Effetti sul fenotipo dei diversi tipi di mutazione

Mutazioni con perdita di funzioneQuasi sempre sono Mutazioni recessive (genotipo in omozigosi): - l’eterozigote non esprime il fenotipo mutante, quindi senza aploinsufficienza (per meccanismi compensatori dell’altro allele?)- con aploinsufficienza (pochissimi i casi di alleli recessivi che esprimono questo fenotipo)

Mutazioni con acquisto di funzioneIn genere sono Mutazioni dominanti- per aumento della produzione proteica (e funzione) rispetto al wt- per produzione di una nuova proteina (e funzione) rispetto al wt

APPLICAZIONI DELLA TERAPIA GENICA

- malattie ereditarie monogeniche con ereditarietà mendeliana

- malattie infettive

- malattie multigeniche (cancro)

Terapia genica classica:1) Produzione e somministrazione della proteina che manca al paziente2) Eliminazione delle cellule malate3) Attivazione delle cellule del sistema immunitario che determinano l’uccisione delle cellule malate

Terapia genica non convenzionale: Correzione del difetto genetico restaurando la normale espressione genica.1) Inserimento completo del gene wt nelle cellule somatiche 2) Mutagenesi mirata nelle cellule somatiche per ripristino gene wt3) Silenziamento nelle cellule somatiche del trascritto del gene mutato4) Terapia genica nelle cellule germinali (solo in animali modello)

Strategie per la terapia genicasomatica

Aggiunta genica

Correzione genica per mutagenesi mirata (gene targeting)

Inibizione genica

Eliminazione cellulare controllata

Eliminazione cellulare mediatadal sistema immunitario

Terapia genica somatica in vivo ed ex vivo

in vivo

ex vivo

Terapia genica somatica ex vivo

- Applicabile solo a certi tipi cellulari: cellule in divisione e coltivabili in vitro (es: da midollo osseo, pelle, tumori)

-Estrazione/preparazione delle cellule primarie o della linea cellulare del paziente (cellule autologhe)

- Trasferimento del gene in vitro

- Quando possibile controllo dei trasformanti

- Reimpianto delle cellule nel paziente

SVANTAGGI

- Applicabile a pochi tessuti (sistema emopoietico, cellule epiteliali, ecc)

- Tecnica difficile con scarsa efficienza

- Necessità di trattamenti ripetuti nel tempo

Esempi: cellule staminali di midollo osseo trattate in emofilici e talassemici

Terapia genica somatica ex vivo

Introduzione diretta del gene in vivo nelle cellule bersaglio:

- iniezione diretta in tipi cellulari non coltivabili in vitro (es. c. cerebrali) o per aumentare il numero di cellule trattate rispetto alla terapia ex vivo (es. nel muscolo scheletrico distrofico)

- somministrazione in prossimità del tessuto bersaglio (ad es. vie respiratorie nella fibrosi cistica)

Problemi:

- Trasferimento quantitativamente limitato

- Rischio di inserimento in cellule sane

- Reazione immunitaria (alle proteine virali, se si utilizzano virus; talvolta alla proteina espressa)

Terapia genica somatica in vivo

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO

1) Trasferimento genico diretto: - trasfezione di DNA “nudo” in plasmidi (applicato a volte a cellule muscolari)- trasfezione mediata da liposomi (vescicole formate da doppio strato lipidico)

2) Trasferimento tramite vettori- retrovirus- adenovirus- virus adeno-associati

3) Tipi di inserzione: - ectopica - mirata

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO

1) Trasferimento genico diretto

Vantaggi:- Non si generano nuovi virus patogeni

- Riduzione del rischio di reazione immunitaria - Possono trasferire molecole di DNA anche molto grandi

Svantaggi: - Scarsa efficienza sia di trasferimento che di integrazione - Se integrati, possibile mutagenesi inserzionale

2) Trasferimento tramite vettori virali

Caratteristiche necessarie: - Le particelle virali ricombinanti devono essere difettive rispetto alla

replicazione (deleti per geni responsabili di replicazione e assemblaggio del virione), non produrre composti tossici per l’ospite.

Vantaggi: - Alta efficienza di trasferimento genico

Svantaggi: - Espressione transiente - Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con

eventuali virus presenti nell’ospite - Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate - Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale

nel genoma) (attivazione di oncogèni) - Possibilità di reazioni immunitarie - Tecniche con bassa efficienza e costi elevati

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO

Retrovirus (ad RNA): hanno specifici recettori per entrare nelle cellule; si integrano nei cromosomi in localizzazioni casuali, entrano nel nucleo solo quando si dissolve membrana nucleare (solo cellule in divisione)

Adenovirus:  legame a specifici recettori cellulari che permettono l'ingresso del virus tramite endocitosi; infettano molti tipi cellulari, anche non in divisione; geni non integrati (episomi); espressione per brevi periodi; necessità di trattamenti ripetuti (es. trattamento fibrosi cistica)

Virus adeno-associati (AAV): non sono in grado di replicarsi autonomamente ma necessitano di virus helper co-infettanti come adenovirus o Herpex simplex. Si integrano in sito specifico (19q13.3).

Lunga sequenza terminale ripetuta

Psi + non codificante: per impacchettamento nel capside

Maturazione del genoma a RNA

Trascrittasi inversa e integrasi

Proteina per involucro

Retrovirus

Vettore retroviraleSostituzione di gag, pol, env con gene X: lunghezza max = 8 kbMarcatore selez: gene Neo

Lunghezza massima: 8Kb

da Dr. Sara Caldarola

Linee cellulari per packaging: forniscono le necessarie funzioni di gag, pol, env, ma delete per gene psi; hanno inserito stabilmente i geni virali codificanti per proteine strutturali del capside, produce virioni vuoti per l’assemblaggio dei virioni.La loro transfezione transiente con vettore ricombinante determina l’impacchettamento del costrutto nel virione (contiene l’enzima transcrittasi inversa) vettore virale completo da usare per l’infezione delle cellule da trattare

PREPARAZIONE RETROVIRUS PER L’INFEZIONE CELLULARE

Dr. Sara Caldarola

IL RETROVIRUS NON E’ IN GRADO DA SOLO DI REPLICARSI E PRODURREPARTICELLE FAGICHE PER ALTRE INFEZIONI CELLULARI

INFEZIONE CON RETROVIRUS DELLA CELLULA BERSAGLIO

Patogeno naturale dell’uomo, genoma a DNA a doppio filamento, causa il comune raffreddore

Come vettore ha una delezione della regione E1 il che lo rende difettivo per la replicazione. Come cellule d'impaccamento vengono usate cellule renali embrionali.

Adenovirus

Virus AdenoassociatiAppartengono alla famiglia dei parvovirus.

Genoma formato da una molecola di DNA a singolo filamento di circa 5 kb.

Capside icosaedrico e sono privi d'un involucro lipidico.

Non sembrano associati a nessuna patologia: ideali come vettori.

Espressione prolungata del transgene

Ma dimensioni ridotte del transgene (max 4,7 kb)

Terapia genica nei tumoriSe inattivato gene soppressore tumore (oncosoppressore) introduzione nuova versione gene; Se attivato oncogène spegnimento con gene con RNA antisenso

Inserimento gene wt

Inserimento miratoe doppia ricombina-zione per ripristinogene wt

Strategie di terapia genica somatica in malattie da aploinsufficienza

Strategie di terapia genica somatica in malattie da acquisizione di funzione

Produzione di RNA interferenti introdotti con vettori virali

Produzione di RNA interferenti introdotti con vettori virali

RISC: RNA-Induced Silencing Complex.(Formato da RNA e proteine)srotola ds RNA e il filamento complementaresi appaia con RNA da silenziare, degradazione dell’ RNA a doppio filamento

Complesso Dicer:RNAsi che degrada lunghi filamenti di dsRNA a frammenti di circa 20 bp

Si introduce nella cellula l’RNA del geneche si vuole silenziare a doppio filamento (dsRNA)

Es: ganciclovir

Terapia genica dei tumori

Gcv Gcv-P Gcv-PPP

Incorporazione DNA

Terminazione catenarottura DNA

Tk HSV Tk mamm

Ganciclovir (Gcv): analogo di un nucleoside virale (metilguanina): uccide le cellule tk+, ovvero quelle con il vettore virale inserito

Terapia genica in vivo per i tumori cerebrali

Ganciclovir (Gcv): analogo del nucleoside erpetico: uccide le cellule tk+, ovvero con il vettore virale inserito

Gcv Gcv-P Gcv-PPP

Incorporazione DNA

Terminazione catenarottura DNA

Tk HSV Tk mamm

VPC = Cellule infettate da Herpes simplex (con gene Tk) che producono virioniimpiantatenel tumore

Produzione di timidina chinasi virale

Somministrazione farmaco (GCV)Neuronavigazione

stereoatassica guidata da MRI

Malattia Gene introdotto Tessuto targetß-talassemia ß-globina Midollo osseoImmunodef. congenita (SCID) ADA Midollo/linfocitiDistrofia muscolare Distrofina MuscoloFibrosi cistica CFTR Epitelio alveoliEmofilia A e B Fattore VIII e IX Epatociti/muscoliFenilchetonuria Fenilalanina idrossilasi FegatoMorbo di Gaucher Glucocerebrosidasi Midollo osseoMucopolisaccaridosi tipo I -L-iduronidasi FibroblastiMucopolisaccaridosi tipo VII ß-glucuronidasi Midollo osseoEpidermolisi bullosa Laminina Cheratinociti

TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE UMANE MENDELIANE

SCID: SEVERE COMBINED IMMUNODEFICIENCY DISEASE

Assenza di Adenosina deaminasi (ADA) (enzima della via di recupero delle purine) Malattia AR: mancanza di cellule progenitrici dei linfociti T e accumulo metaboliti tossici (adenosina e derivati)

Terapia classica:-Trapianto di midollo: compatibilità del 90-100% dell’HLA (una minoranza dei pazienti)- Somministrazione di enzima ADA estratto dai bovini (correzione del metabolismo, ripristina in parte funzioni immunitarie).

Terapia genica ex vivo:- Cellule staminali emopoietiche- Precursori linfociti T - Infezione con vettore retrovirale. Il cDNA dell’ADA dimensioni ridotte(1.5 Kb). Non è necessaria una regolazione fine dell’espressione genica con ripristino della fisiologia sia con alta che bassa efficienza di integrazione- Cellule con copia gene ADA hanno un vantaggio selettivo di crescita eliminando più facilmente i metaboliti tossici

SCID: UN ESEMPIO DI SUCCESSO DELLA TERAPIA GENICA SOMATICA

Terapia con incremento delle copie geniche ex vivo con retrovirus per la deficienza di adenosina deaminasi (ADA)

Terapia 6-7 volte l’anno.Dopo 5 anni recupero parziale della funzione immunitaria

ADAPrecursori linfociti T da midollo osseo paziente ADA-

Terapia genica per la deficienza di adenosina deaminasi (ADA)

Linfociti T oppureCellule staminali midollo osseo (tutte le linee emopoietiche transgeniche)

Malattia letale entro i 30 anni senzatrattamenti.

Terapia classica:- Drenaggio bronchiale- Somministrazione antibiotici

Terapia genica ex vivo-Vettori adenovirali per introdurreil gene CFRT nelle cellule dei polmoni tramite aereosol

Problematiche:Tessuto polmonare crea barriere fisiche (muco) e immunitarie;difficile ingresso dell’adenovirus nel nucleo; reazioni infiammatorie; espressione a breve termine

Terapia con staminali?Inserimento CFTR in vettori virali e infezione di staminali paziente (da midollo), spinte a differenziarsi ad epiteliali per ripopolare il polmone

COSA È LA DMDCOSA È LA DMD

LA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE (DMD) E’ UNA GRAVE PATOLOGIE GENETICA, CAUSATA DALLA TOTALE ASSENZA DELLA DISTROFINA NEL MUSCOLO STRIATO E LISCIO.

colpisce tutti i muscoli scheletrici, la muscolatura liscia e il cuore. difficoltà di deambulazione e di movimento insufficienza respiratoria problemi cardiaci DMD: conduce alla completa immobilità, l’aspettativa di vita non supera i 25-30

anni. A 10-12 anni i ragazzi vivono sulla carrozzina.

La DMD è una malattia rara, con una ha una frequenza di 1 su 3500

Mutazioni dello stesso gene causano anche:• La distrofia di Becker (DMB), meno invalidante con assenza parziale di

distrofina.

• Cardiomiopatia dilatativa legata all’X

• Il gene è localizzato sul braccio corto del cromosoma X.

• Le donne con una sola copia mutata del gene sono portatrici sane, gli uomini, essendo emizigoti, si ammalano.

• E’ il più lungo gene fin ora identificato, circa 2,3 Mb (79 esoni)

• mRNA rappresenta solo lo 0,5% del gene (circa 12 kb)

• 7 promotori, originano 1 proteina lunga e 6 versioni più corte.

• La distrofina, formata da 3685 aminoacidi, PM 427 kDa.

TUTTA COLPA DI UN GENETUTTA COLPA DI UN GENE

LA DISTROFINALA DISTROFINA• Ancorata sulla faccia interna della membrana

delle fibre muscolari.C- terminale è legato ad altre proteine

di membrana. N-terminale è connesso alle strutture

contrattili all’interno della cellula muscolare.

• Determinante per la stabilità meccanica della membrana durante la contrazione muscolare, funziona da ammortizzatore.

• Assenza o malfunzionamento causa rottura della membrana muscolare:

Ingresso del calcio nelle fibre.Attivazione di enzimi.Infiammazione e attivazione dei

fibroblasti.Formazione di tessuto cicatriziale che

sostituisce quello muscolare.Degenerazione muscolare e insorgenza

della patologia.

Terapia genica per la DMD

- Terapia di tipo sistemico (muscolatura striata, cuore, diaframma)

- Muscoli target difficilmente raggiungibili

- Transgene di dimensioni elevate (cDNA di 14 kb)

- Pochi vettori utilizzabili

TERAPIA GENETICA: L’EXON SKIPPINGTERAPIA GENETICA: L’EXON SKIPPING• La mutazione elimina EX50 portando alla

fusione di IVS 49 e IVS50; cambia il reading frame del gene della distrofina e cessa la produzione della proteina funzionale

• Viene indotto l’exon skipping (E.S.) dell’esone 51 nel pre-mRNA: Antisense Oligo (AO) che si attaccano alla sequenza dell’ESE (exonic-splicing-enhancer) all’interno dell’esone 51

• E.S. ristabilisce il corretto schema di lettura (reading frame) modificando l’mRNA (EX49 in frame con EX52)

• La proteina è più corta ma ancora funzionante

• Converte la DMD in DMB in modo da ridurre la gravità della malattia

COME FUNZIONA L’EXON SKIPPING 1/2COME FUNZIONA L’EXON SKIPPING 1/2• AOS o Oligonucleotidi antisenso, corti frammenti di RNA, si appaiano in regioni

coinvolte nello splicing del pre –mRNA, producendo splicing alternativo con rimozione di uno o piu esoni

• i 2 tipi di AOS più utilizzati nella sperimentazione per l’eliminazione dell’esone 51 sono:

2’O- metyl- fosforotioates, PRO05, formato da 20 basi

Morfolino, AVI-4658, ha 30 basi, e include le 20 del PRO05

2’O-Metil AO

morfolino AO

UCUUUACGGUGAAGGAACU GAUCUUUACGGUGAAGGAACUACAACCYC

Il trattamento con una molecola antisenso, somministrata con iniezione intramuscolare.

Lo studio, compiuto presso UCL (Londra) ha riguardato 7 ragazzi di età compresa tra 10 e 17 anni con DMD a cui era stata diagnosticata la malattia e in cui poteva risultare di beneficio lo skipping (salto) dell’esone 51.

Due dei pazienti hanno ricevuto 0.09 mg dell’oligonucleotide antisenso AVI-4658, iniettato localmente in un piccolo muscolo del piede (extensor digitorum brevis).Gli altri 5 pazienti hanno ricevuto 0.9 mg di AVI-4658 nell’altro piede.

I pazienti che hanno ricevuto il più basso dosaggio (0.09 mg) di AVI-4658 hanno mostrato poca espressione di distrofina, il dosaggio più alto (0.9 mg) ha prodotto un aumento dell’espressione di distrofina nel muscoli trattati.

Nelle aree delle sezioni immunocolorate adiacenti al luogo in cui AVI-4658 è stato iniettato, il 44-79% delle miofibre ha aumentato l’espressione della distrofina.

Fonte: Lancet Neurology, 2009

Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA

• Efficienza (trasduzione di un numero di cellule elevato).• Garanzia di una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati).• Capacità di incorporare DNA di varie dimensioni.• Garanzia nella regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dell’espressione del gene introdotto• Non patogenicità • Facilità di somministrazione al paziente.• Capacità di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.• Buona tolleranza.• Assenza di immunogenicità • Facilità di costruzione e riproducibilità

IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. I VETTORI PIU’ UTILIZZATI OGGI SONO I RETROVIRUS