efecto del Último máximo glacial sobre la diversidad
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Efecto del Último Máximo Glacial sobre la diversidad
genética de la rana moteada Batrachyla leptopus Bell, 1843
(Batrachylidae)
Profesor Patrocinante: Dr. José Nuñez
Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas
Facultad de Ciencias
Trabajo de Titulación presentado como parte
de los requisitos para optar al título de
Ingeniero en Conservación de Recursos Naturales
CARLOS IGNACIO ESPARZA FUENTES VALDIVIA
2015
Índice de materias Página
i Calificación del Comité de Titulación i
ii Resumen ii
1 INTRODUCCIÓN 1
2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2
2.1 Diversidad genética 2
2.2 Marcadores moleculares 2
2.3 Antecedentes de la especie en estudio 3
2.4 Último Máximo Glacial 4
2.5 Problema de investigación 6
2.6 Hipótesis 6
2.7 Objetivos 6
3 MATERIAL Y MÉTODOS 8
3.1 Material 8
3.1.1 Área de estudio 8
3.2 Métodos 10
3.2.1 Extracción de ADN genómico 10
3.2.2 Electroforesis en gel de agarosa 10
3.2.3 Amplificación de ADN a través de Reacción en Cadena de la Polimerasa 11
3.2.4 Alineamiento de secuencias 11
3.2.5 Análisis informático 11
4 RESULTADOS 13
4.1 Extracción de ADN 13
4.2 Amplificación de ADN 14
4.3 Variabilidad genética 15
4.4 Demografía poblacional histórica 16
5 DISCUSIÓN 20
6 CONCLUSIONES 23
7 REFERENCIAS 24
Índice de tablas Página
Tabla 1 Localidades de muestreo de especímenes Batrachyla leptopus. N, tamaño
de la muestra; NG y G corresponden a las zonas no glaciadas y glaciadas
por el Ultimo Máximo Glacial.
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Tabla 2 Valores de los parámetros de diversidad genética para la región control D-
loop de individuos de B. leptopus analizados. N: Tamaño de la muestra,
Hd: Diversidad haplotípica, S: Número de sitios polimórficos, π:
Diversidad nucleotídica, H: Número de haplotipos, D: D de Tajima.
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Índice de figuras Página
Figura 1 Extensión estimada de masas de hielo en Chile en el Último Máximo
Glacial de acuerdo a Hollin & Schilling (1981).
5
Figura 2 Fotografía de electroforesis en gel de agarosa al 1 %, producto de
extracción de ADN genómico. El pocillo uno corresponde al estándar
Lambda/Hind III acompañado a la izquierda por el peso molecular
correspondiente. Los pocillos dos, tres, cuatro y cinco pertenecen a
extracción de ADN extraído a partir de una extremidad posterior de
Batrachyla leptopus.
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Figura 3 Fotografía de electroforesis en gel de agarosa al 1 %, producto de
amplificación de ADN mitocondrial de la región de control D-loop
mediante técnica de PCR. En el pocillo uno se encuentra el estándar con
peso molecular de aproximadamente 560 pb. Los pocillos dos, tres y cuatro
corresponden a ADN mitocondrial de Batrachyla leptopus.
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Figura 4 Análisis de diferencias pareadas en Batrachyla leptopus para A) zonas
afectadas por el Último Máximo Glacial, B) zonas no afectadas por el
Último Máximo Glacial, C) zonas afectadas y no afectadas por el Último
Máximo Glacial.
17
Figura 5 Gráfico bayesiano de línea de cielo en Batrachyla leptopus para A) zonas
afectadas por el Último Máximo Glacial, B) zonas no afectadas por el
Último Máximo Glacial, C) zonas afectadas y no afectadas por el Último
Máximo Glacial.
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Figura 6 Red de haplotipos en Batrachyla leptopus para A) zonas afectadas por el
Último Máximo Glacial, B) zonas no afectadas por el Último Máximo
Glacial, C) zonas afectadas y no afectadas por el Último Máximo Glacial.
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i
Calificación del Comité de Titulación
Nota
Patrocinante Dr. José J. Nuñez 6,2
Copatrocinante Dr. Paulo Corti 6,4
Informante Dra. Carolina Briones 6,5
El Patrocinante acredita que el presente Trabajo de Titulación cumple con los requisitos de
contenido y de forma contemplados en el Reglamento de Titulación de la Escuela. Del mismo
modo, acredita que en el presente documento han sido consideradas las sugerencias y
modificaciones propuestas por los demás integrantes del Comité de Titulación.
ii
Resumen
Batrachyla leptopus es una rana endémica de los bosques templados del sur de Chile y Argentina.
Su rango de distribución latitudinal en Chile se extiende desde la Región del Bío-Bío (36°02´S)
hasta la Región de Aysén (45°24´S). Este rango de distribución comprende zonas afectadas y no
afectadas por el Último Máximo Glacial (UMG), hace 20.000 años antes del presente. Dentro de
este contexto se ha establecido que las poblaciones que estaban dentro del rango de extensión del
UMG se extinguieron y que las poblaciones actuales representan eventos de colonización
postglacial hacia estas zonas. El objetivo general de este trabajo fue determinar la diversidad
genética en poblaciones de Batrachyla leptopus en su rango de distribución e inferir el efecto del
UMG sobre estas poblaciones. Para ello, se secuenció un fragmento de la región D-loop
mitocondrial de 107 muestras, correspondientes a 19 localidades comprendiendo zonas afectadas
y no afectadas por el UMG. Los análisis de diversidad genética se realizaron con los programas
DNAsp, BEAST y Network. El análisis de línea de cielo (BSP) fue concordante con eventos de
expansión poblacional reciente en zonas afectadas, estando de acuerdo con la hipótesis planteada.
Es posible concluir que la diversidad genética de las poblaciones de B. leptopus en zonas
afectadas por Último Máximo Glacial es más baja, en comparación a las poblaciones de zonas no
afectadas por este evento.
1
1. INTRODUCCIÓN
Las glaciaciones son eventos que corresponden a periodos de tiempo donde la
temperatura media del planeta desciende lo suficiente como para formar grandes masas de hielo
en latitudes más bajas de lo habitual. Estos eventos han generado drásticos cambios
medioambientales en el pasado, como por ejemplo: reducción de hábitats disponibles para la
vida, disminución de los niveles de oxígeno en los océanos, cambios espaciales en la distribución
de organismos y formación de puentes biogeográficos, entre otros.
A finales del Pleistoceno, hace aproximadamente 20.000 años antes del presente, tuvo
lugar el último evento glacial conocido como el Último Máximo Glacial (UMG). Durante este
período, masas de hielo irrumpieron en gran parte de la Patagonia Chilena y la Cordillera de los
Andes hasta la latitud de Chile central, entre los 38° S y los 55° S, lo cual cambió drásticamente
el paisaje y presumiblemente la distribución preglacial del ensamble de especies, tanto florística
como faunística del área afectada por las masas de hielo.
Una de las especies que pudo haber sido afectada por este evento glacial fue la rana
moteada Batrachyla leptopus Bell 1843, anfibio endémico de los bosques templados del sur de
Chile y Argentina. En Chile, el rango de distribución latitudinal de esta especie se extiende desde
la Región del Bío-Bío (36°02´S) hasta la Región de Aysén (45°24´S). Este rango de distribución
comprende zonas afectadas y no afectadas por el UMG, por lo que se presume que las
poblaciones que estaban dentro del rango de extensión del UMG se extinguieron y que las
poblaciones actuales representan eventos de colonización postglacial hacia estas zonas.
Para la evaluación de esta hipótesis, se planteó 1) determinar la diversidad genética de
Batrachyla leptopus mediante el marcador mitocondrial D-loop entre los 36º y los 45º de latitud
Sur, 2) realizar un análisis filogeográfico por coalescencia de las poblaciones estudiadas y 3)
evaluar la diversidad genética entre zonas afectadas y no afectadas por el Último Máximo
Glacial. Para ello se utilizó marcadores moleculares de tipo ADN mitocondrial, específicamente
se trabajo con la región D-loop, ya que esta se caracteriza por tener una gran variación intra-
específica, casi nula recombinación y una alta tasa de evolución, debido a que el ADNmt se
hereda por uno de los progenitores (habitualmente de la madre).
2
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Diversidad genética
De acuerdo a Noss (1990), la diversidad biológica se compone de cuatro niveles de
organización, estos son: diversidad genética, diversidad de especies, diversidad de ecosistemas y
diversidad de paisajes. La diversidad genética es uno de los niveles más básicos de diversidad
biológica y es en este nivel de organización donde se genera la variación que permite a las
poblaciones evolucionar y adaptarse a su ambiente (Molina et al. 2010). Existen variadas
definiciones para diversidad genética: 1) la propuesta por National Forest Inventory (2003) que
hace referencia a la variación de información genética en todos los organismos de un área
determinada, o 2) la descrita por Frankham et al. (2002) que la define como la variedad de alelos
y genotipos en un grupo de estudio (población, especie o grupo de especies).
Las alteraciones en la diversidad genética en las poblaciones de individuos tanto animales
como vegetales son perjudiciales para éstas ya que, la disminución de la diversidad genética
reduciría la capacidad de las poblaciones para adaptarse a las diversas condiciones
medioambientales y modificará la respuesta a las presiones de la selección natural (McFarlane et
al. 2006). En este sentido, una población con una alta diversidad genética podría poseer una
mayor capacidad de recuperación ante un disturbio medioambiental (Frankham et al. 1999,
Reusch et al. 2005).
2.2. Marcadores moleculares
Los marcadores moleculares corresponden a un conjunto de herramientas que permiten
localizar y aislar genes de interés (Rentaría 2007). Los marcadores moleculares son utilizados
ampliamente para estimar la diversidad genética de las poblaciones (Godoy 2009). Dentro de las
aplicaciones más comunes de los marcadores moleculares se pueden mencionar: identificación de
poblaciones divergentes (McKay & Latta 2002), diferenciación de poblaciones (Balloux &
Lugon 2002), análisis filogenéticos y taxonómicos (Apostolidis et al. 1997, Ashton & De queiroz
3
2001, Nuñez et al. 2011), mapeo de genomas (Mohan et al. 1997), cuantificación de variabilidad
genética intra e inter específica (Dávila et al. 2007), y resistencia a enfermedades y virus (Brown
2000; Gentzbittel et al. 1998).
En el presente Trabajo de Titulación, se ha propuesto utilizar el marcador mitocondrial D-
loop, ya que de acuerdo con Pierce (2009) y Vázquez (2006) se caracteriza por tener una gran
variación intra-específica, casi nula recombinación y alta tasa de evolución. Además, este
marcador molecular ha sido ampliamente utilizado en estudios filogeográficos como por ejemplo
por Núñez et al. (2011), quienes analizaron las regiones mitocondriales D-loop, citocromo
oxidasa b (cyt b) y 16S, con el propósito de describir la diversidad del linaje y los patrones
filogeográficos de la rana Eupsophus calcaratus y evaluar los efectos de la glaciación del
pleistoceno en la demografía de las poblaciones en regiones glaciadas y no glaciadas. También ha
sido utilizado por Ashton & De queiroz (2001), quienes mediante la utilización de la región
control D-loop y del gen ND2 examinaron las relaciones genéticas entre poblaciones de la
serpiente Crotalus viridis y evaluaron la monofilia de esta especie. Del mismo modo Apostolidis
et al. (1997) investigaron las relaciones filogenéticas y la estructura geográfica de la trucha
marrón Salmo trutta L. en dos cuencas marinas mediante la utilización de la región control D-
loop y cyt b.
2.3. Antecedentes de la especie en estudio
Batrachyla leptopus es un anuro endémico de los bosques templados de Chile y
Argentina. En Chile, su distribución latitudinal se extiende desde la región del Región del Bio-
Bío, hasta la Región de Aysén. Su rango de distribución altitudinal va desde los 50 hasta los 1000
msnm (Rabanal & Nuñez 2009). Los ejemplares adultos pueden variar entre 30-60 mm, siendo de
mayor tamaño las hembras que los machos (Cei 1962). Morfológicamente, se caracterizan por
presentar una cabeza larga y puntiaguda, cuerpo esbelto y estilizado, extremidades finas y largas,
y dedos largos terminados en falanges ensanchadas. La coloración dorsal varía desde café oscuro
a rojizo o terracota y en la zona ventral muestran un vientre pálido de color amarillo grisáceo con
manchas irregulares (Celis et al. 2011). Los individuos se pueden encontrar bajo troncos caídos y
hojarasca húmeda en bosques húmedos y zonas anegadas con abundante vegetación. La época
4
reproductiva de esta especie es entre los meses de enero y abril. Los huevos son depositados
sobre suelo húmedo bajo troncos podridos o entre la vegetación cercana a cuerpos de agua y
sectores anegables. (Nuñez et al. 2012).
2.4. Último Máximo Glacial
Durante las glaciaciones del Pleistoceno, grandes capas de hielo cubrieron extensas áreas
de América del Sur entre los 36 ° S y 56 ° S (Hulton et al. 2002; Rabassa & Clapperton, 1990).
Según Ruzzante et al. (2008) estas glaciaciones se pueden dividir en cuatro periodos geológicos:
La mayor glaciación Patagónica (1.1 Ma), la más fría glaciación del Pleistoceno (0.7 Ma), la
última glaciación del sur de la Patagonia (180 ka) y el Último Máximo Glacial (UMG). De
acuerdo con Ehlers & Gibbard (2007) el Último Máximo Glacial se refiere al máximo volumen
de hielo durante el último ciclo glacial. Durante este evento, hace aproximadamente 20.000 años
antes del presente, masas de hielo cubrieron totalmente el territorio continental de Chile desde los
Andes hasta el nivel del mar a partir de los 43° S hacia el sur, los glaciares ocuparon la Cordillera
Andina hasta la latitud de Chile central y descendieron hasta el valle llegando, en la Región de
los Lagos, hasta los pies de la Cordillera de la Costa (Figura 1). La presencia de glaciares y sus
efectos asociados, tales como escurrimientos superficiales, congelamiento de suelos y erosión,
afectaron gran parte del sur de Chile. En consecuencia, los bosques templados se restringieron a
laderas protegidas de la Cordillera de la Costa, especialmente entre los 37° S y los 40° S. Se
estima que estos procesos pueden haber reducido el área del bosque templado a una tercera parte
de su extensión preglacial (Armesto et al. 1994). El Último Máximo Glacial tuvo un gran
impacto en el ensamble composicional de la biota, por ejemplo Xu et al. (2009) muestran que en
el cangrejo de agua dulce Aegla alacalufi, el avance de las masas de hielo provocó que las
poblaciones fueran relegadas a refugios glaciales, para que posteriormente tras la retirada de los
glaciales los individuos sobrevivientes a este disturbio, recolonizaran las áreas desglaciadas
expandiendo sus poblaciones. Estos autores concluyen que, debido a estos acontecimientos, se
modificó la diversidad genética y la estructura de la población de estos organismos. El estudio de
Breitman et al. (2011) acerca de relaciones filogenéticas de Liolaemus lineomaculatus, sugiere
que durante el UMG individuos de esta especie podrían haber persistido en áreas de refugios
5
glaciales, ahora bajo el nivel del mar a lo largo del margen oriental de la Patagonia. Estudios en
Oligoryzomys longicaudatus de Palma et al. (2012) proponen que poblaciones de esta especie
permanecieron en múltiples refugios dentro de los Bosques Templados de la Patagonia de Chile y
Argentina, y la dispersión posterior al norte y al sur de las zonas de refugio previamente
propuestas puede haber ocurrido durante y después del UMG. Además se propone un escenario
de expansión de la población en el período de tiempo del retiro de los glaciares, que pudo haber
sido facilitado por las capacidades de dispersión de la especie. Por otra parte estudios en
Hypochaeris palustris de Muellner et al. (2005) indican que las poblaciones de la Cordillera de la
Costa y de la Cordillera de los Andes se diferenciaron durante el UMG, además proponen que las
poblaciones costeras permanecieron en refugios libres de hielo durante el UMG, debido a que la
tasa de polimorfismo en las poblaciones de la Cordillera de la Costa es más alta en comparación
con todas las demás poblaciones estudiadas. Generalmente los refugios glaciales albergan índices
más altos de diversidad genética que los que han sido colonizados después de la retirada de los
glaciares (Hewitt 1996). Estos ejemplos se ajustan pertinentemente al trabajo que se pretende
realizar en esta tesis, ya que la idea central es evaluar el efecto del Último Máximo Glacial en
poblaciones de Batrachyla leptopus tanto en zonas afectadas por la glaciación como en zonas que
no fueron afectadas por la glaciación y de esa forma comparar la diversidad genética en ambos
escenarios.
Figura 1. Extensión estimada de masas de hielo en Chile en el Último Máximo Glacial de
acuerdo a Hollin & Schilling (1981).
6
2.5. Problema de investigación
Existen variados estudios relacionados con el sur de la Patagonia (Glasser et al. 2004;
Gregori et al. 2008; Rabassa et al. 2005; Stern 2008) referentes a volcanismo, orogenia,
glaciaciones, entre otros, sin embargo existen pocos estudios filogeográficos de vertebrados
terrestres ampliamente distribuidos a través de la región del bosque valdiviano. Esta región, al ser
intensamente glaciada en el pasado, experimentó importantes cambios poblacionales a nivel de la
biota local y aun se desconoce la medida en que algunas especies sobrevivieron dentro de
refugios glaciales y las rutas a través de las cuales se produjeron las recolonizaciones. Es por esto
que esta tesis tiene por objetivo determinar la diversidad genética sobre poblaciones de
Batrachyla leptopus y estimar el efecto del Último Máximo Glacial sobre estas poblaciones.
2.6. Hipótesis
La diversidad genética de poblaciones de Batrachyla leptopus en zonas que fueron
afectadas por el Último Máximo Glacial es más baja que en las zonas que no fueron afectadas por
este evento climático.
2.7. Objetivos
Objetivo General:
Determinar la diversidad genética sobre poblaciones de Batrachyla leptopus en zonas
afectadas y no afectadas por el Último Máximo Glacial.
Objetivos Específicos:
I. Determinar la diversidad genética de Batrachyla leptopus mediante el marcador
mitocondrial D-loop entre los 36º y los 45º de latitud Sur.
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II. Realizar un análisis filogeográfico de las poblaciones estudiadas, a través de redes de
haplotipos.
III. Evaluar la diversidad genética entre zonas afectadas y no afectadas por el Último Máximo
Glacial, a través de gráficos bayesianos de línea de cielo.
8
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Material
3.1.1. Área de estudio
Las muestras de Batrachyla leptopus se obtuvieron mediante prospecciones en cuatro
localidades de la Región de los Ríos. (Valdivia, San José de la Mariquina, Coñaripe, Antilhue),
utilizando el método de relevamiento por encuentros visuales (Heyer et al. 2001). Este método
realiza una búsqueda limitada por unidad de tiempo de esfuerzo, que brinda un cierto número de
especies colectadas u observadas por persona por hora. Para su empleo se debe estandarizar el
esfuerzo de colecta dentro de los diversos tipos de hábitats, así se pueden expresar tanto los datos
de abundancia individual de especies como el número de animales vistos por unidad de hábitat
(distancia o superficie) por hora (Angulo et al. 2006).
Adicionalmente, este trabajo se complementó con una base de datos de 96 secuencias de
Batrachyla leptopus disponible en el Laboratorio de Sistemática, del Instituto de Ciencias
Marinas y Limnológicas de la Universidad Austral de Chile. Considerando así un total de 107
secuencias (Tabla 1). Las secuencias disponibles abarcan mayoritariamente zonas afectadas por
el Último Máximo Glacial.
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Tabla 1: Localidades de muestreo de especímenes Batrachyla leptopus. N, tamaño de la muestra;
NG y G corresponden a las zonas no glaciadas y glaciadas por el Ultimo Máximo Glacial.
Punto Localidad Latitud (S) Longitud (O) N Región
1 Los Queules 35°59'32" 72°31'33" 11 NG
2 Coñaripe 39°34'41" 72°00'59" 5 NG
3 San José 39°29'41" 73°02'26" 2 NG
4 Valdivia 39°48'18" 73°15'04" 3 NG
5 Antilhue 39°48'56" 72°53'15" 1 NG
6 Cordillera Pelada 40°08'25" 73°25'04" 6 NG
7 Bahía Mansa 40°33'47" 73°43'54" 15 NG
8 Antillanca 40°45'31" 72°09'37" 2 G
9 Alerce Andino 41°21'30" 72°20'10" 5 G
10 Puntra 42°07'09" 73°49'12" 7 G
11 Isla Lemuy 42°36'42" 73°39'40" 4 G
12 Pumalin 42°49'28" 72°41'09" 8 G
13 Tepuhueico 42°50'28" 74°00'00" 8 G
14 El Amarillo 42°53'40" 72°28'06" 11 G
15 Yaldad 43°06'30" 73°43'25" 9 G
16 Marín Balmaceda 43°47'00" 72°54'01" 2 G
17 La Junta 43°24'08" 72°30'21" 6 G
18 Lago Verde 44°12'30" 71°52'08" 1 G
19 Queulat 44°22'00 72°25'40" 1 G
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3.2. Métodos
3.2.1. Extracción de ADN genómico
La extracción de ADN se realizo a partir de secreciones bucales y muestras de tejido
obtenidas de la extremidad posterior. El ADN se obtuvo siguiendo el procedimiento de
extracción con fenol-cloroformo de Sambroock et al. (1989) con modificaciones.
Las muestras de tejido fueron secadas con papel absorbente para eliminar los residuos de
etanol, luego con tijeras y pinzas estériles se procedió a extraer una porción comprendida entre el
fémur y las falanges distales que fueron depositadas en tubos Eppendorf con etanol absoluto para
su conservación. De las muestras de secreción bucal se obtuvieron torulados para los cuales la
digestión enzimática se realizo directamente en los tubos Eppendorf. Para la digestión
enzimática, se agrego al tubo Eppendorf los siguientes reactivos: 200 µL de STE (1X), 30 µL de
SDS 20% y 10 µL de Proteinasa K 100µg/mL. Luego se agitó en vortex y se llevo a baño
termoregulado por 1 hora a 55°C, mezclando pasados los primeros 30 minutos para agilizar el
proceso de digestión. Posteriormente a la mezcla de digestión enzimática se agregó 200 µL de
fenol saturado (pH 8) y se agitó en vortex. A continuación la mezcla resultante se centrifugó por
5 minutos a 10.000 rpm, una vez finalizado se extrajo la fase superior que contuvo el ADN para
posteriormente ser depositados en nuevos tubos Eppendorf previamente rotulados, a estos tubos
se le añadió el doble de volumen de la fase superior de etanol absoluto frío y se dejó precipitar a -
20° C por 24 horas. Finalizado ese tiempo el precipitado se centrifugó por 5 minutos a 10.000
rpm a 4°C. Luego se extrajo el sobrenadante de la muestra y se dejó secar el precipitado a
temperatura ambiente hasta que la humedad desapareció por completo. Posteriormente el
precipitado se resuspendió en 50 µL de agua desionizada para diluir el ADN obtenido, se agito
con ayuda de vortex y se almacenó a 4° C.
3.2.2. Electroforesis en gel de agarosa
Las muestras se sometieron a electroforesis en geles de agarosa para evaluar la cantidad y
calidad del ADN resultante. Los geles de agarosa fueron preparados al 1%, para ello se utilizó
0,35 gr de agarosa y 35 mL de TAE 1X, luego se llevó al microondas a temperatura media por 2
minutos. Posteriormente se añadió 1 µL de SYBR safe, luego se mezcló ligeramente y se vació al
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molde de la cámara electroforética para gelificar por 30 minutos. Luego sobre papel film se
mezcló 7 µL de la muestra de ADN junto con 3 µL de buffer de carga, la mezcla resultante se
sembró en cada pocillo de gel, y el primer pocillo se destinó para sembrar 2 µL de estándar de
tamaño molecular (ʎ). Luego se dejó correr las muestras por 30 minutos a 100 mA de corriente.
La visualización de la calidad y cantidad de ADN se realizó mediante un transiluminador UV
para posteriormente fotografiar el resultado.
3.2.3. Amplificación de ADN a través de Reacción en Cadena de la Polimerasa
La mezcla de PCR se realizó de los siguientes componentes: 2,5 µL de MgCl2; 5µL de
buffer 5X; 0,5 µL de DNTPs; 0,25 µL de Taq polimerasa y 13,75 µL de agua desionizada. Por
último se agregó 1 µL de ADN y 1 µL de cada partidor, hasta completar 25 µL de reacción de
PCR. Los partidores utilizados fueron ControlPH (5´-GTC CAT AGA TTC AST TCC GTC AG-
3´) y CWrevL (5´-GAC ATA YTA TGT ATAATC GAG CAT TCA-3´) Goebel et al. (1999).El
perfil de amplificación fue el siguiente: Denaturación inicial a 95°C por 4 minutos, denaturacion
a 94°C por 1 minuto, reasociación a 48°C por 1 minuto, extensión a 72°C por 1 minuto,
finalizando con una extensión terminal a 72°C por 7 minutos. Los productos de PCR se
sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1% y se visualizaron en un transiluminador UV.
Para la secuenciación, las muestras fueron enviadas a Macrogen Inc., Seúl, Corea.
3.2.4. Alineamiento de secuencias
Las secuencias obtenidas de Batrachyla leptopus, fueron alineadas con el programa
ClustalX2 (Thompson et al. 1997).
3.2.5. Análisis informático
Para generar los índices de diversidad genética se usó DnaSP v.5.1 (Librado & Rozas
2009), para esto se seleccionaron los archivos NEXUS correspondientes y mediante la opción del
menú principal “Analysis”, se utilizaron las funciones “DNA Polymorphism” y “Tajima´s Test”,
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con las cuales se generaron las tablas con los índices de diversidad genética. Para generar los
histogramas de diferencias pareadas se utilizo la función “Population Size Change”.
Para generar gráficos bayesianos de líneas de cielo se utilizó BEAST v1.7.2
(Drummond & Rambaut 2007), para esto con un complemento del programa denominado
BEAUTi se seleccionaron los archivos NEXUS correspondientes y en la ventana MCMC se
ajustó el parámetro de la longitud de cadena a 1.000.000 de generaciones, posteriormente en la
pestaña TREES, se selecciono la opción Bayesian Skyline de la sección Tree Prior, con el cual se
generó un archivo de salida de extensión .XML, y posteriormente con el programa BEAST se
seleccionó el archivo de salida .XML con el cual se generaron dos archivos de salida .LOG y
.TREES. Posteriormente con otro complemento del programa BEAST denominado Tracer se
añadió el archivo de salida .LOG para finalmente con la función Bayesian Skyline Reconstruction
ubicado en el menú “Analysis”, seleccionar el otro archivo de salida .TREES con el cual se
generaron los gráficos de análisis de línea de cielo.
Para diseñar la red de haplotipos se usó Network v.4.6.1.2 (Polzin & Daneschmand 2001),
para esto se seleccionaron los archivos NEXUS correspondientes, y mediante la función Median
Joining ubicada en la opción del menú principal Calculate Network, seguido del submenú
Network Calculations, se creó un archivo de salida con extensión .OUT, para posteriormente
editar la red de haplotipos mediante la opción Draw Network.
13
4. RESULTADOS
4.1. Extracción de ADN
De las 17 muestras analizadas se logro extraer ADN con éxito del total de ellas, con una
buena calidad de ADN y un alto peso molecular de aproximadamente 23000 pb, esto se evidencia
al observar las electroforesis de los productos extraídos (Figura 2).
Figura 2 Fotografía de electroforesis en gel de agarosa al 1 %, producto de extracción de ADN
genómico. El pocillo uno corresponde al estándar Lambda/Hind III acompañado a la izquierda
por el peso molecular correspondiente. Los pocillos dos, tres, cuatro y cinco pertenecen a
extracción de ADN extraído a partir de una extremidad posterior de Batrachyla leptopus.
14
4.2. Amplificación de ADN
De las 17 muestras sometidas a amplificación solo fue posible amplificar 11 muestras de
la región mitocondrial D-loop con un peso molecular de aproximadamente 560 pb, es probable
que algunas muestras presentaran mucho ADN por lo que no fue posible amplificarlas (Figura 3).
Figura 3. Fotografía de electroforesis en gel de agarosa al 1 %, producto de amplificación de
ADN mitocondrial de la región de control D-loop mediante técnica de PCR. En el pocillo uno se
encuentra el estándar con peso molecular de aproximadamente 560 pb. Los pocillos dos, tres y
cuatro corresponden a ADN mitocondrial de Batrachyla leptopus.
15
4.3. Variabilidad genética
Las 64 muestras analizadas para la zona afectada por el Último Máximo Glacial
presentaron una diversidad haplotípica de 0,903 y una diversidad nucleotídica de 0,00890, por su
parte el test de Tajima arrojó un valor positivo de 0,17384. Las 43 muestras analizadas para la
zona no afectada por el Último Máximo Glacial presentaron una diversidad haplotípica de 0,973
y una diversidad nucleotídica de 0,02329, por su parte el test de Tajima arrojó un valor positivo
de 0,28384. El total de las muestras analizadas 107, incluyendo tanto las zonas afectadas como
las no afectadas por el Último Máximo Glacial presentaron una diversidad haplotípica de 0,961 y
una diversidad nucleotídica de 0,01883, por su parte el test de Tajima arrojó un valor negativo de
-0,15761 (Tabla 2).
Tabla 2: Valores de los parámetros de diversidad genética para la región control D-loop de
individuos de B. leptopus analizados. N: Tamaño de la muestra, Hd: Diversidad haplotípica, S:
Número de sitios polimórficos, π: Diversidad nucleotídica, H: Número de haplotipos, D: D de
Tajima.
Zona N Hd S π H D
Glaciada 64 0,903 23 0,0089 27 0,17384
No glaciada 43 0,973 58 0,02329 30 0,28384
Glaciada y
no glaciada 107 0,961 62 0,01883 57 -0,15761
16
4.4. Demografía poblacional histórica
El análisis de diferencias pareadas para las zonas afectadas por el UMG indica que se
produjo un aumento reciente en la población, esto debido a que el histograma arrojo una curva
observada de tipo unimodal la cual se ajusta a un modelo de expansión poblacional reciente
(Figura 4A). El gráfico de línea de cielo bayesiano para las zonas afectadas por el UMG
corrobora este resultado ya que, alrededor de entre los 10.000 y los 20.000 años antes del
presente se aprecia una marcada tendencia hacia un aumento en el tamaño efectivo estimado de la
población (Figura 5A). Del mismo modo la red de haplotipos para las zonas afectadas por el
UMG indica un modelo de expansión poblacional reciente ya que, se observan haplotipos
compartidos entre localidades como por ejemplo: Yaldad, Puntra y Lemuy, esto revela que estos
haplotipos comparten la misma secuencia de ADN, lo cual representa eventos recientes de
conexión genética (Figura 6A).
El análisis de diferencias pareadas para las zonas no afectadas por el UMG indica que no
hubo un cambio poblacional significativo, ya que el histograma arrojo una curva de tipo
multimodal, la cual no se ajusta a un modelo de expansión poblacional reciente (Figura 4B). El
gráfico de línea de cielo bayesiano para las zonas no afectadas por el UMG respaldan este
resultado ya que, en la curva promedio del gráfico no se aprecia una variación demográfica
significativa, lo cual indica que las poblaciones mantuvieron un patrón relativamente constante
(Figura 5B). De la misma forma la red de haplotipos para las zonas no afectadas por el UMG
evidenció que los haplotipos presentes no comparten secuencias genómicas idénticas entre
localidades, presentándose en forma más estructurada lo cual apunta hacia una mayor
diferenciación entre éstos en comparación a los de la zona afectada por el UMG, representando
eventos más antiguos de conexión genética. (Figura 6B).
Los resultados del análisis de diferencias pareadas, del grafico de líneas de cielo
bayesiano y de la red de haplotipos para las zonas afectadas y no afectadas por el UMG permiten
entregar una aproximación general de la demografía poblacional histórica de B. leptopus (Figuras
4C, 5C, 6C).
17
A)
B)
C)
Figura 4. Análisis de diferencias pareadas en Batrachyla leptopus para A) zonas afectadas por el
Último Máximo Glacial, B) zonas no afectadas por el Último Máximo Glacial, C) zonas
afectadas y no afectadas por el Último Máximo Glacial.
18
A)
B)
C)
Figura 5. Gráfico bayesiano de línea de cielo en Batrachyla leptopus para A) zonas afectadas por
el Último Máximo Glacial, B) zonas no afectadas por el Último Máximo Glacial, C) zonas
afectadas y no afectadas por el Último Máximo Glacial.
19
Figura 6. Red de haplotipos en Batrachyla leptopus para A) zonas afectadas por el Último
Máximo Glacial, B) zonas no afectadas por el Último Máximo Glacial, C) zonas afectadas y no
afectadas por el Último Máximo Glacial.
A) B)
C)
20
5. DISCUSIÓN
Los indicadores de variabilidad genética indican que las zonas no afectadas por el Último
Máximo Glacial presentan una mayor diversidad genética con respecto a las zonas afectadas por
el Último Máximo Glacial, lo cual evidenciado en los valores de diversidad haplotípica (Hd),
diversidad nucleotídica (π) y la cantidad de sitios polimórficos (S) (Tabla2). Al presumir que las
poblaciones que estaban dentro del rango de extensión del UMG se extinguieron y que las
poblaciones actuales representan eventos de colonización postglacial también se presume que la
estructura genética fue drásticamente modificada, por tanto los valores de variabilidad genética
aportados en las secuencias estudiadas respaldan la hipótesis planteada, la cual hace alusión a que
la diversidad genética de poblaciones de Batrachyla leptopus en zonas que fueron afectadas por
el Último Máximo Glacial es más baja que en las zonas que no fueron afectadas por este evento
climático, por ende se acepta la hipótesis nula.
La demográfica poblacional histórica apunta a que las poblaciones de B. leptopus de
zonas afectadas por el UMG, experimentaron un proceso de expansión poblacional, esto
evidenciado tanto en el histograma de análisis de diferencias pareadas (Figura 4A), como en el
gráfico de línea de cielo (Figura 5A). De acuerdo con Vásquez et al. (2009) los gráficos de línea
de cielo presentan la variación del tamaño efectivo de una población a través del tiempo, en base
a esto se infiere que la expansión poblacional que experimentaron las poblaciones en las zonas
afectadas por el UMG son coincidentes con el retiro de las masas glaciares.
Por otra parte el valor del test de neutralidad D de Tajima para las zonas afectadas por el
UMG como para el de las zonas no afectadas por el UMG arrojó un valor positivo el cual de
acuerdo con Tajima (1989) podría indicar que algunos alelos secuenciados se encuentran bajo
selección positiva.
Este patrón se repite en especímenes del cangrejo de agua dulce Aegla alacalufi, trabajo
realizado por Xu et al. (2009) el cual revela que las poblaciones afectadas por glaciales
experimentaron una expansión demográfica con un aumento constante en las poblaciones tras el
21
UMG, como lo indica el grafico de línea de cielo del estudio para poblaciones afectadas por
glaciales.
Del mismo modo estos resultados son concordantes con el trabajo elaborado por Palma et
al. (2012), quienes analizaron el efecto de las glaciaciones en poblaciones de Oligoryzomys
longicaudatus, y que concluyen que la baja diversidad nucleotídica (π) encontrada en ciertos
haplotipos de Oligoryzomys sugieren una historia reciente de expansión poblacional hacia zonas
de colonización postglacial.
El estudio de Vera et al. (2012) realizado en la evidencia de múltiples refugios de
Liolaemus pictus durante el UMG propone en sus análisis demográficos una disminución del
tamaño poblacional durante las glaciaciones Pleistocénicas. Sin embargo esta disminución
empezó previo al UMG. Poco después de la glaciación de Llanquihue hace aproximadamente
70.000 años antes del presente. Posteriormente se propone que las extensas capas de hielo
produjeron bastas zonas de exclusión para las poblaciones de animales y de plantas con una
subsecuente retirada de los glaciales con temperaturas más cálidas (hace aproximadamente
17.000 años antes del presente), con lo cual se proporcionaron condiciones más favorables para la
recolonización de la biota, incluida B. leptopus. Así lo corroboran los análisis de diferencias
pareadas (Figura 4A) y el gráfico de línea de cielo (Figura 5A).
De igual forma el estudio de Nuñez et al. (2011) quienes trabajaron con E. calcaratus
plantean que de acuerdo a variados análisis demográficos realizados, los individuos de E.
calcaratus estudiados poseen señales de una expansión demográfica consistentes con el retiro
glacial Pleistocénico. Particularmente el análisis demográfico y la variación genética los linajes:
A, E y F (Linajes mayoritariamente provenientes de zonas glaciadas) dan cuenta de una reciente
expansión poblacional representado por una curva unimodal en el histograma de análisis de
diferencias pareadas y los gráficos de línea de cielo, consistente con tiempos estimados de estas
expansiones que van desde aproximadamente los 71.000 y los 18.000 años antes del presente.
Además la alta diversidad haplotípica y la baja diversidad nucleotídica para cada uno de estos
linajes, son consistentes con una expansión poblacional. Por otro lado la inferencia de demografía
histórica, la distribución actual y los tiempos de divergencia en los linajes A y E (provenientes de
las localidades de: Villarica e Isla Guafo), sugieren que estas poblaciones fueron capaces de
22
sobrevivir en refugios dentro de las regiones más frías, seguido por aumentos demográficos pero
sin evidencia significativa de expansión de rango.
Por otro lado las zonas no afectadas por el UMG evidencian que las poblaciones se
mantuvieron relativamente constantes y sin mayores variaciones, esto de acuerdo a los resultados
del análisis de diferencias pareadas (Figura 4B), el gráfico de línea de cielo (Figura 5B) y la red
de haplotipos (Figura 6B). A diferencia de la red de haplotipos para las zonas afectadas por el
UMG (Figura 6A), en la red de haplotipos para las zonas no afectadas por el UMG se puede
observar poblaciones más diferenciadas y estructuradas, con lo cual se infiere que estas
poblaciones permanecieron aisladas en los presuntos refugios glaciales.
Del mismo modo en el estudio realizado por Azpilicueta et al. (2009) referente a los
efectos de las glaciaciones cuaternarias en la Patagonia evidenciado por ADN cloroplástico en
Nothofagus obliqua, se sugiere la existencia de múltiples refugios, donde esta especie arbórea
sobrevivió durante el UMG. Es por ello que la alta diversidad genética detectada en individuos de
la Cordillera de la Costa, con haplotipos ancestrales y aislados, apoya esta teoría.
Igualmente en el estudio de Vera et al. (2012) los resultados sugieren la presencia de más
de un clásico refugio glacial putativo (Cordillera de la Costa). Estos refugios estarían ubicados en
la Isla de Chiloé, en el Valle Central, adyacente a la costa del Océano Pacifico y varios valles
aislados dentro del cordón Andino. De acuerdo a estos antecedes se sospecha de la presencia de
refugios glaciales dentro de la Isla de Chiloé para especímenes de B. leptopus, lo cual tendrá que
ser determinado en estudios posteriores.
23
6. CONCLUSIONES
La diversidad genética de las poblaciones de B. leptopus en zonas afectadas por Último
Máximo Glacial es más baja, en comparación a las poblaciones de zonas no afectadas por el
UMG.
Las poblaciones de B. leptopus en las zonas afectadas por el UMG han experimentado una
expansión de rango reciente coincidente con el retiro de las masas de hielo.
Las poblaciones de B. leptopus en las zonas no afectadas por el UMG se ajustan a un
modelo de tamaño poblacional constante.
Los valores de variabilidad genética para las zonas no afectadas por el UMG podrían ser
aun mayores, si se hubiese podido incluir secuencias de todas las regiones políticas en la que se
distribuye latitudinalmente B. leptopus.
24
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