD4 T kletkite se aloreaktivni za aloprotivgenite od klasa 2, a KD8 T kletkitereagiraat na aloprotivgeni od klasa 1.Aloreaktivnosta na T kletkite e zbunuva~ka od dve pri~ini. Prvo, sposobnosta na T kletkite da reagiraat kon alogenite tkivnosovpadlivi protivgenise sprotivstavuva na site dokazi koi pokaùvaat deka T kletkite moàt da odgovorat samo vrz tu| protivgen plus na sopstvenite molekuli od GTK.Sepak, pri odgovor na alogenski presadoci T kletkite prepoznavaat tu|a (ne-sopstvena) molekula od GTK. Vtor problem od strana na T-kleto~niotodgovor na alogenite molekuli od GTK e toa {to za~estenosta na aloreaktivnite T kletki e mo{ne visoka. Se procenuva deka od 1% do 5% od site Tkletki se reaktivni na daden aloprotivgen, {to e povisoko od normalnata za~estenost na T kletkite koi se reaktivni so koj bilo drug odreden tu|protivgenski peptid plus molekulata od sopstveniot GTK. Ovaa visoka za~estenost na aloreaktivnite T kletki se sportivstavuva na osnovniot principr e s e d lus le ula a d s s e O aa s a za es e s a al rea e le se s r s a u a a s r cza klonsko odbirawe (selekcija). Ako edna T kletka od 20 reagira so daden aloprotivgen i ako se prepostavi deka ima 100 razli~ni haplotipovi H-2 kajgluvcite, toga{ nema dovolno razli~ni T-kleto~ni osobenosti za da gi pokrijat site edinstveni H-2 aloprotivgeni,a da ne govorime za tu|i protivgenikoi se prikaàni od strana na molekulite od sopstveniot GTK.Edno mo`no i biolo{ki zadovolitelno objasnuvawe za visokata za~estenost na aloreaktivnite T kletki e deka odreden T-kleto~en receptor koj especifi~en za tu| protivgen peptid plus molekulata od sopstveniot GTK isto taka moè vkrsteno da reagira so odredeni alogeni molekuli od GTK. Sodrugi zborovi, ako alogenata molekula od GTK plus alogeniot peptid strukturno nalikuvaat na preraboten tu| peptid plus molekulata od sopstveniotGTK, istiot T kleto~en receptor moè da gi prepoznae i dvata kompleksa na peptid-GTK. Bidej}i alogenite kletki prikaùvaat po 10 molekuli od GTKod klasa 1 po kletka, T kletkite koi imaat receptori za vkrsteno reagirawe so nizok afinitet bi moèle da se vrzat poradi visokata gustina vrzmembranskiot aloprotivgen. Od druga strana, tu|iot protivgen }e bide retko prikaàn vrz membranata na protivgen prikaùva~kata kletka ili naizmeneta sopstvena kletka koja e povrzana so klasa 1 ili klasa 2 molekula od GTK ograni~uvaj}i ja reakcijata samo na onie T kletki koi imaatreceptori so visok afinitet.Informaciite koi se va`ni za mehanizmite za vrzuvaweto na aloreaktivniot TKR se dobieni od X-B. Reizer i kolegite, koi ja odredija strukturata naTKR kaj glu{ec vo kompleks so alogenite klasa 1 molekuli koi sodràt vrzan oktapeptid. Ovaa analiza otkriva struktura koja e sli~na na strukturitekoi se prikaàni za TKR vrzan vo komleks so sopstveniot GTK vodej}i gi avtorite do zaklu~ok deka prepoznavaweto na alogenite ne se razlikuva odprepoznavaweto na molekulite od sopstveniot GTK.Vistinskoto prepoznavawe na tu| GTK moè da bide direktno-T kletkite prepoznavaat alogeni molekuli od GTK na tu|ite kletki kako da se molekuli

GTK T | GTK b fod sopstveniot GTK-ili indirektno {to zna~i deka T kletkite prepoznavaat tu| GTK po negovoto prerabotuvawe, a fragmentite od nego se pretstavenikako vrzani za sopstveniot GTK. I dvete opcii moàt da sozdadat golem broj kombinacii koi se prepoznatlivi od strana na T kletkite na doma}inot.Kaj indirektniot model, otsustvoto na negativniot izbor (negativna selekcija) za peptidite koi se sodràt vo molekulite od tu|iot GTK moè dapridonese za visokata za~estenost na aloreaktivnite T kletki. Ovoj uslov, vo kombinacija so razlikite vo strukturata na izloènite delovi odalogenata molekula od GTK moè da se smeta kako fenomen na aloreaktivnost. Objasnuvaweto za golemiot broj aloreaktivni kletki moè da se najde kajgolemiot broj na vozmo`ni (potencijalni) protivtela dobieni od molekulite na tu| GTK plus mo`nite peptidni protivgeni koi se ve}e vrzani zatu|ite GTK molekuli za vreme na nivnoto prerabotuvawe pred prikaùvaweto.

21

ograni~uvawena sopstveniot-gtkna...

Documents