UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho”

Instituto de Biociências

CAMPUS DE BOTUCATU

“EFEITOS DA TEMPERATURA E DO MATE (Ilex paraguariensis) SOBRE O

PROCESSO DE CARCINOGÊNESE DE ESÔFAGO EM RATOS WISTAR

MACHOS.”

Juliana Ferreira da Silva

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós Graduação em Biologia Geral e Aplicada

Botucatu – SP 2008

Juliana Ferreira da Silva

“EFEITOS DA TEMPERATURA E DO MATE (Ilex paraguariensis) SOBRE O

PROCESSO DE CARCINOGÊNESE DE ESÔFAGO EM RATOS WISTAR

MACHOS.”

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós Graduação em Biologia Geral e Aplicada

Orientador: Prof. Dr. Luís Fernando Barbisan

Botucatu-SP 2008

Banca examinadora Prof. Dr. Luís Fernando Barbisan

Prof. Dr. Daniel Araki Ribeiro Profa. Dra. Lígia Souza Lima Silveira da Mota

DEDICATÓRIA

Bendito seja o Senhor, minha rocha, que adestra as minhas mãos para a peleja e os meus dedos para a guerra;

Aquele que habita no esconderijo do Altíssimo, à sombra do Onipotente descansará.

Direi do Senhor: Ele é o meu Deus, o meu refúgio, a minha fortaleza, e nele confiarei.

Porque ele te livrará do laço do passarinheiro, e da peste perniciosa. Ele te cobrirá com as suas penas, e debaixo das suas asas estarás seguros; a sua verdade será o teu escudo e broquel.

Não terás medo do terror de noite nem da seta que voa de dia, Nem da peste que anda na escuridão,

nem da mortandade que assola ao meio-dia. Mil cairão ao teu lado,

e dez mil à tua direita, mas tú não serás atingido. O Senhor é a minha luz e a minha salvação; a quem temerei? O

Senhor é a força da minha vida; de quem me recearei? Ainda que um exército se acampe contra mim, o meu coração não temerá; ainda que a guerra se levante contra mim, conservarei a

minha confiança. Bem-aventurado o povo cujo Deus é o Senhor.

Salmo 27,91 e 144.

Primeiramente a DEUS, Jesus e Maria nossa mãe Por estarem sempre comigo, me amparando, auxiliando e iluminando á todos os meus caminhos. Segurando nas minhas mãos nos momentos em que mais precisei, cuidando de mim em todos os

momentos desta caminhada e me livrando de todo o mal.

À minha mãe Maria A minha eterna gratidão, por sempre acreditar em mim, por lutar para que eu conseguisse chegar onde

cheguei, por todas as noites que chorou por mim, que orou por mim e por todo amor e carinho que sempre me dedicou.

Ao Meu esposo Emerson

Que teve tanta paciência, que me incentivou, nunca me deixou desistir, cuidou de mim quando eu mais precisei, me deu apoio, amor e confiança.

À minha irmã Joseane

Que sempre acreditou em mim, meu deu conselhos na hora em que eu mais precisei, me deu apoio e

carinho mesmo distante.

À minha Vó Rosina

Agradeço pelo carinho, amor, cuidado e paciência que sempre teve comigo

Às minhas Grandes amigas Valquíria e Edilene

Que me ensinaram grande parte de tudo que sei hoje, que tiveram carinho e muita paciência, que sempre me incentivaram, sempre me auxiliaram nos momentos em que mais precisei.

Ao meu pai Paulino

Apesar de o senhor não estar aqui comigo, apesar de nem sequer eu lembrar de seu rosto, tenho certeza que onde o senhor estiver estará sempre torcendo por mim, cuidando de mim e orando por mim.

Sei que algum dia nós vamos nos encontrar novamente e eu poderei chama-lo de “Pai” pois a vida não nos deu esta oportunidade.

Agradecimentos

Ao Prof. Dr. Orientador Luís Fernando Barbisan por me orientar e me conduzir pelo caminho correto,

por acreditar em mim, pela acolhida, pelo respeito e por me tornar à pessoa que sou hoje. Obrigada por

tudo que me ensinou, você sempre será uma referência em minha vida pessoal e profissional.

A Profa. Dra. Lígia por me ajudar no início de minha caminhada, por me orientar no momento em que

mais precisei, por me ensinar grande parte de tudo que sei hoje, por acreditar em mim.

Ao Paulo César Georgette que me ensinou muito, que se tornou um grande amigo, que me ajudou em

tudo que precisei, sei que sempre poderei contar com você.

A minha amiga Lívia Lacorte que sempre esteve comigo em todos os momentos desta caminha,

sofremos, lutamos, estudamos e também chegamos lá juntas.

A todos os professores do programa de Biologia Geral e Aplicada por todos os ensinamentos.

Aos secretários da pós-graduação pela atenção.

A todos os meus familiares que sempre acreditaram em mim.

Lista de Abreviaturas

AD – Adenocarcinoma (s)

NSAIDS – Drogas antiinflamatórias não-esteroidais

CE - Carcinoma Epidermóide

COX-2 - Ciclooxigenase 2

CYP - Citocromo

DEN - Dietilnitrosamina

DRGE - Doença do Refluxo Gastroesofágico

EB - Esôfago de Barret

EUA - Estados Unidos da América

INCA - Instituto Nacional do Câncer

NMBA - N-nitrosometilbenzilamina

MNNG - N-metil-N'-nitrosoguanidina

HPV - Papilomavírus Humano

PHAs- Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

URSS - União Soviética

Sumário

Resumo .....................................................................................................................9

Abstract...................................................................................................................10

Introdução...............................................................................................................11

Introdução geral as neoplasias..............................................................................11

Câncer de esôfago: epidemiologia, fatores de risco e subtipos...........................13

Álcool e cigarro como fatores de risco para o câncer de esôfago.......................17

O consumo de bebidas quentes como fator de risco para o câncer de esôfago.20

Dados controversos sobre o consumo do mate....................................................21

Modelos de indução de câncer de esôfago em ratos.............................................23

Considerações finais e objetivos............................................................................25

Referências*............................................................................................................26

Artigo científico.......................................................................................................39

Conclusões...............................................................................................................67

9

1. Resumo

O consumo de mate em altas temperaturas tem sido considerado um fator de risco para o

desenvolvimento do carcinoma epidermóide de esôfago (CE) na América do Sul. Desta forma,

os efeitos da ingestão de mate sobre danos de DNA e a carcinogênese de esôfago, induzidos

pela dietilnitrosamina (DEN) e injúria térmica, foram avaliados em ratos Wistar machos. Na

fase de iniciação, os animais foram iniciados com injeções i.p. da DEN (8 x 80 mg/Kg p.c.) e

submetidos a injúria térmica (água a 65 0C, 1ml/rato, instilado no interior do esôfago) e

receberam, concomitantemente, mate (2.0% p/v, grupo teste) ou chá-verde (2.0% p/v, grupo

controle positivo) como única fonte de líquidos por oito semanas. Nenhum tratamento

adicional foi introduzido durante a fase de pós-iniciação (nona a vigésima semana do

experimento). Amostras de sangue periférico foram coletadas quatro horas após a última

administração da DEN para o teste do cometa na oitava semana e amostras de esôfago e

fígado foram coletadas na oitava e vigésima semanas do experimento. Na oitava semana, a

ingestão de mate e chá-verde por si não foi genotóxica e reduziu de forma significativa os

níveis de danos no DNA de leucócitos de sangue periférico nos animais tratados com a DEN.

Além disso, uma redução significativa nos níveis de proliferação celular no epitélio do

esôfago e no parênquima hepático e no número de lesões hepáticas pré-neoplásicas foram

também observadas nos grupos iniciados e que receberam mate ou chá-verde. Na vigésima

semana, uma menor incidência de neoplasias de esôfago e fígado foi observada nos grupos

que receberam previamente mate e chá-verde quando comparado ao grupo iniciado pela DEN

e submetido à injúria térmica. Os resultados do presente estudo indicam que a ingestão de

mate se mostrou benéfica contra danos no DNA e a carcinogênese de esôfago e fígado

induzidos pela DEN.

10

2. Abstract

Drinking hot mate has been associated with risk for esophageal squamous cell carcinoma

in South America. Thus, the modifying effects of mate tea intake on DNA damage and

esophageal carcinogenesis induced by diethylnitrosamine (DEN) plus thermal injury were

evaluated in male Wistar rats. In the initiation phase, rats were treated with DEN injections (8

x 80 mg/Kg b.w.) plus thermal injury (water 65 0C, 1ml/rat, instilled into the esophagus) and

concomitantly received mate tea (2.0% w/v, test group) or green tea (2.0% w/v, positive

control group) as the sole source of drinking fluid for 8 weeks. Any additional treatment was

introduced at post-initiation until week 20. Peripheral blood was collected 4 hr after the last

DEN application for comet assay at week 8 and samples from esophagus and liver were

collected at weeks 8 and 20. At week 8, mate or green tea intake itself were non-genotoxic and

significantly decreased DNA damage levels in peripheral blood leucocytes from DEN-treated

animals. Also, a significant reduction of cell proliferation rates in both esophageal epithelium

and liver parenchyma and on the number of putative preneoplastic liver lesions were observed

in initiated and mate or green tea-treated animals at week 8. A significant lower incidence of

esophageal and liver neoplasms and tumor multiplicity was observed in the groups previously

treated with mate or green tea when compared to the DEN initiated/thermal injury group at

week 20. These data indicate that mate tea presented protective effects against DNA damage

and esophageal and liver carcinogenesis induced by DEN.

11

3. Introdução

3.1.) Introdução geral a neoplasias

As neoplasias malignas têm sido apontadas como uma das principais causas de morbi-

mortalidade no mundo ocidental moderno (WCRF, 1997; WHO, 1998). Além disso, através

de análises estatísticas de morbi-mortalidade, resultantes dos vários tipos de cânceres,

observa-se que a doença vem aumentando em níveis mundiais (Parkin, 2001). São doenças

crônico-degenerativas, multifatoriais que envolvem alterações genéticas progressivas,

expressas por alterações celulares metabólicas e morfológicas. Cada tipo de neoplasia possui

características clínicas e biológicas peculiares que devem ser investigadas para aprimorar seu

diagnóstico, tratamento e prognóstico (Robbins e Cotran, 2005).

As neoplasias corresponderam a 16% dos casos de morte no período entre 1999 a 2001,

no estado de São Paulo (Batista et al., 2004). Estas taxas elevadas de mortalidade relacionadas

ao câncer podem ser atribuídas ao diagnóstico tardio e as dificuldades (Parkin, 2001).

A divisão e morte celulares são eventos controlados por fatores genéticos, capazes de

permitir a manutenção da homeostase tecidual e do organismo. No entanto, há circunstâncias

especiais em que estes controles falham e as células passam a se dividir de forma autônoma ou

tornam-se mais resistentes à morte celular por apoptose. Esta capacidade de se dividir de

forma autônoma, ou seja, de se libertar dos controles de crescimento, é a principal

característica da célula neoplásica, em decorrência de mutações que ocorrem no material

genético da célula (Loeb et al., 2003). Além disso, essa capacidade de escape aos controles

regulatórios se transmite a toda progênie da célula, isto é, as mutações são fixadas no genoma

celular gerando clones celulares com deleções ou amplificações em genes críticos, o que leva

ao desequilíbrio entre as taxas de proliferação, morte celular (apoptose), na comunicação com

células vizinhas e com a matriz extracelular, angiogênese, diferenciação e finalmente a

compressão, invasão de tecidos adjacentes e disseminação metastática (Robbins e Cotran,

2005). Esses danos genéticos podem afetar duas classes de genes os proto-oncogenes e os

genes supressores tumorais. Nos proto-oncogenes amplificação, deleção, rearranjo ou

mutações de ponto resultam em aumento de sua função (oncogenes). Nos genes supressores as

alterações na metilação ou perda cromossômica que resultam em perda de sua função

(Griffiths et al., 2006).

O processo de carcinogênese ou oncogênese ocorre através de múltiplas etapas, ou seja,

a iniciação, promoção e progressão (Pitot e Dragan, 1996; Pitot, 2001). A iniciação se

caracteriza pela ocorrência de uma ou mais mutações no DNA de uma célula alvo. Essas

12

mutações podem ser causadas por diversos fatores, entre eles pela exposição a agentes

químicos cancerígenos, vírus oncogênicos ou radiação. As células que fixaram as lesões de

DNA (i.e., após um ciclo de divisão celular) são consideradas então “células iniciadas”, estas

células podem então sofrer a ação de agentes promotores (epigenéticos) (Pitot e Dragan, 1996;

Pitot, 2001). A célula iniciada sofre outras mutações genéticas adicionais (i.e., proto-

oncogenes e genes supressores de tumores) podendo transformar-se em uma célula com

fenótipo maligno. Para que ocorra essa transformação, é necessário um longo e/ou persistente

contato com outros fatores, incluindo a exposição a agentes cancerígenos epigenéticos (Pitot e

Dragan, 1996; Pitot, 2001). Na fase de promoção, a suspensão da exposição a esses agentes

muitas vezes interrompe ou reverte o processo de carcinogênese. Alguns componentes

contidos nos alimentos ou cigarro (i.e., aminas aromáticas, hidrocarbonetos policíclicos

aromáticos - PHAs, nitrosaminas, etc), e a exposição excessiva e prolongada a hormônios ou

xeno-estrógenos são exemplos de fatores que promovem a transformação de células iniciadas

em malignas (Wogan et al., 2004; Safe, 2004).

O terceiro e último estágio da carcinogênese, a progressão, se caracteriza pela

multiplicação descontrolada e irreversível das células alteradas. Nesse estágio, a neoplasia já

está instalada, evoluindo até o surgimento de metástases e dos sintomas clínicos da doença

(Pitot, 2001). As substâncias químicas podem atuar nas diferentes fases do processo da

carcinogênese. Assim, existem substâncias químicas que podem induzir a formação de células

iniciadas que atuam como agentes promotores ou agentes completos (Pitot e Dragan, 1996).

Por exemplo, o cigarro contém inúmeras substâncias mutagênicas/cancerígenas, atuando,

portanto como um agente cancerígeno completo, pois possui componentes que atuam nos três

estágios da carcinogênese (Stoner et al., 2001; Wogan et al., 2004).

A proliferação e morte celular são eventos essenciais às etapas de iniciação, promoção e

progressão da carcinogênese (Pitot e Dragan, 1991; Tomatis, 1993; Shulte-Hermann et al.,

1993). A maioria das células neoplásicas contém alterações genéticas que estão envolvidas na

perda do controle desses processos (Lehrbach et al., 2003). Por exemplo, para as neoplasias

esofágicas, várias alterações genéticas estão envolvidas, incluindo a perda da função no gene

TP53 e amplificação do gene da ciclina D1, entre outros (Ransford e Jankowski, 2000; Stoner

et al., 2001). Mutações no gene TP53, que colaboram para a progressão de lesões displásicas

em CE do esôfago, têm conferido vantagens na sobrevivência de clones celulares mutados

pela diminuição de sua eliminação por apoptose (Ransford e Jankowski, 2000).

13

3.2.) Câncer de esôfago: epidemiologia, fatores de risco e subtipos

O esôfago é um tubo longo, de ± 25 cm, músculo-membranoso e estreito, que comunica

a orofaringe ao estômago. Ele permite a passagem do alimento ou líquido deglutido até o

interior do estômago, através de contrações musculares peristálticas (Sobotta, 2006).

Sendo sua mucosa revestida com um epitélio estratificado pavimentoso ou escamoso, as

neoplasias podem surgir em qualquer região do esôfago, podendo manifestar-se como uma

estenose, como uma lesão papilífera ou nodular ou como uma área achatada anormal (em

forma de placa). Neste órgão, o desenvolvimento do câncer de esôfago, é um processo

progressivo de múltiplas etapas, com aumento na proliferação das células epiteliais esofágicas,

hiperplasia das células basais, displasia, carcinoma in situ e carcinoma avançado de células

escamosas do esôfago (Lehrbach et al., 2003).

As neoplasias de esôfago apresentam desenvolvimento rápido e, na maioria dos casos, o

prognóstico é desfavorável com sobrevida média abaixo de cinco anos (Enzinger e Mayer,

2003; Kollarova et al, 2007). A prevalência das neoplasias de esôfago em humanos tem

aumentado significativamente nas últimas décadas (Stoner et al., 2001; Engel et al., 2003). O

câncer de esôfago já é enquadrado entre as dez neoplasias mais freqüentes que acometem o ser

humano (Parkin et al., 2001; Stoner et al., 2001; Enzinger e Mayer, 2003; Kollarova et al,

2007) e, entre as localizadas no trato gastrintestinal, a terceira de maior incidência (Parkin et

al., 2001). A incidência do CE do esôfago em humanos é influenciada por fatores ambientais

locais, predisposição genética e estilo de vida, sendo mais freqüente em algumas áreas da

França, China, Irã, África do Sul e América do Sul (Craddock, 1992; Day e Varghese, 1994).

As áreas de alto risco estão localizadas ao longo do chamado “cinturão do câncer do esôfago”

que vai do Irã às repúblicas do sudoeste da antiga União Soviética (URSS), oeste e noroeste

da China. Alguns países da América do Sul, sudoeste da África e da Europa também

apresentam alta incidência deste tipo de neoplasia (Tomatis et al., 1990; Craddock, 1992; Day

e Varghese, 1994). Esta neoplasia é predominante em indivíduos do sexo masculino e sua

incidência aumenta com a idade, sendo o pico de freqüência entre os 50-70 anos de idade

(Kollarova et al, 2007). No Brasil, o câncer de esôfago está entre os dez tipos de maior

incidência e o sexto em mortalidade de acordo com dados obtidos dos Registros de Base

Populacional de 2000 (INCA, 2005). Em especial, no Rio Grande do Sul a incidência de

câncer de esôfago está em torno de 14,3/100.000 casos entre os homens e 4,2/100.000 entre as

mulheres (Barros et al., 2000).

14

De acordo com o INCA - Instituto Nacional do Câncer, no período de 1979 e 1983 e

entre 1995 e 1999 houve um percentual de 10,61/ 8,91 de mortes causadas por câncer de

esôfago em homens e 5,03/3,69 em mulheres no Rio grande do Sul. De acordo com

estimativas do INCA 2008 haverá 19,73/100.000 casos de morte por câncer esôfago entre os

homens e 7,58/100.000 casos de morte por câncer de esôfago entre as mulheres.

Cerca de 90% das neoplasias do esôfago incluem CE que provém de seu epitélio de

revestimento e cerca de 7% dos casos incluem AD que podem originar-se de glândulas da

submucosa do esôfago e, mais comumente, do epitélio cilíndrico do chamado EB (Pera et al.,

1993; Cameron et al., 1995; Stoner et al., 2001). Entretanto nos Estados Unidos da América

(EUA), ambos possuem taxas semelhantes de incidência, a qual é mais freqüente em homens

sendo que os negros possuem um risco maior do que os brancos de até quatro vezes (Blot et

al., 1991; Parkin et al., 2001).

A etiologia de câncer esofágico nas regiões de alto risco (maior incidência) não foi ainda

elucidada. Nas regiões de incidência mais baixa ou intermediária, estudos epidemiológicos

têm mostrado que o uso de álcool, o tabagismo, a deficiência de micronutrientes, o consumo

de bebidas quentes (em especial de chás) e o baixo nível socioeconômico são os principais

fatores de risco envolvidos, mas com uma predisposição genética pouco definida (Blot et al.,

1991; Craddok, 1992). A maioria das neoplasias de esôfago na Europa e nos EUA é

freqüentemente atribuída ao consumo do álcool e do cigarro, visto que estes apresentam

quantidades significativas de substâncias mutagênicas e/ou cancerígenas, em especial de

nitrosaninas (Lu et al., 1991; Yang et al., 1992; Straif et al., 2000). HPV é freqüentemente

encontrado no CE de regiões com alta incidência (Stoner et al., 2001), dos vários tipos já

identificados de HPV apenas 24 são associados às lesões esofágicas, (HPV-1, 2, 3, 4, 6, 7, 10,

11, 13, 16, 18, 30, 32, 33, 35, 45, 52, 55, 57, 59, 69, 72 e 73) e apenas o tipo HPV-6 e 11 não

estão associados aos tumores esofágicos (Oliveira et.al., 2003). Entretanto o consumo de

vegetais verdes e de frutas parece exercer algum fator protetor (Stefani et al., 1990; Li et al.,

1993; Tampi et al., 2005; Farhadi et al., 2005).

Baseado nas considerações precedentes supõe-se que os fatores ambientais e nutricionais

possam aumentar o risco, enquanto as deficiências nutricionais possam atuar como

promotoras ou potencializadoras de cancerígenos ambientais. Por exemplo, compostos N-

nitrosos presentes nos alimentos e no tabaco podem ser os responsáveis pelo amplo espectro

de mutações de ponto do gene supressor de tumores TP53 nos éxons 5-8 e mutações de

transição, transversão e deleções que estão presentes em mais de 50% dos cânceres

esofágicos. As mutações no gene P16 e a perda de alelos envolvendo outros genes em outros

15

cromossomos também são prevalentes nessas neoplasias, de acordo com o conceito de que a

aquisição escalonada e o acumulo de alterações genéticas levam ao desenvolvimento do

câncer (Putz et al., 2002). As mutações somáticas no gene supressor tumoral TP53 são

encontradas em aproximadamente 50% de todos os tumores humanos, fazendo dele o gene

mais comumente alterado, são mais frequentes mutações do tipo missense e se acumulam nos

éxons 5-8, a maioria destas mutações altera a estrutura da proteína p53 e condiciona a perda

de sua função de supressor tumoral . As mutações no gene TP53 ocorrem em mais de 50 tipos

diferentes de tumores, incluindo os de bexiga, cérebro, cólon, esôfago entre outros (Stoner et.

al, 2001, Putz et al., 2002).

Várias alterações moleculares no CE do esôfago foram descritas, como perda de

heterozigose no cromossomo 1p, 3p, 4, 5q, 9, 11q, 13q, 17q, 18q; perda da função de genes

supressores tumorais dentre eles TP53, metilação e perda do P16MST1 ou P15 e redução da

expressão de Rb; amplificação gênica de D1 ciclina; HST-1, EGFR, INT-2; aumento na

expressão de iNOS, hTERT, BMP-6, COX-2, c-myc e β-catenina (Stoner et. al, 2001, Putz et

al., 2002).

No processo de inflamação crônica devido ao uso do mate em temperaturas elevadas,

ocorre a formação de nitrosaminas e radicais livres endógenos que podem ser responsáveis

pela alta freqüência de mutações de transição G>A e C>T no gene TP53 observado em CE de

pacientes do sul do Brasil. A prevalência de transição G>A destes casos do Rio Grande do Sul

foi mais alta do que as encontradas depositadas nas bases de dados mundiais (IARC, Lion-

França) (Putz et al., 2002).

O CE é derivado do epitélio escamoso estratificado da mucosa esofágica. Nessas

neoplasias formam-se quantidades variáveis de queratina, com relação ao grau de

diferenciação normal e, quando a queratina não está na superfície, ela se acumula na forma

córneas; nos casos em que as células estão bem diferenciadas, podem-se observar pontes

intercelulares (desmossomos) entre células adjacentes (Stedman, 1996). Neste tipo de tumor

freqüentemente há presença de invasão de fungos, ulceração e lesões que invadem o epitélio

do esôfago. No CE podem ocorrer áreas bem diferenciadas e poucas áreas de necrose, mas

também podemos encontrar tumores com taxas de mitoses elevadas e grandes áreas de necrose

(Stoner et al., 2001, Putz et al., 2002). A maioria dos pacientes com este tipo de neoplasia

apresenta metástase, prognóstico pouco favorável, e uma sobrevida acima de cinco anos

apenas para 10% dos casos.

As principais intervenções preventivas para reduzir a incidência de CE seriam a

abstinência de bebidas alcoólicas e do cigarro e o consumo de alimentos que contenham

16

propriedades antioxidantes e/ou antiflamatória como o chá-verde, frutas frescas vermelhas e

vegetais (Wang et al., 2006, Stoner et al., 2001, Stoner et al., 2007).

O AD de esôfago está mais relacionado com as doenças que acometem o esôfago, entre

elas a DRGE, esofagite de refluxo e EB, com o desenvolvimento de metaplasia intestinal,

displasia e AD de esôfago (Ransford e Jankowski, 2000).

Existem muitos fatores de risco para o desenvolvimento do AD de esôfago, dentre eles

estão: idade, sexo, DRGE, EB, hérnia de hiato, esofagites, úlceras e disfagia, o uso de

medicamentos que relaxam o esfíncter esofágico e causam refluxo gastroesofágico (i.e.,

nitroglicerinas, aminofilina, β receptor agonista, anticolinérgicos e benzodiazepinas),

obesidade, dieta rica em gordura, colesterol e proteína animal e consumo de cigarros (Chow et

al., 1998; Lagergren, 2000; Wu et al., 2001; Lagergren, 2006; Murray et al., 2006; Dodaran et

al., 2006). O EB, um dos fatores de alto risco para o desenvolvimento do AD, é uma condição

secundária desencadeada pela DRGE (Olliver et al., 2005; Dodaran et al., 2006; Murray et al.,

2006; Fléjou, 2006). Pacientes que apresentam esta condição pré-maligna apresentam maior

risco para o desenvolvimento da doença, pois a maioria dos casos de AD de esôfago provém

do EB. (Olliver et al., 2005; Murray et al., 2006; Fléjou, 2006; Dodaran et al., 2006;

Lagergren, 2006).

A influência de fatores genéticos na etiologia do AD de esôfago tem importância

limitada na maioria dos casos. Nenhuma evidência de histórico familiar tem sido estabelecida

para este tipo de neoplasia, ou seja, não está relacionado com a hereditariedade (Lagergren,

2006). Mutações no gene TP53 foram encontradas na maioria dos AD (Olliver et. Al., 2005).

Em alguns estudos foi possível verificar que a infecção por Helicobater pilori diminuiu

o risco para o desenvolvimento de AD de esôfago em 60%. O efeito protetor do H. pilori se

deve a sua habilidade de induzir gastrite atrófica e a produção de amônia (Lagergren, 2006).

Sabe-se também que o consumo de uma alimentação rica em frutas, vegetais e alimentos com

alto teor de antioxidantes contribuem para a diminuição do risco de desenvolvimento da

doença neoplásica (Chow et al., 1998; Ye et al., 2004; Lagergren, 2006).

Estudos epidemiológicos mostram uma redução do risco de desenvolvimento de

neoplasias gastrintestinal associados à utilização de antiinflamatórios não esteroidais

(NSAIDS), especialmente pelo uso de inibidores de ciclooxigenase-2 (COX-2) (Lagergren,

2000; Lagergren, 2006). As neoplasias de esôfago apresentam aumento da expressão de COX-

2 e, portanto, o tratamento com inibidores COX-2 poderia retardar o desenvolvimento dessas

neoplasias (Taketo,1998; Wilson et al., 1998; Zimmerman et al., 1999; Lagergren, 2006).

17

O AD que surge no EB geralmente está localizado no esôfago distal e pode invadir o

cárdia gástrico adjacente. Inicialmente, aparece como manchas planas ou elevadas de uma

mucosa intacta, podendo evoluir para grandes massas nodulares de até cinco centímetros, ou

pode exibir características infiltrativas e difusas ou profundamente ulcerativas.

A incidência mundial de AD de esôfago está aumentando e seu prognóstico é pouco

favorável assim como a do CE (Parkin, 2001). Esta neoplasia é de alta morbidade, ou seja,

apenas 10% dos pacientes diagnosticados têm uma sobrevivência de até cinco anos, sendo

mais freqüente em homens com idade acima de 60 anos (Lagergren, 2006).

3.3.) Álcool e cigarro como fatores de risco para o câncer do esôfago

A maioria das neoplasias do esôfago na Europa e nos EUA é freqüentemente atribuída

ao consumo do álcool e do cigarro, visto que apresentam quantidades significativas de

substâncias mutagênicas e/ou cancerígenas, em especial PHAs e nitrosaminas (Lu et al., 1991;

Yang et al., 1992; Straif et al., 2000; Wogan et al., 2004).

O consumo crônico de etanol está relacionado diretamente com o desenvolvimento de

tumores no trato aéreo-digestivo superior, principalmente a cavidade oral, faringe, laringe e

esôfago, sendo que cerca de 25% a 80% desses tipos de neoplasias podem ser atribuídas ao

consumo crônico de etanol (Brown, 2005). Além desses órgãos, o desenvolvimento de

neoplasias no fígado, intestino grosso, mama e pâncreas, está também relacionado ao consumo

excessivo de álcool (Brown, 2005; Boffeta e Hashibe, 2006). Vários estudos epidemiológicos,

revisados em Poschl e Seitz (2004), mostram forte correlação entre a ocorrência dessas

neoplasias e a ingestão de álcool, sugerindo que o etanol é um fator de risco importante para o

desenvolvimento dessas doenças. O consumo abusivo de etanol ainda é uma das principais

causas de desnutrição em adultos nos países desenvolvidos (Bunout, 1999). A ingestão de

álcool causa deficiências nutricionais tais como alterações no metabolismo lipídico, protéico,

de carboidratos, de vitaminas, em especial vitamina A e do complexo B, e micronutrientes,

como o zinco (Bunout, 1999). Essas deficiências contribuem para a carcinogênese, uma vez

que o consumo excessivo de etanol promove hipometilação do DNA, inclusive de genes

supressores de tumor, aumentando a necessidade de ingestão de doadores de grupos metil,

cuja absorção fica comprometida após o consumo de álcool (Stickel et al., 2002; Pöschl e

Seitz, 2004). Não obstante, o aldeído causa destruição do folato na célula, o que inibe a

transmetilação de genes envolvidos na carcinogênese (Pöschl e Seitz, 2004).

18

O etanol pode apresentar efeito co-carcinogênico, pois seu consumo abusivo pode

reduzir os níveis de substâncias antioxidantes, como as glutationas (redutases e transferases),

α-tocoferol e β-caroteno, seja pela perda de estoques teciduais, por inibição de síntese ou por

destruição através da geração de radicais livres, além de alterar a função de enzimas hepáticas

antioxidantes, como a glutationa-S-transferase em decorrência da formação de adutos

acetaldeído-enzima (Sultana et al., 2005). O consumo de etanol aumenta a expressão da

enzima CYP2E1 em vários órgãos, em especial no fígado e esôfago (Kushida et al., 2005;

Tsutsumi et al., 1993; Stickel et al., 2002; Pöschl e Seitz, 2004; McKillop e Schrum, 2005).

Essa enzima pertence à família do citocromo P450, que é responsável pela biotransformação

de vários pró-cancerígenos, tais como as aflatoxinas, nitrosaminas, hidrocarbonetos

policíclicos, em suas formas reativas (Tsutsumi et al., 1993; Stickel et al., 2002; Yu e Yuan,

2004; Pöschl e Seitz, 2004). Estas substâncias estão presentes no ar e em alimentos

contaminados com micotoxinas, sendo que as mesmas são produzidas no preparo de carnes e

no cozimento dos alimentos, e estão presentes ainda no cigarro e em bebidas alcoólicas

(Tsutsumi et al., 1993; Stickel et al., 2002; Karim et al., 2003; Pöschl and Seitz, 2004;

McKillop and Schrum, 2005; Marrero, 2005; Kushida et al., 2005). A CYP2E1 também é

responsável pela biotransformação do etanol a acetaldeído e pela geração de radicais livres de

oxigênio (RLO) (Stickel et al., 2002; Karim et al., 2003; Pöschl and Seitz, 2004; McKillop

and Schrum, 2005), sendo que o estresse oxidativo é um evento promotor da carcinogênese

(Bunout, 1999; Karim et al., 2003; Stickel et al., 2002; Petersen, 2005; Donohue et al., 2006).

O acetaldeído apresenta efeitos mutagênicos e carcinogênicos, uma vez que reage com o

DNA, formando adutos e inibindo o sistema de reparo, induzindo aberrações cromossômicas e

estimulando a apoptose e outros danos celulares (Stickel et al., 2002; Pöschl and Seitz, 2004;

Brooks e Theruvathu, 2005).

Entre os fatores de risco associados ao desenvolvimento de neoplasias do esôfago, o

consumo de cigarros é um dos mais importantes (Vaughan et al., 1995; Gammon et al., 1997).

Entretanto, há poucos estudos sobre a importância da inalação da fumaça (fumantes passivos)

e do tipo de tabaco, para a etiologia dos cânceres de esôfago.

Launoy et al. (2000) demonstraram que a melhor relação entre o risco para o câncer do

esôfago e o cigarro, depende do tipo de tabaco e do padrão morfológico da neoplasia, sendo

consistentes com estudos que revelam que o fumo de rolo ou corda apresentam maior risco

para o desenvolvimento dessa doença (Stephani et al., 1990). O nível de exposição ao cigarro

e o risco para o desenvolvimento do CE depende da intensidade e duração do contato com a

19

fumaça do cigarro (Doll et al., 1994; Castellsague et al., 1999; Lagergren et al., 2000). Há

evidências de que o fumo está mais associado com o CE do que com o desenvolvimento de

AD de esôfago (Lagergren et al., 2000).

Estudos realizados na França demonstraram aumento de 4,6 e 10,9 vezes maior de

desenvolvimento de câncer do esôfago em pacientes que fumaram 35 ou mais cigarros ou que

beberam três ou mais doses de álcool por dia, respectivamente (Kollarova et al, 2007). Esses

fatores, quando associados, tiveram seus efeitos potencializados, apresentando risco final

multiplicado (Kollarova et al, 2007). Ex-fumantes, após 15-19 anos, apresentam redução do

risco para 1,2 vezes.

Entre os vários elementos cancerígenos presentes na fumaça do tabaco, os

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, as aminas aromáticas e as nitrosaminas apresentam-

se como os componentes mais importantes para o desenvolvimento de neoplasias em humanos

(Hoffmann et al.,1990; Wogan et al., 2004). As nitrosaminas tais como a 4(metilnitrosamina)-

1-(3-piridil)-1-butanona (NNK) e a N´-nitrosonornicotina (NNN) têm sido associadas ao

desenvolvimento do câncer oral, de esôfago, pulmão e pâncreas em fumantes (Hoffman et al.,

1990; Hecht et al., 1990; Hecht, 1998, 1999; Wogan et al., 2004) e são potentes indutores de

neoplasias do esôfago em roedores (Craddock, 1992).

A exposição às nitrosaminas pode se dar através da alimentação, do tabaco e da síntese

endógena que ocorre no estômago pela reação do nitrito com aminas secundárias (Magee,

1989). O rato é a espécie mais suscetível ao desenvolvimento de neoplasias de esôfago

induzido por nitrosaminas, independentemente da via de administração (Lijinsk, 1992). A

ativação metabólica das nitrosaminas é catalisada pelo citocromo P450 (CYP), e o produto

formado é extremamente instável podendo reagir com o DNA, induzindo mutações (Magee,

1989), sendo que no fígado, a CYP2E1 é a enzima mais importante envolvida nesta ativação

(Yang et al., 1992). O esôfago de ratos não expressa de forma significante a enzima CYP2E1,

mas em contrapartida, expressa a CYP2A3 responsável em grande parte pelo metabolismo das

nitrosaminas (Pinto et al., 2001, 2003).

Como o etanol altera a biotransformação das nitrosaminas em animais experimentais e

no homem (Pinto, 2000), verifica-se experimentalmente aumento no número de tumores

esofágicos frente administração concomitante de etanol e nitrosaminas (Aze et al., 1993;

Tsutisumi et al., 1993).

20

3.4.) O consumo de bebidas quentes como fator de risco para o câncer do esôfago

O efeito do consumo de bebidas quentes como fator de risco para o desenvolvimento do

CE de esôfago ainda é um tema controverso (Stoner et al., 2001; Putz et al., 2002; Pinto et al.,

2003; Ishikawa et al., 2006). Por exemplo, o consumo de chá-verde (~60°C a 80°C) tem sido

considerado como um fator de proteção para o câncer de esôfago em estudos epidemiológicos

desenvolvidos na China (Wang et al., 2006, Wang et al., 2007), mas, no entanto foi

considerado um fator de risco em um estudo populacional desenvolvido no Japão (Ishikawa et

al., 2006). Além disso, o consumo regular de chá-verde é um importante fator de proteção

contra o desenvolvimento do CE, pois possui componentes antioxidantes e/ou

antiinflamatórios (Steele, 2003; Wang et al., 2006, Wang et al., 2007). Experimentalmente, o

consumo de chá verde inibiu a carcinogênese de esôfago induzida pela N-

nitrosometilbenzilamina (composto carcinogênico encontrado em algumas modalidades de

alimento como vegetais em conserva) (Wang et al., 2006).

A erva-mate, produzida a partir das folhas da Ilex paraguariensis (família das

aqüifoliáceas), é originária da região subtropical da América do Sul. O uso habitual de

chimarrão ou mate, uma infusão quente de folhas secas e picadas de Ilex paraguariensis, tem

sido relacionado ao aumento nas taxas de incidência de câncer esofágico (CE) na América do

Sul, incluindo o sul do Brasil, Uruguai e nordeste da Argentina (Victora et al., 1987; Victora

et al., 1990; Castelletto et al., 1994; Leitão e Braga, 1994; Winge et al., 1995; Rolón et al.,

1995; Fonseca et al., 2000; Stoner et al., 2001; Putz et al., 2002; Pinto et al., 2003; Fagundes

et al., 2006; Ishikawa et al., 2006; Bates et al., 2007; Stefani et al., 2007). Os índíos Guaranis

e Quínchuas que habitavam essas regiões tinham o hábito de beber infusões com as folhas da

erva mate. Esse hábito foi transmitido aos respectivos colonizadores, por volta do século XVI.

A forma de consumo do mate foi modificada pelos colonizadores e transmitida aos seus

descendentes e aos imigrantes que hoje ocupam essa região (Barros et al., 2000). Hoje em dia,

a erva mate é tradicionalmente consumida como uma infusão quente ou chimarrão (RS), ou

gelado (tererê) (Mato Grosso do Sul e Paraguai).

O chimarrão também é consumido no Chile e principalmente no Uruguai, país de maior

consumo per capita (cerca de 8-10 kg de erva/habitante/ano). Na Argentina a taxa de consumo

é em torno de 6,5 kg de erva/habitante/ano e, na região sul do Brasil, 3-5 kg de

erva/habitante/ano. Análises químicas da erva-mate têm revelado a presença de diversas

propriedades nutricêuticas e medicinais no produto, o que lhe confere um grande potencial de

21

aproveitamento para a saúde humana. Alguns compostos químicos encontrados na erva-mate

são alcalóides (cafeína, metilxantina, teofilina e teobromina); taninos (ácidos fólico e caféico);

vitaminas (A, B1, B2, C e E); sais minerais (alumínio, cálcio, fósforo, ferro, magnésio,

manganês e potássio); proteínas (aminoácidos essenciais); glicídios (frutose, glucose, rafinose

e sacarose); lipídeos (óleos essenciais e substâncias ceráceas); celulose; dextrina; sacarina e

gomas (Keys, 1993; Souza et al., 1991; Perez, 1993, Heck et al., 2007).

O consumo de chimarrão, ingerido normalmente em grandes volumes e em alta

temperatura (entre 65°C a 71°C), é um conhecido fator de risco para CE. Existem hipóteses

relacionando a temperatura elevada do mate ao desenvolvimento do processo de

carcinogênese de esôfago (Winge et al., 1995; Kinjo et al., 1998). Por exemplo, o consumo de

grandes quantidades de mate (ao redor de 1,8 L/dia) em temperaturas na ordem de 69,5°C

(~65°C a 71°C) tem sido considerado um fator de risco para desenvolvimento de câncer

esofágico, em especial quando associado a outros fatores de risco bem estabelecidos como

cigarro e álcool (Victora et al., 1990; Prolla et al., 1993).

Existem três prováveis hipóteses relacionando o aumento da incidência de câncer de

esôfago em humanos pelo consumo de mate em altas temperaturas (Victora et al., 1987; Rolón

et al., 1995): 1) a injúria térmica da mucosa esofágica poderia desencadear a liberação de

mediadores inflamatórios que seriam importantes para o desenvolvimento do processo

carcinogênico nesse órgão (Putz et al, 2002); 2) durante o processo de secagem e

processamento das folhas do mate (defumação) ocorreria a produção de substâncias

mutagênicas e/ou carcinogênicas (PHAs) que são potencialmente carcinogênicas para o

esôfago (Zuin et al., 2005; Kamangar et al., 2008); 3) a associação de ambos os fatores

anteriores, citados acima.

3.5.) Dados controversos sobre o consumo do mate

Em um recente estudo experimental, o tratamento com mate reduziu o estresse

oxidativo, o influxo de células inflamatórias e a expressão de MMP-9 e TNF- α no pulmão de

camundongos expostos a fumaça do cigarro (Lanzetti et al., 2008). Desta forma, os resultados

desse experimento sugerem que o mate poderia ser um recurso no tratamento da inflamação

aguda de pulmão em pessoas exposta ao cigarro (Lanzetti et al., 2008).

Alguns estudos recentes apontam para a relação do consumo de mate com o

desenvolvimento de câncer de bexiga, em estudos de casos na Argentina e Uruguai. O

22

consumo de mate ingerido através de uma bomba metálica durante 20 anos foi associado com

câncer de bexiga em pessoas que sempre fumaram, mas não demonstrou o mesmo efeito em

não fumantes. Já o mate cozido (feito através de infusão tradicional da erva), não foi associado

ao desenvolvimento do câncer de bexiga (Bates et al., 2007).

Outro estudo indica que o consumo mate está envolvido no desenvolvimento de câncer

de bexiga, mas os dados ainda são controversos (Stefani et al., 2007; Bates et al., 2007).

Pessoas que bebem grandes quantidades de mate apresentam aumento de risco para o

desenvolvimento de neoplasia de bexiga, principalmente quando associada ao consumo de

cigarros, mas estudos adicionais são necessários para confirmar ou rejeitar esta hipótese

(Stefani et al., 2007).

As folhas de Ilex paraguariensis contem substâncias com atividade antioxidante

(Schinella et al., 2000; Actis-Goretta, et al., 2002; Chandra et al., 2004; Schinella et al., 2005;

Bixby et al., 2005), que inibem a proliferação de células endoteliais (Arbiser et al., 2005) ou

que inibem a atividade da enzima topoisomerase II (Ramirez- Mares et al., 2004; Meijia et al.,

2005). Desta forma, o consumo de erva mate poderia compensar os efeitos deletérios da

temperatura sob a mucosa do esôfago. Experimentos em ratos indicam que a administração

intra-esofágica de água em temperatura superior a 60°C pode potencializar o efeito de

carcinógenos sob o esôfago. Ratos Fischer 344 que receberam administração intra-esofágica

de água a 65°C durante ou após as aplicações de N-nitrosometilbenzilamina (NMBA),

desenvolveram mais neoplasias de esôfago do que os grupos controles de animais que

recebem somente água 65°C ou NMBA (Li et al., 2003). A administração crônica intra-

esofágica de água a 65°C induziu o aparecimento de sarcomas no esôfago em ratos Wistar

machos tratados com N-metil-N'-nitrosoguanidina (MNNG), um típico carcinógeno para o

estômago de ratos (Yioris et al., 1984). Desta forma, suspeita-se que a alta temperatura em que

é ingerido o mate seja o principal fator de risco para o desenvolvimento de câncer de esôfago.

Existem muitos dados controversos a respeito da mutagenicidade do mate, Segundo

Leitão e Braga (1994) o mate apresentou efeito citotóxico e clastogênico em células de

Escherichia coli e Salmonella typhimurium em cultura. Outro estudo do mesmo grupo

mostrou efeito genotóxico e mutagênico do mate em linfócitos humanos em cultura (Fonseca

et al., 2000). Entretanto, estudos recentes com mate apontam para ausência de efeito

clastogênico ou aneugênico, cromossomos inteiros que não completam a migração anafásica

da divisão celular semelhante à não disjunção, em linfócitos humanos em cultura e efeito

antimutagênico em células hepáticas, renais e de bexiga de camundongos expostas ao

peróxido de hidrogênio (Alves et al., 2008, Miranda et al., 2008).

23

As diferenças dos resultados de mutagenicidade/genotoxicidade do mate poderiam estar

relacionadas às diferentes amostras de mate utilizadas, visto que processo de secagem das

folhas do mate (defumação com contaminação por PHAs) podem ser potencialmente

carcinogênicas para o esôfago (Zuin et al., 2005; Kamangar et al., 2008). As variáveis

agronômicas podem também contribuir para diferenças de composição química das amostras

de mate influenciando nos resultados de experimentos in vitro e in vivo (Jacques et al., 2007 a

e b).

Embora existam alguns estudos que apontam para a relação entre o consumo do mate em

grandes quantidades e em altas temperaturas (chimarrão) e o aumento no risco de

desenvolvimento de carcinoma, outros estudos mostram resultados favoráveis ao uso do mate

devido ao efeito antioxidante dos polifenóis encontrados no mate (Steele, 2003; Wang et al.,

2006; Stoner et al., 2007; Lanzetti et al., 2008).

O efeito cancerígeno do mate sempre foi relacionado às altas temperaturas em que ele é

consumido, mas o desenvolvimento de neoplasias em outros órgãos como rins, pulmão e

bexiga, relacionados ao consumo de mate sugerem a contaminação da erva com compostos

cancerígenos como benzopireno, compostos N-nitrososos e outros, ou da água em que o mate

é preparado (Bates et al., 2007; Stefani et al., 2007). Por exemplo, estudos sobre a composição

química do mate sugerem que o mate pode ter efeito carcinogênico devido aos altos conteúdos

de ácido caféico (Stefani et al., 2007).

3.6.) Modelos de indução de câncer de esôfago em ratos.

Existem vários modelos experimentais em roedores para estudo do processo de

carcinogênese de esôfago. Esses modelos in vivo podem ser divididos em dois grandes grupos,

em decorrência do tipo de neoplasia envolvida: 1) os modelos de indução de carcinomas de

células escamosas (Lehnert et al., 1982; Balansky et al., 2002) e 2) os modelos de indução de

AD e EB sob influência de refluxo gastro/duodeno/esofágico (Seto et al., 1991; Attwood et

al., 1992; Ireland et al., 1996; Goldstein et al., 1997).

Nos carcinógenos químicos (nitrosaminas) mais utilizados na indução química de CE

encontram-se dietilnitrosamina (DEN) (Peto et al., 1991; Salet et al., 2002) e a N-

nitrosometilbenzilamina (NMBA) (Wargovich e Imada, 1993; Siglin et al., 1995). Para os

experimentos de carcinogênese química de esôfago a DEN tem sido administrada

preferencialmente pela a via oral e intraperitoneal (Yioris et al., 1984; Wargovich e Imada,

24

1993). A DEN apresenta alta especificidade para o esôfago, induzindo grande número de

tumores em ratos e camundongos, semelhantes aos carcinomas de células escamosas em

humanos (Peto et al., 1991; Aze et al. 1993; Salet et al., 2002). Assim os modelos de

carcinogênese experimental utilizando-se a DEN poderiam ser úteis no estudo de vários

fatores relacionados ao desenvolvimento dessa neoplasia (Aze et al. 1993; Balansky et al.,

1994; 2002).

O CE de esôfago induzido quimicamente em roedores ocorre através do

desenvolvimento de alterações seqüenciais caracterizadas inicialmente por lesões esofágicas

pré-neoplásicas (hiperplasias) e neoplásicas (CE) (Aze et al. 1993, Stoner et al., 2001).

Os modelos animais representam ferramenta essencial para investigar a evolução da

DRGE porque permitem estudar a biologia e evolução dessa doença. Esses modelos têm sido

empregados para mimetizar a doença no ser humano e simplificar estudos sobre os efeitos de

fatores exógenos sobre o sistema digestório (Soren et al., 2003; Piazuelo et al., 2005).

Uma das técnicas cirúrgicas é a anastomose látero-lateral da transição esôfago-gástrica

com uma alça de jejuno. Goldstein et al. (1997) avaliaram o desenvolvimento de lesões

esofágicas em função do tempo em ratos submetidos ao refluxo duodeno-gastroesofágico e

constataram que os animais desenvolveram esofagite leve 3 semanas após a cirurgia; leve a

moderada após 5 semanas, esofagite moderada entre a 9a. e 17 a. semana e esofagite moderada

a severa (EB) entre a 23a. e 31a. semanas após a cirurgia. O AD foi diagnosticado após 30

semanas do procedimento cirúrgico que proporcionou a instalação do refluxo gástrico.

Miwa et al., 2004, observaram em ratos machos Wistar, submetidos à gastrectomia total

e ligação do esôfago com o jejuno, hiperplasia e erosões das células basais do epitélio

escamoso do esôfago, e posteriormente, o desenvolvimento de AD.

25

4. Considerações finais e objetivos

O câncer de esôfago já é enquadrado entre as dez neoplasias mais freqüentes que

acometem o ser humano (Parkin et al., 2001; Stoner et al., 2001; Enzinger e Mayer, 2003;

Kollarova et al, 2007) e, entre as localizadas no trato gastrintestinal, a terceira de maior

incidência (Park et al., 2001). A etiologia de câncer esofágico nas regiões de alto risco (maior

incidência) não foi ainda elucidada.

De acordo com estimativas do INCA 2008 haverá 19,73/100.000 mortes por câncer de

esôfago entre os homens e 7,58/100.000 casos de morte por câncer de esôfago entre as

mulheres. Considerando a crescente incidência mundial de câncer de esôfago, em especial no

Rio Grande do Sul; a importância da identificação de fatores de risco associados à promoção

da carcinogênese de esôfago e a existência de poucos estudos epidemiológicos sobre a

provável relação entre o consumo do mate (chimarrão) em altas temperaturas e o câncer de

esôfago, o presente estudo teve a finalidade de investigar a possível ação da Ilex

paraguariensis no desenvolvimento de pré-neoplasias e neoplasias de esôfago em ratos.

Para determinar os efeitos do mate (Ilex paraguariensis) e da temperatura sobre o processo

de promoção da carcinogênese de esôfago foram realisados os seguintes estudos:

1) avaliar a habilidade da infusão de mate em potenciar ou inibir os efeitos da injúria térmica

(água a 65 0C) no processo de iniciação da carcinogênese de esôfago em animais iniciados

pela DEN;

2) avaliar o potencial diferencial de amostras orgânica e comercial a Ilex paraguariensis em

inibir a carcinogênese de esôfago induzida com a DEN associada a injuria térmica (água a 65 0C);

3) Comparar os efeitos da infusão de Ilex paraguariensis com a da Camellia sinensis (chá

verde). O chá-verde é a bebida herbal mais consumida no mundo e apresenta efeitos

anticarcinogênicos comprovados em estudos experimentais e em estudos (Yang et al., 2002;

Chung et al., 2003.

26

5. Referências*

Actis-Goretta, L., Mackenzie, G.G., Oteiza, P.I., Fraga, C.G. Comparative study on the antioxidant capacity of wines and other plant-derived beverages. Ann N Y Acad Sci, v. 957, p 279-83, 2002.

Alves, R.J., Jotz, G.P., Amaral, V.S., Montes, T.M., Menezes, H.S., Andrade, H.H.The evaluation of maté (Ilex paraguariensis) genetic toxicity in human lymphocytes by the cytokinesis-block in the micronucleus assay. Toxicol In Vitro, v. 22, p 695-708, 2008.

Araújo, C.L.C., Vanzelotti, I.R., Lemos, J. I., Azevedo, M.F. Stedman’s Medical Dictionary. 25ed Rio de Janeiro: RJ, 1996.

Arbiser, J.L., Li, X.C., Hossain, C.F, Nagle, D.G., Smith, D.M., Miller ,P., Govindarajan, B., DiCarlo, J., Landis-Piwowar, K.R., Dou, Q.P. Naturally occurring proteasome inhibitors from mate tea (Ilex paraguayensis) serve as models for topical proteasome inhibitors. J Invest Dermatol, v. 25, p 207-212, 2005.

Attwood, S.E.A., Smyrk, T.C., DeMeester, T.R. Duodenoesophageal reflux and development of esophageal adenocarcinoma in rats. Sugery, v. 111, p 503-510, 1992.

Aze,Y., Toyoda,K., Furukawa,F., Mitsumori,K., Takahashi,M. Enhancing effect of ethanol on esophageal tumor development in rats by initiation of diethylnitrosamine. Carcinogenesis, v.14, p 37-40,1993.

Balansky RM, Blagoeva PM, Mircheva ZI, De Flora S . Modulation of diethylnitrosamine carcinogenesis in rat liver an esophagus. J Cell Biochem, v. 56, p 449-454,1994.

Balansky, R.M., Ganchev,G., D'Agostini,F., De Flora,S. Effects of N-acetylcysteine in an esophageal carcinogenesis model in rats treated with diethylnitrosamine and diethyldithiocarbamate. Int J Cancer, v.98, p 493-497, 2002.

Bates, M.N., Hopenhayn, C., Rey, O.A., Moore, L.E. Bladder cancer and mate consumption in Argentina: A case-control study. Cancer Letters, v. 246, p 268-273, 2007. Batista, L.E., Escuder, M.M., Pereira, J.C. The color of death: causes of death according to race in the State of Sao Paulo, 1999 to 2001. Rev. Saude Publica, v.38, p.630-636, 2004.

*Formatação Segundo as Normas da ABNT

27

Bixby,M., Spieler,L., Menini,T., Gugliucci,A. Ilex paraguariensis extracts are potent inhibitors of nitrosative stress: a comparative study with green tea and wines using a protein nitration model and mammalian cell cytotoxicity. Life Sci, v. 77, p 345-358, 2005.

Blot,W.J., Devesa,S.S., Kneller,R.W. and Fraumeni,J. F. Rising incidence of adenocarcinoma of the esophagus and gastric cardia. J. Am. Med. Assoc, v. 265, p 1287-1289, 1991.

Bofetta P., Hashibe, M. Alcohol and cancer. Lancet Oncol, v. 7, p 149-156, 2006.

Brooks, T.J., Theruvathu, J.A. DNA adducts from acetaldehyde: implications for alcohol-related carcinogenesis. Alcohol, v. 35, p 187-193, 2005.

Brown, L.M. Epidemiology of alcohol-associated cancers. Alcohol, v. 35, p 161-168, 2005.

Bunout, D. Nutritional and metabolic effects of alcoholism: their relationship with alcoholic liver disease. Nutrition, v. 15, p 583-589, 1999.

Cameron,A.J., Lomboy,C.T., Pera,M., et al. Adenocarcinoma of the esophagogastric junction and Barret´s esophagus. Gastroenterology, v. 109, p 1541-1546, 1995.

Castelletto,R., Castellsagué,X., Muñoz,N., Iscovich,J., Chopita,N. and Jmelnitsky,A., Alcohol, tobaco, diet, mate drinking and oesophageal câncer in Argentina. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prevent, v. 3, p 557-564,1994.

Castellsague, X., Munhoz, N., De Stefani, E., Victora, C.G., Castelletto, R., Rollon, P.A., Quintana, M.J. Independent and joint effects of tobacco smoking and alcohol drinking on the risk of esophageal cancer in men and women. Int J Câncer, v. 82, p 657-664, 1999.

Castro, L. P., Brito, E. M., Coelho, L. G. V. Doença Do refluxo gastroesofágico. RBM, v. 57, p 1214-32, 2000.

Cecconello, I., Pinotti, H.W., Zilberstein, B., Nasi, A. Esofagite de refluxo – Etiopatogenia, diagnóstico e tratamento clínico. Tratado de clínica cirúrgica do aparelho digestivo. 1ed, São Paulo: SP, 1994.

Chandra,S., De.Mejia Gonzalez,E. Polyphenolic compounds, antioxidant capacity, and quinone reductase activity of an aqueous extract of Ardisia compressa in comparison to mate (Ilex paraguariensis) and green (Camellia sinensis) teas. J Agric Food Chem, v. 52, p 3583-3589, 2004.

28

Chow, W.H., Blot, W.J., Vaughan, T.L. Body mass index and risk of adenocarcinoma of the esophagus and gastric cardia. J. Nalt Cancer Inst, v. 90, p 150-155, 1998.

Craddok,V.M., Etiology of esophageal cancer: some operative factors. Eur J Cancer Prev, v. 1, p 89-103, 1992.

Day,N.E., Varghese,C.,Esophageal cancer. Cancer Surv, v. 19-20, p 43-54, 1994.

De Barros,S.G.S., Ghisolfi,E.S., Lus,L.P., et al. Mate (chimarrão) e consumido em alta temperatura por população de alto risco para o câncer epidermoide de esôfago. Arq.Gastroenterol, v. 37, p 25-30, 2000.

De Stefani,E., Muñoz,N., Estève,J., Vassalo,A., Victora,C.G, Teuchmann,S. Matè drinking, alcohol, tobaco, diet and esophageal câncer in Uruguay. Cancer Res, v. 50, p 426-431, 1990.

De Stefani, E., Boffetta, P., Pelegrini, H.D., Correa, P., Ronco, A.L., Brennan, P., Ferro, G., Acosta, G., Mendilaharsu, M. Non-alcholic beverages and risk of bladder câncer in Uruguay. BMC, v. 7, p 1-8, 2007.

Dodaran, M.S., Logan, R.F.A., West, J., Card, T., Coupland, C. Risk of oesophageal cancer in Barret’s oesophagus and gastro-oesophageal reflux. GUT, v. 53, p 1070-1074, 2006.

Donohue, T.M., Osna, N.A., Clemens, D.L. Recombinant Hep G2 cells that express alcohol dehydrogenase and cytochrome P450 2E1 as a model of ethanol-elicited cytotoxicity. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, v. 38, p 92-101, 2006.

Doll, R., Peto, R., Wheatley, K., Gray, R., Sutherland, I. Mortality in relation to smoking: 40 years' observations on male British doctors. BMJ, v. 309, p 901-911, 1994.

Engel,L.S., Chow,W.H., Vaughan,T.L., Gammon,M.D., Risch,H.A., Stanford,J.L., Schoenberg,J.B., Mayne,S.T., Dubrow,R., Rotterdam,H., West,A.B., Blaser,M., Blot,W.J., Gail,M.H., Fraumeni,J.F.Jr. Population attributable risks of esophageal and gastric cancers. J Natl Cancer Inst, v. 95, p 1404-1413, 2003.

Enzinger, P.C., Mayer, R.J. Esophageal cancer. N Engl J Med, v. 349, p 2241-2252, 2003.

Fagundes, R.B., Abnet, C.C., Strickland, P.T., Kamangar, F., Roth, M., Taylor, P.R., Dawsey, S.M. Higher urine I-hydroxy pyrene glucuronide ( I-OHPG) is associated with tabacco smoke

29

exposure and drinking mate in healthy subjects from Rio Grande do Sul Brazil. BMC, v. 6, p 1-7, 2006.

Farhadi,M., Tahmasebi,Z., Merat,S., Kamangar,F., Nasrollahzadeh,D., Malekzadeh, R. Human papillomavirus in squamous cell carcinoma of esophagus in a high-risk population. World J Gastroenterol, v. 11, p 1200-1203, 2005.

Fléjou, J.F. Barret’s oesophagus: from metaplasia to dysplasia and cancer. GUT, v. 54, p 6-12, 2006.

Fonseca, C.A., Otto,S.S., Paumgartten, F.J., Leitao, A.C.Nontoxic, mutagenic, and clastogenic activities of Mate-Chimarrao (Ilex paraguariensis). J Environ Pathol Toxicol Oncol, v. 19, p 333-346, 2000. Gammon, M.D., Schonberg, J.B., Ahsan, H. Tabacco alcohol, and socio economic status and adenocarcinomas of the esophagus and gastric cardia. J. Natl Cancer Inst, v. 89, p 1277-1284, 1997.

Goldstein ,S.R., Yang, G., Curtis, S.K. Development of esophageal metaplasia and adenocarcinomas in rat surgical model without the use of a carcinogen. Carcinogenesis, v. 18, p 2265-2270, 1997.

Griffiths, A.J.F., Wessler, S.R, Lewontin, R.C., Gelbart, W.M., Suzuki, D.T. Introdução à Genética. 8ed Rio de Janeiro: RJ, 2006.

Hecht, S.S., Hoffman, D. The relevance of tobacco-specific nitrosamines to human cancer. Cancer Surv,v. 8, p 273-95, 1990.

Hecht, S.S. Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-niyrosamines. Chen. Res. Toxicol, v. 11, p 559-603, 1998.

Hecht, S.S. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. J. Natl. Cancer Inst, v.91, p 1194-1210, 1999.

Heck, C.I., Mejia, E.G. Yerba mate tea (Ilex paraguariensis): A Comprehensive review on chemistry, helath implicatinons and technological considerations. JFS, v. 72, p 1-14, 2007.

Hoffman, D., Hecht, S.S. Advances in tobacco carcinogenesis. In Handbook of experimental pharmacology, v. 94, p 63-102, 1990.

30

Instituto Nacional do Câncer (INCA). Estimativas da incidência e mortalidade por câncer no Brasil, 2005. Instituto Nacional do Câncer (INCA). Estimativas da incidência e mortalidade por câncer no Brasil, 2008.

Ishikawa, A., Kuriyama, S., Tsubono, Y., fukao, A., Takahashi, H., Tachiya, H., Tsuji, I. Smoking, Alcohol Drinking, Green Tea Consumption and the Risk of Esophageal Câncer in Japanese Men. J. of Epidemiology, v. 16, p 185-192, 2006.

Ireland, A.P., Peters, J.H., Smyrk, T.C, et al. Gastric juice protects against the development of esophageal adenocarcinomas in rats. Ann. Surg, v. 224, p 358-371, 1996.

Jacques, R.A., Krause, L.C., Freitas, L.S., Dariva, C.,Oliveira, J.V., Caramão, E.B. Influence of drying methods and agronomic variables on the chemical composition of mate tea leaves (Ilex paraguariensis A. St.-Hil) obtained from high-pressure CO2 extraction. J Agric Food Chem, v. 55, p 10081-10085, 2007.

Jacques, R.A., Krause, L.C., Freitas, L.S., Dariva, C.,Oliveira, J.V., Caramão, E.B. Influence of agronomic variables on the macronutrient and micronutrient contents and thermal behavior of mate tea leaves (Ilex paraguariensis). J Agric Food Chem, v. 55, p 7510-7516, 2007. Kamangar F., Schantz M.M., Abnet C.C., Fagundes R.B., Dawasey S.M. High levels of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons in mate drinks. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, v. 17, p 1262-8, 2008. Karim, M.R., Wanibuchi, H., Wei, M., Morimura, K., Salim, E.I., Fukushima, S. Enhancing risks of ethanol on MeIQx-induced rat hepatocarcinogenesis is accompanied with increased levels of cellular proliferation and oxidative stress. Cancer Letters, v. 192, p 37-47, 2003.

Kelloff, G.J. Perspectives on cancer chemoprevention research and drug development, Adv. Cancer Res, v. 78, p 199–334, 2000.

Keys,J.D. Chinese Herbs – their botany, chemistry and pharmacodynamics, 3a Ed., Tokio: Charles E. Tuttle Company 1993.

31

Kinjo,Y., Cui,Y., Akiba,S., Watanabe,S., Yamaguchi,N., Soube,T., Mizuno,S. and Beral,V. Mortality risks of oesophageal cancer associated with hot tea, alcohol, tobaco and diet in Japan. J. Epidemiol, v. 8, p 235-243, 1998.

Kollarova, H., Machova, L., Horakova, D., Janoutova, G., Janout, V. Epidemiology of esophageal cancer--an overview article. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, v. 151, p 17-20, 2007.

Kouzu, T., Yoshimura, S., Onuma, E.K., Hishikawa, E., Arima, M. Barrett's esophagus. Cancer & chemotherapy, v. 25, p 1499-1504,1998.

Kushida, M., Wanibuchi, H., Morimura, K., Kinoshita, A., Kang, J.S., Puatanachokchai, R., Wei, M., Fukushima, S. Dose-dependence of promotion of 2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5]quinoxaline-induced rat hepatocarcinogenesis: Evidende for a threshold. Cancer Science, v. 96, p 747-757, 2005.

Lagergren, J., Bergstrom, R., Adami, H.O. Association between medications that relax the lower esophageal sphincter and risk for esophageal adenocarcinoma Ann Intern Med, v. 133, p 165-175, 2000.

Lagergren, J. Adenocarcinomas of oesophagus: What exactly is the size of the problem and who is at risk. GUT, v. 54, p 1-5, 2006.

Lamzetti, M., Bezerra, F.S., Souza, B.R., Lima, A.C.B., Koatz, V.L.G., Porto, L.C., Valenca, S.S. Mate tea reduced acute lung inflammation in mice exposed to cigarette smoke. Nutrition, v. 24, p 375-381, 2008.

Launoy, G., Milan, C., Faivre, G. et al. Tobacco type and risk of squamous cell cancer of the oesophagus im males: a French multicentre caso-control study. Int. J. Epidem., v. 29, p 36-42, 2000.

Lehnert,T., Yioris,N., Ivankovic,S., Junghanns,K. Experimental carcinogenesis of the esophagus by duodenal reflux and chronic administration of MNNG. Eur. Surg. Res, v. 14, p 164, 1982. Lehrbach, D.M., Nita, M.E., Cecconello, I. Molecular aspects of esophageal squamous cell carcinoma carcinogenesis. Gastroenterol, v. 40, p 256-261, 2003.

32

Leitão,A.C., Braga,R.S. Mutagenic and genotoxic effects of mate (Ilex praguariensis) in prokaryotic organisms. Braz J Med Biol Res, v. 27, p 1517-1525, 1994.

Li,J.Y., Taylor,P.R., Li,B., Dawsey,S., Wang,G.Q., Ershow,A.G., Guo,W., Liu,S.F., Yang,C.S., Shen,Q., Wang,W., Mark,S.D., Zou,X.N., Greenwald,P., Wu,Y.p., Blot,W.J. Nutrition intervention trials in Linxian, China: multiple vitamin/mineral supplementation, cancer incidence and disease-specifc mortality among adults with esophageal dysplasia. J Nalt Cancer Inst, v. 85, p 1492-1498, 1993.

Li ZG, Shimada Y, Sato F, Maeda M, Itami A, Kaganoi J, Komoto I, Kawabe A, Imamura M. Promotion effects of hot water on N-nitrosomethylbenzylamine-induced esophageal tumorigenesis in F344 rats. Oncol Rep, v. 10, p 421-426, 2003. Lijinsky, W., Kovatch, R.M., Saavedra, J.E. Carcinogenesis and mutagenesis by N-nitroso compounds having a basic center. Cancer Lett, v. 15, p 101-107, 1992.

Loeb, L.A., Loeb, K.R., Anderson, J.P. Multiple mutations and cancer. Review. PMID, v. 100, p 776-781, 2003.

Lu,S.H., Chui,S.X., Yang,W.X., Hu,X.N., Guo,L.P. and Li,F.M. Relevance of N-nitrosamines to esophageal cancer in china. In O´Neill,I.K., Chein,J. and Bartsch,H. (eds) Relevance to Human Cancer of N-nitroso Compounds, Tobaco Smoke and Mycotoxin, IARC Scientific Publications, v. 105, p11-17, 1991.

Magee, P.N. The experimental basis for the role of nitrosos compounds in human cancer. Cancer Surv, v. 8, p 207-39, 1989.

Marrero, J.A. Hepatocelular carcinoma. Current Opinion in Gastroenterology, v. 21, p 308-

312, 2005.

McKillop, I.H., Schrum, L.W. Alcohol and liver cancer. Alcohol, v. 35, p 195-203, 2005.

Melo, L.L., Kruel, C.D.P., Kliemann, L.M., Cavazzola, L.T., Boeno, R.L., Silber, P.C., Grossi, R.S. Influence of surgically induced gastric and gatroduodenal content reflux on esophageal carcinogenesis – experimental model in Wistar female rats. Diseases of the esophagus, v. 12, p 106-115, 1999.

33

Meijia, G.E., Song, Y.S., Ramirez, M.V., Kobayashi, H. Effect of yerba mate (Ilex paraguariensis) tea on topoisomerase inhibition and oral carcinoma cell proliferation. J Agric Food Chem, v. 53, p 1966-1973, 2005.

Miranda, D.D.C., Arçari, D.P., Pedrazolli, J., Carvalho, P.O., Cerutti, S.M., Bastos, D.H.M., Ribeiro, M.L. Protective effects of mate tea (Ilex paraguariensis) on H2O2-induced DNA damage and DNA repair in mice. Mutagenesis, v. 10, p 1-5, 2008.

Miwa, K., Miyashita, T., Hattori, T. Reflux of duodenal or gastroduodenal contents induces esophageal carcinoma in rats. Nippon Rinsho, v. 62, p 1433-1438, 2004.

Murray, L. Watson, P. Johnston, B., Sloan, J., Mainie, I.M.L., Gavin, A. Risk of adenocarcinoma in Barrett’s oesophagus: Population based study. BMJ, v. 327, p 534-535, 2006.

Newton, M., Kamm, M.A., Soediono, P.O., Milner, P., Burnham, W.R., Burnstock, G. Oesophageal epithelial innervation in health and reflux oesophagitis. Gut, v. 44, p 317-322, 1999.

Oliveira, M.C., Soares, R.C., Pinto, L.P., Costa, A.L.L. HPV e carcinogênese oral: revisão bibliográfica. Rev Bras Otorrinolaringol, v. 69, p 301-3017, 2003.

Olliver, J.R., Hardie, L.J., Gong, Y.Y., Dexter, S., Chalmers, D., Harris, K.M., Wild, C.P. Risk factors, DNA damage, and disease progression in Barret’s esophagus. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, v. 14, p 620-625, 2005.

Parkin,D.M. Global cancer statistics in the year 2000, v. 2, p 533-543, 2001.

Pêra,M., Cameron,A.J., Trastek,V. F., et al. Increasing incidence of adenocarcinoma of the esophagus and esophagogastric junction. Gastroenterology, v. 104, p 510-513, 1993. Perez,C., Anesini, Screening of plants used in Argentine folk medicine for antimicrobial activity, J Ethnopharmacol, v. 39, p 119-128, 1993.

Petersen, D.R. Alcohol, iron-associated oxidative stress, and cancer. Alcohol, v. 35 , p 243-249, 2005.

34

Peto,R., Gray,R., Brantom,P., Grasso,P. Dose and time relationships for tumor induction in the liver and esophagus of 4080 inbred rats by chronic ingestion of N-nitrosodiethylamine or N-nitrosodimethylamine. Cancer Res, v. 51, p 6452-6469, 1991.

Piazuelo, E., Cebriã, J.N.C., Escartãn, A., Jimenez, P., Soteras, F., Ortego, J., Lanas, A. Superoxide dismutase prevents development of adenocarcinoma in a rat model of Barrett's esophagus. World J Gastroenterol, v. 11, p 7436-7443, 2005.

Pinto, L.F.R. Diferrences between isoamyl alcohol and ethanol on the metabolism and DNA ethylation of N- nitrosodiethylamine in the rat. Toxicology, v. 151, p 73-79, 2000.

Pinto, L.F.R., Rossini, A.M.T., Albano, R.M., Felzenszwalb, I., Gallo, C.V.M., Nunes, R.A., Andreollo, N.A. Rat oesophagus cytrochrome P450 (CYP) monooxygenase system: comparison to the liver and relevance in N- nitrosodiethylamine carcinogenesis. Carcinogenesis, v. 22, p 1877-1883, 2001.

Pinto, L.F.R., Rossini, A.M.T., Albano, R.M., Felzenszwalb, I., Gallo, C.V.M., Nunes, R.A., Andreollo, N.A. Mechanisms of esophageal câncer desenvolviment in Brazilians. Mutation Researsh, v. 544, p 365-373, 2003.

Pitot, H.C., Dragan, Y.P., Teeguarden, J., Hsia, S., Campbell, H. Quantitation of multistage carcinogenesis in rat liver. Toxicol Pathol, v. 24, p 119-128, 1996.

Pitot, H.C. Pathways of progression in hepatocarcinogenesis. The Lancet, v. 358, p 859-860, 2001.

Pöschl, G., Seitz, H.K. Alcohol and cancer. Alcohol and Alcoholism, v. 39, p 155-165, 2004.

Prolla,J.C., Dietz,J., da Costa,L.A. Geographical diffrences in esophageal neoplasm mortality in Rio Grande do Sul. Rev Assoc Med Bras, v. 39, p 217-220, 1993.

Putz,A., Hartmann,A.A., Fontes,P.R.O., Alexandre,C.O.P., Silveira,D.A., Klug,S.J & Rabes,H.M. TP53 Mutation Pattern of Esophageal Squamous Cell Carcinomas in a High Risk Area (Southern Brazil): Role of Life Style Factors. Int. J. Cancer, v. 98, p 99-105, 2002.

Ramirez-Mares,M.V., Chandra,S., De Mejia,E.G. In vitro chemopreventive activity of Camellia sinensis, Ilex paraguariensis and Ardisia compressa tea extracts and selected polyphenols. Mutat Res, v. 554, p 53-65, 2004.

35

Ransford, R.A., Jankowski, J.A. Genetic versus environmental interactions in the oesophagitis-metaplasia-dysplasia-adenocarcinoma sequence (MCS) of Barrett's oesophagus. Acta Gastroenterol Belg, v. 63, p 18-21, 2000. Robbins, S.L., Cotran, R.S. Bases patológicas das doenças. 7ed Rio de Janeiro: RJ, 2005. Rodrigues, M.A.M. Esófago de Barret e displasia: critérios diagnósticos. J. Bras. Patol. Méd. Lab, v. 40, p 185-91, 2004. Rolón,P.A., Castelisague,X., Benz,M., Muñoz,N. Hot and cold mate drinking and esophageal cancer in Paraguay. Cancer Epidemiol Biomarkers Prey, v. 4, p 595-605,1995.

Safe, S. Endocrine disruptors and human health: is there a problem. Toxicology, v. 205, p 3-10, 2004.

Salet,A., Zilberstein,B., Andreollo,N.A., Eshkenazy,R., Pajecki,D. Experimental esophageal carcinogenesis 2002. Savary, M., Miller, G. The esophagus. Handbook and atlas of endoscopy. Solothunr, Gassman, 1978. Schinella,G.R., Troiani,G., Davila,V., De Buschiazzo,P.M., Tournier,H.A. Antioxidant effects of an aqueous extract of Ilex paraguariensis. Biochem Biophys Res Commun, v. 269, p 357-60, 2000.

Schinella,G., Fantinelli,J.C., Mosca,S.M. Cardioprotective effects of Ilex paraguariensis extract: evidence for a nitric oxide-dependent mechanism. Clin Nutr, v. 24, p 360-366, 2005.

Schulte-Hermann, R., Bursch, W., Kraupp-Grasl, B., Oberhammer, F., Wagner, A., Jirtle, R. Cell proliferation and apoptosis in normal liver and preneoplastic foci. Environ Health Perspect, v. 101, p 87-90, 1993.

Seto,Y., Kobori,O., Shimizu,E., et al. The role of alkaline reflux in esophageal carcinogenesis induced by N-amyl-N-methylnitrosamine in rats. Int J Câncer, v. 49, p 758-763,1991.

Siglin, J.C., Khare, L., Stoner, G.D. Evaluation of dose and treatment duration on the esophageal tumorigenicity of N-nitrosomethylbenzylamine in rats. Carcinogenesis, v. 16, p 259-265, 1995.

36

Sobotta, J. Atlas de anatomia humana. 22ed Rio de Janeiro: RJ, 2006.

Soren, S., Stephan, H., Alexander, S. et al. Animal models in gastrointestinal alcohol research-a shor tappraisal of the different models and their results. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol, v.1 7, p 519–42, 2003.

Souza,M.P., Matos,M.E.O., Matos,F.J.A., Machado,M.I.L., Craveiro,A.A. Constituintes Químicos Ativos de Plantas Medicinais Brasileiras, Editora da UFC: Fortaleza, 1991.

Steele, V.E. Current mechanistic aprroaches to the chemoprevention of cancer. J Biochemistry and Molecular Biology, v. 36, p 78-81, 2003.

Stickel, F., Schuppan, D., Hahn, E.G., Seitz, H.K. Cocarcinogenic effects of alcohol in hepatocarcinogenesis. Gut, v. 51, p 132-139, 2002. Stoner, G.D., Gupta, A. Etiology and chemoprevention of esophageal squamous cell carcinoma. Carcinogenesis, v. 22, p 1737-1746, 2001. Stoner, G.D., Wang, L.S., Chen, T. Chemoprevention of esophageal squamous cell carcinoma. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 224, p 337-349, 2007. Straif,K., Weiland,S.K., Bungers,M., et al. Exposure to high concentrations of nitrosamines and cancer mortality among a cohort of rubber workers. Occup Environ Med, v. 57, p 180-187, 2000. Sultana, R., Raju, B.S., Sharma, V. Formation of acetaldehyde adducts of glutathione S-transcenase A3 in the liver of rats administered alcohol chronically. Alcohol, v. 35, p 57-66, 2005. Taketo, M.N. Cyclooxygenase-2 inhibitors in tumorigenesis (parte I). J Nalt Cancer Inst, v. 90, p 1529-1536, 1998. Tampi,C., Pais,S., Doctor,V.M., Plumber,S., Jagannath,p. HPV-associated carcinoma of esophagus in the young: a case report and review of literature. Int J Gastrointest Cancer, v. 35, p 135-142, 2005.

37

Tomatis,L., Aitio,A., Day,N.E., et al. Cancer: cause, occurrence and control. IARC Sci. Publ no 100. Lyon: IARC, 1990. Tomatis,L. Cell proliferation and carcinogenesis: a brief history and current view based on an IARC workshop report. International Agency for Research on Câncer. Environ Health Perspect, v. 101, p 149-151, 1993. Tsutsumi, M., Matsuda, Y., Takada, A. Role of ethanol-inducible cytochrome P-450 2E1 in the development of hepatocellular carcinoma by the chemical carcinogen, N-nitrosodimethylamine. Hepatology, v. 18, p 1483-1489, 1993. Vaughan, T.L., Davis, S., Kristal, A. Obesity, alcohol, and tobacco as risk factors for cancers of the esophagus and gastric cardia: adenocarcinoma versus squamous cell carcinoma. Cancer Epidemiol. Biom. Prev, v. 4, p 85–92, 1995. Victora,C.G., Muñoz,N., Day,N.E., Barcelos,L.B., Peccin,D.A., Braga,N.M., Hot beverages and oesophageal câncer in southern Brasil: a case-control study. Int. J. Cancer, v. 39, p 710-716, 1987. Victora,C.G., Muñoz,N., Horta,B.l., Ramos,E.O., Patterns of mate drinking in a Brazilian city. Cancer Res, v. 50, p 7112-7115, 1990. Wang, Z., Tang, L., Sun, G., Tang, Y., Xie, Y., Wang, S., Hu, X., Gao, W., Cox, S.B., Wang, S. Etiological study of esophageal squamous cell carcinoma in an endemic region: a population-based case control study in Huaian, China. BMC Cancer, v. 6, p 1-9, 2006. Wang, J.M., Xu, B., Rao, J.Y., Shen, H.B., Xue, H.C., Jiang, Q.W. Diet habits, alcohol drinking, tobacco smoking, green tea drinking, and the risk of esophageal squamous cell carcinoma in the Chinese population. Eu J Gastroenterol Hepatol, v. 19, p 171-176, 2007. Wargovich,M.J., Imada,O. Esophageal carcinogenesis in the rat: a model for aerodigestive tract cancer. J Cell Biochen, v. 17, p 91-94,1993. Wattenberg, L.W. Chemoprevention of Cancer. Prev. Med, v. 25, p 44-45, 1996.

World Cancer Research Fund. Food, nutrition and prevention of cancer: A global perspective. Washington. Am. Inst. Cancer Res, p 35-71, 508-40, 1997.

38

World Health Organization. The World Health Report 1998: Life in the 21st century a vision for all. Geneva. W.H.O, p 61-111, 1998. Winge,H., Ferreira,A.G., Mariath,J.E.A., Tarasconi,L.C. Erva mate: biologia e cultura no cone sul. Porto Alegre, Ed. Da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1995. Wilson, K.T., Fu, S., Ramanujam, K.S. Increased expression of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in Barrett’s esophagus and associated adenocarcinomas. Cancer Res, v. 58, p 2929-2934, 1998. Wogan G.N., Hecht S.S., Felton J.S., Conney A.H., Loeb L.A. Environmental and chemical carcinogenesis. Semin Cancer Biol, v. 14, p 473-486, 2004. Wu, A.H., Wan, P., Bernstein, L.A. Multithnic population-based study of smoking, alcohol and body size and risk of adenocarcinomas of the stomach and esophagus (United States). Cancer Causes Control, v. 12, p 721-732, 2001. Yang,W.X., Pu,J., Lu,S.H., Li,F.M., and Guo,L.P. Studies on the exposure level of nitrosamines in the gastric juice and its inhibition in high risk areas of esophageal cancer. Chin. J. Oncol, v. 14, p 407-410, 1992. Ye, W., Heald, M., Lagergren, J. Helicobacter Pylori infection and gastric atrophy: risk of adenocarcinomas and squamous-cell carcinoma of the esophagus and gastric cardia adenocarcinomas. J Natl Cancer Inst, v. 96, p 388-396, 2004. Yoris,N., Ivankovic,S., Lehnert,T. Effest of Thermal Injury and Oral Administration of N-Methyl-N’-Nitro-N-Nitrosoguanidine on the Development of Esophageal Tumors in Wistar Rats. Oncology, v. 41, p 36-38, 1984. Yu, M., Yuan, J.M. Environmental factors and risk for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, v. 127, p 572-578, 2004.

Zimmerman, K.C., Sarbia, M., Weber, A.A. Cyclooxygenase-2 expression in human esophageal carcinoma. Cancer Res, v. 59, p 198-204, 1999. Zuin V.G., Montero L., Bauer C., Popp P.. Stir bar sorptive extraction and high-performance liquid chromatography-fluorescence detection for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in Mate teas. J Chromatogr A, v.1091, p 2-10, 2005.

39

6. Artigo científico

Mate tea attenuates DNA damage and carcinogenesis induced by

diethylnitrosamine and thermal injury in the rat esophagus

Trabalho a ser publicado na revista Environment and Molecular Mutagenesis

* Observação: O artigo segue as normas de formatação estabelecidas pela revista em que será

publicado.

40

Mate tea attenuates DNA damage and carcinogenesis induced by

diethylnitrosamine and thermal injury in the rat esophagus

Juliana Ferreira da Silva1, Lucas Tadeu Bidinotto2, Kelly Silva Furtado2, Daisy Maria Fávero

Salvadori2, Maria Aparecida Marchesan Rodrigues2, Luis Fernando Barbisan1,2*

1UNESP São Paulo State University, Institute of Biosciences, Department of Morphology,

18618-000 Botucatu, SP, Brazil.

2UNESP São Paulo State University, School of Medicine, Department of Pathology, 18618-000

Botucatu, SP, Brazil.

Running title: mate tea and DNA damage and esophageal carcinogenesis

*Address correspondence to:

Luis Fernando Barbisan, Ph.D.

Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP),

18618-000 Botucatu, SP, Brazil.

Telephone/Fax-simile: 55-14-38116264/ e-mail: barbisan@ibb.unesp.br

41

Abstract

Drinking hot mate has been associated with risk for esophageal squamous cell carcinoma

in South America. Thus, the modifying effects of mate tea intake on DNA damage and

esophageal carcinogenesis induced by diethylnitrosamine (DEN) plus thermal injury were

evaluated in male Wistar rats. In the initiation phase, rats were treated with DEN injections (8

x 80 mg/Kg b.w.) plus esophageal thermal injury and concomitantly received mate tea (2.0%

w/v, test group) or green tea (2.0% w/v, positive control group) as the sole source of drinking

fluid for 8 weeks. Any additional treatment was introduced at post-initiation until week 20.

Peripheral blood was collected 4 hr after the last DEN application for comet assay at week 8

and samples from esophagus and liver were collected at weeks 8 and 20. At week 8, mate or

green tea intake itself were non-genotoxic and significantly decreased DNA damage levels in

peripheral blood leucocytes from DEN-treated animals. Also, a significant reduction of cell

proliferation rates in both esophageal epithelium and liver parenchyma and on the number of

putative preneoplastic liver lesions were observed in mate or green tea-treated animals at week

8. A significant lower incidence of esophageal and liver neoplasms and tumor multiplicity was

observed in the groups previously treated with mate or green tea when compared to the DEN

initiated/thermal injury group at week 20. These data indicate that mate tea presented

protective effects against DNA damage and esophageal and liver carcinogenesis induced by

DEN.

Key words: Mate tea, Green tea, DNA damage, diethylnitrosamine-induced esophageal and

liver lesions

42

Introduction

Esophageal cancer is the eight most common human cancer worldwide and ranks sixth

as a cause of cancer mortality (Parkin et al., 2001). Squamous cell carcinoma (SCC) is the

predominant histological type with a variable geographic distribution and occurs at very high

incidence in certain parts of China, Central Asia, Iran, South Africa, South America, France

and Italy (Stoner and Gupta, 2001; Parkin et al., 2001). In Brazil, the highest incidence of

esophageal SCC occurs in the most Southern region, Rio Grande do Sul, with age-adjusted

mortality rates reported as 20.4/100,000/year for men and 6.5/100,000/year for women

(Fagundes et al., 2006). The marked variations in geographical distribution of esophageal SCC

indicate that environmental factors are involved in its pathogenesis (Stoner and Gupta, 2001).

Thus, there is a need to develop effective strategies for the prevention of this malignancy and

the detection of potential risk factors and chemoprevention are potentially viable approaches.

Tobacco and alcohol are the main agents involved in the etiology of esophageal SCC

in Europe and North America, where over 90% of cases can be attributed to these causes

(Parkin et al., 2001). Besides, drinking a local hot beverage has been shown to increase the

risk for development of this malignancy in Uruguay, Paraguay, northeastern Argentina and

southern Brazil (Victora et al., 1990; Pintos et al., 1994; Castelletto et al., 1994; Rolón et al.,

1995;; Castellasagué et al., 2000; De Barros et al., 2000; Sewran et al., 2003; De Stefani et al.,

2003; Goldenberg et al., 2003). Populations from these high risk areas share the habit of

drinking a local tea known by the folk name of “mate”, “yerba mate” or “erva-mate”, an

infusion of dried leaves of the perennial tree Ilex paraguariensis St. Hil., a native species of

South America (Heck and Mejia, 2007). In Brazil, the leaves and stems of mate are used to

prepare different beverages, such as chimarrão (green dried leaves brewed with hot water in a

vessel called ‘cuia’ through a metal straw), tererê (green dried leaves brewed with cold water

in the same kind of vessel and straw) and the mate tea (roasted leaves brewed with hot water

and drank as any other herbal tea) (De Barros et al., 2000; Alves et al., 2008; Miranda et al

2008,). In southeastern South America where the “gaucho” culture is widespread, large

amounts of mate are drunk at high temperatures (65 to 71 0C), placing the oropharynx and

esophagus with very hot fluids (de Barros et al., 2000). This might partially explain the high-

incidence rates of SCC cancer in this region (Castellsagué et al., 2000; Pütz et al., 2002).

The potential mutagenic/genotoxic of mate aqueous extracts is still controversial. Mate

solutions showed mutagenic activity in different Salmonella typhimurium strains, at

43

concentrations of 20 to 50 mg/plate, and genotoxic activity in the inductest (WP2s (lambda)

strain), with a maximal phage induction at concentrations of 10 to 20 mg/plate (Leitão and

Braga, 1994). Additionally, mate aqueous extracts (range doses 100–750 μg/ml) increased the

frequency of chromosomal aberrations in cultured human peripheral lymphocytes, but was not

clastogenic to bone marrow cells of male Wistar rats (at oral doses up to 2 g/kg) (Fonseca et

al., 2000). Recently, Alves et al. (2008) demonstrated that mate tea was not a clastogenic

or/and aneugenic agent (range doses of 175–1400 μg/ml) for culture of human peripheral

lymphocytes using a cytokinesis-block micronucleus assay in the absence of exogenous

metabolic activation. Also, mate tea intake (0.5, 1.0 or 2.0 g/kg, for 60 days) was non

genotoxic to the liver, kidney and bladder cells from male Swiss mice. Besides, the regular

ingestion of mate tea increased the DNA resistance to H2O2-induced DNA strand breaks and

improved DNA repair after H2O2 challenge in liver cells from male Swiss mice (Miranda et

al., 2008).

Various studies have detected contamination with polycyclic aromatic hydrocarbons

(PAH) in different samples of commercial mate leaves and hot and cold mate infusions (Zuin

et al., 2005; Kamangar et al., 2008). Also, an increase in urine 1-hydroxypyrene glucuronide

(1-OHPG) levels was detected in healthy subjects with mate drinking habits from Rio Grande

do Sul (Fagundes et al., 2006). Besides the association with upper aerial-digestive cancer,

mate drinking has been associated with cancer development in other organs like the bladder,

which is not influenced by thermal injury (Bates et al., 2007; De Stefani et al., 2007).

Therefore, it is unclear whether the increased risk of esophageal SCC previously attributed to

hot mate consumption is related to thermal injury at which mate is often drunk, or due to

carcinogenic contaminantion, or both (Castellsagué et al., 2000; Pütz et al., 2002; Zuin et al.,

2005; Kamangar et al., 2008).

The purpose of this study was evaluate the modifying influence of mate tea intake on

DNA-damage, assessed by the Comet assay on peripheral blood leukocytes, and the

development of esophageal preneoplastic and neoplastic lesions in male Wistar rats treated

with the carcinogen diethylnitrosamine (DEN) plus esophageal thermal injury by instillation

with hot water 650C. Additionally, positive control groups treated with green tea were

included in this study due to be one of the most common beverages worldwide with

remarkable chemopreventive properties (Yang et al., 2002; Chung et al., 2003).

44

Materials and Methods

Animals and treatments

The animals were handled in accordance with the Ethical Principles for Animal

Research adopted by the Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA). Four-week-

old male Wistar rats were obtained from CEMIB (UNICAMP Campinas, SP, Brazil). The

animals were housed in polypropylene cages (four animals/cage) covered with metallic grids

under standard conditions (22 ± 2 0C, 55 ± 10% humidity under a 12-hr light-dark cycle).

They were fed commercial NUVILAB-CR-1 chow (NUVITAL, Curitiba, PR, Brazil) and

water ad libitum for a 2-week acclimation period before beginning the experiment. Samples of

leaves of Ilex paraguariensis St. Hil (mate) and Camelia sinensis (green tea) were generously

supplied by the CentroFlora Group (Botucatu-SP, Brazil).

The animals were randomly allocated into seven groups, consisting of 20 rats in

Groups G1 to G3 and 05 rats in Groups G4 to G7 (Figure 1). Groups 1 to 3 were treated once

a week with intraperitoneal (i.p.) injections of diethylnitrosamine (DEN, Sigma-Aldrich Co.,

St. Louis Mo, USA) (8 x 80 mg/kg of body weight) and received hot water 650C (1ml/rat,

instilled into the esophagus) twice a week for 8 consecutive weeks. This esophageal DEN

initiation and thermal injury protocol was adopted with minor modifications from previously

described protocols (Balansky et al., 1994; Li et al., 2003). Group 4 was treated with DEN and

received water 25 0C (1ml/rat, instilled into the esophagus) twice a week for 8 consecutive

weeks. Groups 5, 6 and 7 received i.p. injections of NaCl 0.9% (DEN vehicle) once a week

and water 250C (1ml/rat) twice a week for 8 consecutive weeks. Concomitantly, the groups

received drinking water (groups G1, G4 and G7) or mate tea (2.0% w/v, groups G2 and G5) or

green tea (2.0% w/v, groups G3 and G6) as the sole source of drinking fluid for 8 weeks. After

the initiation period, animals from groups G1 to G3 received drinking water and food ad

libitum until at week 20. The groups were sacrificed at weeks 8 and 20 by a CO2 atmosphere.

Body weight and food/liquid consumption were measured twice a week during the entire

experimental period. Tea solutions (2.0% w/v) were prepared by adding 20 g of minced leaves

of Ilex paraguariensis or Camelia Sinensis to 1000 ml hot water (70 0C) for 20 min, filtering

and allowed to cool down at room temperature. Tea solutions were prepared daily and offered

ad libitum in dark bottles.

45

Comet assay

Samples of peripheral blood from the periorbital vein plexus were collected from all

groups at 4 hr after the last DEN treatment at week 8 to perform the Comet assay. The single-

cell gel electrophoresis assay or Comet assay was performed under alkaline conditions

according to a previously described protocol (Tice et al., 2000). Briefly, 5 µl of each blood

sample were mixed with 120 µl of 0.5% low-melting-point agarose (Invitrogen, Carlsbad,

CA) at 37ºC and layered onto conventional microscope slides, precoated with 1.5% normal-

melting-point agarose (Invitrogen). The slides were placed overnight in cold freshly-prepared

lysing solution (1% Triton X-100, 2.5 mM NaCl, 0.1 mM Na2EDTA, 10 mM Tris with 10%

dimethylsufoxide, pH 10.0) and then into a horizontal electrophoresis apparatus containing

alkaline electrophoresis buffer (0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, pH>13) at 4ºC for 20 min.

Using the same buffer, electrophoresis then was performed at 25 V and 300 mA for 20 min.

After electrophoresis, the slides were washed twice for 5 min in neutralizing buffer (0.4 M

Tris-HCl, pH 7.5), fixed for 5 min in absolute alcohol, air-dried, and stored at room

temperature.

Immediately before analysis, the DNA was stained with 50 µl of 20 µg/ml ethidium

bromide. The slides were examined with a 40X objective using an epi-illumined fluorescence

microscope (Olympus-Bx60) attached to a color CCD video camera, and connected to an

image analysis system (Comet II; Perspective Instruments, Suffolk, UK) (Figure 2 A). Coded

slides were scored blindly and 50 blood cells were randomly analyzed for each animal (25

cells per slide from two slides per animal)

Tail intensity (the quantity of DNA in the tail of the comet) and tail moment (product

of DNA density in the tail and the mean distance of DNA migration in the tail) were used to

measure the extent of DNA damage. The comet images with a “cloudy” appearance or a very

small head and a tail like a balloon (necrotic/apoptotic cells) were excluded from the

evaluation under the assumption that they represent dead cells (Hartmann and Speit, 1997).

Tissue processing, histology and immunohistochemical procedures.

At necropsy, the esophagus was excised, opened longitudinally and fixed flat in 4%

phosphate-buffered formalin during 24 hours for paraffin embedding. Serial sections of

esophagus (at least 4-6 strips per animal) were routinely processed. The paraffin blocks were

cut into 5-μm-thick sections and stained with hematoxylin-eosin (HE) for histophatological

analysis or for immunohistochemical analysis of epithelial cell proliferation using

proliferating cell nuclear antigen (PCNA) (Figure 2 B) (Siglin et al., 1995).

46

The liver was excised, weighted, and representative samples were fixed in 4%

phosphate-buffered formalin during 24 hours for paraffin embedding. The paraffin blocks

were cut into 5-μm-thick sections and stained with HE for histophatological analysis or for

immunohistochemical analysis of preneoplastic hepatocellular lesions positive for glutathione

S-transferase P form (GST-P) and PCNA (Figure 2 C and D) (Ito et al., 1988; Eldridge et al.,

1993).

At week 20, macroscopically visible lesions on the esophageal mucosa and in the liver

were mapped and registered. The classification scheme for esophageal and liver preneoplastic

and neoplastic lesions was based on criteria previously described (Goodman et al., 1994;

Whiteley et al., 1996). Preneoplastic esophageal and liver lesions and tumor yield within each

experimental group were expressed in terms of both incidence and multiplicity.

GST-P and PCNA expression were detected by the avidin-biotin peroxidase complex

(ABC) method. Briefly, deparaffinated 5-μm tissue sections on poly-L-lysine-coated slides

were treated sequentially with 3% H2O2 in phosphate-buffered saline (PBS) for 10 min, nonfat

milk for 60 min, anti-GSTP antibody (clone 311, 1:1000 dilution; MBL laboratory, Tokyo,

Japan) or anti-PCNA antibody (clone PC10, 1:200 dilution; Dako, Glostrup, Denmark)

overnight, biotinylated horse anti-rabbit or anti-mouse IgG (1:300 dilution) for 60 min, and

avidin-biotin-peroxidase solution (1:50 dilution) for 45 min (Elite ABC kit; Vector Laboratory,

Burlingame, CA). Chromogen color development was accomplished with 3,3´-diaminobenzidine

tetrahydrochroride (Sigma). The slides were counterstained with Harris haematoxylin.

GST-P positive lesions and PCNA labeling analysis.

Morphometric analyses of putative preneoplastic hepatocellular lesions (PNL) positive for

GST-P were measured using a Nikon photomicroscope (Microphot-FXA, Tokyo, Japan)

connected to a KS-300 apparatus (Kontron Electronic, Munich, Germany). Liver area was

measured in a special Macro-Stand device (supported by Canon TV zoom lens V6x16/16-100

mm plus a Canon 58 mm close-up 240 lens connected to a CCD black-and-white video

camera module with a Sony DC-777 camera unit) connected to the KS-300. GST-P-positive

PNL were also classified according to two different classes: AFH and hepatic nodules ≤ 3 or >

3 mm in diameter. Data were expressed as number of GST-P-positive PNL per liver area

(lesions/cm2).

47

The PCNA-labeling indices, expressed as a percentage, were calculated by dividing the

number of squamous epithelial cells or hepatocytes with PCNA-labeled nuclei (S phase) by

the total number of cells counted in the each tissue sample (1000 to 2000 cells for esophagus

and 5,000 to 10,000 cells for liver).

Statistical analysis.

Statistical analysis was performed using the Jandel Sigma Stat Software (Jandel

Corporation, San Rafael, CA, USA). The body weight, body weight-gain food and liquids

intake, relative liver weight, PCNA-labeling indices, GST-P-positive data and tumor

multiplicity were analyzed by ANOVA test or the Kruskal-Wallis test. The incidence of

different types of preneoplastic or neoplastic lesions was examined using χ2 test or the

Fischer exact test. Significance was set at P< 0.05.

Results

General findings

Seven animals were found dead during the course of the experiment: three rats from

the DEN/TI-treated group (G1), two rats from the DEN/IT/mate tea-treated group (G2) and

one rat from the DEN/TI/green tea-treated group (G3). A complete necropsy was not

performed due to advanced postmortem changes and/or cannibalism.

Table I shows the mean values of the final body weight, body-weight gain, and, mate

tea, green tea, water and food consumption during the first 8 week. Values of the final body

weight, body-weight-gain and liquid intake were higher for the DEN/TI plus mate or green

tea-treated groups (G2 and G3) than to the DEN/TI and DEN-treated groups (G1 and G4)

(Table I). No differences in relative liver weight were observed among the DEN-treated

groups but the values for alanine aminotransferase (ALT) were lower in mate (G2) and green

tea-treated groups (G3) (P= 0.062 and P < 0.05, respectively). At week 8, the final body

weight, body-weight-gain, ALT levels were significantly different in DEN-treated groups (G1

to G4) when compared to the non-DEN-treated groups (G5 to G7) (P < 0.001).

During the post-initiation phase, food and water consumption did not differ between

the groups (G1 to G3). No differences in final body weight and body-weight gain values were

observed at week 20 (data not shown). Moreover, an increase in relative liver weight values

was detected in DEN/TI-treated group (G1, 5.3 ± 0.7) when compared to the DEN/TI plus

mate or green tea-treated groups (G2 and G3, 4.2 ± 0.5 and 4.1 ± 0.6) (P < 0.001).

48

Genotoxicity data and esophagus and liver analysis at week 8

Figure 3A shows the values obtained in the Comet assay analyses (tail moment and tail

Intensity parameters) on peripheral blood leukocytes evaluated 4 hours after the last DEN

injection. The levels of DNA damage were significantly higher in the DEN-treated groups (G1

to G4) when compared to the non-initiated groups (G5 to G7) (P < 0.001). Mate or green tea

intake itself was non genotoxic (G5 and G6 vs. G7). Significantly decreased levels of DNA

damage were detected in the peripheral blood leucocytes, when these teas were administered

simultaneously with DEN treatment (G2 and G3 vs. G1 and G4, P < 0.001).

Thermal injury regimen induced mild hyperkeratosis and hyperplasia in the squamous

epithelial of esophagus from DEN-treated animals (G1 vs. G4). A significant reduction of

incidence of animals with hyperkeratosis/hyperplasia (40 and 50%) and in cell proliferation

rates in esophageal epithelium were observed in mate or green tea-treated animals (G2 and G3

vs. G1) at the end of DEN treatment and thermal injury regimens (Figure 3B).

GST-P positive hepatocellular lesions were observed only in DEN-initiated groups (G1

to G4). The number of preneoplastic lesions (PNL > 3 mm) was significantly lower in mate or

green tea-treated groups (G2 and G3) when compared to the DEN/TI group (G1).

Mate or green tea treatments per si did not cause any histological changes in the

esophageal epithelium or in the liver parenchyma in the non-initiated groups (G5 and G6 vs.

G7).

Esophagus and liver histopathological analysis at week 20

Table II summarizes the incidence data of histologically-diagnosed esophagus and

liver preneoplastic and neoplastic lesions and tumor multiplicity. Specially, there was a

reduction on the incidence of esophageal dysplastic lesions in DEN/TI plus green tea group

(G3) (Figure 4A) and esophageal papilloma (Figure 4B) and hepatic adenoma in DEN/TI plus

mate or green tea-treated groups (G2 and G3) when compared to the DEN/TI-treated group

(G1) (P = 0.054; P < 0.04 and P < 0.09, respectively). The morphology of the hepatocellular

carcinomas (Figure 4C) was more undifferentiated in DEN/TI group (G1) that in the groups

receiving mate or or green tea (G2 and G3). Cholangiocellular neoplasms (Figure 4D) were

detected only in DEN/TI group. Also, tumor multiplicity for both esophagus and liver

neoplasms was lower among the groups receiving mate or green tea (G2 and G3) when

compared to the DEN/TI-treated group (G1) (P < 0.05).

49

Discussion

The results described herein indicate that mate tea intake reduced the levels of DNA

damage in peripheral blood leukocytes and esophageal carcinogenesis induced by

DEN/thermal injury protocol in male Wistar rats. Besides, liver carcinogenesis was also

inhibited in the DEN-initiated group receiving concomitantly mate tea. The protective effects

of mate tea on chemically-induced DNA damage and carcinogenesis were similar to the

observed in the positive control group treated with green tea. In fact, green tea or their specific

catechins have been proved to inhibit DNA damage and carcinogenesis in rodents and human

(Yang et al., 2002; Chung et al., 2003).

Experimental and epidemiological studies have supported the role of thermal injury on

the promotion of esophageal carcinogenesis (Yioris et al., 1983; Kinjo et al., 1998;

Castellsagué et al., 2000; Li et al., 2003; Sewram et al., 2003). The consumption of hot

beverages can provoke changes in esophageal epithelium that could increase the risk of

damage from contact with refluxed gastric/duodenal contents or others potential carcinogens

(Tobey et al., 1999; Yang et al., 2002; Pütz et al., 2002; Li et al., 2003). Besides, chronic

exposure to high luminal temperature can result in an inflammatory process that may led to

the formation of nitrosamines and free radicals able to initiate and/or promote the esophageal

carcinogenesis process (Pütz et al., 2002). The thermal injury protocol used in this study

resulted in an increase in the rates of cell proliferation, a well established parameter for cancer

risk development on esophageal epithelium from DEN-treated animals (group G1 vs. group

G4). Moreover, Li et al. (2003) showed that thermal injury abolished the inhibitory effects of

epillocatechin-3 gallate from green tea against esophageal carcinogenesis process induced by

N-nitrosomethylbenzylamine in male Fisher 344 rats. In contrast, using a more suitable

thermal injury protocol, our findings indicate that the morphological and proliferative changes

induced by thermal injury were attenuated by treatment with mate or green tea.

Various chemicals with antioxidant properties have been found to inhibit chemically-

induced mutagenesis and carcinogenesis in different animal models (Kelloff, 2000; De Flora

et al., 2001). In the present study, we have observed that the treatment with mate or green tea,

during the initiation phase of carcinogenesis, significantly reduced the levels of DNA damage

induced by DEN in peripheral blood cells. Since mate has demonstrated

antimutagenic/antigenotoxic and antioxidant properties (Schinella et al., 2000; Actis-Goretta

et al., 2002; Bracesco et al., 2003; Bixiby et al., 2005; Miranda et al., 2008), this tea-like

50

beverage could be classified as a potential chemopreventive agent against DNA damage

(Kelloff, 2000; De Flora et al., 2001). On the other hand, we have examined the possible

adverse effects of mate tea per si on male Wistar rats since it has been reported that

contamination of carcinogenic PAHs can occur in mate leaves or their infusions (Zuin et al.,

2005; Kamangar et al., 2008), Importantly, rats receiving mate tea for two months did not

present any adverse effect, as indicated by unaltered body and liver weights, transaminase

levels, esophagus and liver morphology and cell proliferation indices. Also, mate tea treatment

per si was not able to induce DNA damage in blood cells by the comet assay analysis. Similar

results have been observed by Miranda et al (2008) that showed that mate tea, administered at

0.5, 1.0 or 2.0 g/kg for two months, was non genotoxic to the liver, kidney and bladder cells

from male Swiss mice. This care with toxicity should be taken into account if safety measures

for public health are to be implemented in response to increased ingestion of this tea-like

beverage by human populations of Southern America (Heck and de Mejia, 2007).

The exact mechanisms involved in the protective effects of mate tea against DNA

damage and carcinogenesis are not clearly understood. The inhibitory action of mate tea could

be explained by its putative antioxidant activity or their modifying influence on

mutagenic/carcinogenic metabolic pathways. It has been reported that DEN biotransformation

produces 8-hydroxyguanine (8-OHG), a parameter of oxidative DNA damage that play a role

on the initiation step of carcinogenesis (Verna et al., 2002). Besides, mate tea was found to

induce quinone reductase activity, a surrogate marker of phase II enzymes, in Hepa1c1c7

murine hepatoma cell line (Chandra and De Mejia Gonzalez, 2004). Therefore, it could be

suggested that mate tea intake during initiation phase with DEN might provide a protective

effect against mutagenesis and carcinogenesis, since a possible increase on phase II enzymes

could imply the elimination of DEN electrophilic metabolites which would be able to

covalently bind to DNA (DNA alkylation) leading to mutations (Verna et al., 2002).

Moreover, the free radical scavenger properties could explain the protective effect of this

herbal tea on the oxidative DNA damage induced by DEN metabolites, thus reducing the

deleterious effects of this carcinogen on their targets. Therefore, an association between phase

II enzyme induction and antioxidant properties could be responsible for the reduction of DNA

damage and the development of preneoplastic and neoplastic lesions induced by DEN. Also,

as mate tea has been shown to induce cell totoxicity in HepG2 human hepatocellular cancer

and SCC-61 and OSCC-3 squamous cancer cell lines, this herbal tea may be useful for the

51

prevention of tumor promotion and progression probably due to the inhibitory activity on

topoisomerase II enzyme (Ramirez-Mares et al., 2004, Gonzales de Mejia, et al., 2005),.

In conclusion, the results of the present study indicate that mate tea intake presented

inhibitory effects against DNA damage and rat esophageal and liver carcinogenesis induced

by DEN. Our findings are of potential interest for their possible application on human cancer

chemoprevention. The underlying mechanism(s) of chemoprevention of mate tea on

mutagenesis and carcinogenesis should be further investigated.

Acknowledgements

This study was supported by CAPES and TOXICAM.

52

References

Actis-Goretta L, Mackenzie GG, Oteiza PI, Fraga CG. 2002. Comparative study on the

antioxidant capacity of wines and other plant-derived beverages. Ann N Y Acad Sci, 957:

279-83.

Alves RJ, Jotz GP, Amaral VS, Montes TM, Menezes HS, Andrade HH. 2008. The evaluation

of maté (Ilex paraguariensis) genetic toxicity in human lymphocytes by the cytokinesis-

block in the micronucleus assay. Toxicol In Vitro, 22: 695-708.

Balansky RM, Blagoeva PM, Mircheva ZI, De Flora S. 1994. Modulation of

diethylnitrosamine carcinogenesis in rat liver and esophagus. J Cell Biochem, 56: 449-54.

Bates MN, Hopenhayn C, Rey OA, Moore LE. 2007. Bladder cancer and mate consumption in

Argentina: a case-control study. Cancer Lett, 246: 268-73.

Bixiby M, Spieler L, Menini T, Gugliucci A. 2005. Ilex paraguariensis extracts are potent

inhibitors of nitrosative stress: a comparative study with green tea and wines using a

protein nitration model and mammalian cell cytotoxicity. Life Sci, 77: 345-58.

Bracesco N, Dell M, Rocha A, Behtash S, Menini T, Gugliucci A, Nunes E. 2003. Antioxidant

activity of a botanical extract preparation of Ilex paraguariensis: prevention of DNA

double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae and human low-density lipoprotein

oxidation. J Altern Complement Med, 9:379-87.

Castelletto R, Castellsagué X, Muñoz N, Iscovich J, Chopita N, Jmelnitsky A. 1994. Alcohol,

tobaco, diet, mate drinking and oesophageal cancer in Argentina. Cancer Epidemiol

Biomarkers Prev, 3: 557-64.

Castellsagué X, Munhoz N, De Stefani E, Victora CG, Castelletto R, Rollon PA. 2000.

Influence of mate drinking, hot beverages and diet on esophageal cancer risk in Southern

America. Int J Cancer, 88: 658-664.

53

Chandra S, De Mejia Gonzalez E. 2004. Polyphenolic compounds, antioxidant capacity, and

quinone reductase activity of an aqueous extract of Ardisia compressa in comparison to

mate (Ilex paraguariensis) and green (Camellia sinensis) teas. J Agric Food Chem, 52:

3583-89.

Chung FL , Schwartz J, Herzog CR Yang YM. 2003. Tea and cancer prevention: studies in

animals and humans. J Nutr, 133:3268S-74S.

De Barros SG, Ghisolfi ES, Luz LP, Barlem GG, Vidal RM, Wolff FH, Magno VA, Breyer

HP, Dietz J, Grüber AC, Kruel CD, Prolla JC. 2000. High temperature "matè" infusion

drinking in a population at risk for squamous cell carcinoma of the esophagus. Arq

Gastroenterol, 37: 25-30. (in portuguese)

De Flora, S, Izzotti A, D’Agostini, F, Balasky RM, Nooman D, Albini, A. 2001. Multiple

points of intervention in the prevention of cancer and other mutation related diseases,

Mutat Res, 480/481: 9–22.

De Stefani E, Boffetta P, Pelegrini HD, Correa P, Ronco AL, Brennan P, Ferro G, Acosta G,

Mendilaharsu M. 2007. Non-alcholic beverages and risk of bladder cancer in Uruguay.

BMC Cancer, 7: 57.

De Stefani E, Deneo-Pellegrini H, Ronco AL, Boffetta P, Brennan P, Muñoz N, Castellsagué

X, Correa P, Mendilaharsu M. 2003. Food groups and risk of squamous cell carcinoma of

the oesophagus: a case-control study in Uruguay. Br J Cancer, 89:1209-147.

Eldridge SR, Butterworth BE, Goldsworthy TL. 1993. Proliferating cell nuclear antigen: a

marker for hepatocellular proliferation in rodents. Environ Health Perspect, 101 (suppl 5):

21-8.

Fagundes RB, Abnet CC, Strickland PT, Kamangar F, Roth M, Taylor PR, Dawsey SM. 2006.

Higher urine I-hydroxy pyrene glucuronide (I-OHPG) is associated with tabacco smoke

54

exposure and drinking mate in healthy subjects from Rio Grande do Sul Brazil. BMC, 6:

1-7.

Fonseca CA, Otto SS, Paumgartten FJ, Leitao AC. 2000. Nontoxic, mutagenic, and

clastogenic activities of Mate-Chimarrao (Ilex paraguariensis). J Environ Pathol Toxicol

Oncol, 19: 333-46.

Goldenberg D, Golz, A, Joachims HZ. 2003. The beverage maté: a risk factor for cancer of the

head and neck. Head Neck, 25:595-601.

Gonzales de Mejia GE, Song YS, Ramirez MV, Kobayashi H. 2005. Effect of yerba mate

(Ilex paraguariensis) tea on topoisomerase inhibition and oral carcinoma cell proliferation.

J Agric Food Chem, 53: 1966-73.

Goodman DG Maronpot RR, Newberne PM, Popp JA, Squire RA. 1994. Proliferative and

selected other lesions in the liver of rats In: Guides for Toxicologic Pathology.

STP/ARP/AFIP, Washington, DC.

Hartmann A, Speit G. 1997. The contribution of cytotoxicity to DNA-effects in the single cell

gel test (comet assay). Toxicol Lett, 90: 183-188.

Heck, C.I., de Mejia, E.G. 2007. Yerba mate tea (Ilex paraguariensis): A comprehensive

review on chemistry, health implications and technological considerations. J Food

Science, 72: 1-14.

Ito N, Tsuda H, Tatematsu M, Inoue T, Tagawa Y, Aoki T, Uwagawa S, Kagawa M, Ogiso T,

Masui, T., Imaida L, Fukushima, S, Asamoto, M. 1988. Enhancing effect of various

hepatocarcinogens on induction of preneoplastic glutathione S-transferase placental form

positive foci in rats--an approach for a new medium-term bioassay system.

Carcinogenesis, 9:387-94.

55

Kamangar F, Schantz MM, Abnet CC, Fagundes RB, Dawasey SM. 2008. High levels of

carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons in mate drinks. Cancer Epidemiol

Biomarkers Prev, 17:1262-8.

Kelloff GJ. 2000. Perspectives on cancer chemoprevention research and drug development.

Adv Cancer Res, 78:199–334, 2000.

Kinjo Y, Cui Y, Akiba S, Watanabe S, Yamaguchi N, Sobue T, Mizuno S Beral V. 1988.

Mortality risks of oesophageal cancer associated with hot tea, alcohol, tobacco and diet in

Japan. J Epidemiol. 8:235-43.

Leitão AC, Braga RS. 1994. Mutagenic and genotoxic effects of mate (Ilex praguariensis) in

prokaryotic organisms. Braz J Med Biol Res, 27: 1517-25.

Li ZG, Shimada Y, Sato F, Maeda M, Itami A, Kaganoi J, Komoto I, Kawabe A, Imamura M.

2003. Promotion effects of hot water on N-nitrosomethylbenzylamine-induced esophageal

tumorigenesis in F344 rats. Oncol Rep, 10: 421-426.

Miranda DDC, Arçari DP, Pedrazolli J, Carvalho PO, Cerutti SM, Bastos DHM, Ribeiro ML.

2008. Protective effects of mate tea (Ilex paraguariensis) on H2O2-induced DNA damage

and DNA repair in mice. Mutagenesis, 10: 1-5.

Parkin, D.M. 2001. Global cancer statistics in the year 2000, Lancet Oncol, 2:533-43.

Pintos J, Franco EL, Oliveira BV, Kowalski LP, Curado MP, Dewar R. 1994. Maté, coffee,

and tea consumption and risk of cancers of the upper aerodigestive tract in southern Brazil.

Epidemiology, 5:583-90.

Pütz A, Hartmann AA, Fontes PRO, Alexandre COP, Silveira DA, Klug SJ, Rabes HM. 2002.

TP53 Mutation Pattern of Esophageal Squamous Cell Carcinomas in a High Risk Area

(Southern Brazil): Role of Life Style Factors. Int. J. Cancer, 98: 99-105.

56

Ramirez-Mares MV, Chandra S, De Mejia EG. 2004. In vitro chemopreventive activity of

Camellia sinensis, Ilex paraguariensis and Ardisia compressa tea extracts and selected

polyphenols. Mutat Res, 554: 53-65.

Rolón PA, Castellsague X, Benz M, Muñoz N. 1995. Hot and cold mate drinking and

esophageal cancer in Paraguay. Cancer Epidemiol Biomarkers Prey, 4: 595-605.

Schinella GR, Troiani G, Davila V, De Buschiazzo P M, Tournier HA. 2000. Antioxidant

effects of an aqueous extract of Ilex paraguariensis. Biochem Biophys Res Commun, 269:

357-60.

Sewram V, De Stafani E, Brennan P, Boffetta P. 2003. Maté consumption and the risk of

squamous cell esophageal cancer in uruguay. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 12:508-

13.

Siglin JC, Khare L, Stoner GD. 1995. Evaluation of dose and treatment duration on the

esophageal tumorigenicity of N-nitrosomethylbenzylamine in rats. Carcinogenesis,

16:259-65.

Stoner GD, Gupta A. 2001. Etiology and chemoprevention of esophageal squamous cell

carcinoma. Carcinogenesis, 22: 1737-1746.

Tice RR, Agurell E, Anderson D, Burlinson B, Hartmann A, Kobayashi H, Miyamae Y, Rojas

E, Ryu JC, Sasaki YF. 2000. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in

vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen, 35:206-21.

Tobey NA, Sikka D, Marten E, Caymaz-Bor C, Hosseini SS, Orlando RC. 1999. Effect of

heat stress on rabbit esophageal epithelium. Am J Physiol, 276: 322-330.

Verna L, Whysner J, Williams GM. 1996. N-nitrosodiethylamine mechanistic data and risk

assessment: bioactivation, DNA-adduct formation, mutagenicity, and tumor initiation.

Pharmacol Ther, 71:57-81.

57

Victora CG, Muñoz N, Horta Bl, Ramos EO. 1990. Patterns of mate drinking in a Brazilian

city. Cancer Res, 50: 7112-7115.

Whiteley LO, Anver MR, Borrs S, Jokinen MP. 1996. Proliferative lesions of the intestine,

salivary glands, oral cavity, and esophagus in rats. In: Guides for Toxicologic Pathology.

STP/ARP/AFIP, Washington, DC.

Yang CS, Maliakal P, Meng X. 2002. Inhibition of carcinogenesis by tea. Annu Rev

Pharmacol Toxicol, 42:25-54.

Yang WX, Pu J, Lu SH, Li FM, Guo LP. 1992. Studies on the exposure level of nitrosamines

in the gastric juice and its inhibition in high risk areas of esophageal cancer. Chin. J.

Oncol, 14: 407-410.

Yoris N, Ivankovic S, Lehnert T. 1984. Effect of Thermal injury and oral administration of N-

methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine on the development of esophageal tumors in Wistar

rats. Oncology, 41: 36-38.

Zuin VG, Montero L, Bauer C, Popp P. 2005. Stir bar sorptive extraction and high-

performance liquid chromatography-fluorescence detection for the determination of

polycyclic aromatic hydrocarbons in Mate teas. J Chromatogr A, 1091:2-10.

58

Table I – Body weight, food and liquid consumption, relative liver weight (RLW) and alanine aminotransferase (ALT) levels at week 81.

Group/Treatment 2

Number

of rats

Body Weight Consumption RLW ALT

Final Gain Liquid Food (%) (U/L)

(g) (g) (ml/rat/day) (g/rat/day)

Initiated groups

(G1) DEN+TI 20 260.8 ± 29.5 59.1 ± 24.1 28.9 ± 8.2 18.3 ± 5.4 2.9 ± 0.7 88.6 ± 14.8

(G2) DEN+TI+ Mate tea 20 296.8 ± 32.8†** 97.6 ± 27.6†** 33.6 ± 8.1†** 18.8 ± 4.1 2.8 ± 0.3 69.6 ± 8.1§

(G3) DEN+TI+ Green tea 20 317.2 ± 31.2†,‡** 118.4 ± 28.8†,‡** 34.8 ± 7.7†** 19.7 ± 4.9 2.8 ± 0.4 63.6 ± 9.8†*

(G4) DEN 05 266.8 ± 27.8 82.4 ± 24.3 30.6 ± 8.0 17.2 ± 4.1 2.7 ± 0.4 85.4 ± 19.5

Non-initiated groups

(G5) Mate tea 05 380.8 ± 36.5†** 188.0 ± 30.8†** 37.0 ± 7.0 23.3 ± 2.3 3.7 ± 0.4 55.8 ± 10.2†**

(G6) Green tea 05 394.4 ± 28.0†** 198.6 ± 29.6†** 34.6 ± 6.9 23.0 ± 3.8 3.8 ± 0.3 58.8 ± 7.3†**

(G7) Control 05 380.2 ± 32.4†** 177.0 ± 30.1†** 34.0 ± 7.6 22.5 ± 2.5 3.6 ± 0.4 57.6 ± 14.2†**

1Values are mean ± SD; 2DEN = diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w., i.p. once a week) and TI= Thermal injury, hot water 650C (1ml/rat, p.o, twice a week) for 8 consecutive weeks; †,‡ Different from G1 and G4 groups or G2 group, respectively. *P < 0.05 or ** P < 0.001. § Trend 0.05 < P < 0.1

58

59

Table II– Incidence (%) of preneoplastic and neoplastic lesions in esophagus and liver and tumor

multiplicity (mean ± SD) at week 20.

Group/Treatment 1

Parameters G1 G2 G3

DEN+TI DEN+TI+Mate tea DEN+TI+Green tea

Number of rats 12 13 14

Esophagus

Dysplasia 8 (67) 6 (46) 3 (21) §

Papilloma 7 (58) 2 (14)†* 1 (7)†**

Liver 2

CCF/ECF 11 (92) 13 (100) 13 (93)

BCF 6 (50) 8 (62) 7 (50)

Adenoma 8 (67) 1 (8)†** 1 (7)**

HCC 4 (33) 2 (14) 1 (7)

Cholangioma 1 (8) 0 1 (7)

Cholangiocarcinoma 1 (8) 0 0

Mixed 3 (25) 3 (23) 0

Tumor multiplicity 3

4.09 ± 1.81 (34) 4 1.67 ± 0.82 (10)* 1.50 ± 0.55 (9)* 1DEN = diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w., i.p., once a week) and TI= Thermal injury, hot water 650C (1ml/rat, p.o., twice a week) for 8 consecutive weeks; 2Prenoplastic lesions with the following phenotypes: CCF/ECF, clear cell/eosinophilic cell foci or BCF, basophilic cell foci; HCC= Hepatocellular carcinoma, Mixed= Hepatocholangioma or hepatocholangiocarcinoma; 3 Mean number of tumors in rat bearing-tumor; 4 Total number of esophagus and liver tumors/group. † Different from G1 group, *P < 0.05 or **P < 0.001; § P= 0.054, trend for G1 group.

59

60

Legends for Figures

Figure 1- Experimental protocol (details in Material and Methods section)

Figure 2- A) Comet image of peripheral blood leukocytes from a DEN-treated group (G4)

animal (40x objective); B) Epithelial cells positive for PCNA (dark nuclei) in

esophagus from a DEN/TI-treated group (G1) animal (40 x objective); C)

Preneoplastic lesion positive for GST-P in the liver from a Group DEN/TI plus

mate tea (G2) animal (20 x objective); D) Hepatocytes positive for PCNA (dark

nuclei) in the liver from a DEN/TI-treated group (G1) animal (40x objective). DEN

= diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w., i.p., once a week) and TI= Thermal

injury, hot water 650C (1ml/rat, p.o., twice a week) for 8 consecutive weeks.

Figure 3- Effects of mate tea intake on DNA damage levels in peripheral blood leukocytes and

development of hepatocellular lesions: A) Data on tail moment and tail Intensity

using the comet assay; B) Number of preneoplastic lesions (PNL) positive for

GSTP per liver area (PNL/cm2) divided into two different size classes. G1=

DEN/TI-treated group, G2= DEN/TI plus mate tea group, G3= DEN/TI plus green

tea group, G4= DEN-treated group, G5= mate tea group (G5), G6= green tea group

(G6) and G7= non-treated group. DEN = diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w.,

i.p., once a week) and TI= Thermal injury, hot water 650C (1ml/rat, p.o., twice a

week) for 8 consecutive weeks.

†, ‡, # Different from G1 group, G1 and G4 groups and G1 to G4 groups, respectively.

* P < 0.05, ** P < 0.001, §. P= 0.065, trend for G1 group.

Figure 4- Effects of mate tea intake on PCNA labeling index in the esophagus and liver in the

different groups. G1= DEN/TI-treated group, G2= DEN/TI plus mate tea group,

60

61

G3= DEN/TI plus green tea group, G4= DEN-treated group, G5= mate tea group

(G5), G6= green tea group (G6) and G7= non-treated group. DEN =

diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w., i.p., once a week) and TI= Thermal injury,

hot water 650C (1ml/rat, p.o., twice a week) for 8 consecutive weeks.

†, ‡, # Different from G1 group, G1 and G4 groups and G1 to G4 groups,

respectively. * P < 0.05, ** P < 0.001.

Figure 5- Morphological phenotypes of the lesions in the esophagus and liver diagnosed at

week 20. A-B) Displastic squamous lesion and papilloma in the esophageal

mucosa from DEN/TI-treated group animals (10x and 20x objective, respectively)

and C-D) Poorly differentiated hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma

in the liver from DEN/TI-treated group animals (40x objective). DEN =

diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w., i.p., once a week) and TI= Thermal injury,

hot water 650C (1ml/rat, p.o., twice a week) for 8 consecutive weeks.

61

62

n = n = Number of rats

s = s = Sacrifice

NaCl 0.9%, 8 x 5ml/kg, i.p.

DEN, 8 x 80 mg/kg, i.p.

20 Week

2

4

Group

n=20

sn= 201

s

1 2 7 8 9 10 19181711

n= 20

s

3

s

s

s

n= 05

s

5

6

7

n= 05

n= 05

n= 05

s

s

s

Water 250C, 1ml/rat, p.o.

Mate tea 2.0% in drinking water

Hot water 650C, 1ml/rat, p.o.

Green tea 2.0% in drinking water

Figure 1

n = n = Number of rats

s = s = Sacrifice

NaCl 0.9%, 8 x 5ml/kg, i.p.

DEN, 8 x 80 mg/kg, i.p.

n = n = Number of rats

s = s = Sacrifice

NaCl 0.9%, 8 x 5ml/kg, i.p.

DEN, 8 x 80 mg/kg, i.p.

20 Week

2

4

Group

n=20

sn= 201

s

1 2 7 8 9 10 19181711

n= 20

s

3

s

s

s

n= 05

s

5

6

7

n= 05

n= 05

n= 05

s

s

s

Water 250C, 1ml/rat, p.o.

Mate tea 2.0% in drinking water

Hot water 650C, 1ml/rat, p.o.

Green tea 2.0% in drinking water

Figure 1

62

63

Figure 2

B

D

A

C

Figure 2

B

D

A

C

63

64

Figure 3

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

GroupG2 G3 G4 G1 G2 G3 G4G1 G1 G2 G3 G4

Num

oH

/cbe

rfA

Fm

2

PNL = 0.3mm PNL > 0.3mm All

B

†,‡*†*

§ §

†*

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

DN

A d

amag

ele

vels

Tail moment

5.0

10.0

15.0

20.0

DN

dam

lls

Aag

eev

eTail intensity

G2 G3 G4 G5 G6 G7G1 Group G2 G3 G4 G5 G6 G7G1 Group

A

†**†**

†** †**#** #**#** #** #** #**

Figure 3

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

GroupG2 G3 G4 G1 G2 G3 G4G1 G1 G2 G3 G4

Num

oH

/cbe

rfA

Fm

2

PNL = 0.3mm PNL > 0.3mm All

B

†,‡*†*

§ §

†*10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

GroupG2 G3 G4 G1 G2 G3 G4G1 G1 G2 G3 G4

Num

oH

/cbe

rfA

Fm

2

PNL = 0.3mm PNL > 0.3mm All

B

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

GroupG2 G3 G4 G1 G2 G3 G4G1 G1 G2 G3 G4

Num

oH

/cbe

rfA

Fm

2

PNL = 0.3mm PNL > 0.3mm AllPNL = 0.3mm PNL > 0.3mm All

B

†,‡*†*

§ §

†*

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

DN

A d

amag

ele

vels

Tail moment

5.0

10.0

15.0

20.0

DN

dam

lls

Aag

eev

eTail intensity

G2 G3 G4 G5 G6 G7G1 Group G2 G3 G4 G5 G6 G7G1 Group

A

†**†**

†** †**#** #**#** #** #** #**1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

DN

A d

amag

ele

vels

Tail momentTail moment

5.0

10.0

15.0

20.0Tail intensityTail intensity

G2 G3 G4 G5 G6 G7G1 Group G2 G3 G4 G5 G6 G7G1 Group

A

†**†**

†** †**#** #**#** #** #** #**D

N d

aml

lsev

eag

eA

64

65

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

PCN

A la

bei

xlin

gnd

e(%

)

Liver

Group

Esophagus

10.020.030.040.050.060.070.0

G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7

PCN

beg

de)

†*

A la

linin

x(%

GroupG1 G2 G3 G4 G5 G6 G7

Figure 4

†*†*

†,‡* †,‡*

#** #** #**

†* †* †*

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

Pe

ix

CN

A la

blin

gnd

e(%

)

Liver

Group

Esophagus

10.020.030.040.050.060.070.0

G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7

PCN

beg

de)

†*

x(%

inA

lalin

GroupG1 G2 G3 G4 G5 G6 G7

Figure 4

†*†*

†,‡* †,‡*

#** #** #**

†* †* †*

65

66

BA

C D

Figure 5

BA

C D

Figure 5

66

67

7. Conclusões Finais

1) A ingestão de mate apresentou efeitos benéficos contra a ação mutagênica/carcinogênica da

DEN em animais submetidos ao protocolo de injúria térmica. Esses efeitos foram similares ao

do chá-verde, embora as folhas de mate não apresentem catequinas em sua composição (Heck

and de Mejia, 2007).

2) A ausência de genotoxicidade do mate em leucócitos de sangue periférico de ratos Wistar,

poderia ser indicativo de ausência de contaminação por PHAs. A análise de resíduos de

pesticidas e de contaminação por PHAs na amostra utilizada neste estudo enriqueceria os

nossos resultados e conclusões.

3) A ingestão de mate sem resíduos de PHAs e em temperaturas mais amenas ou mesmo

gelado (tererê) poderia trazer efeitos benéficos a saúde humana inclusive retardando o

aparecimento de doenças crônico-degenerativas como o câncer

Perceptivas futuras

1) Avaliar os efeitos da ingestão de mate sobre a expressão das enzimas de biotransformação

da DEN no esôfago (CYP 2A3) e fígado (CYP 2E1) através da análise por Western blot e/ou

RT-PCR.

2) Avaliar os efeitos da ingestão de mate na fase de pós-iniciação da carcinogênese de esôfago

e hepática induzida pela DEN.

67