“efecto de gas1 sobre la diferenciación neuronal y la
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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS
DEL INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
UNIDAD ZACATENCO
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA BIOFÍSICA Y NEUROCIENCIAS
“Efecto de Gas1 sobre la diferenciación neuronal y la
neurotoxicidad inducida por 6-OHDA”
Tesis que presenta:
M. en C. ELIZABETH BAUTISTA RODRÍGUEZ
Para obtener el grado de:
DOCTORA EN CIENCIAS
En la especialidad de:
NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Director de Tesis:
DR. JOSÉ VÍCTOR SEGOVIA VILA
México, D.F Julio, 2017
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AGRADECIMIENTOS:
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), por la beca
otorgada con el número de becario 244958 durante el proyecto de
doctorado.
Al Instituto Carlos Slim de la Salud por la Beca Carlos Slim Excelencia.
Folio: S131914074, FOLIO SP: 132055820
3
AGRADECIMIENTOS:
Esta tesis doctoral, no hubiese sido posible sin la cooperación desinteresada de todas y cada
una de las personas que anunciaré a continuación, Espero no dejar a nadie en el tintero, de
ser así ofrezco una disculpa.
Ya que la familia es lo primero en todo y cuyas palabras no me alcanzarán para expresar
todo mi agradecimiento.
A mi esposo José Luis, por su apoyo, amor y paciencia en este camino que hemos decido
compartir juntos. Te amo.
A mis padres Judith y Roberto por sus enseñanzas, soporte y su ejemplo de vida. Los Amo.
A Felicitas y Moisés mi segundos padres que me brindan todo su apoyo y amor sin ningún
interés. Los Amo.
Fabián y Sofía por su ayuda en todo momento, cariño, apoyo y la alegría que me brindan.
Los amo.
A Iveth, Andy y Lu por enseñarme la importancia de los hermanos, por su soporte y cariño.
Las Amo.
A mi tutor el Dr. José Víctor Segovia Vila por su guía, apoyo, confianza, paciencia y la
oportunidad de desarrollarme como investigadora, que consolidaron mi firme compromiso
con la ciencia. Mi reconocimiento como un investigador con un fuerte compromiso por su
vocación.
A mis asesores por sus valiosos comentarios y observaciones al Dr. Diego Ricardo Felix
Grijalva del Depto. de Biología Celular/CINVESTAV, al Dr. Daniel Martínez Fong del
Depto. de FByN/CINVESTAV, al Dr. Benjamín Florán Garduño del Depto. de
FByN/CINVESTAV y al Dr. Raúl Antonio Aguilar Roblero de la UNAM/IFC/División de
Neurociencias.
Por el apoyo administrativo a la Dra. Ma. Eugenia Garrido Mendoza.
4
Por permitirme hacer parte de los experimentos en su laboratorio al Dr. Juan Antonio
González-Barrios del Hospital 1º de Octubre ISSSTE.
Por el apoyo técnico y personal, convirtiéndose además de colaboradores en grandes
amigos:
Q.F.B. Araceli Navarrete Alonso
Técnico Rubén Sánchez Islas
M en C. Manuel Lara Lozano
Ing. José Nicolás Aguirre Pineda
M. en C. Lizbeth Daniel García
Dr. José Miguel Chin Chan
Dr. Dulce Ávila Rodríguez
M. en C. Laura Sánchez Hernández
M. en C. Emmanuel Barbosa
Dr. Lucia Gabriela García
Mi especial agradecimiento al Dr. Natanael Zarco Salinas y la Q.F.I. Paula Vergara
Zubillaga, quienes me han dado un claro ejemplo de la dedicación y amor por lo que hacen,
y quienes se han convertido en amigos entrañables.
A mis amigos Aida, Ino, Eli y Jonathan, que hicieron que mi estancia en el CINVESTAV
fuera placentera. Por su amistad apoyo, confianza, tiempo y cariño.
A todos mis compañeros de laboratorio que he conocido durante mi estancia en el
laboratorio y de quienes aprecio sus enseñanzas.
Finalmente, esta lista sería interminable al agradecer al personal administrativo (Ale, Luz
Ma y Maru), auxiliares y técnicos (Lulu, Carmen, Lidia, Aurora, José y Marisol), que sin
interés alguno han ayudado a que tenga una estancia agradable en el CINVESTAV.
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DEDICADO A:
A mi familia que son mi soporte y mi motor en la vida para ser
cada día una mejor persona y dar lo mejor de mí en lo que hago.
Cada minuto que pasa es una oportunidad así que demos gracias y
miremos hacia arriba.
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ABREVIATURAS
Generales
6-OHDA: 6-hidroxidopamina
9-cis AR: ácido 9-cis retinoico
ADAM: metaloproteasas (ADAM)
ADHs o RDHs/SDRs. alcohol deshidrogenasa
AKT: Cinasa de Proteína B: cinasa de serinas y treoninas
APP: proteína precursora del Amiloide β
AR: ácido retinoico
ARTN: artemina
ATRA: ácido retinoico all-trans
Bad: antagonista de Bcl2 de la muerte celular
BMP: proteína morfogénica del hueso
CRABPs: proteínas de unión del ácido retinoico
CRBPs: proteínas de unión celular al retinol
CTN: células troncales neurales
DAT: transportador de dopamina
EGL: capa granular externa del cerebelo
ELISA: ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
EP: enfermedad de Parkinson
ESCs: células madre embrionarias
Gas1: growth arrest specific 1
GDNF: factor neurotrófico derivado de glía
GFAP: proteína fibrilar acídica de glial
GFL: ligandos de la familia de GDNF
GFP: proteína verde fluorecente
GFRα: receptor alfa de la familia de los ligandos de GDNF
GPI: grupo glicosil-fosfatidilinositol
GSK3: glucógeno sintasa cinasa 3
iPCs: células pluripotentes inducidas
LCR: líquido cefalorraquídeo
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LPS: lipopolisacárido
MAO: monoamino oxidasa
MAP2: proteína asociada a los microtúbulos 2
MYC: factor de transcripción Myc
N1E115: células de neuroblastoma de ratón
Nardilisina: N-Arg di-básica convertasa
NAT: transportador de recaptura de noradrenalina
NIH/3T3: línea celular de fibroblastos de ratón
NMDA: N-metil-D-aspartato
NRTN: Neurturina
NSE: enolasa especifica neuronal
PI3K: cinasa de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato
PP2A: proteína fosfatasa 2A (PP2A)
PSEN 1: presenilina 1
pSer9-GSK3β: fosforilación en la serina 9 de GSK3β
PSPN: persefina
Ptc: patched
pTyr-GSK3β: fosforilación en la tirosina 216 de GSK3β
RALDHs: retinaldehido deshidrogenasa
RAREs: secuencias consenso de DNA conocidas como elementos de respuesta al ácido
retinoico
RARs: receptores nucleares de AR
RE: retículo endoplásmico
RNS: especies reactivas de nitrógeno
ROS: especies reactivas de oxígeno
RXRs: receptores X de retinoides
SFB: suero fetal bovino
SH ANT-GAS1: células de neuroblastoma que no expresan Gas1
SH-GAS1: células de neuroblastoma que sobreexpresan Gas1 completo
Shh: sonic hedgehog
SH-SY5Y: células de neuroblastoma humano
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SH-tGAS1: células de neuroblastoma que sobreexpresan Gas1 carente del ancla GPI
Smo: smoothened
SNC: sistema nervioso central
SOD: superóxido dismutasa
TCF/LEF: factor derivado de células-T (TCF) y factor de unión al potenciador linfoide
(lymphoid enhancer-binding factor o LEF).
TH: tirosina hidroxilasa
VMAT: transportador vesicular de monaminas
WNT: proteína wingless
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RESUMEN
Gas1 es una proteína pleiotrópica que induce apoptosis en células tumorales y tiene un
papel fundamental durante el desarrollo, ya que promueve la diferenciación miogénica y la
proliferación celular en el cerebelo. Sin embargo, su caracterización neuroquímica y
función fisiológica en el cerebro no ha sido aun totalmente elucidada. Recientemente, se ha
reportado la presencia de dos formas de Gas1, una unida a la membrana por GPI y la otra
secretada por células. Previamente nuestro grupo mostró que Gas1 se expresa en diferentes
áreas del cerebro adulto. Inicialmente, reportamos los niveles de ARNm y proteína de Gas1
en diferentes regiones del cerebro y analizamos su expresión en neuronas glutamatérgicas
(VGLUT2+), GABAérgicas (GAD67+) y dopaminérgicas (TH+). Los resultados muestran
que Gas1 se expresa en neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas presentes en el
hipocampo, tálamo, núcleo fastigial, capa molecular y Purkinje del cerebelo, así como en
neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra. Sin embargo, se detectaron bajos niveles de
Gas1 en neuronas granulares del cerebelo. En este contexto, también se muestra que Gas1
se expresa y libera de las neuronas en cultivo primario de células de Purkinje, del
hipocampo, y de líneas celulares neuronales (SH-SY5Y y N1E115 células diferenciadas),
pero no de las células granulares del cerebelo. Adicionalmente, utilizando células SH-
SY5Y diferenciadas con ácido retinoico (AR) como un modelo de diferenciación neuronal,
encontramos que Gas1 indujo la formación de neuritas a través de la inhibición de GSK3β
y aumentó los niveles de tirosina hidroxilasa (TH). Con base en lo anterior y utilizando
células SH-SY5Y diferenciadas con AR y tratadas con 6-OHDA como modelo in vitro de
la enfermedad de Parkinson (EP), encontramos que Gas1 indujo neuroprotección contra el
daño inducido por 6-OHDA. Esto mediante la inhibición de GSK3β, estabilización de los
niveles de β-catenina, aumento de los niveles de TH y SOD1, y disminución de los niveles
de óxido nítrico. En conjunto estos resultados muestran que Gas1 regula de manera
paracrina la señalización en el cerebro, promueve la formación de neuritas y la
diferenciación dopaminérgica. Asimismo con base en lo anterior se mostró su efecto
neuroprotector ante el daño inducido por la 6-OHDA señalándolo como un posible agente
terapéutico para el tratamiento de la EP.
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ABSTRACT
Gas1 is a pleiotropic protein that induces apoptosis of tumor cells and has important roles
in development promoting myogenic differentiation and cell proliferation in the
cerebellum, however, the characterization of both the neurochemical localization and
physiological functions of Gas1 remains largely unknown. Recently, it has been reported
the presence of two forms of Gas1, one attached to the membrane by GPI and the other
secreted by cells. Previously, we showed that Gas1 is expressed in different areas of the
adult mouse brain. Here, we report the levels of Gas1 mRNA and protein in different brain
regions and analyzed its expression in glutamatergic (VGLUT2+), GABAergic (GAD67+)
and dopaminergic (TH+) neurons. We found that Gas1 is expressed in GABAergic and
glutamatergic neurons in the Purkinje-molecular layer of the cerebellum, hippocampus,
thalamus, and fastigial nucleus, as well as in dopaminergic neurons of the substantial nigra.
However, low levels of Gas1 were detected in the granular neurons of cerebellum. In this
regard we detected the expression and release of Gas1 in primary culture of neurons of
Purkinje and hippocampal cells as well as in neuronal cell lines (SH-SY5Y and N1E115
differentiated cells) but not from cerebellar granular cells. Additionality, using SH-SY5Y
cells differentiated with retinoic acid (RA) as a neuronal model, we found that Gas1
induced the formation of neurite through the inhibition of GSK3β and increased the levels
of tyrosine hydroxylase (TH). Based on the above and using SH-SY5Y cells differentiated
with RA and treated with 6-OHDA as in-vitro model of the Parkinson's disease (PD). We
found that Gas1 induced neuroprotection against damage induced by 6-OHDA, through of
the inhibition of GSK3β, stabilizating the levels of β-catenin, increasing the levels of TH
and SOD1, and decreasing the levels of nitric oxide. Taken together, these results show that
Gas1 regulates paracrine signaling, promotes the formation of neurites and dopaminergic
differentiation. Likewise, based on the above, we reported its neuroprotective effect against
the 6-OHDA-induced damage and we suggest that Gas1 could be a potential therapeutic
agent for treatment of the PD.
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ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN …………………………………………………………..
1. Gas1 (Growth arrest specific 1)
1.1 Regulación transcripcional y estructura proteica de Gas1 …………….......
1.2 Expresión de Gas1 …………………………………………………………..
1.3 Funciones de Gas1 …………………………………………………………..
1.3.1 Gas1 inhibe la señalización inducida por GDNF ………………
1.3.2 Gas1 estimula la vía de señalización de Shh ……………………
2. Ácido retinoico
2.1 Síntesis ……………….……………………………………………...............
2.2 Mecanismo de acción del ácido retinoico ………………………………….
2.3 Diferenciación neuronal del AR acciones genómicas y no genómicas
3. Enfermedad de Parkinson
3.1 Características y cambios bioquímicos de la EP …………………………..
3.2 6-hidroxidopamina (6-OHDA) modelo experimental de la EP ………......
3.3 Efectos neuroprotectores de los inhibidores de GSK3β …………………..
II. JUSTIFICACIÓN …………………………………………………….......
III. HIPÓTESIS ………………………………………………………….........
IV. OBJETIVO GENERAL ………………………………………………….
4.1 Objetivos particulares ……………………………………………….……...
V. MATERIALES Y METODOS …………………………………………..
5.1 Sujetos experimentales ……………………………………………..……..
5.2 Cultivo celular ……………………………………………………………..
5.3 Tratamiento con 6-OHDA ………………………………………………...
5.4 Ensayos de viabilidad celular: MTT y de Azul de tripano ……………...
5.5 Cultivo primario …………………………………………………………...
5.6 Generación de la línea estable SH-GAS1 y producción de proteína
recombinante Gas1 (SH-tGAS1) ……….………………………..…………….…
5.7 Inmunofluorescencia………………………………………………………
5.8 Inmunocitoquímica y conteo de neuritas …………………………….......
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5.9 Microscopia confocal ……………………………………………………..
5.10 Extracción de RNA y reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR) ……………………………………………………………..………...
5.11 Extracción de RNA y PCR tiempo real …………….………………....
5.12 ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) ………........
5.13 Microdisección de las capas del cerebelo …………………….………
5.14 Western blot ……………………………………………………...........
5.15 Niveles de óxido nítrico (NO) ………………………………………...
5.16 Análisis estadístico …………………………………………………….
VI. RESULTADOS …………………………………………………………..
6.1 Gas1 se expresa en diferentes órganos del ratón adulto ……….............
6.2 Gas1 se expresa en diferentes regiones del SNC de ratón adulto, siendo el
cerebelo la región con los mayores niveles ……………………………………..
6.3 Gas1 se expresa en el cuerpo celular de las neuronas GABAérgicas y
glutamatérgicas tanto del giro dentado como en el cuerno de Amón…………..
6.4 Gas1 se expresa en el cuerpo celular pero no en el neuropilo de neuronas
glutamatérgicas y GABAérgicas del tálamo………………………………………
6.5 En el cerebelo, Gas1 se expresa en el cuerpo celular de las neuronas
GABAérgicas y en las neuronas glutamatergicas del núcleo fastigial pero no está
presente en células glutamatérgicas de la capa granular ……………………......
6.6 La capa de células Purkinje-molecular presenta altos niveles de Gas1
mientras que la capa de células granulares del cerebelo tiene bajos niveles ……
6.7 Gas1 es secretado por neuronas de Purkinje y del hipocampo pero no de
células granulares del cerebelo …………………………………………………….
6.8 Los niveles de Gas1 se incrementa durante el proceso de diferenciación de
la células SH-SY5Y inducida con AR …………….............................................
6.9 El silenciamiento de Gas1 disminuye la formación de neuritas inducidas
por el AR en células SH-SY5Y …………………………………………………….
6.10 Gas1 soluble induce la formación de neuritas a través de la inhibición de
GSK3β …………………………...........................................................................
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6.11 Gas1 aumenta los niveles de TH en células SH-SY5Y diferenciadas con
AR y se expresa en células dopaminérgicas de la SNpc ………………...................
6.12 El promotor de gas1 humano, ratón y rata presenta sitios
RARE y TCF/LEF ………………......................................................................
6.13 Búsqueda de los motivos funcionales de Gas1 ………………….......
6.14 Determinación de la concentración efectiva 50 de 6-OHDA.....…….
6.15 Desarrollo y caracterización de las células SH GAS1 ……….……...
6.16 Gas1 promueve la supervivencia celular de las células SH-SY5Y
tratadas con 6-OHDA y diferenciadas con AR …………………………………
6.17 Gas1 promueve la supervivencia celular a través de la inhibición de
GSK3β e incremento de β-catenina total ……………………….........................
6.18 Gas1 incrementa los niveles de tirosina hidroxilasa ……………........
6.19 Gas1 incrementa los niveles de superóxido dismutasa 1 (SOD1) en
células SH-SY5Y diferenciadas y tratadas con 6-OHDA …….………………...
6.20 Gas1 incrementa los niveles de óxido nítrico pero atenúa los niveles que
induce la 6-OHDA en las células SH-SY5Y diferenciadas……………..............
VII. DISCUSIÓN ………………………………………………………………
VIII. CONCLUSIONES ……………………………………………………….
IX. PERSPECTIVAS …………………………………………………...............
X. BIBLIOGRAFÍA …………………………………………………………...
XI. ANEXOS …………………………………………………………………….
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I. INTRODUCCION
1. Gas1 (Growth arrest specific 1)
1.1 Regulación transcripcional y estructura protéica de Gas1
El balance entre el estado proliferativo y el quiescente de las células es regulado por
diversos factores extrínsecos e intrínsecos. Las células pueden salir del ciclo celular y entrar
a una fase no proliferativa conocida como fase G0. En esta fase se identificó la expresión
de seis genes conocidos como gas (growth arrest-specific) [130]. De esta, el mRNA de
gas1 es el más abundante en células NIH/3T3 en fase G0 inducida por la privación de suero
o por alta densidad celular [20, 35, 130]. Los genes Gas1 humano y de ratón están
localizados en el brazo largo del cromosoma 9 y 13, los cuales presenta un 77.04% de
homología entre ellos [23, 34]. El gen gas1 posee un solo exón, sugiriendo que
probablemente fue originado por retrotraposición [61]. Hay pocos estudios acerca de la
regulación transcripcional de gas1, sin embargo, se ha reportado que Menin [59], c-Myc
[85] y Src [58] reprimen la transcripción de gas1, mientras que C/EBP [116] Wt1 [73] y el
ácido retinoico (AR) [41, 150] inducen su transcripción. Adicionalmente se ha reportado la
interacción de cuatro miRNAs con el mRNA humano de GAS1. miR-34a-5p, -148a-3p, -
130b-5p and -183-5p [60, 67]. miR-34a-5p reprime la expresión de GAS1 promoviendo así
la supervivencia por la disminución en los niveles de la caspasa 3 activa en células de
carcinoma papilar de tiroides [96, 156]. Además miR-148a suprime la expresión de GAS1
en células estelares hepáticas [90].
El gen GAS1 humano codifica para una proteína precursora de 345 aminoácidos, de
aproximadamente 45 kDa [35]. En su extremo N-terminal tiene un péptido señal para su
direccionamiento a la membrana celular y en el C-terminal tiene un pro-péptido que es
removido cuando sufre una modificación lipídica (Ser 318), que permite su anclaje a la
membrana a través de un grupo glicosil-fosfatidilinositol (GPI) [34, 35]. La forma madura
de Gas1 tiene un peso molecular de 37 kDa, diversos estudios sugieren que la región amino
posee la actividad funcional ya que la región que abarca del aminoácido 182 al 234 es
esencial para inducir la detención del ciclo celular, mientras que la pérdida de su ancla GPI
o bien el fragmento C-terminal no afectan su función [34, 125, 137].
15
Por otro lado, Gas1 tiene aproximadamente un 25% de homología estructural con los
GFRαs (del inglés, GDNF family of receptors alpha). La homología estructural entre Gas1
y los GFRαs comprende aproximadamente 220 residuos que contienen dos repetidos en
tándem y 10 residuos de cisteínas que participan en la formación de puentes disulfuro (Fig.
1) [17, 131]. Dichas características sugieren que Gas1 puede ser un miembro de la familia
de los GFRαs. Cabe añadir que ambas proteínas están ancladas a la membrana a través de
un grupo GPI, el cual puede ser escindido para dar lugar a las formas solubles [143].
Recientemente se ha reportado que la desintegrina y las metaloproteasas (ADAM) 10 y 17
son responsables del corte del ancla GPI de Gas1 en las células mesangiales [143]. Además
se ha reportado la presencia de una forma soluble de Gas1 en diferentes fluidos corporales
como el líquido cefalorraquídeo (LCR), orina y sangre [7, 143].
Figura 1.Organización esquemática de los dominios de Gas1 y GFRα1. a) Las flechas
indican el sitio aceptor de serina para GPI y una corta región hidrofóbica en el C-terminal
esencial para dicho anclaje. Las líneas muestran los cinco puentes disulfuro que se
encuentran en el dominio D3 de GFRα1. b) Se muestra el empalme del modelo estructural
del dominio D-N de Gas1 (naranja) y D3 de GFRα1 (verde). En rojo se muestran los
puentes disulfuro. (Modificado de Schueler-Furman et al., 2006).
1.2 Expresión de Gas1
Gas1 se expresa en estados tempranos del desarrollo en el tronco primitivo, somitas,
corazón, extremidades, vesícula ótica, riñón, músculo, gónadas, cerebro y placenta [34, 83,
84, 92]. Su expresión es fundamental ya que los ratones knockout para gas1 mueren
inmediatamente después de nacer y desarrollan diversos defectos asociados con la
a)
b)
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disminución en la señalización de Shh, lo cual genera una reducción en el tamaño del
cerebelo, falta de pigmentación en la retina, alteraciones en el tracto gastrointestinal y
microformas de holoprosencefalia [13, 101, 132, 133]. Durante el desarrollo, Gas1 induce
tanto efectos proliferativos como pro-apoptóticos, ya que promueve la muerte del tejido
interdigital [91] y la proliferación de células progenitoras granulares del cerebelo [70]. Por
otro lado, el proyecto del atlas humano de la Fundación Knut y Alice Wallenberg ha
demostrado los niveles de expresión de mRNA y proteina de Gas1 en diferentes órganos
humanos tales como hígado, musculo, tejido endocrino, páncreas, tracto gastrointestinal y
cerebro. Este proyecto también ha mostrado la expresión de Gas1 en diferentes líneas
celulares y aparentemente muestra resultados que indican una regulación a la baja de los
niveles de Gas1 en tejidos cancerígenos como linfomas y carcinoma de células escamosas
(http://www.proteinatlas.org/). En este sentido los bajos niveles de GAS1 se han propuesto
como indicadores de diagnóstico del cáncer de próstata [122].
Por otro lado, la expresión de Gas1 durante el desarrollo embrionario del cerebro de ratón
es amplio, abarcando zonas proliferativas como la zona subventricular, el giro dentado del
hipocampo, la corriente migratoria rostral y en la capa granular externa del cerebelo (EGL),
en esta última región promueve la proliferación celular ya que actúa como un co-receptor
de Sonic hedgehog (Shh) [70]. Por su parte el Instituto Allen mediante hibridación in situ
ha demostrado la presencia de Gas1 en diferentes regiones del cerebro de ratón y humano
(http://www.brain-map.org/). En este sentido, previamente nuestro grupo describió que
Gas1 se expresa principalmente en neuronas y de manera más restringida en células gliales
del cerebro de ratón adulto [154], sin embargo aún falta determinar el fenotipo
neuroquímico específico en donde se expresa y su función en neuronas.
1.3 Funciones de Gas1
Gas1 es una proteína pleiotrópica con diferentes blancos moleculares y que ejerce sus
efectos dependiendo del contexto celular y fisiológico donde se exprese. Inicialmente se
describió a Gas1 como un regulador negativo del ciclo celular ya que inhibe la síntesis de
DNA durante la transición de la fase G0 a S [35]. Adicionalmente, se sugirió que Gas1
inhibía la proliferación mediante la actividad de p53 y Rb, sin embargo, su co-expresión no
genera efectos aditivos, ya que por sí solo Gas1 induce muerte celular [10]. Debido a esto
17
se ha propuesto como un posible gen supresor de tumores ya que está localizado en una
región cromosómica frecuentemente mutada en cáncer de vejiga y mielomas malignos [16,
135]. Partiendo de estos hechos se ha evaluado el potencial terapéutico de Gas1 mediante
su expresión ectópica para disminuir la tasa de proliferación celular descontrolada de
diversas líneas celulares cancerosas como adenocarcinoma pulmonar (A549) [18], células
de glioma murino C6 [93, 94], células de glioma humano U373 [10], células de mama
MDA-MB-231 [72] y en cultivo primario de células de glioblastoma multiforme humano
entre otros [38]. Más aún la forma secretable de Gas1 (es decir, en ausencia de su ancla
GPI) puede inhibir el crecimiento de tumores subcutáneos implantados en ratones
inmunosuprimidos [72, 93, 94] e incluso disminuir la angiogénesis en células de cáncer de
mama MDA-MB-231 (Fig. 2) [72]. Dichos efectos antitumorales se deben en la gran
medida a la capacidad de Gas1 para inhibir a Akt e inducir la activación de la vía intrínseca
de la apoptosis (Fig. 2) [155].
Asimismo, se ha demostrado que Gas1 es un supresor de metástasis de células de
cáncer de mama 67NR y células de melanoma B16-F0 [57]. En relación a lo anterior, datos
previos han mostrado que Gas1 inhibe la migración de células de cáncer de mama mediante
la inhibición de ERK y de manera independiente de la vía de señalización que induce Ret
(Fig. 2) [72]. Por otro lado, se sabe que la unión y el bloqueo de algunas integrinas
disminuyen la migración e invasividad de las células tumorales y por ende la metástasis
[126]. Considerando lo anterior se ha propuesto la posible interacción entre el dominio
RGD de Gas1 e integrinas ya que un estudio previo demostró que la integrina α5β1 (en
ausencia de unión a la fibronectina) disminuye la proliferación de células HT29 de
carcinoma de colon por inducción de la transcripción de GAS1 (Fig. 2) [145]. Sin embargo,
hasta el momento no hay evidencia de la interacción entre el dominio RGD de Gas1 y la
migración celular.
Por otra parte, se ha propuesto a Gas1 como un coadyuvante en el tratamiento del
cáncer ya que la sobreexpresión de GAS1 en células de adenocarcinoma humano (A594)
incrementa la sensibilidad al tratamiento con cisplatino, el cual inhibe la proliferación y la
apoptosis [152, 158]. Además, la regulación a la baja de GAS1 promueve la resistencia a
18
epirubicina en células de cáncer gástrico por la pérdida en la regulación del eflujo de drogas
y de la apoptosis [159]. En este sentido se informó que GAS1 podría ser un biomarcador
importante para el pronóstico de cáncer gástrico y de tiroides, ya que la expresión reducida
o negativa de GAS1 se asocia con menor tiempo de supervivencia [68, 147].
Figura 2. Vías de señalización activadas y blancos moleculares de Gas1 relacionados
con su efecto antitumoral. (Segovia et al., 2016).
A pesar de los reportes que sugieren que Gas1 es un gen supresor de tumores, el
knockout para Gas1 (Gas1-/-) no desarrolla hiperplasias [13, 133] indicando un papel
fisiológico importante. Diversos reportes muestran que Gas1 realiza diferentes funciones
dependiendo del contexto celular donde se expresa. Por ejemplo en el riñón Gas1 es un
inhibidor de la proliferación de las células mesangiales [143], tiene un efecto
antiinflamatorio en la glomerulonefritis y promueve la proliferación de los progenitores de
la nefrona a través de la activación de FGF/WT1 [73]. Interesantemente, se reportó que la
VE-cadherina induce la expresión Gas1 para inhibir la apoptosis sin afectar el crecimiento
de las células endoteliales [136]. Además, Gas1 es un gen blanco de C/EBP durante el
desarrollo folicular, la ovulación y la leutinización [116]. Referente a procesos de
diferenciación, Gas1 induce la diferenciación de los mioblastos a través de la activación de
p38MAPK [86]. Con respecto a las funciones de Gas1 en el sistema nervioso central
(SNC), se ha reportado que regula negativamente el tráfico intracelular de APP (Proteína
precursora del Amiloide β) [26, 27]. Así como con la inducción de efectos pro-apoptoticos
en diversos modelos neurotóxicos [104, 149, 155] y contrastantemente, con la estimulación
19
de la proliferación durante el desarrollo embrionario del cerebelo [70]. Dichos efectos
opuestos, se deben a la capacidad de Gas1 para estimular la vía de señalización de Shh e
inhibir la vía de señalización inducida por GDNF [70, 155].
1.3.1 Gas1 inhibe la señalización inducida por GDNF
Debido a la similitud estructural entre Gas1 y los GFRαs se ha propuesto una relación
funcional entre ellos [17, 131]. Estudios de coinmunoprecipitación en extractos de cerebros
de ratones (embrionarios de 14 d) demuestran la interacción de Gas1 con la proteína Ret un
co-receptor con actividad tirosina cinasa que media la vía de señalización del GDNF [17].
La familia de ligandos del GDNF (GFLs) consta de cuatro miembros: GDNF (del inglés,
glial cell line-derived neurotrophic factor), neurturina, artemina y persefina [3].
Figura 3. Descripción gráfica de las interacciones y efectos de Gas1 con diferentes vías
de señalización. Las flechas negras indican regulación positiva o activación; Las líneas
discontinuas indican interacción mientras que las líneas rojas inhibición.
20
Estructuralmente los GFLs están relacionados aunque comparten solo un 40% de identidad
en la secuencia de aminoácidos. Todos los miembros de la familia del GDNF utilizan al co-
receptor Ret para inducir sus efectos. La unión de los GFLs a Ret no es directa sino que
está mediada por los GFRαs. Así, la especificidad de unión es la siguiente: GDNF se une a
GFRα1, neurturina a GFRα2, artemina a GFRα3 y persefina a GFRα4, aunque un mismo
ligando puede unirse a otro GFRα, pero con menor afinidad [3]. Cuando los GFLs se unen
a su correspondiente GFRα atraen a Ret a las balsas lipídicas para su dimerización y
transfosforilación en residuos de tirosina específicos de su dominio intracelular [3, 129],
induciendo diferentes cascadas de señalización, relacionadas con supervivencia,
diferenciación, morfogénesis, y plasticidad sináptica [129].
En células SH-SY5Y privadas de suero o en presencia de sustancias excitotóxicas,
GAS1 disminuye la fosforilación de la tirosina 1062 de Ret e inhibe la activación de Akt
[13, 140, 155], facilitando la desfosforilación de Bad (activo) el cual se transloca a la
mitocondria y participa en la liberación del citocromo C, que junto con Apaf-1 y la caspasa
9 forman el apoptosoma que a su vez activará a la caspasa 3 ejecutora de la muerte celular
por apoptosis (Fig. 3) [148, 155].
1.3.2 Gas1 estimula la vía de señalización de Shh
Shh es un morfógeno secretable implicado en el desarrollo de diversos tejidos y órganos,
incluido el SNC. El receptor de Shh es Patched (Ptc) el cual inhibe constitutivamente a
Smoothened (Smo), un receptor acoplado a la proteína Gαi/o de la familia frizzled33. La
unión de Shh a Ptc produce la desinhibición de Smo y la translocación al núcleo de los
factores de transcripción Gli (Fig. 3), induciendo efectos mitogénicos, de diferenciación o
supervivencia34. Boc, Cdo y Gas1 pueden unirse a Shh para promover su señalización. De
modo que las células progenitoras de neuronas granulares del cerebelo que carece de Boc,
Cdo y Gas1 pierden completamente la capacidad de proliferación dependiente de Shh27.
.
21
2. Ácido retinoico
2.1 Síntesis
El ácido retinoico (AR) es un isoprenoide, derivado liposoluble de la vitamina A (retinol),
el cual es sintetizado en dos pasos: el primero es la oxidación reversible del retinol a retinal
realizado por la alcohol deshidrogenasa (ADHs o RDHs/SDRs) y el segundo consiste en la
oxidación del retinal para formar el AR, mediante la acción de la retinaldehido
deshidrogenasa (RALDHs; Fig. 4A). Por lo tanto el AR es la forma oxidada del retinol,
siendo el ácido retinoico all-trans (ATRA) y el ácido 9-cis retinoico (9-cis AR) sus
isómeros. Cabe mencionar que algunos retinodes no son funcionales y solo actúan como
moléculas de almacenamiento inactivas, precursores metabólicos o derivados de las formas
activas. La conversión de retinol a retinal se realiza en todos los tejidos, sin embargo la
síntesis de AR se restringe a los sitios donde se expresa la enzima RALDHs. Finalmente, el
AR puede ser degradado por tres enzimas de la familia citocromo P450, CYP26A1,
CYP26B1 y CYP26 (Fig. 4A) [39]. Por otro lado, la concentración de AR es regulada por
la unión a proteínas de unión del ácido retinoico (CRABPs) o por la unión del retinol a las
proteínas de unión celular al retinol (CRBPs), ambas proteínas son inducibles ante la
concentración de AR (Fig. 4 B).
2.2 Mecanismo de acción
El ácido retinoico ejerce sus efectos a través de su unión a los receptores nucleares de AR
(RARs: α, β y γ) los cuales forman heterodímeros con los receptores X de retinoides
(RXRs: α, β y γ) [97, 98]. Este complejo a su vez se une a secuencias consenso de DNA
conocidas como elementos de respuesta al ácido retinoico (RAREs; Fig. 4C), los cuales se
localizan en la región promotora de los genes de respuesta al AR. Los RAREs consisten en
repeticiones directas de un núcleo hexamérico de la secuencia consenso 5’-
[A/T]G[G/T]TCA-3´ separadas por una, dos o cinco pares de bases [8].
Los receptores RARs y RXRs tienen una región A/B amino terminal que contiene
un dominio de activación transcripcional regulado por AF-1, un dominio C central
correspondiente al dominio de unión al DNA (DBD) y un dominio de dimerización débil,
una región D de localización nuclear y finalmente una región E que posee el dominio de
22
unión al ligando (LBD), una interfaz de dimerización fuerte y una región de unión a co-
reguladores transcripcionales.
Figura 4. (A) Biosíntesis y degradación del ácido retinoico. (Modificado de Rhinn y
Dolle., 2012) (B) Mecanismo de acción del ácido retinoico. Proteínas de unión a retinoides.
(C) Mecanismo de acción en ausencia y presencia de ácido retinoico (Modificado de
Marlétaz et al., 2006).
En ausencia de AR, el heterodímero RAR/RXR está constitutivamente unido a
secuencias RAREs, en asociación con co-represores (SMRT y NcoR), que inhiben la
transcripción a través de la desacetilación de las histonas aumentando así la condensación
de la cromatina. La unión del AR induce cambios conformacionales en LBD para la unión
de co-activadores (TIF2 y SRC-1) y la liberación de co-represores que producen la
acetilación de las histonas y por lo tanto la activación de la transcripción. El AR induce la
transcripción de sus propios receptores RARs y de genes implicados en su propio
23
metabolismo como CRBP1/2 (Rbp1/2), CRABP1 /2 y CYP26A1, así como genes de varios
miembros de la familia Hox, y de factores de transcripción como HNF-3α and Cdx1 [117].
Recientemente a través de microarreglos se han propuesto nuevos genes de repuesta al AR
de los cuales se incluyen Cdkn1a, Bmp4, Cdx2, Shh, Ptc1 y Egr2, entre otros [8].
Interesantemente el AR induce la expresión de gas1 en células de la cresta neural [150],
células de carcinoma embrionario F9 [139] y en células de neuroblastoma SH-SY5Y [26],
sin embargo no se comprobando si el promotor de Gas1 contiene una secuencia RARE.
2.3 Diferenciación neuronal por el AR: acciones genómicas y no genómicas
El AR regula la morfogénesis e induce la diferenciación neuronal durante el desarrollo del
SNC [71, 99, 117]. La diferenciación involucra el cese de la proliferación y la entrada a la
fase G0 (quiescente) del ciclo celular [97]. Se ha reportado que el RARα induce la
detención del ciclo celular a través del aumento en los niveles de p27, un regulador
negativo del ciclo celular; adicionalmente el AR incrementa la expresión de los inhibidores
de CDK los cuales promueven la salida de la fase G1 del ciclo celular [150]. Es importante
mencionar que el AR induce la diferenciación neuronal activando la transcripción de varios
genes, incluyendo los que codifican para los factores de transcripción BRN2, factor nuclear
κB (NF κB), STRA13, SOX1, SOX6 NeuroD y neurogenina 1; moléculas de señalización
celular como la proteína cinasa Cε (PKCε), ceramida, presenilina 1 (PSEN 1), estructurales
como la proteína asociada a los microtúbulos 2 (MAP2); receptores de la superficie celular
como sus propios receptores y componentes de la vía canónica de WNT, entre otros [71].
Se ha reportado que durante la diferenciación neuronal se induce la señalización de
FGF, se activan los canales de calcio tipo L, y se inhiben la señalización de la proteína
morfogénica del hueso (BMP) [71], para subsecuentemente activar la via de Notch y por lo
tanto promover la proliferación de progenitores neuronales e inhibir su diferenciación (Fig.
5). Más tarde, la presencia del AR inhibe la expresión de Zic3 gemina, Foxd411 y Notch,
promoviendo de esta manera la expresión de genes proneurales como neurogenina, MyT1,
Ascl2 y Math1, que finalmente conducen a la diferenciación neuronal (Fig. 5). La
inhibición de la señalización de Notch en los progenitores neuronales es la señal clave que
permite la diferenciación neuronal, mientras que la señalización sostenida de Notch
24
conlleva a la diferenciación astrocítica. Cabe indicar que la señalización de Notch es
inhibida en precursores gliales para la generación de oligodendrocitos (Fig. 5) [95].
Interesantemente, se ha mostrado que la co-represión de Notch/Tlx1 genera la expresión de
gas1 durante la diferenciación de las células troncales embrionarias (GEO profiles;
GDS2905 and GDS2906) [121]. Además previamente se reportó que la expresión de gas1
disminuye cuando las células troncales neuronales son diferenciadas a un linaje glial [112],
ambos hallazgos sugieren un papel relevante de Gas1 durante la diferenciación.
Figura 5. (A) Notch modula la diferenciación de neuronas, astrocitos y
oligodendrocitos. (B) Vías activadas e inhibidas durante la diferenciación neuronal.
(Modificado de Janesick et al., 2015, Louvi y Artavanis-Tsakonas; 2006).
Por otro lado, muchos de los efectos del AR sobre la diferenciación neuronal han
sido ampliamente estudiados usando la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y [77, 78].
El tratamiento con 10μM de AR en estas células genera la formación de procesos parecidos
a neuritas que establecen contactos con células adyacentes [40]. Asimismo, el AR aumenta
los niveles de proteínas características de neuronas maduras como MAP2, enolasa
específica neuronal (NSE), NeuN y sinaptofisina, entre otras. Por otro lado, se ha reportado
que el AR incrementa los niveles de proteínas que promueven la supervivencia celular
como: Akt y ERK1/2, y de la vía de señalización de JNK [30], cabe mencionar que un
aumento en la concentración de AR induce apoptosis [146]. Además, incrementa los
niveles de proteínas características de neuronas maduras con fenotipo adrenérgico como el
transportador vesicular de monoaminas (VMAT), del transportador de dopamina (DAT),
A B
25
los subtipos 2 y 3 de los receptores dopaminérgicos (D2R y D3R) y de la tirosina
hidroxilasa (TH), la cual es la enzima limitante de la síntesis de dopamina [30, 77, 78]. En
este contexto, la habilidad del AR para inducir diferenciación neuronal se ha propuesto
como una terapéutica contra el cáncer y como una terapia de trasplante celular o
regenerativa para diferentes enfermedades neurodegenerativas. Interesantemente, se ha
demostrado que las células SH-SY5Y diferenciadas con AR son más resistentes a insultos
neurotóxicos como el tratamiento con 6-hidroxidopamina (6-OHDA) o MPP+ [30, 47, 75],
una neurotoxina que mimetiza las características bioquímicas de la enfermedad de
Parkinson (EP).
3. Enfermedad de Parkinson
3.1 Características y cambios bioquímicos
La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno progresivo neurodegenerativo, que fue
descrito por James Parkinson en 1817, consiste en un conjunto principalmente de
alteraciones motoras que empiezan a ser observadas cuando aproximadamente el 70% de
las neuronas dopaminérgicas de la SNpc han muerto [45, 118, 119]. Aunque se ha
reportado la presencia de otros síntomas no motores como depresión y deficiencias en la
memoria y el lenguaje, debido a que son afectadas otras áreas cerebrales como el locus
coeruleus, el núcleo basal de Meynert, y el hipotálamo. Los principales síntomas motores
que presentan los pacientes son: temblores rítmicos en reposo, acinesia, bradicinesia,
rigidez muscular e inestabilidad postural [111].
Por otra parte, la forma idiopática de esta enfermedad prevalece sobre la forma genética la
cual se debe a una mutación en el gen de la α-sinucleina. La etiología de la EP idiopática o
esporádica es aún desconocida, sin embargo, se ha demostrado una relación entre la muerte
de las neuronas dopaminérgicas con el estrés oxidativo producto del daño mitocondrial,
procesos neuroinflamatorios, excitotoxicidad, cambios epigenéticos, exposición a
organofosforados, monóxido de carbono, disminución de factores neurotróficos y
disfunciones proteosomales [31, 113]. Todo lo anterior contribuye a la apoptosis de la
neuronas dopaminérgicas generando una disminución en los niveles de dopamina y por
ende el desbalance en el circuito de los ganglios basales [14].
26
3.2 6-hidroxidopamina (6-OHDA), modelo experimental de la EP
La 6-OHDA es una neurotoxina que produce la muerte selectiva de las neuronas
dopaminérgicas y que mimetiza las características bioquímicas de la EP tanto in vitro como
in vivo [6, 15, 66, 127]. La administración de 6-OHDA en el estriado, SN o bien en la vía
nigroestriatal (haz medial del cerebro) en roedores conduce a la degeneración de las
terminales y/o neuronas dopaminérgicas, y en consecuencia a la pérdida de las funciones
motoras [15, 152]. In vitro se utilizan diversas líneas celulares con características de
neuronas dopaminérgicas como PC12 y SH-SY5Y [4, 77].
Figura 6. Representación gráfica del mecanismo propuesto de los efectos de la
toxicidad de la 6-OHDA. La 6-OHDA induce muerte de las neuronas dopaminérgicas a
través de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) por oxidación intra o
extracelular, por producción de H2O2 inducida por la actividad de la MAO o por la
inhibición del complejo I y IV mitocondrial, el cual también produce diminución de ATP.
Modificado de Blum et al., 2001.
27
Debido a que la 6-OHDA presenta una estructura similar a la dopamina ingresa a la
célula a través del transportador de recaptura de dopamina (DAT) o noradrenalina (NAT).
Intracelularmente la 6-OHDA inhibe el complejo I y IV mitocondrial de la cadena
trasportadora de electrones, generando altas concentraciones de peróxido de hidrogeno
(H2O2) y derivados de radicales libres (Fig. 6). Así se ha comprobado que el incremento de
enzimas antioxidantes, protegen del daño inducido por la 6-OHDA. Por otro lado, tanto la
dopamina como la 6-OHDA al ser desaminadas por la monoamino oxidasa (MAO) o bien
por la auto-oxidación no enzimática forman radicales libres, en ambos casos se generan
especies tóxicas conocidas como quinonas (Fig. 6) [15]. Cabe señalar que las neuronas
dopaminérgicas contienen altos niveles de dopamina, H2O2 y hierro, la reacción no
enzimática entre estas sustancias puede producir la formación de 6-OHDA (Fig. 6) [15].
Las especies reactivas de oxigeno (ROS) y de nitrógeno (RNS) generadas por la 6-OHDA
causan daño en el DNA caracterizado por altos niveles de 8-hydroxy-2`-deoxyguanosina,
lipoperoxidación, mutaciones en el DNA, desorganización del citoesqueleto, desregulación
de la recaptura de glucosa y de α-aminoisobutirico [138, 153].
3.3 Efectos neuroprotectores de los inhibidores de GSK3β
La enzima glucógeno sintasa cinasa 3 (GSK3), es una serina/treonina cinasa que fue aislada
del músculo esquelético de conejo en 1980 [43]. Inicialmente se reportó a GSK3 como una
enzima inhibidora de la glucógeno sintasa, sin embargo, ahora se sabe que participa en
múltiples procesos celulares como síntesis proteica, proliferación, diferenciación, motilidad
celular, dinámica de microtúbulos y apoptosis. Existen dos isoformas: GSK3α y GSK3β,
las cuales son codificadas por genes diferentes. Ambos genes presentan una homología del
85% en su secuencia completa y del 95% en su dominio con actividad cinasa. También se
han descrito dos isoformas de GSK3β resultantes de “splicing” alternativo: GSK3β1 y
GSK3β2. Se sabe que la perdida de alguna de las isoformas no es compensada por la otra,
lo que sugiere que poseen funciones independientes. Además existe evidencia que muestra
que la deleción de GSK3β es letal en estado embrionario, en contraste con los ratones
knockout de GSK3α los cuales no mueren a edad temprana. GSK3β está constitutivamente
activa y se expresa ampliamente en diversos tejidos, pero principalmente durante el
desarrollo embrionario y en el cerebro adulto, siendo más abundante en las neuronas.
28
GSK3β es activada por la fosforilación en su tirosina (Tyr216) localizada en su
dominio cinasa e inactivada por fosforilación en la serina 9 (Ser9). Interesantemente, se han
detectado polimorfismos genéticos en GSK3β en pacientes con EP [81]. Por otra parte los
agregados proteicos conocidos como cuerpos de Lewy compuestos principalmente por α-
sinucleina (proteína pre-sináptica) son una característica importante de la EP. Se sabe que
la α-sinucleina regula la producción de dopamina a través de su interacción con la TH [9].
La α-sinucleína es un sustrato de fosforilación de GSK-3β. La inhibición de GSK-3β
disminuye la expresión de α-sinucleína y previene de la muerte celular inducida por el
MPP+ [79].
Por lo tanto, la inhibición de GSK-3β puede ser neuroprotectora para las neuronas
dopaminérgicas al atenuar la toxicidad producida por la sobreexpresión de la α-sinucleína.
Otros estudios muestran una relación directa entre la activación de GSK3β y la muerte
neuronal dopaminérgica inducida por estrés oxidativo [28, 63, 115]. Por ejemplo como la
inyección de 6-OHDA en la SN induce la activación de GSK3β y de la caspasa 3 en
neuronas dopaminérgicas [63]. Además, la 6-OHDA inhibe transitoriamente a GSK3β y
posteriormente induce su fosforilación en la Tyr216 en células SH-SY5Y [28]. Por otra
parte, GSK3β en su forma activa induce la degradación de diferentes proteínas incluida la
ciclina D [28]. Interesantemente la 6-OHDA disminuye los niveles de la ciclina D1 en
células SH-SY5Y y PC12 indicando activación de GSK3β [28]. En contraste se ha
reportado que la disminución en los niveles de GSK3β usando un shRNA de interferencia
produce un incremento de la viabilidad celular por disminución de la activación de las
caspasas 3 y 9 [89].
GSK3β se encuentra principalmente en el citosol, pero también en la mitocondria y
en el núcleo, en todos estos orgánulos su activación facilita condiciones pro-apoptóticas
implicadas en la EP (Fig. 7). Por ejemplo; la GSK3β mitocondrial inhibe al complejo I
aumentando la producción de ROS y favoreciendo la formación de poros de transición de
permeabilidad mitocondrial. Por su parte, la GSK3β citosólica fosforila a las proteínas α-
sinucleína y Tau generando su agregación [87], además aumenta los niveles de la proteína
pro-apoptótica Bax (Fig. 7) [87]. Asimismo, GSK3β promueve la respuesta inflamatoria
29
por activación de la microglía e incremento en la producción de citocinas inflamatorias
(Fig. 7).
Figura 7. Mecanismo propuesto de los efectos de la toxicidad de la GSK3β. Modificado de Li et al., 2014.
Considerando los datos anteriores se ha propuesto como estrategia terapéutica el uso
de inhibidores de GSK3β. Así, se ha comprobado que el pre-tratamiento con inhibidores de
GSK3β como el litio, kenpaullona o TDZD-8 disminuyen la muerte neuronal inducida por
la 6-OHDA, MPP o rotenona [28, 76, 115]. El inconveniente con el uso de algunos de estos
inhibidores es su inespecificidad y por lo tanto sus efectos sobre otras cinasas. Sin embargo,
se ha probado que otros inhibidores específicos como indirubin-3′-oxima y AR-A014418
atenúan la apoptosis, restauran los niveles de dopamina en el estriado y por ende
disminuyen el deterioro conductual causado por el MPTP [151].
Es fundamental la búsqueda de inhibidores de GSK3β para generar nuevas opciones
terapéuticas para la EP, por ello es importante el estudio de las vías que regulan tanto su
inhibición como su activación. Por ejemplo, las formas activas de Akt, S6K o MAPKs
30
inducen la inactivación de GSK3β (Fig. 8 y 10) [21, 103]. Por su parte, el litio fosforila e
inhibe a GSK3β a través de la disrupción del complejo Akt/β-arrestina/proteína fosfatasa
2A (PP2A). En contraste, la 6-OHDA activa a GSK3β a través de activación de PP2A y
desfosforilación de Akt (Fig. 8 y 10) [28].
Figura 8. Proteínas que inhiben a GSK3β. Los aminoácidos inducen la activación de la
proteína cinasa mTOR, que a su vez activa a la proteína ribosomal S6 cinasa (S6K), la cual
fosforila a la Ser9 de GSK3 inhibiendo su actividad. Por su parte, los factores de
crecimiento producen la conversión de Ras en su estado activo (unido a GTP), el cual a su
vez induce la activación de la cascada de la proteína cinasa activada por mitógenos
(MAPK). La proteína cinasa 1 activada por MAPK (MAPKAP-K1, también llamada RSK)
inhibe a GSK3. Dependiendo del estado fisiológico de la célula, otros factores de
crecimiento o la insulina pueden inhibir a GSK3 a través de PKB/Akt (Modificado de
Cohen et al., 2001).
Por otro lado, GSK3β es un componente clave de la vía de señalización de WNT
(Fig. 9-10). En ausencia de ligando, GSK3β en su estado activo forma un complejo con
APC, Axina y otras proteínas que facilitan la fosforilación de la β-catenina en la serina 45
por CK1 y en las Ser 33/37/41 por GSK3β. Esto genera la ubiquitinación de la β-catenina y
su posterior degradación en el proteosoma (Fig. 9) [42]. En presencia de ligando, WNT se
une a un receptor de la familia Frizzled y a un co-receptor de la familia LRP5/6 lo cual
induce el desensamble del complejo APC/Axina/CK1/GSK3β conduciendo a la
31
estabilización de la β-catenina y su translocación al núcleo donde interactúa con genes de
respuesta de la familia TCF/LEF (Fig. 9-10) [42].
Figura 9. Vía de señalización canónica de Wnt. Izquierda, en ausencia del ligando, el
complejo GSK3β/Axin/APC/CKIα ubiquitina a la β-catenina induciendo su degradación.
En estas condiciones TCF reprime la transcripción por interacción con el represor Groucho
(TLE1 en humanos), el cual induce la desacetilación de histonas y la compactación de la
cromatina. Derecha, Wnt se une al receptor Frizzled y LRP para entonces asociarse con
parte del complejo de destrucción el cual ya no puede inducir la ubiquitinación de la β-
catenina, por lo tanto esta se transloca al núcleo. En tanto, la β-catenina nuclear forma un
complejo con TCF desplazando a Groucho y recluta a co-activadores de la transcripción
(Modificado de Eisenmann et al., 2005).
GSK3 también ha sido relacionada con la vía de señalización de Notch. Notch es un
receptor transmembranal cuya activación mediada por ligando genera su escisión
proteolítica por presenilina, liberando el dominio intracelular de Notch (NICD) el cual se
transloca al núcleo donde se une a RBP-Jk para activar la transcripción de genes diana que
bloquean la diferenciación neuronal por represión de la transcripción de genes pro-neurales,
de esta forma Notch promueve la proliferación de las células troncales neurales (CTN) [22].
Se ha demostrado que GSK3 fosforila al dominio intracelular de Notch para inhibir
su degradación, sin embargo, otros estudios muestran que promueve su degradación, estos
32
datos contradictorios aún no han sido aclarados [22]. Se sabe que la baja actividad de GSK3
y la alta señalización de Notch se correlacionan con una mayor tasa de proliferación de las
CTN [22], es decir que probablemente la fosforilación que realiza GSK3 en Notch es para
inducir su degradación, aunque esto queda por demostrarse.
Por otro lado, GSK3 es un inhibidor de la vía de señalización de Shh (Fig. 10). Como
previamente se mencionó en ausencia de Shh, Ptc inhibe constitutivamente a Smo, el cual
media sus efectos mediante las proteínas Gli de las cuales Gli1 y Gli2 son activadores
transcripcionales, mientras que Gli3 es un represor (Fig. 3). En ausencia de Shh, GSK3 y
CK1 fosforilan y facilitan la formación del complejo Gli/Cos2/Fused, esto genera a su vez
la ubiquitinación y proteólisis de Gli, produciendo así una forma truncada de Gli carente
del dominio de activación C-terminal. En presencia de ligando el complejo Gli/Cos2/Fused
se desensambla, inhibiendo la fosforilación y el procesamiento de Gli [22].
Figura 10. Algunas proteínas blanco de GSK3β. GSK3 es una molécula clave
involucrada en varias vías de señalización como: PKA, PKC, RAS / RAF, Akt, WNT, HH
(Shh) y mTOR. GSK3 es normalmente inactivada por la fosforilación específica en el
residuo serina 9, de esta forma por ejemplo permite la actividad transcripcional de la β-
catenina y de eIF2B. Por su parte GSK3 en su estado activo (pTyr216) bloquea la
señalización HH (Shh), la apoptosis, la diferenciación y las acciones transcripcionales
mediadas por MYC. (Modificado de Marschalek et al., 2010) [100].
33
A pesar de que GSK3β en su estado activo promueve la proliferación, se sabe que
existe una baja actividad de GSK3β y una alta actividad de Notch para inducir la
proliferación e inhibir la diferenciación de la células troncales neurales [65, 82]. Debido a
lo anterior se optó por la adición de inhibidores de GSK3β en protocolos de diferenciación
de células troncales y de las células troncales neurales. Más allá de esto se ha demostrado
que la adición de inhibidores de GSK3β induce la diferenciación dopaminérgica [19, 80,
142].
34
II. JUSTIFICACIÓN
Gas1 ejerce diferentes funciones dependiendo del contexto celular en que se exprese,
produciendo detención del ciclo celular, muerte celular, proliferación o diferenciación,
debido a su capacidad de inhibir la síntesis del DNA, bloquear la vía de señalización de
GDNF, estimular la vía de Shh o de p38MAPK, respectivamente. Datos previos indican
una relación entre Gas1, la diferenciación con AR y la muerte neuronal inducida por
agentes neurotóxicos como MPTP o NMDA. Sin embargo, hasta el momento existe poca
evidencia de las funciones de Gas1 sobre la diferenciación neuronal y la neurotoxicidad.
Por lo tanto, inicialmente el presente estudio se enfocó en la caracterización neuroquímica
de la expresión de Gas1 en regiones del cerebro donde previamente se han descrito efectos
así como en regiones que presentan altos niveles de Gas1 y cuya organización permite
visualizar su presencia en el cuerpo celular o en el neuropilo. Posteriormente, se detectó a
Gas1 soluble en cultivos primarios de neuronas, para subsecuentemente analizar sus efectos
sobre la formación de neuritas utilizando células SH-SY5Y diferenciadas con AR. Con
base en los resultados de los experimentos anteriores se decidó analizar el efecto
neuroprotector de Gas1 ante el insulto neurotóxico inducido por la 6-OHDA en células SH-
SY5Y diferenciadas con AR.
III. HIPÓTESIS
Gas1 se expresa en neuronas GABAérgicas, glutamérgicas y dopaminérgicas, induce el
crecimiento neurítico y protege de la muerte a las células SH-SY5Y tratadas con 6-OHDA
y diferenciadas con AR.
35
IV. OBJETIVO GENERAL
Analizar la expresión de Gas1 en neuronas así como determinar su función en la
diferenciación neuronal y sus efectos sobre la neurotoxicidad inducida por la 6-OHDA
como modelo de la EP.
4.1 Objetivos particulares
1. Determinar los niveles de mRNA y proteína Gas1 en diferentes regiones del SNC.
2. Determinar la expresión de Gas1 en neuronas GABAérgicas, glutamatérgicas y
dopaminérgicas del hipocampo, tálamo, cerebelo y de la SNpc.
3. Determinar la expresión y liberación de Gas1 en cultivos primarios de células de
hipocampo, células granulares y células de Purkinje.
4. Determinar la función de Gas1 en la diferenciación neuronal de las células SH-
SY5Y diferenciadas con AR.
5. Analizar los efectos de Gas1 sobre la neurotoxicidad inducida por
6-OHDA en células SH-SY5Y diferenciadas con AR.
36
V. MATERIALES Y METODOS
5.1 Sujetos experimentales
Los experimentos en animales se realizaron de acuerdo a la NOM-062-ZOO-1999
(SAGARPA) y a la normativa interna del CINVESTAV. Ratones machos CD1 de 8-10
semanas de edad se mantuvieron con acceso ad libitum a comida y agua. Para los ensayos
de RT-qPCR, RT-PCR, ELISA y western blot, los ratones fueron sacrificados,
posteriormente los órganos y las diferentes regiones cerebrales (cerebelo: Cb, bulbo
olfatorio: OB, corteza: Cx, hipocampo: Hip, tálamo: Tal y las capas granulares y Purkinje-
Molecular) se disecaron con la ayuda de un estereoscopio y sobre una caja Petri. Los tejidos
se preservaron a -80ºC hasta su procesamiento. Para la inmunofluorescencia, los ratones se
sacrificaron con una sobredosis de pentobarbital (50 mg/Kg, i.p.) y se perfundieron por vía
intracardiaca con 150 mL de solución salina al 0.9%, y 150 mL de p-formaldehído al 4% en
PBS (pH: 7.4). El cerebro fue extraído de la cavidad craneal y se incubó durante 24 h, en p-
formaldehído al 4%, para después colocarlo en gradientes de sacarosa al 10, 20 y 30% con
un periodo de incubación de 12 h cada uno. Después se realizaron cortes coronales en
sentido antero-posterior de 30 µm en un micrótomo, los cuales se almacenaron a 4˚C para
después ser procesados. Brevemente, para los cultivos primarios se utilizaron cerebros de
ratones CD1 de 5 a 8 d de edad. El Cb e Hip se disectaron y mantuvieron en solución de
Hank´s (HBSS) con 100U/mL de penicilina y 100mg/mL de estreptomicina para ser
procesados inmediatamente.
5.2 Cultivo celular
Las líneas celulares NIH/3T3, SH-SY5Y, SH ANT-GAS1, SH-GAS1 y N1E115 fueron
cultivadas en medio DMEM HG (alta glucosa; Life Technologies, Carlsbad CA)
suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado (SFB), 2mM de L-glutamina,
50U/mL de penicilina y 50mg/mL de estreptomicina (Life Technologies, Carlsbad CA).
Todos los cultivos se mantuvieron a 37ºC/5% de CO2/95% de aire y 100% de humedad
relativa. Las células NIH/3T3 fueron utilizadas como control de la expresión de Gas1, por
lo tanto se cultivaron en medio DMEM HG suplementado con 30% de SFB (bajo estas
condiciones no expresan Gas1). Para la detección de Gas1 las células NIH/3T3 fueron
cultivadas con 0.5% de suero por 24h. Para determinar los efectos de Gas1 sobre la
37
formación de neuritas y la diferenciación neuronal, células SH-SY5Y, SH ANT-GAS1 y
SH-GAS1 fueron diferenciadas con 10μM de AR mientras que las células N1E115 con
20μM de AR (Sigma Aldrich, St Louis, MO) en DMEM HG con 0.5% de SFB por 3, 5, 7 y
14 d dependiendo del experimento. Las células SH-SY5Y y N1E115 son líneas celulares
con morfología epitelial adherente que forma procesos parecidos a neuritas cuando se
incuba con 10 10μM de AR. Las células SH ANT-GAS1 es una línea estable que expresa
una secuencia antisentido para Gas1 es decir no expresa Gas1 y que previamente fue
generada en nuestro laboratorio [155]. En contrataste la línea celular SH-GAS1
sobreexpresa Gas1 de forma regulable por la adición de tetraciclina [93].
5.3 Tratamiento con 6-OHDA
Con el propósito de mostrar los efectos de Gas1 ante el daño inducido por la 6-OHDA
usamos las líneas celulares SH-SY5Y, SH ANT-GAS1 y SH-GAS1. Previo a la exposición
a la 6-OHDA, las células SH-GAS1 fueron incubadas con tetraciclina (1mg/mL) por 24h
para inducir la expresión de Gas1. Todas las líneas celulares fueron tratadas con 80μM de
6-OHDA (Sigma Aldrich, St Louis, MO). La 6-OHDA se diluyó en 0.1% de ácido
ascórbico para evitar su oxidación. Terminado el tiempo de incubación con la 6-OHDA las
células fueron procesadas para medir la actividad mitocondrial por la técnica de MTT, la
permeabilidad celular por la técnica de azul de tripano, niveles de óxido nítrico o
procesadas para western blot.
5.4 Ensayos de viabilidad celular: MTT y de Azul de tripano
Para determinar la viabilidad celular, empleamos las técnicas de exclusión de azul de
tripano y MTT (Sigma Aldrich, St Louis, MO). En ambos ensayos las células se sembraron
en cajas de 24 pozos a una densidad de 1x105 células/pozo. Para el ensayo de MTT, las
células fueron incubadas por 2h con 5mg/mL de MTT, terminado el tiempo de incubación
se midió la cantidad de formazán formado a una longitud de onda de 540nm en un lector de
ELISA (Bio Rad: iMark TM). Para el ensayo de azul de tripano las células fueron
tripsinizadas (0.05% de tripsina), centrifugadas (3000 rpm por 5 min) y resuspendidas 0.4%
de azul de tripano/PBS, el número de células vivas y muertas (azules) se contó en una
cámara de Neubauer.
38
5.5 Cultivo primario
Los cultivos primarios de hipocampo, células granulares y células de Purkinje se
obtuvieron a partir de ratones CD-1 de 5 a 8 d de edad. Los cultivos se realizaron basados
en los reportes de Ahlemeyer y cols. (2005) y Furuya y cols. (1998) con algunas
modificaciones [2, 52]. Brevemente, el Hip y el Cb se disectaron y transferieron a HBSS,
suplementado con 100U/mL de penicinilina y 100mg/mL de estreptomicina. El tejido se
disoció mecánicamente por 5 min y digirió enzimáticamente con 0.1% tripsina y 1U/mL
DNasaI por 15 min. La suspensión celular fue lavada con HBSS y resuspendida en DMEM
F12 (Life Technologies, Carlsbad CA) suplementado con 20nM progesterona, 30nM
selenito de sodio, 100μM putrescina, 3.9mM glutamina, 5μg/mL insulina y 100μg/mL
transferrina (Sigma Aldrich, St Louis, MO). Las células se sembraron en cajas Petri
cubiertas con poli-D-Lisina (10μg/mL). Al cultivo primario de células de Purkinje se les
añadió 0.5ng/ml de hormona T3 (Sigma Aldrich, St Louis, MO). Por otro lado, el cultivo de
células granulares fue cultivado en presencia de 25mM de KCl (Sigma Aldrich, St Louis,
MO). Todos los cultivos primarios fueron tratados con 1μM AraC (Sigma Aldrich, St
Louis, MO) por 6h para reducir la presencia de células gliales.
5.6 Generación de la línea estable SH-GAS1 y producción de proteína recombinante
Gas1 (SH-tGAS1)
Previamente se obtuvo un lentivirus que contienen un vector que codifica a la proteína
Gas1 en su forma completa y una isoforma carente de la secuencia de anclaje GPI (tGas1),
las cuales expresan las dos formas de Gas1 de forma regulable (sistema TET-ON) [93, 94].
Las células SH-SY5Y se infectarón con los lentivirus que contienen el elemento represor
(ER; MOI 5), las células se seleccionaron con blasticidina (Invitrogen; 5mg/mL).
Posteriromente, las células SH-SY5Y con el ER, se infectaron con lentivirus que contienen
un plásmido que codifica la secuencia completa de Gas1 (MOI: 10). Esta línea celular
obtenida sobreexpresa Gas1 completo (SH-GAS1) y se utilizó en los experimentos con 6-
OHDA. Por otro lado, las células SH-SY5Y con el ER se infectaron con lentivirus que
contenían el vector que codifica tGas1 (MOI: 10), así se generó la línea celular SH-tGAS1
que expresa la proteína recombinante Gas1 soluble (carente del ancla GPI) que se uso en
los experimentos de formación de neuritas. Ambas líneas fueron seleccionadas con Zeocina
39
(Invitrogen: 250mg/mL). Adicionalmente, para obtener la proteína recombinante, las
células SH-tGAS1 (que sobreexpresan Gas1 soluble) fueron incubadas con 0.05% de suero
y 10μM de AR por 24 h después el medio por 0.05% de suero y 1mg/ml de tetraciclina esto
con la finalidad de inducir la expresión de tGas1. Después de 48 h se recogió el medio de
células SH-tGas1, se filtró (0,22 μm; Millipore) y se lavó cinco veces usando un centricon
(Millipore Cat # UFC805008 50.000 KDa), la concentración de Gas1 se cuantificó por
ELISA (Systems Cat # DY2636) y se realizaron las diluciones correspondientes para el
tratamiento de las células SH-SY5Y y SH ANT-GAS1.
5.7 Inmunofluorescencia
Las secciones coronales fueron lavadas 3 veces con PBS 1X, pH 7.4 durante 10 min c/u. En
seguida se permeabilizaron con PBS Tritón al 0.2% (PBST) por 30 min. Posteriormente se
realizó el bloqueo de los sitios inespecíficos incubando con 1% de albúmina sérica bovina
(BSA libre de IgG´s) (Sigma) disuelta en PBST por 30 min, para después incubar por 48 h
a 4⁰C, con los anticuerpos primarios: ratón anti-GAD 67 (1:1000, MAB5406, Chemicon);
ratón anti-VGLUT2 (1:50, MAB5504 Chemicom); conejo anti-Gas1 (dirigido contra la
secuencia: DGVPHPPRPGSGA, ProSci) y ratón anti-TH (1:500; Sigma, Cat# T2928).
Posteriormente se incubaron con los anticuerpos secundarios correspondientes Alexa 488 y
Alexa 594 (Life Technologies, Carlsbad, CA) durante 2 h. Los núcleos fueron teñidos con
DAPI (DAPI; Vector Laboratories). Para corroborar la expresión de Gas1 en el cerebro de
ratón adulto se realizaron inmunofluorescencias utilizando un anticuerpo policlonal contra
la secuencia completa de Gas1 humano producido por Santa Cruz Biotechnology (1:50,
Cat: SCB, Cat # H-300, Fig. 11).
5.8 Inmunocitoquímica y conteo de neuritas
Las células SH-SY5Y y SH ANT-GAS1 fueron sembradas sobre cubreobjetos y tratadas
con 10μM de AR por 7 d. Para determinar si la formación de las neuritas era restablecida en
las células SH ANT-GAS1, estas se trataron con 0.1ng/ml de Gas1 y 10μM de AR por 7 d.
Después las células fueron fijadas con 4% de p-formaldehido por 15min, lavadas 2 veces
con PBS, incubadas con 0.2% Triton X-100/PBS y bloqueadas con 1% de BSA por 30 min
a temperatura ambiente. Para la detección de neuritas las células se incubaron con un
40
anticuerpo primario ratón anti-tubulina βIII (1:1000; Covance Cat# 801201) por 16 h. Los
cubreobjetos se lavaron 3 veces con 0.2% Triton X-100/PBS e incubaron con el anticuerpo
secundario cabra anti-ratón (Alexa 594; Life Technologies, Carlsbad, CA). Los núcleos
fueron teñidos con DAPI (DAPI; Vector Laboratories). Un total de 25 células fueron
contadas en 3 campos de cada grupo, el número de neuritas fue dividido entre el número de
células.
Figura 11. Gas1 se expresa en la corteza cerebelosa (Cb; A-C) médula oblongada (MO; D-
F) y corteza (Cx; G-I) del cerebro del ratón adulto. Barra: (A y D) 100μM.
41
5.9 Microscopia confocal
Las imágenes se obtuvieron usandoun microscopio confocal Leica TCS SP8, usando
objetivos de inmersión 40X y 100X. Los intervalos de longitud de onda para cada
fluoróforo fueron reducidos para evitar al máximo posibles interferencias, asímismo la
adquisición fue secuencial para evitar interferencias entre canales. Las imágenes fueron
analizadas en el programa LAS AF lite.
5.10 Extracción de RNA y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
El RNA total de las células NIH/3T3 o tejido de la capa de células granulares o células
Purkinje-Molecular fue aislado usando TRIzol (Invitrogen). Se emplearon 5μg de RNA
total y se trataron con DNAsa1 (New England Biolabs; Ipswich, MA) y M-MLV siguiendo
las instrucciones del proveedor (Invitrogen). Posteriormente, 2μl del cDNA resultante se
usaron para amplificar gas1 y β-actina. Para amplificar a gas1 los primers usados fueron:
sentido 5’CTGTGCCTGATGGCGCTGCTGC3’ y antisentido
5’ACGCAGTCGTTGAGCAG CGCC3’ (amplicon: 595 pb). Las condiciones de
amplificación fueron: para la etapa de desnaturalización a 95ºC (1 ciclo, 5 min), seguido de
35 ciclos a 95ºC (20 seg), 62ºC (30s) y 72 ° C (30 seg) para la desnaturalización, la
alineación y la extensión, respectivamente; con una disociación final a 72°C (1 ciclo, 5
min). Por otro lado, usamos un par de oligonucleótidos previamente descritos para
amplificar β-actina (380 pb) [154].
5.11 Extracción de RNA y PCR tiempo real
El RNA total fue extraído por el método de TRIzol (Invitrogen), todas las muestras fueron
tratadas con DNAsa1 (Invitrogen) y con la retrotranscriptasa SuperScript® III (Invitrogen)
seguido de RNAsaH (Invitrogen). Se preparó un total de 7.5 µl de mezcla de reacción que
contenía: 3.5 µL de SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0.45 µl df
dNTPs, 0.75 µl de cDNA y se ajustó el volumen con agua grado biología molecular. La
reacción de PCR en tiempo real fue corrida en un equipo 7900HT Fast Real-Time PCR
Thermocycler (Applied Biosystems). Los primers usados para amplicar a gas1 de ratón
fueron: sentido 5’-CCCTCTTCTGTGCGGTTTTC-3’ y antisentido 5’-
CCCTTCTCCAAGTCCATTGG -3’; adicionalmente se usaron primers para amplificar a
42
β-actina previamente reportados [154]. Los datos fueron obtenidos usando el software
SDS-2.4, las curvas de amplificación y línea base fueron ajustadas usando el método
reportado por Ririe et al., 1997 [120]. Para comparar la tasa de expresión (2-ΔΔCt), usamos la
expresión de β-actin y gas1 del Cb como control positivo.
5.12 ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas)
Los niveles de proteína Gas1 se midieron por ELISA usando los kits DuoSet ELISA de
R&D Systems Cat# DY2644 y DY2636 de acuerdo a las instrucciones del proveedor. La
extracción de proteínas se realizó usando un buffer de lisis que contenía inhibidores de
proteasas (Complete; Roche Diagnostics, Indianapolis, Ind., USA). La cuantificación de
proteínas se realizó por el método del ácido bicinconínico (Sigma Aldrich, St Louis, MO).
Así, un total de 50 μg de proteína fue usada para la determinación de Gas1 por ELISA. Los
niveles de Gas1 en el medio de cultivo de la células SH-SY5Y, N1E115, así como en los
cultivos primarios de células de Purkinje, hipocampo y granulares fueron medidos sin
dilución. Los datos fueron analizados y normalizados para obtener la cantidad de Gas1
humano o de ratón en nanogramos por microgramo de proteína total, los niveles de Gas1 en
el supernadante (medio condicionado) son reportados en nanogramos por mililitro.
5.13 Microdisección de las capas del cerebelo
Este protocolo fue realizado con base a lo reportado por Chou y Jungalwala [32]. Ratones
de 8 semanas de edad fueron sacrificados por decapitación, el cerebelo fue removido, para
obtener cortes sagitales, los cuales se transfirieron a una caja Petri con HBSS y
subsecuentemente lavados con agua DEPC. Se usó un estereoscopio para disecar la capa de
células Purkinje-Molecular en una sola sección y la capa de células granular y sustancia
blanca en otra sección.
5.14 Western blot
La extracción de proteínas de las células o tejidos fue realizado usando un buffer de lisis
que contenía un mezcla de inhibidores de proteasas (Complete; Roche Diagnostics,
Indianapolis, IND) y la cuantificación de proteínas se realizó por el método del ácido
bicinconínico (Sigma Aldrich, St Louis, MO). Un total de 50 μg de proteína de cada
43
muestra fue separada en un gel de electroforesis de SDS-poliacrilamida y transferida a
membranas de nitrocelulosa (BioRad; Hercules, CA). Las membranas fueron bloqueadas
con 5% de leche libre de grasas/TBS/0.1% Tween 20 (TBST) por 2 h e incubadas por 12 h
en presencia de los anticuerpos primarios: anti-Gas1, anti-pSer9 GSK3β (1:1000, CTS Cat
#5558), anti-GSK3β (1:1000, CTS Cat #12456), anti-β-catenina (1:1000), anti-TH (1:250,
SCB Cat#), anti-SOD1 (1:500,) y anti-β-actin (1:5000) [54]. Posteriormente las membranas
fueron lavadas tres veces con TBS/0.1% Tween e incubadas con los anticuerpos
secundarios anti-conejo o anti-ratón correspondientes acoplados a peroxidasa de rábano
(Jackson ImmunoResearch). Las membranas fueron reveladas usando un kit Lightning
Plus-ECL (PerkinElmer; Waltham, MA) y las imágenes se obtuvieron usando el
biodocumentador; BioDoc-It Imaging System (UVP; Upland, CA), para después ser
analizadas usando el software Image J®.
5.15 Niveles de óxido nítrico (NO)
Para determinar los efectos de Gas1 sobre el estrés nitrosativo se midieron los niveles de
NO por la técnica de Griess en el sobrenadante de las células tratadas con y sin 80μM de 6-
OHDA. Se tomaron 150 μL del sobrenadante fresco y se agregó a este 20 μL de una
solución que contenía N-(1-naftil) etilendiamina (1mg/mL) y ácido sulfanílico (10 mg/ml).
Dicha mezcla se incubó durante 30 min a temperatura ambiente y en oscuridad,
posteriormente se realizó la lectura de las muestra a una longitud de onda de 540nm. Los
niveles de NO de las células SH-SY5Y fueron tomadas como el 100%.
5.16 Análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± SEM (n=3). Los análisis estadísticos se
realizaron usando ANOVA de una vía seguido de un análisis post hoc de comparación
múltiple de Tukey (p ≤ 0.05).
44
VI. RESULTADOS
6.1 Gas1 se expresa en diferentes órganos del ratón adulto
En este trabajo inicialmente se cuantificaron por ELISA los niveles de Gas1 en diferentes
órganos del ratón adulto de 8 semanas de edad de la cepa CD-1 (Fig. 12). Esto con el
propósito de comparar los niveles de Gas1 en el cerebro con respecto a otros órganos. Los
resultados muestran que páncreas, testículo y bazo son los órganos con los mayores niveles
de Gas1 seguidos por el músculo, intestino delgado, pulmón y riñón, mientras que las
órganos con los niveles más bajos de Gas1 son: cerebro, corazón e hígado (Fig. 12). Se usó
como control células NIH/3T3 (NIH S/S) en presencia de suero como control negativo y en
ausencia de suero por 96 h como control positivo de la expresión de Gas1 (Fig. 12).
NIH
C/S
NIH
S/S
Baz
o
Cer
ebro
Cora
zón
Híg
ado
Inte
stin
o
Músc
ulo
Páncr
eas
Pulmón
Riñ
ón
Testíc
ulo
0.0
0.5
1.0
1.5
2.05
6
7
8
ng
Gas1/
g p
rote
ína
Figura 12. Gas1 se expresa en diferentes tejidos de ratón adulto. Los niveles fueron
cuantificados por ELISA y se expresan como ng Gas1/μg de proteína. NIH C/S, células
NIH/3T3 en proliferación; NIH S/S, células NIH/3T3 cultivadas con 0.5% de suero por 96
horas.
45
6.2 Gas1 se expresa en diferentes regiones del SNC de ratón adulto, siendo el
cerebelo la región con los mayores niveles
En el presente trabajo, se empleó qRT-PCR y ELISA para medir los niveles de mRNA y
proteína de Gas1 en diferentes regiones del cerebro adulto. El producto de PCR fue
amplificado de todas las regiones examinadas, incluyendo Cb, OB, Cx, CPu, Tal e Hip
después de 35 ciclos de amplificación (Fig. 13A). Se determinaron los niveles de mRNA (2-
ΔΔCt) por qRT-PCR, se usó a β-actin como control de carga y al Cb como control positivo.
En la figura 13B se muestran los niveles del mRNA de gas1 en las diferentes regiones
analizadas, se observa que el Cb es la región con los niveles más altos de gas1 seguido del
Hip, Tal, CPu, OB y Cx siendo esta última región la que contienen bajo número de copias
del mRNA (Fig. 13B).
Figura 13. Gas1 se expresa en diferentes regiones de cerebro adulto de ratón. (A)
Amplificación y (B) niveles de expresión del mRNA de Gas1 por qRT-PCR y niveles de
(C) proteína Gas1 determinados por ELISA en diferentes regiones del cerebro adulto. (D)
Detección de Gas1 por western blot en las estructuras correspondientes. Para qRT-PCR y
western blot, β-actina fue usada como control de carga. B (-) reacción sin cDNA; NP,
células NIH/3T3 en proliferación; N24, células NIH/3T3 cultivadas con 0.5% de suero por
24h; Cb, cerebelo; Hip, hipocampo; Tal, tálamo; Brain, cerebro adulto completo.
46
Como control se usaron células N1H/3T3 cultivas en ausencia o presencia de suero. La Fig.
13 A-B muestra la presencia y los niveles de gas1 en células NIH/3T3 cultivadas con 0.5%
de SFB por 24 h (N24; Fig. 13A). Por otro lado, los resultados obtenidos por qRT-PCR son
comparables a los obtenidos por ELISA (Fig. 13C), en el cual los niveles de Gas1 fueron
normalizados por pg/μg de proteína (Fig. 13C). Con base en los resultados anteriores se
corroboró la expresión de Gas1 por western blot en el Cb, Hip y Tal (Fig. 13 D). El
siguiente objetivo fue determinar la expresión neuroquímica específica de Gas1 en regiones
del cerebro adulto donde previamente se han descrito sus efectos y cuya organización
permite visualizar la presencia de Gas1 en el cuerpo celular o en el neuropilo. Para detectar
a Gas1 en los diferentes fenotipos, detectamos proteínas específicas de neuronas
glutamatérgicas (VGLUT2+, transportador vesicular de glutamato 2), GABAérgicas
(GAD67+: descarboxilasa de ácido glutámico de 67 KDa) y dopaminérgicas (TH+: tirosina
hidroxilasa). A pesar de que el CPu tiene niveles considerables de Gas1, se decidió no
incluirlo en el estudio ya que esta área recibe entrada glutamatérgica de Tal y Cx pero no
posee neuronas glutamatérgicas. Las abreviaturas se explican en la Tabla I.
6.3 Gas1 se expresa en el cuerpo celular de las neuronas GABAérgicas y
glutamatérgicas tanto del giro dentado como del cuerno de Amón
Para detectar a Gas1 en neuronas GABAérgicas, utilizamos un anticuerpo contra GAD67,
enzima que cataliza la formación de GABA a partir de la descarboxilación del L-glutamato.
La isoforma GAD67 es soluble y se distribuye en todo el cuerpo celular, en contraste con la
isoforma GAD65 la cual está anclada a la membrana de las vesículas sinápticas y se
encuentra predominantemente en las terminales axónicas. Por otra parte, detectamos a Gas1
en neuronas glutamatérgicas usando un anticuerpo contra el transportador vesicular de
glutamato 2 (VGLUT2) que se expresa exclusivamente en neuronas glutamatérgicas, ya
que otros transportadores vesiculares como VGLUT1 y 3 se localizan en otro tipos
neuronales como serotoninérgico, colinérgico e inclusive en astrocitos.
La figura 14A muestra la inmunorreactividad a Gas1 en los diferentes estratos neuronales
del hipocampo incluido la capa Py (Pyramidale; subdividida en tres regiones: CA1, CA2,
47
CA3); Or: stratum oriens; SLu; stratum lucidum; Rad: stratum radiatum: LMol: lacunosum
moleculare; Mol; stratum moleculare; GrDG: stratum granulosum del giro dentado; y
PoDG: capa polimórfica conocida también como hilus.
El stratum pyramidale es la región del hipocampo que contiene los somas de las neuronas
piramidales. Con base en las diferencias de tamaño y densidad con la que se agrupan estas
células, se ha subdivido a esta región en distintos campos citoarquitectónicos denominados
CA1, CA2 y CA3. El análisis detallado de estas regiones reveló colocalización de Gas1 con
VGLUT2 (Fig. 14 E-F; 16 D-E; 17 D-E). Cabe señalar que se ha reportado escasa expresión
de VGLUT2 en el hipocampo y que su expresión se restringe a algunas neuronas [48-50,
64]. Por otro lado, se detectaron células Gas1 y VGLUT2 positivas en las células de la
capa granular (Fig. 15 F-G) y polimorfa (hilus, Fig. 15 F-I) del giro dentado. Además, en el
hilus Gas1 se expresa en el soma y no en las terminales glutamatérgicas ubicadas en la
periferia de las neuronas hiliares (Fig. 15 F-I).
Con respecto a la expresión de Gas1 en las neuronas GABAérgicas, se muestra que Gas1
no colocalizó con el plexo GABAérgico presente en las diferentes regiones de la capa
piramidal de CA1 (Fig. 16 A-B), CA2 (Fig. 17 A-B) y CA3 (Fig. 14 B-C; Fig. 18 D-E) del
hipocampo. Por otro lado, se detectaron células Gas1+-GAD67+ en el stratum oriens
adyacente a CA1 (Fig. 16 A-B), CA2 (Fig. 17 A-B) y CA3 (Fig. 14 B-C; Fig. 18 D-E).
Cabe mencionar que las terminales de estas neuronas forman un plexo alrededor de los
somas de las células piramidales adyacentes el cual no fue positivo a Gas1. Además, se
observó un abundante plexo GABAérgico no inmunorreactivo a Gas1 en la capa polimorfa
(hilus: Fig. 15 A-D) y alrededor del soma de las neuronas granulares (Fig. 15 A-B). Tanto
en el hilus como en el borde de la capa granular se encontraron células de canasta
GABAérgcas positivas a Gas1 (Fig. 15 A-D). En el stratum lucidum (Fig. 18D) y en el
stratum moleculare (Fig. 18 A-B) se detectaron células Gas1-GAD67+ con morfología
horizontal y con inmunorreactividad a Gas1 únicamente en el soma.
48
6.4 Gas1 se expresa en el cuerpo celular pero no en el neuropilo de neuronas
glutamatérgicas y GABAérgicas del tálamo
Como se observa en la figura 19, Gas1 se expresa ampliamente en los núcleos talámicos.
En este trabajo, se analizó dicha expresión en el núcleo reticular (Rt) y ventroposterior
medial (VPM) del tálamo para determinar la distribución diferencial de Gas1 tanto en el
plexo como en las neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas. La inmunorreactividad a
GAD67 sólo se encontró en el núcleo Rt (Fig. 19 B), mientras que en el VPM sólo se
observó en el neuropilo (Fig. 19B-C). Gas1 colocalizó con GAD67 en el soma de células de
núcleo Rt (Fig. 19 B) pero no en el neuropilo GABAérgico presente en el núcleo VPM
(Fig. 19C). Por otra parte, el núcleo VPM contiene VGLUT2-IR abundante tanto en el
cuerpo neuronal como en el neuropilo pero únicamente el cuerpo celular fue
inmunorreactivo a Gas1 (Fig. 19 D-G).
6.5 En el cerebelo, Gas1 se expresa en el cuerpo celular de las neuronas
GABAérgicas y en las neuronas glutamatergicas del núcleo fastigial pero no está
presente en células glutamatérgicas de la capa granular
En la corteza cerebelosa (Fig. 20 A), células Gas1+-GAD67+ se observaron en la capa
molecular, (células de canasta; Fig. 20 B y D), en la capa de células de Purkinje (Fig. 20 B
y E) y en la capa de células granulares (células de Golgi; Fig. 20 B y F). Los cuerpos
celulares de Purkinje y las dendritas, fueron fuertemente positivas a GAD67, pero
únicamente los cuerpos celulares fueron inmunorreactivos a Gas1 (Fig. 20 B y E). En la
capa molecular, se observó GAD67-IR en células de canasta (Fig. 20 B-D) dispersas cerca
de las células de Purkinje y abundante inmunorreactividad punteada en el neuropilo (Fig.
20 B). Las células de canasta fueron inmunorreactivas para GAD67-Gas1 en la capa
molecular mientras que el neuropilo fue únicamente inmunorreactivo a GAD67 (Fig. 20 B,
D y E). En la capa granular se observaron células de Golgi que expresan GAD67-Gas1 (Fig.
20 F). Por otro lado, se observó inmunorreactividad a VGLUT2 en las células granulares
(Fig. 20 C y G) y en las fibras paralelas de la capa molecular y terminales de fibras
musgosas en la capa granular (Fig. 20 C, G, H), sin embargo ni el cuerpo celular ni la
terminales fueron positivas a Gas1 (Fig. 20 C y G).
49
Por otra parte, se analizó la expresión de Gas1 en el núcleo fastigial y la
inmunofluorecencia muestra que Gas1 se expresa en el cuerpo celular de las neuronas
glutamatérgicas pero no en el neuropilo (fig. 21 D y E). Las células de Purkinje envían sus
axones al núcleo fastigial para hacer contacto sináptico con las células glutamatérgicas que
residen en este núcleo. Las figuras 20 A y B muestran que las terminales GABAérgicas de
las células de Purkinje no son positivas a Gas1.
Tabla 1. Abreviaturas de las regiones cerebrales
Abreviación Estructura
CA1 Región CA1 del hipocampo
CA2 Región CA2 del hipocampo
CA3 Región CA3 del hipocampo
Cx Corteza
GD Giro dentado
Gr Capa granular del cerebelo
GrDG Capa granular del giro dentado
LMol Capa lacunosum moleculare del hipocampo
Mol Capa molecular del cerebelo
Or Capa oriens del hipocampo
PoDG Capa polimórfica del giro dentado (hilus)
Pur Capa de células de Purkinje del cerebelo
Py Capa piramidal del hipocampo
Rad Stratum radiatum del hipocampo
Rt Núcleo reticular del tálamo
SLu Stratum lucidum del hipocampo
VPM Núcleo ventroposteromedial del tálamo
WM Sustancia blanca
50
Figura 14. Gas1 se expresa en neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas de CA3 del
hipocampo. (A) Inmunohistoquímica para Gas1 (verde) en el hipocampo. (B-C) Gas1 está
presente en el soma de las neuronas GABAérgicas (GAD67+: rojo) de estrato oriens y (E-F)
en el soma de las neuronas glutamatérgicas piramidales (VGLUT2+: rojo) de CA3. Los
núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las células indicadas con flechas en B y E, se
amplifican en C y F, respectivamente. Barra: (A) 200μm, (B y E) 100 μm, (C y F) 10 μm. D
y G muestran la localización de los campos examinados. Las abreviaturas se exponen en la
Tabla I.
51
Figura 15. Gas1 se expresa en las neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas del giro
dentado y del hilus (capa polimórfica) del hipocampo. (A y F) Gas1 (verde) está
presente en el soma de las neuronas GABAérgicas (GAD67+: rojo) situadas en la capa
granular (A y B) e hilus, aunque, (A y D) pero no en el neuropilo GABAérgico (F-G).
Además, Gas1 (verde) se encuentra en las neuronas glutamatérgicas (VGLUT2+: rojo) de la
capa granular e (F y G) hilus (F y I), pero no en el neuropilo glutamatérgico (rojo). Los
núcleos se tiñeron con DAPI (azul) Las células indicadas con flechas y puntas de flecha en
A y F se amplifican en B y D y en G e I, respectivamente. Barra: (A y F) 100 μm, (B, D, G
e I) 10μm. C, E, H y J muestran la localización de los campos examinados. Las abreviaturas
se exponen en la Tabla I.
52
Figura 16. Gas1 co-localiza con GAD67 y VGLUT2 en CA1 del hipocampo. (A-B) Gas1
se expresa en el soma de las neuronas GABAérgicas (GAD67+: rojo) del stratum oriens y
(D-E) y en el soma de las neuronas glutamatérgicas (VGLUT2+: rojo) de las células
piramidales de CA1 del hipocampo. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las células
indicadas por las flechas en A y D se amplifican en B y D, respectivamente. Barra: (A y D)
100 μm, (B y E) 10 μm. C y F representan las áreas examinadas. Las abreviaturas se
exponen en la Tabla I.
Figura 17. Gas1 se expresa en las neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas de CA2
del hipocampo. (A-B) Gas1 está presente en el soma de las neuronas GABAérgicas
(GAD67+: rojo) de stratum oriens y (D-E) y en el soma de las neuronas glutamatérgicas
(VGLUT2+: rojo) de las células piramidales de CA2 del hipocampo. Los núcleos se tiñeron
con DAPI (azul). Las células indicadas por las flechas en A y D, se amplifican en B y E,
respectivamente. Barra: (A y D) 100 μm, (B y E) 10 μm. C y F muestran las áreas
examinadas. Las abreviaturas se exponen en la Tabla I.
53
Figura 18. Gas1 se expresa en neuronas GABAérgicas de la capa molecular del
hipocampo. (A-B) Gas1 expresa en el soma de neuronas GABAérgicas (GAD67+: rojo) de
la capa molecular pero no (D-E) en el neuropilo GABAérgico de la capa piramidal de CA2.
Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). La célula indicada por la flecha en A se amplifica
en B; La inserción en B se amplifica en E. Barra: (A y D) 100 μm, (B y E) 10 μm. C y F
muestran las áreas examinadas. Las abreviaturas se exponen en la Tabla I.
54
Figura 19. Gas1 se expresa en neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas del tálamo.
(A) Inmunohistoquímica para Gas1 (verde) en el tálamo. (B y E) Gas1 (verde) se expresa
en el soma de las neuronas GABAérgicas (GAD67+: rojo) del núcleo Rt (D y G) y en el
soma de las neuronas glutamatérgicas (VGLUT2+: rojo) del núcleo VPM. (C y F) Sin
embargo, Gas1 (verde) no co-localiza con el neuropilo GABAérgico (rojo) del núcleo
VPM. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las células indicadas por las flechas en B, C
y D, se amplifican en E, F y G, respectivamente. Barra: (A) 200 μm, (B, C y D) 100 μm,
(E, F y G) 10 μm. H muestra la localización de los campos examinados. Las abreviaturas se
exponen en la Tabla I.
55
56
Figura 20. Expresión de Gas1 en neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas en el
cerebelo. (A) Inmunohistoquímica para la proteína Gas1 (verde) en el cerebelo. (B) Gas1
está presente en el soma de las neuronas GABAérgicas (GAD67+: rojas) incluyendo: (D)
células de canasta de la capa molecular, (E), de Purkinje y (F) de Golgi de la capa granular.
Las células indicadas con flecha, punta de flecha y punta de flecha vacía en B se amplifican
en D, E y F, respectivamente. (C y G) Baja inmunorreactividad a Gas1 se observa en las
células glutamatérgicas (VGLUT2+: rojo) de la capa granular, indicado por la punta de
flecha. (C y H) En la capa molecular Gas1 se observan como pequeñas manchas que
forman estructuras similares a los procesos, indicadas por una flecha. Sin embargo, estos
procesos no co-localizan con las fibras trepadoras (VGLUT2+), indicadas por la punta de
flecha. (A-C) En el WM, no observamos inmunorreactividad para Gas1. Los insertos
superior e inferior se amplifican en G y H, respectivamente. Los núcleos se tiñeron con
DAPI (azul). Barra: (A) 200 μm, (B y C) 100 μm, (D-H) 10 μm. Las abreviaturas se
exponen en la Tabla I.
.
Figura 21. Gas1 se expresa en las neuronas glutamatérgicas del núcleo fastigial pero
no en los terminales axonales de las células de Purkinje. (A-B) Gas1 no está presente en
las terminales GABAérgicas de las neuronas de Purkinje (GAD67 +). (D y E) Gas1 (verde)
está presente en el soma de las neuronas glutamatérgicas (VGLUT2 +: rojo) del núcleo
fastigial. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las células indicadas con la flecha en A y
D, se amplifican en B y D, respectivamente. Barra: (A y D) 100 μm, (B - E) 10 μm. C y F
muestran las áreas examinadas. Las abreviaturas se exponen en la Tabla I.
57
6.6 La capa de células Purkinje-molecular presenta altos niveles de Gas1 mientras
que la capa de células granulares del cerebelo tiene bajos niveles
El análisis inmunohistoquímico reveló que en el cerebelo Gas1 se expresa en neuronas
GABAérgicas (presentes en la capa molecular y en células de Pukinje) pero es casi
indetectable en neuronas glutamatérgicas (células granulares). Para confirmar estos
resultados, se disectaron la capa de células granulares y la de Purkinje-molecular del
cerebelo de ratones CD1 adultos, para analizar la presencia de mRNA por PCR de punto
final y los niveles de proteína por ELISA. Como control se utilizaron células NIH/3T3 las
cuales solo expresaron Gas1 cuando se cultivaron con baja concentración de SFB (Fig. 22).
En la figura 22A se muestra la presencia del producto de PCR de gas1 en células NIH/3T3
crecidas con bajo SFB, en cerebelo completo y en la capa de células Purkinje-molecular
después de 35 ciclos de amplificación. Sin embargo, no se detectó gas1 en células NIH/3T3
en proliferación ni en la capa de células granulares del cerebelo.
Figura 22. Gas1 no se expresa en la capa de células granulares pero si en la capa de
células Purkinje-molecular del cerebelo. (A) Amplificación del mRNA de gas1 por RT-
PCR y (B) niveles de proteína Gas1 en células NIH/3T3 en proliferación (NP), NIH/3T3
cultivadas con bajo suero por 24h (N24), Cb: cerebelo; Gra: capa de células granulares y
Pur-Mol: capa de células de Purkinje-Molecular por ELISA. B (-): reacción sin sDNA. Los
datos se muestran como la media +SEM, n=3 por grupo; *P < 0.05 and *** P < 0.001.
Con respecto a los niveles de proteína Gas1, encontramos bajos niveles en la capa
de células granulares comparados con la capa de células Purkinje-molecular (Fig. 22 B). Es
de señalar que no se observa el producto de PCR de gas1 en la capa de células granulares,
sin embargo, se detectó proteína por ELISA (Fig. 22 A y B; Gra). Probablemente la
58
resolución de gel no es adecuada para detectar niveles tan bajos del mensajero y que solo
fueron observados por ELISA o bien dichos niveles proteicos de Gas1 corresponden a la
forma soluble de Gas1 liberada por las neuronas de Purkinje. Debido a lo anterior se
decidió medir los niveles de Gas1 en el extracto total de cultivos primarios.
6.7 Gas1 es secretado por neuronas de Purkinje y del hipocampo pero no de
células granulares del cerebelo
Como previamente se comentó, se ha reportado que Gas1 se libera de las células
mesangiales y NIH/3T3 [7, 143]. Por lo tanto, el siguiente objetivo fue determinar si las
neuronas expresan y liberan Gas1, para ello se realizaron cultivos primarios de neuronas del
hipocampo, de Purkinje y granulares del cerebelo. Los cultivos primarios se caracterizaron
morfológicamente y como se observa en la figura 23, en los cultivos primarios tanto las
células del hipocampo (Fig. 23 A) como las células granulares (Fig. 23B) presentan una
morfología alargada y procesos que hacen contactos con células adyacentes, mientras que
las células de Purkinje formaron un árbol dendrítico alrededor del cuerpo celular (Fig. 23 C
y D).
Figura 23. Imágenes de campo claro de los cultivos primarios de células del (A)
Hipocampo, (B) granulares y (C-D) de Purkinje del cerebelo. A-C 40X y D 100X.
59
Para corroborar que los medios de cultivo utilizados generaban dicha morfología
neuronal (Fig. 23), se cultivaron astrocitos en DMEM HG alta glucosa. Inicialmente, en
este cultivo (sin subcultivo es decir en pasaje 0) se observaron dos morfologías celulares
preponderantes, las células marcadas con una flecha en negro tienen un forma semiepitelial
no refringente (Fig. 24 A), y la segunda población celular marcada con una fecha azul
presenta una morfología estrellada con cuerpo celular pequeño y procesos ramificados
radiales (Fig. 24 B). Estos datos sugieren que es una mezcla de oligondendrocitos y
astrocitos. En el subcultivo 2 se observó una disminución de la población con abundante
procesos ramificados radiales. Posteriormente se detectó la presencia de GFAP como
marcador de células gliales, encontrando que el 98% de están células fueron positivas (Fig.
24 B-C).
Figura 24. Cultivo primario de astrocitos. (A) Imagen de campo claro de cultivo
primario de atrocitos. Imnunocitoquímica para la detección de la proteína GFAP. (B)
control negativo (incubación sin anticuerpo primario), (C) cultivo de astrocitos positivos a
GFAP. A-C 40X.
Por otro lado, se determinó la pureza del cultivo primario de neuronas del
hipocampo, granulares y de Purkinje. Para identificar neuronas se empleó un anticuerpo
que reconoce a la proteína NeuN, y para identificar células astrogliales un anticuerpo anti-
GFAP (Fig. 25). Los resultados mostraron que aproximadamente el 85% de la células
fueron positivas a NeuN, el 10% a GFAP y el 5% negativas a NeuN y GFAP.
Una vez caracterizados los cultivos primarios, a continuación se mideron los niveles
de Gas1, tanto el extracto celular como en el medio condicionado, es decir el medio de
cultivo donde crecieron dichas células. Como control de la expresión de Gas1 se usaron a
las líneas celulares de neuroblastoma de ratón N1E115 y las células SH-SY5Y derivadas de
60
un neuroblastoma humano, ambas se diferenciaron por 5d con 10 μM de AR, ya que en
estas condiciones adquieren un fenotipo neuronal más definido. Los resultados muestran
que Gas1 es expresado (Fig. 26 A) y liberado (Fig. 26 B) de las células N1E115, SH-
SY5Y, de Purkinje y del hipocampo pero no de las células granulares del cerebelo. Los
datos de Gas1 en el extracto celular se muestran en pg/μg de proteína y en el medio
condicionado como Gas1 soluble en ng/mL. Por otra parte, con estos datos sugerimos que
los niveles de Gas1 encontrados en la capa de células granulares por ELISA
(microdisección; Fig. 22 B), quizás corresponden al Gas1 liberado de las células de
Purkinje (Fig. 26 B).
Figura 25. Cultivo primario de neuronas del hipocampo. (A) Imnunocitoquímica para la
detección de la proteína NeuN. (B) y para GFAP. Núcleos teñidos con DAPI. A-B 20X
Figura 26. Gas1 se expresa y libera de cultivo primario de neuronas y de líneas
celulares de neuroblastoma diferenciadas con AR. (A) Niveles de Gas1 en el extracto
celular y (B) medio condicionado de cultivo primario de hipocampo, de células granulares
y Purkinje del cerebelo así como de las líneas celulares: SH-SY5Y y N1E115 ambas
diferenciadas con AR. Los datos se muestran como la media +SEM, n=3 por grupo, *** P
< 0.001.
61
6.8 Los niveles de Gas1 se incrementa durante el proceso de diferenciación de la
células SH-SY5Y inducida con AR
Durante el desarrollo embrionario y posnatal, el AR es el principal inductor de la
diferenciación neuronal el cual inhibe la proliferación celular, induce la formación de
neuritas y la expresión de proteínas características de neuronas maduras [1, 71, 114]. En
este contexto, usando microensayos se he demostrado que gas1 podría ser un gen de
respuesta al AR, ya que este último induce la expresión de gas1 en células de la cresta
neural y presumiblemente en células SH-SY5Y [27, 150]. Por lo tanto, y considerando que
Gas1 es liberado de las SH-SY5Y diferenciadas con AR (Fig. 23 B), se analizaron los
niveles de Gas1 durante la diferenciación neuronal, ya que es un excelente modelo de
estudio in vitro de la diferenciación dopaminérgica [22, 29]. Además, previamente se
demostraron los efectos neurotóxicos del Hg usando este modelo [25].
Figura 27. Los niveles de Gas1 se incrementa durante la diferenciación de las células
SH-SY5Y inducida por AR. (A) Expresión de Gas1 y β-actina en células SH-SY5Y
diferenciadas con AR (B) La gráfica muestra el análisis densitométrico para Gas1 después
de la normalización con β-actina. W24h: células SH-SY5Y cultivadas con bajo SFB, Pro:
células SH-SY5Y cultivadas con 20% de SFB, RA; ácido retinoico. Los datos se muestran
como la media +SEM, n=3 por grupo; *P < 0.05 and *** P < 0.001.
Como reportes previos lo muestran, en este trabajo se estimó la diferenciación por la
presencia de procesos parecidos a neuritas [22, 29]. Como control, usamos células SH-
SY5Y cultivadas con bajo SFB (0.5%) o con 20% de SFB por 24 h (Fig. 27). Por otro lado,
expusimos a las células SH-SY5Y a 10μM de AR durante 1, 3, 7 y 14 d para
posteriormente detectar a Gas1 por western blot. El análisis densitométrico muestra que los
62
niveles de Gas1 se incrementa gradualmente a medida que el tratamiento con AR progresa
(Fig. 27), estos datos son consistentes con lo reportado por Chapuis et al., [26].
6.9 El silenciamiento de Gas1 disminuye la formación de neuritas inducidas por el
AR en células SH-SY5Y
La formación de procesos parecidos a neuritas y el incremento de los niveles de TH son
considerados indicadores de diferenciación dopaminérgica de las células SH-SY5Y
inducido por el AR [22, 29]. Por lo tanto, para determinar el papel de Gas1 en el proceso
de diferenciación, contamos el número de neuritas formadas en las células SH-SY5Y
después de 7 d de tratamiento con 10 μM de AR (Fig. 28). Las neuritas se marcaron
empleando un anticuerpo contra tubulina βIII (Fig. 28 A).
Como se observa en la figura 28, las células SH-SY5Y en proliferación, es decir,
cultivadas en ausencia de AR y con 10% de SFB, presentan escasas neuritas comparadas
con las células tratadas durante 7 d con 10μM de AR (Fig. 28). Para determinar los efectos
de Gas1 sobre la formación de neuritas, incubamos células SH ANT Gas1 las cuales no
expresan Gas1 [155], con 10μM de AR durante 7 d. En la figura 28 se muestra que el
silenciamiento de Gas1 produjo una disminución del 50% en el número de neuritas
formadas con respeto a las células SH-SY5Y (Fig. 28).
Considerando que las células SH-SY5Y y las neuronas (cultivo primario) liberan
Gas1, se estudió si Gas1 soluble (recombinante y carente del ancla GPI) podía revertir el
efecto del silenciamiento de Gas1. Por lo tanto, células SH ANT Gas1 se incubaron con 0.1
ng/mL de Gas1 y 10μM de AR por 7 d. Los datos muestran que Gas1 soluble recombinante
rescató la formación de neuritas en las células SH ANT Gas1 (Fig. 28). Cabe mencionar
que la concentración de Gas1 utilizada no tuvo efecto sobre la viabilidad celular medida
por el ensayo de MTT (Fig. 29 C). Con base en los datos obtenidos sugerimos que Gas1
ejerce diferentes efectos dependiendo de la concentración, ya que un trabajo paralelo en el
laboratorio ha demostrado que una concentración de Gas1 300 veces mayor a la utilizada
en este trabajo induce apoptosis en células SH-SY5Y (Sánchez et al., datos no publicados).
63
Figura 28. Gas1 promueve el crecimiento neurítico. (A) Tinción de neuritas con tubulina
β-III en células SH-SY5Y y en células SH-ANT Gas1 las cuales expresan una secuencia
antisentido para Gas1 (B) La gráfica muestra el número de neuritas por célula observadas
en A. Los datos se muestran como la media + SEM, n=3 por grupo; *P < 0.05 y *** P <
0.001.
6.10 Gas1 soluble induce la formación de neuritas a través de la inhibición de GSK3β
Por otro parte, se ha reportado ampliamente que la fosforilación en la serina 9 (pSer9-
GSK3β) de GSK3β inhibe su actividad y que la fosforilación en la tirosina 216 (pTyr216-
GSK3β) induce su activación [21]. Con relación a la diferenciación neuronal, diversos
reportes muestran que el AR promueve la formación de neuritas a través de la pSer9-
GSK3β sin afectar la pTyr216-GSK3β en células SH-SY5Y [29, 106, 107, 109]. Con base
en lo anterior se evaluó el efecto de Gas1 sobre la pSer9-GSK3β y GSK3β total. Se trataron
B
A
64
células SH-SY5Y durante 3d con AR, para después agregar al medio 0.05, 0.1 y 0.15
ng/mL de Gas1 por 24 h (Fig. 29 A). En las figuras 29A y B, se observa que Gas1 aumentó
la fosforilación de GSK3β en la serina 9 indicando que por esta vía Gas1 promueve la
formación de neuritas. Asimismo, usando la técnica de MTT se mostró que las
concentraciones de Gas1 recombinante usadas no tuvieron efecto sobre la vialidad de las
células SH-SY5Y diferenciadas con 10 μM de AR por 7d (Fig. 29 C).
Figura 29. Gas1 recombinante inhibe a GSK3β en células SH-SY5Y. Las células fueron
tratadas con 10μM de AR durante tres d, posteriormente fueron incubadas con diferentes
concentraciones de Gas1. (A) Se muestra un western blot representativo de la
determinación de la expresión de pSer9-GSK3β y GSK3β total (B) Análisis densitométrico
de pSer9-GSK3β después de la normalización con GSK3β total. (C) Las gráfica muestra
que las concentraciones de Gas1 usadas en este experimento no tuvieron efecto sobre la
viabilidad de las células SH-SY5Y diferenciadas con AR. Los datos se muestran como la
media +SEM, n=3 por grupo; *P < 0.05 y ** P < 0.01.
6.11 Gas1 aumenta los niveles de TH en células SH-SY5Y diferenciadas con AR y se
expresa en células dopaminérgicas de la SNpc
Diversos reportes muestran que la inhibición de GSK3β promueve la diferenciación
neuronal dopaminérgica, incluso inhibidores de GKS3β son incorporados rutinariamente
para inducir la diferenciación dopaminérgica de células madre embrionarias (ESCs) y de
células pluripotentes inducidas (iPSCs) [19, 88]. Asimismo, se ha reportado que el AR
induce la diferenciación dopaminérgica de las células SH-SY5Y, desarrollando un fenotipo
neuronal predominantemente dopaminérgico y suprimiendo el perfil de expresión proteico
de otros fenotipos neuronales [77]. Por consiguiente, se midieron los niveles de TH, en
células SH-SY5Y tratadas con diferentes concentraciones de Gas1 y 10μM de AR (Fig.
30).
65
Figura 30. Gas1 aumenta los niveles de TH en células SH-SY5Y y se expresa en
neuronas dopaminérgicas de la SNpc. Las células SH-SY5Y fueron tratadas con 10μM
de AR durante tres d y posteriormente fueron incubadas con diferentes concentraciones de
Gas1. (A) Se muestra un western blot representativo de la determinación de la expresión de
TH y β-actina (B) La gráfica muestra el análisis densitométrico de los niveles de TH
después de la normalización con β-actina. (C) Inmuhistofluorecencia para Gas1 (verde) y
TH (roja) en neuronas dopaminérgicas de la SNpc de ratones CD-1 de 8 semanas de edad
Núcleos teñidos con DAPI. Barra: 100μm. Los datos se muestran como la media +SEM,
n=3 por grupo; *P < 0.05, ** P < 0.01 y ***P < 0.001.
Los datos muestran que Gas1 incrementó los niveles de TH de forma concentración
dependiente (Fig. 30 B). Dado los resultados anteriores, por inmunofluorecencia
detectamos la expresión de Gas1 en neuronas dopaminérgicas (TH+) de la SNpc de ratones
CD1 de 8 semanas de edad. La microfotografía de la figura 30C muestra células
66
inmunorreactivas a TH y Gas1; sin embargo, también se observan células únicamente
inmunorreactivas a TH o a Gas1 (Fig. 30 C).
6.12 El promotor de gas1 en humano, ratón y rata presenta sitios RARE y
TCF/LEF
Hasta el momento los resultados muestran que los niveles de Gas1 incrementan en células
SH-SY5Y diferenciadas con AR, en las cuales promueve la formación de neuritas e
incrementa los niveles de TH, sin embargo se desconoce cual es la relación entre Gas1 y el
AR. Desde el punto de vista de regulación de la transcripción, se ha reportado que el AR
induce la expresión de gas1 en células de la cresta neural [150], células de carcinoma
embrionario F9 [139] y en células de neuroblastoma SH-SY5Y [26]. Por otro lado, se sabe
que los efectos genómicos del AR son mediados por sus receptores RXR y RAR que se
unen a secuencias RARE las cuales son secuencias consenso 5’-[A/T]G[G/T]TCA-3´
presentes en los promotores proximales o distales de diversos genes.
Figura 31. Predicción de sitios RARE y TCF/LEF en el promotor de gas1 humano y
de ratón. Los cuadros pequeños indican los posibles sitios (A) RAREs o (B) TCF/LEF
localizados en la cadena sentido (cuadros pequeños superiores) o antisentido (cuadros
inferirores) de gas1 de humano o de ratón. La fecha negra indica el inicio de la secuencia
de la región codificante.
67
Aunado a lo a anterior, en este trabajo se muestra que los niveles de Gas1 se
incrementa durante diferenciación de las células SH-SY5Y inducida por el AR. Por lo
tanto, este dato apoya la idea de que gas1 es un probable gen de respuesra a los efectos del
AR, sin embargo no se ha comprobado si el promotor de Gas1 contiene secuencias RARE.
Debido a lo anterior se obtuvieron las secuencias genómicas de los promotores de gas1
humano como en el de ratón de la base de datos GenBank.
Utilizando el programa MatInspectorprofesional de Genomatix
(https://www.qiagenbioinformatics.com/) se identificó la presencia de secuencias RAREs
tanto en el promotor de gas1 de humano como de ratón. El análisis abarcó 4250 pb río
arriba del ATG y 750 pbs río abajo. Dado los resultados anteriores es probable que gas1 sea
regulado transcripcionalmente por el AR, sin embargo, se sugiere un estudio más detallado.
Desde otro punto de vista, quizás el AR al inducir la expresión de proteínas WNT genere a
su vez la expresión de gas1, ya que se ha reportado que WNT induce la expresión de gas1
en las somitas [83]. Por lo tanto, ésta regulación podría producirse de la siguiente manera:
una vez que el AR induzca la expresión de WNT1 este a su vez producirá la translocación
al núcleo de β-catenina la cual podría unirse a sitios responsivos TCF/LEF y así regular
transcripcionalmente a gas1. Suponiendo lo anterior se realizó la búsqueda de sitios
TCF/LEF en los promotores de gas1 humano y de ratón. La figura 31 B muestra que ambos
promotores de gas1 presentan 13 sitios TCF/LEF rio arriba de la región codificante.
6.13 Búsqueda de los motivos funcionales de Gas1
Con la finalidad de demostrar una relación entre Gas1 y sus diferentes efectos sobre la
diferenciación neuronal se realizó la búsqueda de motivos funcionales en la proteína
Gas1de humano y de ratón. Para ello se utilizaron los servidores InterPro
(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search), EML (http://elm.eu.org/) y
Minimotif Miner (http://mnm.engr.uconn.edu/MNM/SMSSearchServlet). En la figura 32 y
tabla 2 se muestran los motivos encontrados, la secuencia detectada, función y
localización celular.
68
DOMINIOS SECUENCIA COMPARTIMIENTO CELULAR
Sitio de incisión de las caspasas 3 y
7
SGSDG Citoplasma
Nnúcleo
N-Arg di-básica convertasa (NRD /
Nardilysin)
RRL
RRS
Extracelular,
Aparato de Golgi
Superficie celular
Sitio de reconocimiento por la
ciclina D
RRLI Citoplasma, Núcleo
Variante de motivo de unión a
dominio de MATH de USP7 basada
en las interacciones MDM2 y p53
PLASI
PRTSG
PGSSG
AAASG
Núcleo
Motivo que media la interacción
entre Notch y el factor de
transcripción CLS
AWTP Forma complejos con factores de
transcripción: cromatina y núcleo
Motivo de unión a receptores
nucleares
ILLLLLG Núcleo
Motivo RGD para interacción con
proteínas de matriz extracelular
como integrinas
RGD Extracelular
Motivos reconocido por proteínas
con dominios SH3 de clase I y II
PYGPGR
DDGVPHP
DGVPHPP
VPHPPRP
GDLPYGP
Citoplasma
Membrana plasmática
Adhesión focal
Motivo de unión no covalente a
SUMO
SILLLLL Núcleo
Sitio de fosforilación por CK1 SSGSDGG Aparato de Golgi,
Orgánulos secretores
Extracelular
Sitio de reconocimiento de
fosforilación en GSK3β
PRTSGGG
GRRSSGG
Citoplasma, Núcleo
Sitio de fosforilacion por PKA RRSSGGG Citoplasma, Núcleo
Complejo proteico dependiente de
AMPc
Sitio de cinasa tales como
p38MAPK
GAWTPLA Citoplasma
Motivo de retención en el retículo
endoplásmico (RE)
RRL Membrana del retículo endoplásmico
Membranas de las vesículas en el
transporte vesicular Golgi- RE
Tabla 2. Dominios detectados en Gas1 de humano y de ratón
69
Figura 32. Alineamiento múltiple de las secuencias proteicas de Gas1 de humano y de
ratón usando Clustal O y los motivos encontrados con los servidores InterPro, EML y
Minimotif Miner. Los motivos, secuencias detectadas y localización celular se muestran
en la tabla 2. Adicionalmente se muestran algunas modificaciones postraduccionales como
el péptido señal y la modificación lipídica (obtenidas de la base de datos: uniProt) tanto en
la secuencia de humano como en la de ratón.
70
6.14 Determinación de la concentración efectiva 50 de 6-OHDA.
Considerando que Gas1 aumentó los niveles de TH y se expresa en las neuronas
dopaminérgicas de la SNpc, el siguiente objetivo fue evaluar el posible efecto
neuroprotector de Gas1 ante el daño inducido por la 6-OHDA, un neurotóxico utilizado
como modelo experimental de la enfermedad de Parkinson. Para ello primero
determinamos la concentración de 6-OHDA a utilizar en los experimentos. Se trataron
células SH-SY5Y en proliferación, SH-SY5Y diferenciadas durante 4 y 7d con AR y
células SH ANT Gas1 (las cuales no expresan Gas1 bajo ninguna condición) con diferentes
concentraciones de 6-OHDA durante 24 h. Posteriormente se cuantificó el porcentaje de
células viables por la técnica de azul de tripano
Figura 33. Efecto de diferentes concentraciones de 6-OHDA sobre la viabilidad de las
células SH-SY5Y en proliferación, SH-SY5Y diferenciadas durante 4 y 7 d con AR y
células SH ANT Gas1 tratadas por 7 d con AR. Las líneas celulares fueron tratadas con
diferentes concentraciones de 6-OHDA durante 24 h, posteriormente se cuantificó el
porcentaje de células viables por la técnica de azul de tripano. (A) Curvas dosis respuesta
(B) Dosis efectiva 50. Los datos se muestran como la media + SEM, n=3 por grupo; *P <
0.05, **P < 0.01 y *** P < 0.001.
71
La figura 33A muestra las curvas dosis respuesta de la viabilidad celular con respecto
a la concentración de 6-OHDA. De estos datos se calculó la dosis efectiva 50 de cada línea
celular, es decir, la concentración de 6-OHDA que induce la pérdida del 50% de células
viables (Fig. 33B). Los resultados muestran que las células SH-SY5Y no diferenciadas son
más susceptibles al daño producido por la 6-OHDA con respecto a las células SH-SY5Y
diferenciadas durante 4 y 7d con 10 μM de AR (Fig. 33). Cabe señalar que las células SH-
SY5Y diferenciadas expresan Gas1 mientras que las células SH-SY5Y en proliferación no
lo expresan. Debido a ello incubamos células SH ANT Gas1, las cuales no expresan Gas1
con diferentes concentraciones de 6-OHDA. Interesantemente, los resultados muestran que
la ausencia de Gas1 genera una mayor susceptibilidad a la 6-OHDA con respecto a todos
los grupos (Fig. 33), indicando que la presencia de Gas1 genera un efecto neuroprotector.
Con base en los resultados anteriores se decidió utilizar 80 μM de 6-OHDA para los
subsecuentes experimentos en células diferenciadas con AR.
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
*
C /S C /S S /S S /S N M D A N M D A G L U G L U
*
*a
S H -S Y 5 Y
S H A N T G a s 1
b
Ce
ll v
iab
ilit
y (
%)
Figura 33. Viabilidad de las células SH-SY5Y y SH ANT Gas1 en proliferación (C/S),
cultivadas en ausencia de suero (S/S), tratadas con 5mM de NMDA o 10mM de
glutamato por 24h. El porcentaje de células viables se obtuvo por la técnica de azul de
tripano. Células SH-SY5Y cultivadas en presencia (C/S) y ausencia (S/S) de suero por 24h.
Los datos se muestran como la media +SEM, n=3 por grupo; *P < 0.05; a ***P < 0.001
indica la diferencia con respecto a los grupos SH-SY5Y S/S, SH-SY5Y y SH ANT Gas1
tratados con NMDA o GLU. b ***P < 0.01 indica la diferencia con respecto a los grupos
SH-SY5Y S/S, SH-SY5Y y SH ANT Gas1 tratados con NMDA o GLU.
72
En paralelo, para corroborar el efecto neuroprotector de Gas1 se trataron células SH-
SY5Y y SH ANT Gas1 con 5mM de NMDA, 10mM de glutamato (GLU) o se cultivaron
con 0.5% de suero por 24h con la finalidad de inducir un efecto excitotóxico. Esto basado
en estudios previos que muestran un efecto pro-apoptótico de Gas1 en células SH-SY5Y
privadas suero [155] y en cultivos corticohipocampales tratados como NMDA [104]. En la
figura 34 se observa que el porcentaje de células viables de los diferentes grupos
experimentales, el cual fue obtenido por la técnica de azul de tripano. Los resultados
muestran que en ausencia de suero, el tratamiento con 5mM de NMDA o 10mM de
glutamato por 24 h disminuye la viabilidad de las células SH-SY5Y (Fig. 33).
Interesantemente, la ausencia de Gas1 en las células SH ANT Gas1 protegió de la muerte
celular inducida por la ausencia de suero o de los efectos excitotóxicos (Fig. 33). Estos
datos concuerdan con lo reportado previamente [104, 155].
6.15 Desarrollo y caracterización de las células SH GAS1
Una vez validados los resultados el siguiente objetivo fue determinar la cascada de
señalización que induce Gas1 ante el daño producido por la 6-OHDA. El número de células
SH ANT Gas1 que se obtienen después del tratamiento con 6-OHDA es bajo, por lo tanto
se optó por el desarrollo de una línea celular estable SH GAS1 la cual expresa Gas1 de
forma regulable a través de un sistema de expresión TET-ON.
En el sistema TET-ON la expresión de Gas1 está regulada por un promotor que
responde a la tetraciclina. Las células SH-SY5Y fueron co-infectadas con lentivirus que
contenían la secuencia de expresión para un elemento represor (TetR), lentivirus con la
secuencia de Gas1 bajo el control transcripcional de CMV y lentivirus con expresión
regulable de la GFP (proteína verde fluorecente). En este sistema el TetR se une a una
secuencia del DNA conocida como elemento de respuesta a la tetraciclina, presente en el
promotor, de esta manera se impide la transcripción del transgen. La adición de tetraciclina
produce un cambio conformacional en el TetR produciendo su liberación del promotor y
permitiendo la expresión de Gas1 (Fig 34 A). La línea estable SH GAS1 fue seleccionada
con blasticidina y zeocina, para posteriormente ser caracterizada. Para comprobar que
efectivamente el sistema TET-ON estaba actuando, las células SH GAS1 se trataron con 0,
0.25, 0.05, 1, y 2 μg/mL de tetraciclina por 24 h y posteriormente se determinó la expresión
73
de Gas1 por western blot (Fig. 34 B). Como mencionamos estas células también expresan
de forma regulable a la GFP (Fig. 34 C). Como se muestra en la figura 34 B-C la expresión
de Gas1 es inducida por la adición de tetraciclina de forma concentración dependiente.
Dicho efecto fue corroborado por inmunofluorescencia para Gas1, la figura 34C muestra en
rojo a Gas1 y en verde a GFP únicamente en presencia de tetraciclina.
Figura 34. Caracterización del sistema de expresión regulable de Gas1. (A) Sistema
TET-ON: El elemento represor (TetR) se encuentra constitutivamente unido a la región
promotora regulada por tetraciclina (TetO), de esta forma se impide la transcripción de
Gas1, la adición de tetraciclina genera un cambio conformacional en el elemento represor
liberando su unión al DNA y por ende permitiendo la transcripción de Gas1. (B) Se muestra
un western blot representativo de la determinación de la expresión de Gas1 y β-actina
usando diferentes concentraciones de tetraciclina en células SH-SY5Y. (C)
Inmunofluorecencia para Gas1 (rojo), adicionalmente en verde se muestra la expresión de
GFP, los experimentos fueron realizados en presencia y ausencia de 2 μg/mL de
tetraciclina. El control es en ausencia de anticuerpo primario pero en presencia de
tetraciclina (S/AS). Los núcleos fueron teñidos con DAPI. A. Modificado de:
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trexsystem_man.pdf
74
6.16 Gas1 promueve la supervivencia celular en la línea SH-SY5Y tratadas con 6-
OHDA y diferenciada con AR
Para determinar el efecto de Gas1 sobre la neurotoxicidad inducida por la 6-OHDA, las
células SH-SY5Y, SH ANT GAS1 y SH-GAS1 se incubaron con 10μM de AR por 7 d.
Posteriormente se trataron en presencia o en ausencia de 80μM de 6-OHDA por 24 h (Fig.
35A). Por otro lado, 24h antes del tratamiento con la 6-OHDA se indujo la expresión de
Gas1 en las células SH-GAS1 con 2μg/mL de tetraciclina (Fig. 35A). Terminado el
tratamiento con 6-OHDA se midió la viabilidad celular por la técnica de azul de tripano.
Los datos muestran que la 6-OHDA disminuyó el porcentaje de células viables
aproximadamente en un 50 % con respecto al control (Fig. 35 B). La sobreexpresión de
Gas1 en las células SH-GAS1 atenuó la perdida de la viabilidad inducida por la 6-OHDA y
contrariamente la ausencia de Gas1 en las células SH-ANT GAS1 indujo una drástica
perdida de la viabilidad celular con respecto a los grupos control y al tratado con 6-OHDA
(Fig. 35 B).
Figura 35. Efecto de Gas1 sobre la viabilidad de células SH-SY5Y, SH GAS1 y SH
ANT GAS1 diferenciadas con AR y tratadas con 6-OHDA. (A) Las células SH-SY5Y
fueron tratadas con AR por 8 d para inducir su estado diferenciado. Al séptimo día las
células se trataron con 80μM de 6-OHDA. Por otro lado, 24h antes del tratamiento con la 6-
OHDA se indujo la expresión de Gas1 en las células SH-GAS1 con 2 μg/mL de tetraciclina
(B) Viabilidad celular en las líneas celulares SH-SY5Y, SH-GAS1 y ANT-GAS1 tratadas
con 6-OHDA. Los datos se muestran como la media +SEM, n=3 por grupo; *P < 0.05 y
***P < 0.001. . a: **SH control vs SHGAS1(6-OHDA+Gas1); b: ***SH-SY5Y(6-OHDA)
vs SHGAS1; c: ***SH control vs ANTGAS1; d and e***: SH6OHDA vs SHANT and
SHANT 6OHDA; f:***SHGAS1 vs ANT6OHDA; g and h: ***SHGAS16OHDA vs ANT
and ANT 6OHDA.
75
6.17 Gas1 promueve la supervivencia celular a través de la inhibición de GSK3β e
incremento de β-catenina total
Diversos estudios muestran que la inhibición de GSK3β, y por ende la estabilización de β-
catenina en el núcleo y en el citoplasma, protegen del daño inducido por la 6-OHDA [28,
76, 115]. Por tanto, el siguiente objetivo fue determinar los niveles de pSer9-GSK3β y de la
β-catenina en las células SH-SY5Y y SH-GAS1 después del tratamiento con 6-OHDA. Los
resultados muestran que la 6-OHDA disminuyó los niveles de pSer9-GSK3β (Fig. 36),
mientras que la sobreexpresión de Gas1 en presencia de 6-OHDA mantuvo los niveles de
pSer9-GSK3β con respecto a todos los grupos experimentales incluido el grupo tratado con
6-OHDA (Fig. 36A-B).
Figura 36. Efecto de Gas1 sobre los niveles de GSK3β y β-catenina en las células SH-
SY5Y y SH GAS1 diferenciadas con AR control y tratadas con 80μM de 6-OHDA. (A)
Se muestra un western blot representativo de la determinación de la expresión de pSer9-
GSK3β, GSK3β total, β-catenina y β-actina. (B) La gráfica muestra el análisis
densitométrico de pSer9-GSK3β después de la normalización con GSK3β total y de (C) β-
catenina después de la normalización con β-actina. Los datos se muestran como la media +
SEM, n=3 por grupo; *P < 0.05, **P < 0.01 y ***P < 0.001.
76
Por otro parte, la 6-OHDA no disminuyó de forma significativa los niveles de β-catenina
total (Fig. 36), sin embargo, la sobreexpresión de Gas1 en las células SH GAS1 aumento
los niveles de β-catenina por arriba del control. Asimismo los niveles de β-catenina se
incrementaron por la sobreexpresión de Gas1 en las células SH GAS1 tratadas con 6-
OHDA (Fig. 36 A y C).
6.18 Gas1 incrementa los niveles de tirosina hidroxilasa
El siguiente objetivo fue analizar los niveles de TH en las células SH-SY5Y y SH GAS1
ambas tratadas en presencia o ausencia de 80μM de 6-OHDA. Los resultados muestran que
la 6-OHDA disminuyó aproximadamente en un 50% los niveles de TH en las células SH-
SY5Y con respecto a las células SH-SY5Y control (Fig. 37). Por otro lado, la
sobreexpresión de Gas1 en las células SH GAS1 incrementó los niveles de TH de forma
significativa con respecto al control (Fig. 37), de esta manera la sobreexpresión de Gas1
atenuó la pérdida de los niveles de TH que induce la 6-OHDA (Fig. 37).
.
Figura 37. Efecto de Gas1 sobre los niveles de TH en las células SH-SY5Y y SH GAS1
ambas diferenciadas con AR control y tratadas con 80μM de 6-OHDA. (A) Se muestra
un western blot representativo de la determinación de la expresión de TH y β-actina. (B) La
gráfica muestra el análisis densitométrico de TH después de la normalización con β-actina.
Los datos representan la media + SEM, n=3 por grupo; **P < 0.01 y ***P < 0.001.
77
6.19 Gas1 incrementa los niveles de superóxido dismutasa 1 (SOD1) en células SH-
SY5Y diferenciadas y tratadas con 6-OHDA
Diversos estudios demuestran que la 6-OHDA al inhibir los complejos I y II mitocondriales
incrementa los niveles de anión superóxido el cual es rápidamente degradado por la enzima
superóxido dismutasa (SOD) para producir H2O2 y O2 (Fig. 38 A) [37, 69]. Los resultados
muestran que la 6-OHDA disminuyó los niveles de SOD1, mientras que la sobreexpresión
de Gas1 no generó cambios significativos. Sin embargo, la sobreexpresión de Gas1 en
presencia de 6-OHDA atenuó la disminución de los niveles de SOD1 (Fig. 38B-C).
Figura 38. Efecto de la sobreexpresión de Gas1 sobre los niveles de SOD1 en células
SH-SY5Y y SH GAS1 control y tratadas con 80μM de 6-OHDA. (A) Mecanismo de
acción de enzimas antioxidantes que conllevan a la disminución de las especies reactivas de
oxígeno (ROS). Al inhibir los complejos I y II mitocondriales la 6-OHDA incrementa los
niveles de anión superóxido (O2•) el cual es rápidamente degradado por la enzima
superóxido dismutasa (SOD) para producir peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno
molecular (O2). A partir de estos productos, el hierro potencia la producción de ROS al
promover la formación de hidroxilo (OH) y radicales hidroxilo (OH-) a través de la
reacción de Fenton. Por otra parte, el hierro también cataliza la reacción de Haber-Weiss,
que utiliza Fe3+ de la reacción de Fenton y produce O2, radical hidroxilo e hidróxilo. El
H2O2 puede convertirse en H2O a través de la acción de la catalasa y la glutatión peroxidasa
(GPX). (B) Se muestra un western blot representativo de la determinación de la expresión
de SOD1 y β-actina. (C) Análisis densitométrico de SOD1 después de la normalización
con β-actina. Los datos se muestran como la media + SEM, n=3 por grupo; *P < 0.05.
78
6.20 Efecto de Gas1sobre la producción de óxido nítrico
La 6-OHDA además de inducir la producción ROS también genera especies reactivas de
nitrógeno (RNS), así que se cuantificaron los niveles de NO a través del reactivo de Griess.
El NO es una RNS producida por las sintasas del NO (inducible y neuronal: iNOS e nNOS,
respectivamente) a partir de L-arginina y O2 (Fig. 39A). A su vez el NO genera una
segunda especie conocida como peroxinitrito, el cual es un agente oxidante y nitrante de
proteínas y DNA (Fig. 39 A). Los datos muestran que los niveles de NO se incrementaron
en aproximadamente un 200% en las células tratadas con 6-OHDA comparadas con el
control (Fig. 27). Por otra parte la sobreexpresión de Gas1 en las células SH GAS1
incrementó los niveles de NO en aproximadamente un 50% con respecto al control, pero
dichos niveles son inferiores a los producidos por la 6-OHDA (Fig. 39 B).
Figura 39. Efecto de Gas1 sobre la generación de óxido nítrico en células SH-SY5Y y
SH GAS1 control y tratadas con 80μM de 6-OHDA. (A) El NO es producido por las
sintasas de NO (NOS) inducible o neuronal. A su vez el NO puede reaccionar con el radical
superoxido (O2•) y producir peroxinitrito (ONOO-) el cual es un potente agente citotóxico.
(B) Niveles de NO de las células SH-SY5Y fueron tomadas como 100% y con base en esto
se realizó la normalización. Los datos se muestran como la media + SEM, n=3 por grupo;
*P < 0.05 y ***P < 0.001.
79
VII. DISCUSIÓN
Previamente, nuestro grupo reportó el patrón de expresión de Gas1 en el cerebro de ratón
adulto [155]. En este trabajo se amplió esta observación y se corroboró los niveles de
expresión de Gas1 en diferentes regiones del cerebro adulto. Inicialmente uno de los objetivos
fue proveer una descripción detallada de la localización de Gas1 en regiones que presentan
altos niveles de Gas1 y cuya organización permite detectar diferencialmente a Gas1 en el
cuerpo neuronal o en el neuropilo.
Los datos muestran que Gas1 se expresa en neuronas glutamatérgicas, GABAérgicas y
dopaminérgicas de cada una de las regiones estudiadas: Hip, Tal, Cb y SN. Particularmente en
el Hip, Gas1 se encontró principalmente en las neuronas glutamatérgicas presentes en las
capas de células granulares y piramidales, lo cual sugiere un papel relevante de Gas1 en el
hipocampo. En este contexto, un reporte previo mostró un efecto pro-apoptótico de Gas1 en
cultivo de neuronas corticohipocampales ante insultos excitotóxicos [104]. Estos datos son
consistentes con este trabajo, ya que el silenciamiento de Gas1 protegió de la muerte de las
células SH-SY5Y expuestas a 5 mM de NMDA o 10 mM de glutamato. Aunado a esto,
nuestro grupo previamente reportó que Gas1 inhibe la vía de señalización activada por GDNF
de manera dependiente de Ret e induce apoptosis en células SH-SY5Y cultivadas en ausencia
de suero [155], los datos que fueron recientemente confirmados por Wang et al., [148]. A
pesar de lo anterior, los resultados muestran la expresión de Gas1 en condiciones fisiológicas
normales sugiriendo otras funciones. Es probable que Gas1 ejerza diferentes efectos
dependiendo de su concentración, ya que en las mismas células SH-SY5Y se ha reportado que
Gas1 controla la maduración y reduce los niveles de la proteína precursora β-amiloide (APP)
[26, 27], indicando un papel relevante en la enfermedad de Alzheimer, la cual se caracteriza
por la acumulación de β-amiloide. Además, se ha mostrado que Gas1 induce la diferenciación
de mioblastos [86], participa en el desarrollo gastrointestinal [13] e incluso en el proceso de
ovulación [116]. Por lo tanto, el mecanismo de acción de Gas1 depende del contexto celular y
molecular en el que se encuentre y de su patrón de expresión espacio-temporal.
Por otro lado, de todas las áreas cerebrales analizadas, el Cb es la región que tuvo
mayor concentración de Gas1, dos veces más que cualquier otra (Fig. 1). En el Cb, Gas1 está
80
presente en neuronas de Purkinje y glutamatérgicas de núcleo fastigial, sin embargo, se
detectaron bajos niveles de Gas1 en neuronas glutamatérgicas granulares. Este hallazgo es
consistente con datos previos en donde se mostró que Gas1 se expresa en las células de la
capa granular externa (EGL) para promover su proliferación, pero no se expresa en las
neuronas granulares migratorias en maduración [5, 70, 92]. Como se mencionó anteriormente,
se encontró que las neuronas granulares expresan niveles muy bajos y no liberan Gas1 en
comparación con las células de Purkinje o del hipocampo. La función de Gas1 en las células
de Purkinje no ha sido reportada, sin embargo, se sabe que los ratones Gas1-/- muestran una
reducción en el número de células granulares y de Purkinje [92]. Durante el desarrollo, Gas1
liberado de las neuronas de Purkinje podría promover la proliferación de la células granulares
tal y como lo hace Shh liberado de células de Purkinje [33]. Mientras que en adulto podría
participar en el mantenimiento de la viabilidad o de detención del ciclo celular de las células
granulares las cuales no expresan Gas1.
Además, los resultados mostraron que Gas1 está presente en el cuerpo neuronal y no
en el neuropilo, ni en dendritas proximales o en las terminaciones axonales. Por ejemplo Gas1
se localiza en el soma de las neuronas de Purkinje pero no en sus terminales presentes en el
núcleo fastigial. Cabe indicar que Gas1 es una proteína unida a la membrana celular externa a
través de un grupo GPI [125, 137], aunque también se ha reportado su presencia en el retículo
endoplásmico y en el aparato de Golgi, en donde modula el procesamiento del APP [26, 27].
En este sentido el análisis bioinformático mostró un motivo de retención en el retículo
endoplásmico (RE). Por otra parte, recientemente se mostró que Gas1 es secretada, no por
secreción vesicular si no por el corte de su ancla GPI, de células mesangiales y fibroblastos
[7, 143]. Además, se ha reportado la presencia de forma soluble de Gas1 en el líquido
cefalorraquídeo (LCR), plasma sanguíneo y orina [7, 143, 144]. Interesantemente, aquí se
reporta que las neuronas de Purkinje, del hipocampo, células N1E115 y SH-SY5Y
diferenciadas con AR secretan Gas1, sugiriendo que este modula la señalización tanto de
forma autocrina como paracrina en el cerebro. Además, en este trabajo no se determinó como
se produce el corte de su ancla GPI, sin embargo, un reporte previo mostró que la desintegrina
y las metaloproteasas 10 y 17 (ADAM) son responsables del corte de su ancla GPI en las
células mesangiales [102]. El análisis bioinformático mostró dos sitios de reconocimiento a
81
nardilisina (N-Arg di-básica convertasa), uno de estos sitios se encuentra muy cercano al
ancla GPI. La nardilisina es una metaloproteasa localizada ampliamente en el cerebro [11].
Esta enzima se expresa en conjunto y potencia la actividad de la α-secretasa de ADAM 10 y
17. Curiosamente, se ha reportado una reducción en los niveles de expresión de estas tres
enzimas en cerebros con Alzheimer y Síndrome de Down [12], sugiriendo una desregulación
en la generación de los fragmentos amiloidogénicos. Por lo tanto, es posible que la nardilisina
esté involucrada en el corte del ancla GPI de Gas1 en las neuronas.
Con respecto a la función de Gas1, la ausencia de su ancla GPI no afecta su función
pro-apoptótica ya que previamente nuestro grupo generó una forma recombinante soluble de
Gas1 carente de GPI (tGas), la cual disminuyó el crecimiento tumoral [72, 93, 94]. Las
proteínas ancladas a GPI como Gas1 carecen de capacidad de señalización intrínseca, sin
embargo, algunos estudios muestran que el corte y por ende el desprendimiento de las
proteínas GPI de la membrana celular, se relaciona con diferentes procesos como migración,
modulación de la actividad del canales iónicos, inhibición o la estimulación del crecimiento
neurítico y atracción o repulsión de axones durante la diferenciación neuronal. Dichos efectos
se deben a la comunicación con células vecinas ya sea por unión con factores de crecimiento,
receptores transmembranales, generando gradientes de concentración o actuando como co-
receptores para modular vías de señalización [46, 56, 74, 102, 123, 124]. En este sentido
quizás durante el desarrollo, Gas1 soluble liberado de las neuronas podría generar un
gradiente para la formación de patrones tisulares, ya que está expresado preferencialmente en
el cuerpo celular y no en dendritas proximales o terminales. Por otro parte, Gas1 soluble
podría también modular la supervivencia, o muerte celular de forma paracrina al interactuar
con Shh o Ret, e incluso regular la migración, ya que Gas1 tiene un dominio RGD para su
interacción con integrinas [34, 35, 145]. En el presente trabajo el análisis bioinformático
reveló que dicho sitio RGD está conservado tanto en la secuencia de gas1 de ratón como en la
de humano. Interesantemente, se ha reportado que el complejo de integrinas α5β1 induce la
expresión de Gas1 [145].
Desde otra perspectiva, se he propuesto que existe cambio en la tasa de corte de las
proteínas GPI en diferentes enfermedades neurodegenerativas [36, 55, 56], por lo tanto se
82
sugiere determinar si Gas1 puede cruzar la barrera hematoencefálica y si su niveles cambian
durante estados neuropatológicos. En este contexto, bajos niveles de Gas1 se han propuesto
como indicadores de cáncer de próstata [122]. Aunque no se conocen los niveles de Gas1
soluble en condiciones neurotóxicas, se ha reportado que Gas1 se sobreexpresa en las
neuronas corticohipocampales después de la exposición a NMDA, en tejido hipocampal de
ratas isquémicas y en la SN después de la exposición de LPS o MPTP [104, 140].
Subsecuentemente, para determinar los posibles efectos de Gas1 en las neuronas, se
evaluó su papel en el proceso de diferenciación usando como modelo de estudio a la línea
celular SH-SY5Y diferenciada con AR. En primer lugar se observó que los niveles de Gas1
aumentan durante el proceso de diferenciación neuronal inducido por el AR en las células SH-
SY5Y. Estos datos son consistentes con lo reportado previamente por Chapuis y cols., [26].
La entrada de las células a la fase quiescente del ciclo celular determina el inicio de la
diferenciación neuronal [53]. Se ha reportado que el AR induce la expresión de Gas1 en
conjunto con otros inhibidores del ciclo celular en las células de la cresta neuronal [150]. Por
sí mismo, el AR induce la detención del ciclo celular [24, 44], sin embargo, es probable que
Gas1 esté mediando este efecto, ya que inhibe el ciclo celular en los fibroblastos [130] y
disminuye los niveles de ciclina D1, para promover la diferenciación de los mioblastos [86].
Interesantemente, el análisis bioinformático reveló un sitio de reconocimiento por la ciclina D
y un sitio de fosforilación por CK1 presentes en las secuencias proteicas de Gas1 de ratón,
rata y humano. Por lo tanto, Gas1 podrían potenciar el efecto del AR sobre la detención del
ciclo celular (Fig. 40).
Por otro lado, quizás exista una relación entre gas1 y el AR desde el punto de vista de
regulación transcripcional, ya que se ha reportado que el AR induce la expresión de gas1 en
las células de la cresta neural [150], células de carcinoma embrionario F9 [139] y en las
células de neuroblastoma SH-SY5Y [26]. Aunado a lo anterior, en este trabajo se muestra que
los niveles de Gas1 se incrementan durante diferenciación de las células SH-SY5Y inducida
por el AR. Asimismo, el análisis bioinformático muestra la presencia de secuencias RARE en
el promotor de gas1 (Fig. 40). Por lo tanto, estos resultados apoyan la idea de que gas1 es un
potencial gen responsivo al AR. Desde otra perspectiva, se sabe que gas1 es inducido por
83
WNT en las somitas [83] y el análisis bioinformático mostró también la presencia de sitios
TCF/LEF en los promotores de gas1 humano y de ratón (Fig. 40). Por lo tanto, quizás el AR
al inducir la expresión de proteínas WNT inducirá la expresión de gas1, por la translocación
al núcleo de la β-catenina el cual podría unirse a sitios responsivos TCF/LEF presentes en el
promotor de gas1 (Fig. 40).
Figura 40. Interacciones y efectos de Gas1 con diferentes vías de señalización
involucradas en la formación de neuritas y la diferenciación dopaminérgica.
Adicionalmente, en este trabajo se reportó que el silenciamiento de Gas1 produce una
disminución en el número de neuritas inducida por el AR en las células SH-SY5Y, dicho
efecto fue revertido por la adición de Gas1 recombinante al medio de cultivo, indicando un
efecto paracrino y la existencia de una proteína intermediaria (Fig. 40). Además, se mostró
que Gas1 indujo la formación de neuritas a través de la inhibición de GSK3β y aumentó los
niveles de TH en células SH-SY5Y diferenciadas con AR, indicando un efecto potenciador de
la diferenciación neuronal. Diversos estudios muestran que la inhibición de GSK3β induce la
formación de neuritas, mediante la regulación de la dinámica de proteínas asociadas a
microtúbulos tanto en cultivos primarios de neuronas como en líneas celulares (Fig. 40) [21,
84
106-110, 128, 134, 157]. Cabe mencionar que un estudio muestra que el litio, un inhibidor no
específico de GSK3β, bloquea la formación de neuritas [141]. Por otro lado, Gas1 podría
tener importantes funciones durante la diferenciación dopaminérgica, ya que diversos reportes
muestran que la inhibición de GSK3β promueve la diferenciación neuronal dopaminérgica,
incluso inhibidores de GKS3β son incorporados rutinariamente para inducir la diferenciación
dopaminérgica de células troncales embrionarias (ESCs) y de células pluripotentes inducidas
(iPSCs) [19, 88].
Aunque en este estudio no identificamos cual es la molécula intermediaria o si es una
interacción directa a través de la cual Gas1 inhibe a GSK3β, sugerimos que las integrinas o
las proteínas WNT podrían estar implicadas en dicho proceso, ya que se ha reportado que
WNT induce la expresión de Gas1 en las somitas [83]. Interesantemente, las WNTs son
glicoproteínas secretadas que también inducen la inhibición de GSK3β (Fig. 40). Dentro de
sus múltiples funciones está la de promover la diferenciación y mantenimiento de las
neuronas dopaminérgicas [19, 51, 62, 105].
Con base en los efectos que produce Gas1 sobre la diferenciación dopaminérgica de
las células SH-SY5Y, se analizó su posible efecto terapéutico para el tratamiento de la EP,
usando el modelo de 6-OHDA. A pesar de que diversos estudios muestran el efecto pro-
apoptótico de Gas1 [140, 148, 155], se encontró que su sobreexpresión atenuó el daño
neurotóxico que induce la 6-OHDA en las células SH-SY5Y diferenciadas con AR, esto a
través de la inhibición de GSK3β y la estabilización de los niveles de β-catenina, la cual
mediante su unión a sitios TCF/LEF podría inducir a la transcripción de genes que promueven
la supervivencia celular (Fig. 40). Esto se apoya con estudios previos que muestran que la 6-
OHDA causa efectos tóxicos al inhibir a GSK3β (fosforilación en la Ser9) e inducir su
activación (fosforilacion en la Tyr 216) [28, 76, 115]. En este contexto, se ha comprobado que
el “silenciamiento” o la inhibición de GSK3β disminuye la apoptosis inducida por la 6-
OHDA en células SH-SY5Y [28, 76, 115]. Por lo tanto, estos datos sugieren el uso de Gas1 o
inhibidores de GSK3β como potenciales agentes terapéuticos para el tratamiento de la EP.
85
Adicionalmente, se encontró que Gas1 aumentó los niveles de TH, incluso por arriba
del control, evidenciando un efecto es neuroprotector ante el insulto de la 6-OHDA. Sin
embargo, esto también podrían tener un efecto opuesto ya que una mayor actividad de la
enzima TH conllevaría a una aumento en los niveles de dopamina, cuya autoxidación podría
formar quinonas y por ende potenciar la formación de ROS [15]. Se sugiere un estudio
detallado en función del tiempo para determinar si el efecto neuroprotector de Gas1 persiste.
Con respecto a la producción de ROS, el anión superóxido (O2•) es la primera ROS generada
por la 6-OHDA, esto después de inhibir los complejos I y IV mitocondriales [15]. La enzima
SOD1 es la encargada de disminuir los niveles y la reactividad de O2• al catalizar la formación
de H2O2 y O2. Los resultados muestran que la 6-OHDA disminuyó los niveles de SOD1
indicando acumulación de O2• el cual es altamente citotóxico. Por otro lado, se observó que
la sobreexpresión de Gas1 mantuvo los niveles de SOD1 después del tratamiento con 6-
OHDA, lo que induciría la diminución de O2• y el aumento de los niveles de H2O2 y O2, los
que a su vez formarían H2O mediante la acción de la catalasa y la GPx. Adicionalmente,
encontramos que Gas1 ejerce un efecto protector a través de la disminución los niveles de NO
(RNS) inducidos por la 6-OHDA. Sin embargo, la sobreexpresión de Gas1 por si sola
aumentó los niveles de NO, el cual no tuvo efecto sobre la viabilidad celular. Cabe mencionar
que el NO, no solo ejerce efectos citotóxicos sino que también regula la excitabilidad
neuronal (potenciación a largo y corto plazo), liberación de neurotransmisores y es un factor
importante para el proceso de diferenciación. Cabe señalar que las células SH-SY5Y
diferenciadas con AR tienen mayores niveles de NO con respecto a las células no
diferenciadas, la tolerancia a dichos niveles de NO se debe a un aumento en la expresión de
enzimas antioxidantes y de proteínas que promueven la viabilidad celular como Akt y
ERK1/2, es por ello que las células diferenciadas son más resistentes a insultos tóxicos. Esto
es consistente con lo observado en el presente estudio, en donde las células SH-SY5Y
diferenciadas con AR fueron más recientes a la muerte celular inducida por la 6OHDA con
respecto a las células SH-SY5Y en proliferación.
86
VIII. CONCLUSIONES
No existe una relación unívoca entre la expresión de Gas1 y el fenotipo neuroquímico, ya que
se expresa tanto en neuronas GABAérgicas, glutamatérgicas y dopaminergicas.
Adicionalmente, es este trabajo se reporta que Gas1 podría modular la señalización de manera
paracrina en el cerebro ya que Gas1 es liberado por las neuronas. Incluso se sugiere que
cambios en su liberación durante procesos neurodegenerativos, podrían ser utilizados como
marcadores de diagnóstico.
Por otra parte, en el presente trabajo, se reporta que Gas1 indujo la formación de neuritas a
través de la inhibición de GSK3β, y aumentó los niveles de TH indicando un efecto
potenciador sobre la diferenciación neuronal. Debido a ello se considera que durante el
desarrollo, Gas1 podría ser un factor estimulante de la formación de neuronas
dopaminérgicas, mediante la activación de la vía WNT/GSK3β.
Finalmente, se mostró los efectos neuroprotectores de Gas1 sobre la neurotoxicidad inducida
por la 6-OHDA, señalándolo como un potencial coadyuvante en tratamiento de la EP. Sin
embargo, se sugieren más estudios dosis-respuesta para determinar si dicho efecto persiste, ya
que Gas1 aumentó la concentración de TH por arriba del control, además se han reportado
efectos pro-apoptóticos de Gas1 en las neuronas
87
IX. PERSPECTIVAS
Analizar los efectos de la Gas1 sobre la neurotoxicidad producida por la 6-OHDA en
un modelo in-vivo.
Determinar la relación entre WNT y Gas1 durante la formación de neuronas
dopaminérgicas.
Realizar estudios dosis-respuesta de los efectos Gas1.
Determinar si Gas1 es un gen responsivo al AR.
Analizar la liberación de Gas1 en procesos neurodegenerativos.
Determinar si Gas1 interactúa con integrinas y analizar sus efectos sobre la migración
celular.
88
X. BIBLIOGRAFÍA
[1] Agholme L, Lindstrom T, Kagedal K, Marcusson J, Hallbeck M An in vitro model for
neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical
characteristics of mature neurons. J Alzheimers Dis 2010;20:1069-1082.
[2] Ahlemeyer B, Baumgart-Vogt E Optimized protocols for the simultaneous preparation of
primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn
(P0.5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods 2005;149:110-120.
[3] Airaksinen MS, Saarma M The Gdnf Family: Signalling, Biological Functions and Therapeutic
Value. Nature Reviews Neuroscience 2002;3:383-394.
[4] Alberio T, Lopiano L, Fasano M Cellular models to investigate biochemical pathways in
Parkinson's disease. FEBS J 2012;279:1146-1155.
[5] Allen BL, Tenzen T, McMahon AP The Hedgehog-binding proteins Gas1 and Cdo cooperate to
positively regulate Shh signaling during mouse development. Genes & Development 2007;21:1244-
1257.
[6] Arsikin K, Kravic-Stevovic T, Jovanovic M, Ristic B, Tovilovic G, Zogovic N, Bumbasirevic V,
Trajkovic V, Harhaji-Trajkovic L Autophagy-dependent and -independent involvement of AMP-
activated protein kinase in 6-hydroxydopamine toxicity to SH-SY5Y neuroblastoma cells. Biochim
Biophys Acta 2012;1822:1826-1836.
[7] Ayala-Sarmiento AE, Estudillo E, Perez-Sanchez G, Sierra-Sanchez A, Gonzalez-Mariscal L,
Martinez-Fong D, Segovia J GAS1 is present in the cerebrospinal fluid and is expressed in the choroid
plexus of the adult rat. Histochem Cell Biol 2016;146:325-336.
[8] Balmer JE, Blomhoff R Gene expression regulation by retinoic acid. J Lipid Res 2002;43:1773-
1808.
[9] Baptista MJ, O'Farrell C, Daya S, Ahmad R, Miller DW, Hardy J, Farrer MJ, Cookson MR Co-
ordinate transcriptional regulation of dopamine synthesis genes by alpha-synuclein in human
neuroblastoma cell lines. J Neurochem 2003;85:957-968.
[10] Benítez JA, Arregui L, Vergara P, Segovia J Targeted-simultaneous expression of Gas1 and p53
using a bicistronic adenoviral vector in gliomas. Cancer Gene Therapy 2007;14:836-846.
[11] Bernstein HG, Stricker R, Dobrowolny H, Trubner K, Bogerts B, Reiser G Histochemical
evidence for wide expression of the metalloendopeptidase nardilysin in human brain neurons.
Neuroscience 2007;146:1513-1523.
89
[12] Bernstein HG, Stricker R, Lendeckel U, Bertram I, Dobrowolny H, Steiner J, Bogerts B, Reiser G
Reduced neuronal co-localisation of nardilysin and the putative alpha-secretases ADAM10 and
ADAM17 in Alzheimer's disease and Down syndrome brains. Age (Dordr) 2009;31:11-25.
[13] Biau S, Jin S, Fan CM Gastrointestinal defects of the Gas1 mutant involve dysregulated
Hedgehog and Ret signaling. Biology Open 2012;2:144-155.
[14] Blandini F, Nappi G, Tassorelli C, Martignoni E Functional changes of the basal ganglia
circuitry in Parkinson's disease. Prog Neurobiol 2000;62:63-88.
[15] Blum D, Torch S, Lambeng N, Nissou M, Benabid AL, Sadoul R, Verna JM Molecular pathways
involved in the neurotoxicity of 6-OHDA, dopamine and MPTP: contribution to the apoptotic theory
in Parkinson's disease. Prog Neurobiol 2001;65:135-172.
[16] Brennan SK, Wang Q, Tressler R, Harley C, Go N, Bassett E, Huff CA, Jones RJ, Matsui W
Telomerase inhibition targets clonogenic multiple myeloma cells through telomere length-dependent
and independent mechanisms. PLoS One 2010;5
[17] Cabrera JR, Sanchez-Pulido L, Rojas AM, Valencia A, Manes S, Naranjo JR, Mellstrom B Gas1 Is
Related to the Glial Cell-derived Neurotrophic Factor Family Receptors and Regulates Ret Signaling.
Journal of Biological Chemistry 2006;281:14330-14339.
[18] Cairo G, Ferrero M, Biondi G, Colombo MP Expression of a growth arrest specific gene (gas-1)
in transformed cells. Br J Cancer 1992;66:27-31.
[19] Castelo-Branco G, Rawal N, Arenas E GSK-3beta inhibition/beta-catenin stabilization in
ventral midbrain precursors increases differentiation into dopamine neurons. J Cell Sci
2004;117:5731-5737.
[20] Ciccarelli C, Philipson L, Sorrentino V Regulation of expression of growth arrest-specific genes
in mouse fibroblasts. Mol Cell Biol 1990;10:1525-1529.
[21] Cohen P, Frame S The renaissance of GSK3. Nat Rev Mol Cell Biol 2001;2:769-776.
[22] Cole AR (2013) Regulation of Cell Fate in the Brain by GSK3. In: Wislet-Gendebien S (ed)
Trends in Cell Signaling Pathways in Neuronal Fate Decision. InTech, Rijeka, pp Ch. 06
[23] Colombo MP, Martinotti A, Howard TA, Schneider C, D'Eustachio P, Seldin MF Localization of
growth arrest-specific genes on mouse chromosomes 1, 7, 8, 11, 13, and 16. Mamm Genome
1992;2:130-134.
[24] Cuende J, Moreno S, Bolanos JP, Almeida A Retinoic acid downregulates Rae1 leading to
APC(Cdh1) activation and neuroblastoma SH-SY5Y differentiation. Oncogene 2008;27:3339-3344.
90
[25] Chan MC, Bautista E, Alvarado-Cruz I, Quintanilla-Vega B, Segovia J Inorganic mercury
prevents the differentiation of SH-SY5Y cells: Amyloid precursor protein, microtubule associated
proteins and ROS as potential targets. J Trace Elem Med Biol 2017;
[26] Chapuis J, Vingtdeux V, Campagne F, Davies P, Marambaud P Growth arrest-specific 1 binds
to and controls the maturation and processing of the amyloid- precursor protein. Human Molecular
Genetics 2011;20:2026-2036.
[27] Chapuis J, Vingtdeux V, Capiralla H, Davies P, Marambaud P Gas1 interferes with AbetaPP
trafficking by facilitating the accumulation of immature AbetaPP in endoplasmic reticulum-associated
raft subdomains. J Alzheimers Dis 2012;28:127-135.
[28] Chen G, Bower KA, Ma C, Fang S, Thiele CJ, Luo J Glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta)
mediates 6-hydroxydopamine-induced neuronal death. FASEB J 2004;18:1162-1164.
[29] Chen G, Bower KA, Xu M, Ding M, Shi X, Ke ZJ, Luo J Cyanidin-3-glucoside reverses ethanol-
induced inhibition of neurite outgrowth: role of glycogen synthase kinase 3 Beta. Neurotox Res
2009;15:321-331.
[30] Cheung YT, Lau WK, Yu MS, Lai CS, Yeung SC, So KF, Chang RC Effects of all-trans-retinoic acid
on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology
2009;30:127-135.
[31] Chin-Chan M, Navarro-Yepes J, Quintanilla-Vega B Environmental pollutants as risk factors for
neurodegenerative disorders: Alzheimer and Parkinson diseases. Front Cell Neurosci 2015;9:124.
[32] Chou DK, Jungalwala FB N-Acetylglucosaminyl transferase regulates the expression of the
sulfoglucuronyl glycolipids in specific cell types in cerebellum during development. J Biol Chem
1996;271:28868-28874.
[33] De Luca A, Cerrato V, Fuca E, Parmigiani E, Buffo A, Leto K Sonic hedgehog patterning during
cerebellar development. Cell Mol Life Sci 2016;73:291-303.
[34] Del Sal G, Collavin L, Ruaro ME, Edomi P, Saccone S, Valle GD, Schneider C Structure,
function, and chromosome mapping of the growth-suppressing human homologue of the murine
gas1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:1848-1852.
[35] Del Sal G, Ruaro ME, Philipson L, Schneider C The growth arrest-specific gene, gas1, is
involved in growth suppression. Cell 1992;70:595-607.
[36] Derfuss T, Parikh K, Velhin S, Braun M, Mathey E, Krumbholz M, Kumpfel T, Moldenhauer A,
Rader C, Sonderegger P, Pollmann W, Tiefenthaller C, Bauer J, Lassmann H, Wekerle H, Karagogeos D,
Hohlfeld R, Linington C, Meinl E Contactin-2/TAG-1-directed autoimmunity is identified in multiple
91
sclerosis patients and mediates gray matter pathology in animals. Proc Natl Acad Sci U S A
2009;106:8302-8307.
[37] Dias V, Junn E, Mouradian MM The role of oxidative stress in Parkinson's disease. J
Parkinsons Dis 2013;3:461-491.
[38] Domínguez-Monzón G, Benítez JA, Vergara P, Lorenzana R, Segovia J Gas1 inhibits cell
proliferation and induces apoptosis of human primary gliomas in the absence of Shh. International
Journal of Developmental Neuroscience 2009;27:305-313.
[39] Duester G, Mic FA, Molotkov A Cytosolic retinoid dehydrogenases govern ubiquitous
metabolism of retinol to retinaldehyde followed by tissue-specific metabolism to retinoic acid. Chem
Biol Interact 2003;143-144:201-210.
[40] Dwane S, Durack E, Kiely PA Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to
study cell adhesion and cell migration. BMC Res Notes 2013;6:366.
[41] Eifert C, Sangster-Guity N, Yu LM, Chittur SV, Perez AV, Tine JA, McCormick PJ Global gene
expression profiles associated with retinoic acid-induced differentiation of embryonal carcinoma
cells. Mol Reprod Dev 2006;73:796-824.
[42] Eisenmann DM Wnt signaling. WormBook 2005:1-17.
[43] Embi N, Rylatt DB, Cohen P Glycogen synthase kinase-3 from rabbit skeletal muscle.
Separation from cyclic-AMP-dependent protein kinase and phosphorylase kinase. Eur J Biochem
1980;107:519-527.
[44] Encinas M, Iglesias M, Liu Y, Wang H, Muhaisen A, Cena V, Gallego C, Comella JX Sequential
treatment of SH-SY5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully
differentiated, neurotrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J Neurochem 2000;75:991-
1003.
[45] Fearnley JM, Lees AJ Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity.
Brain 1991;114 ( Pt 5):2283-2301.
[46] Ferraro GB, Morrison CJ, Overall CM, Strittmatter SM, Fournier AE Membrane-type matrix
metalloproteinase-3 regulates neuronal responsiveness to myelin through Nogo-66 receptor 1
cleavage. J Biol Chem 2011;286:31418-31424.
[47] Forster JI, Koglsberger S, Trefois C, Boyd O, Baumuratov AS, Buck L, Balling R, Antony PM
Characterization of Differentiated SH-SY5Y as Neuronal Screening Model Reveals Increased Oxidative
Vulnerability. J Biomol Screen 2016;21:496-509.
92
[48] Fremeau RT, Jr., Burman J, Qureshi T, Tran CH, Proctor J, Johnson J, Zhang H, Sulzer D,
Copenhagen DR, Storm-Mathisen J, Reimer RJ, Chaudhry FA, Edwards RH The identification of
vesicular glutamate transporter 3 suggests novel modes of signaling by glutamate. Proc Natl Acad Sci
U S A 2002;99:14488-14493.
[49] Fremeau RT, Jr., Troyer MD, Pahner I, Nygaard GO, Tran CH, Reimer RJ, Bellocchio EE, Fortin
D, Storm-Mathisen J, Edwards RH The expression of vesicular glutamate transporters defines two
classes of excitatory synapse. Neuron 2001;31:247-260.
[50] Fujiyama F, Hioki H, Tomioka R, Taki K, Tamamaki N, Nomura S, Okamoto K, Kaneko T
Changes of immunocytochemical localization of vesicular glutamate transporters in the rat visual
system after the retinofugal denervation. J Comp Neurol 2003;465:234-249.
[51] Fukusumi Y, Meier F, Gotz S, Matheus F, Irmler M, Beckervordersandforth R, Faus-Kessler T,
Minina E, Rauser B, Zhang J, Arenas E, Andersson E, Niehrs C, Beckers J, Simeone A, Wurst W, Prakash
N Dickkopf 3 Promotes the Differentiation of a Rostrolateral Midbrain Dopaminergic Neuronal Subset
In Vivo and from Pluripotent Stem Cells In Vitro in the Mouse. J Neurosci 2015;35:13385-13401.
[52] Furuya S, Makino A, Hirabayashi Y An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells
with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain Res Brain Res Protoc
1998;3:192-198.
[53] Galderisi U, Jori FP, Giordano A Cell cycle regulation and neural differentiation. Oncogene
2003;22:5208-5219.
[54] Garcia-Tovar CG, Perez A, Luna J, Mena R, Osorio B, Aleman V, Mondragon R, Mornet D,
Rendon A, Hernandez JM Biochemical and histochemical analysis of 71 kDa dystrophin isoform
(Dp71f) in rat brain. Acta Histochem 2001;103:209-224.
[55] Gautam V, D'Avanzo C, Hebisch M, Kovacs DM, Kim DY BACE1 activity regulates cell surface
contactin-2 levels. Mol Neurodegener 2014;9:4.
[56] Gennarini G, Bizzoca A, Picocci S, Puzzo D, Corsi P, Furley AJ The role of Gpi-anchored axonal
glycoproteins in neural development and neurological disorders. Mol Cell Neurosci 2016;
[57] Gobeil S, Zhu X, Doillon CJ, Green MR A genome-wide shRNA screen identifies GAS1 as a
novel melanoma metastasis suppressor gene. Genes & Development 2008;22:2932-2940.
[58] Grossi M, La Rocca SA, Pierluigi G, Vannucchi S, Ruaro EM, Schneider C, Tato F Role of Gas1
down-regulation in mitogenic stimulation of quiescent NIH3T3 cells by v-Src. Oncogene
1998;17:1629-1638.
93
[59] Gurung B, Feng Z, Iwamoto DV, Thiel A, Jin G, Fan CM, Ng JM, Curran T, Hua X Menin
epigenetically represses Hedgehog signaling in MEN1 tumor syndrome. Cancer Res 2013;73:2650-
2658.
[60] Hafner M, Landthaler M, Burger L, Khorshid M, Hausser J, Berninger P, Rothballer A, Ascano
M, Jr., Jungkamp AC, Munschauer M, Ulrich A, Wardle GS, Dewell S, Zavolan M, Tuschl T
Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.
Cell 2010;141:129-141.
[61] Hätinen T, Holm L, Airaksinen MS Loss of neurturin in frog—Comparative genomics study of
GDNF family ligand-receptor pairs. Molecular and Cellular Neuroscience 2007;34:155-167.
[62] Hernandez-Baltazar D, Mendoza-Garrido ME, Martinez-Fong D Activation of GSK-3beta and
caspase-3 occurs in Nigral dopamine neurons during the development of apoptosis activated by a
striatal injection of 6-hydroxydopamine. PLoS One 2013;8:e70951.
[63] Hernandez-Baltazar D, Zavala-Flores LM, Villanueva-Olivo A The 6-hydroxydopamine model
and parkinsonian pathophysiology: Novel findings in an older model. Neurologia 2015;
[64] Herzog E, Bellenchi GC, Gras C, Bernard V, Ravassard P, Bedet C, Gasnier B, Giros B, El
Mestikawy S The existence of a second vesicular glutamate transporter specifies subpopulations of
glutamatergic neurons. J Neurosci 2001;21:RC181.
[65] Holowacz T, Alexson TO, Coles BL, Doble BW, Kelly KF, Woodgett JR, Van Der Kooy D The
responses of neural stem cells to the level of GSK-3 depend on the tissue of origin. Biol Open
2013;2:812-821.
[66] Holtz WA, Turetzky JM, Jong YJ, O'Malley KL Oxidative stress-triggered unfolded protein
response is upstream of intrinsic cell death evoked by parkinsonian mimetics. J Neurochem
2006;99:54-69.
[67] Hsu SD, Tseng YT, Shrestha S, Lin YL, Khaleel A, Chou CH, Chu CF, Huang HY, Lin CM, Ho SY,
Jian TY, Lin FM, Chang TH, Weng SL, Liao KW, Liao IE, Liu CC, Huang HD miRTarBase update 2014: an
information resource for experimentally validated miRNA-target interactions. Nucleic Acids Res
2014;42:D78-85.
[68] Huang Y, Prasad M, Lemon WJ, Hampel H, Wright FA, Kornacker K, LiVolsi V, Frankel W, Kloos
RT, Eng C, Pellegata NS, de la Chapelle A Gene expression in papillary thyroid carcinoma reveals
highly consistent profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98:15044-15049.
[69] Hwang O Role of oxidative stress in Parkinson's disease. Exp Neurobiol 2013;22:11-17.
94
[70] Izzi L, Lévesque M, Morin S, Laniel D, Wilkes Brian C, Mille F, Krauss Robert S, McMahon
Andrew P, Allen Benjamin L, Charron F Boc and Gas1 Each Form Distinct Shh Receptor Complexes
with Ptch1 and Are Required for Shh-Mediated Cell Proliferation. Developmental Cell 2011;20:788-
801.
[71] Janesick A, Wu SC, Blumberg B Retinoic acid signaling and neuronal differentiation. Cell Mol
Life Sci 2015;72:1559-1576.
[72] Jiménez A, López-Ornelas A, Estudillo E, González-Mariscal L, González RO, Segovia J A
soluble form of GAS1 inhibits tumor growth and angiogenesis in a triple negative breast cancer
model. Experimental Cell Research 2014;327:307-317.
[73] Kann M, Bae E, Lenz MO, Li L, Trannguyen B, Schumacher VA, Taglienti ME, Bordeianou L,
Hartwig S, Rinschen MM, Schermer B, Benzing T, Fan CM, Kreidberg JA WT1 targets Gas1 to maintain
nephron progenitor cells by modulating FGF signals. Development 2015;142:1254-1266.
[74] Kaplan MR, Cho MH, Ullian EM, Isom LL, Levinson SR, Barres BA Differential control of
clustering of the sodium channels Na(v)1.2 and Na(v)1.6 at developing CNS nodes of Ranvier. Neuron
2001;30:105-119.
[75] Khwanraj K, Phruksaniyom C, Madlah S, Dharmasaroja P Differential Expression of Tyrosine
Hydroxylase Protein and Apoptosis-Related Genes in Differentiated and Undifferentiated SH-SY5Y
Neuroblastoma Cells Treated with MPP(.). Neurol Res Int 2015;2015:734703.
[76] King TD, Bijur GN, Jope RS Caspase-3 activation induced by inhibition of mitochondrial
complex I is facilitated by glycogen synthase kinase-3beta and attenuated by lithium. Brain Res
2001;919:106-114.
[77] Korecka JA, van Kesteren RE, Blaas E, Spitzer SO, Kamstra JH, Smit AB, Swaab DF, Verhaagen
J, Bossers K Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by
transcriptional profiling. PLoS One 2013;8:e63862.
[78] Kovalevich J, Langford D Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in
neurobiology. Methods Mol Biol 2013;1078:9-21.
[79] Kozikowski AP, Gaisina IN, Petukhov PA, Sridhar J, King LT, Blond SY, Duka T, Rusnak M, Sidhu
A Highly potent and specific GSK-3beta inhibitors that block tau phosphorylation and decrease alpha-
synuclein protein expression in a cellular model of Parkinson's disease. ChemMedChem 2006;1:256-
266.
[80] Kriks S, Shim JW, Piao J, Ganat YM, Wakeman DR, Xie Z, Carrillo-Reid L, Auyeung G, Antonacci
C, Buch A, Yang L, Beal MF, Surmeier DJ, Kordower JH, Tabar V, Studer L Dopamine neurons derived
95
from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature
2011;480:547-551.
[81] Kwok JB, Hallupp M, Loy CT, Chan DK, Woo J, Mellick GD, Buchanan DD, Silburn PA, Halliday
GM, Schofield PR GSK3B polymorphisms alter transcription and splicing in Parkinson's disease. Ann
Neurol 2005;58:829-839.
[82] Kwon C, Cheng P, King IN, Andersen P, Shenje L, Nigam V, Srivastava D Notch post-
translationally regulates beta-catenin protein in stem and progenitor cells. Nat Cell Biol
2011;13:1244-1251.
[83] Lee CS, Buttitta L, Fan CM Evidence that the WNT-inducible growth arrest-specific gene 1
encodes an antagonist of sonic hedgehog signaling in the somite. Proceedings of the National
Academy of Sciences 2001;98:11347-11352.
[84] Lee KK, Leung AK, Tang MK, Cai DQ, Schneider C, Brancolini C, Chow PH Functions of the
growth arrest specific 1 gene in the development of the mouse embryo. Dev Biol 2001;234:188-203.
[85] Lee TC, Li L, Philipson L, Ziff EB Myc represses transcription of the growth arrest gene gas1.
Proc Natl Acad Sci U S A 1997;94:12886-12891.
[86] Leem Y-E, Han J-W, Lee H-J, Ha H-L, Kwon Y-L, Ho S-M, Kim B-G, Tran P, Bae G-U, Kang J-S
Gas1 cooperates with Cdo and promotes myogenic differentiation via activation of p38MAPK.
Cellular Signalling 2011;23:2021-2029.
[87] Li DW, Liu ZQ, Chen W, Yao M, Li GR Association of glycogen synthase kinase-3beta with
Parkinson's disease (review). Mol Med Rep 2014;9:2043-2050.
[88] Li W, Li K, Wei W, Ding S Chemical approaches to stem cell biology and therapeutics. Cell
Stem Cell 2013;13:270-283.
[89] Li Y, Luo F, Wei L, Liu Z, Xu P Knockdown of glycogen synthase kinase 3 beta attenuates 6-
hydroxydopamine-induced apoptosis in SH-SY5Y cells. Neurosci Lett 2011;487:41-46.
[90] Liu XY, He YJ, Yang QH, Huang W, Liu ZH, Ye GR, Tang SH, Shu JC Induction of autophagy and
apoptosis by miR-148a through the sonic hedgehog signaling pathway in hepatic stellate cells. Am J
Cancer Res 2015;5:2569-2589.
[91] Liu Y, Liu C, Yamada Y, Fan CM Growth arrest specific gene 1 acts as a region-specific
mediator of the Fgf10/Fgf8 regulatory loop in the limb. Development 2002;129:5289-5300.
[92] Liu Y, May NR, Fan C-M Growth Arrest Specific Gene 1 Is a Positive Growth Regulator for the
Cerebellum. Developmental Biology 2001;236:30-45.
96
[93] López-Ornelas A, Mejía-Castillo T, Vergara P, Segovia J Lentiviral transfer of an inducible
transgene expressing a soluble form of Gas1 causes glioma cell arrest, apoptosis and inhibits tumor
growth. Cancer Gene Therapy 2010;18:87-99.
[94] López-Ornelas A, Vergara P, Segovia J Neural stem cells producing an inducible and soluble
form of Gas1 target and inhibit intracranial glioma growth. Cytotherapy 2014;16:1011-1023.
[95] Louvi A, Artavanis-Tsakonas S Notch signalling in vertebrate neural development. Nat Rev
Neurosci 2006;7:93-102.
[96] Ma H, Wei Y, Leng Y, Li S, Gao L, Hu H, Chen L, Wang F, Xiao H, Zhu C, Liang C TGF-beta1-
induced expression of Id-1 is associated with tumor progression in gastric cancer. Med Oncol
2014;31:19.
[97] Mark M, Ghyselinck NB, Chambon P Function of retinoic acid receptors during embryonic
development. Nucl Recept Signal 2009;7:e002.
[98] Mark M, Ghyselinck NB, Chambon P Function of retinoid nuclear receptors: lessons from
genetic and pharmacological dissections of the retinoic acid signaling pathway during mouse
embryogenesis. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2006;46:451-480.
[99] Marletaz F, Holland LZ, Laudet V, Schubert M Retinoic acid signaling and the evolution of
chordates. Int J Biol Sci 2006;2:38-47.
[100] Marschalek R Mixed lineage leukemia: roles in human malignancies and potential therapy.
FEBS J 2010;277:1822-1831.
[101] Martinelli DC, Fan CM A Sonic Hedgehog Missense Mutation Associated with
Holoprosencephaly Causes Defective Binding to GAS1. Journal of Biological Chemistry
2009;284:19169-19172.
[102] Matas-Rico E, van Veen M, Moolenaar WH Neuronal differentiation through GPI-anchor
cleavage. Cell Cycle 2016:1-2.
[103] Maurer U, Preiss F, Brauns-Schubert P, Schlicher L, Charvet C GSK-3 - at the crossroads of cell
death and survival. J Cell Sci 2014;127:1369-1378.
[104] Mellstrom B Gas1 Is Induced during and Participates in Excitotoxic Neuronal Death.
Molecular and Cellular Neuroscience 2002;19:417-429.
[105] Metcalfe C, Bienz M Inhibition of GSK3 by Wnt signalling--two contrasting models. J Cell Sci
2011;124:3537-3544.
97
[106] Munoz-Montano JR, Lim F, Moreno FJ, Avila J, Diaz-Nido J Glycogen Synthase Kinase-3
Modulates Neurite Outgrowth in Cultured Neurons: Possible Implications for Neurite Pathology in
Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis 1999;1:361-378.
[107] Munoz-Montano JR, Moreno FJ, Avila J, Diaz-Nido J Downregulation of glycogen synthase
kinase-3beta (GSK-3beta) protein expression during neuroblastoma IMR-32 cell differentiation. J
Neurosci Res 1999;55:278-285.
[108] Munoz-Montano JR, Moreno FJ, Avila J, Diaz-Nido J Lithium inhibits Alzheimer's disease-like
tau protein phosphorylation in neurons. FEBS Lett 1997;411:183-188.
[109] Nciri R, Boujbiha MA, Jbahi S, Allagui MS, Elfeki A, Vincent C, Croute F Cytoskeleton
involvement in lithium-induced SH-SY5Y neuritogenesis and the role of glycogen synthase kinase
3beta. Aging Clin Exp Res 2015;27:255-263.
[110] Nciri R, Bourogaa E, Jbahi S, Allagui MS, Elfeki A, Vincent C, Croute F Chronic neuroprotective
effects of low concentration lithium on SH-SY5Y cells: possible involvement of stress proteins and
gene expression. Neural Regen Res 2014;9:735-740.
[111] O'Suilleabhain PE, Sung V, Hernandez C, Lacritz L, Dewey RB, Jr., Bottiglieri T, Diaz-Arrastia R
Elevated plasma homocysteine level in patients with Parkinson disease: motor, affective, and
cognitive associations. Arch Neurol 2004;61:865-868.
[112] Obayashi S, Tabunoki H, Kim SU, Satoh J-i Gene Expression Profiling of Human Neural
Progenitor Cells Following the Serum-Induced Astrocyte Differentiation. Cellular and Molecular
Neurobiology 2009;29:423-438.
[113] Obeso JA, Rodriguez-Oroz MC, Goetz CG, Marin C, Kordower JH, Rodriguez M, Hirsch EC,
Farrer M, Schapira AH, Halliday G Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med
2010;16:653-661.
[114] Okada Y, Shimazaki T, Sobue G, Okano H Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition
of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol
2004;275:124-142.
[115] Petit-Paitel A, Brau F, Cazareth J, Chabry J Involvment of cytosolic and mitochondrial GSK-
3beta in mitochondrial dysfunction and neuronal cell death of MPTP/MPP-treated neurons. PLoS One
2009;4:e5491.
[116] Ren YA, Liu Z, Mullany LK, Fan CM, Richards JS Growth Arrest Specific-1 (GAS1) Is a C/EBP
Target Gene That Functions in Ovulation and Corpus Luteum Formation in Mice. Biol Reprod
2016;94:44.
98
[117] Rhinn M, Dolle P Retinoic acid signalling during development. Development 2012;139:843-
858.
[118] Rinne JO, Rummukainen J, Paljarvi L, Rinne UK Dementia in Parkinson's disease is related to
neuronal loss in the medial substantia nigra. Ann Neurol 1989;26:47-50.
[119] Rinne JO, Rummukainen J, Paljarvi L, Sako E, Molsa P, Rinne UK Neuronal loss in the
substantia nigra in patients with Alzheimer's disease and Parkinson's disease in relation to
extrapyramidal symptoms and dementia. Prog Clin Biol Res 1989;317:325-332.
[120] Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT Product differentiation by analysis of DNA melting
curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem 1997;245:154-160.
[121] Riz I, Hawley TS, Luu TV, Lee NH, Hawley RG TLX1 and NOTCH coregulate transcription in T
cell acute lymphoblastic leukemia cells. Mol Cancer 2010;9:181.
[122] Rizzi F, Belloni L, Crafa P, Lazzaretti M, Remondini D, Ferretti S, Cortellini P, Corti A, Bettuzzi S
A novel gene signature for molecular diagnosis of human prostate cancer by RT-qPCR. PLoS One
2008;3:e3617.
[123] Rosen CL, Lisanti MP, Salzer JL Expression of unique sets of GPI-linked proteins by different
primary neurons in vitro. J Cell Biol 1992;117:617-627.
[124] Rougon G, Olive S, Durbec P, Faivre-Sarrailh C, Gennarini G Functional studies and cellular
distribution of the F3 GPI-anchored adhesion molecule. Braz J Med Biol Res 1994;27:409-414.
[125] Ruaro ME, Stebel M, Vatta P, Marzinotto S, Schneider C Analysis of the domain requirement
in Gas1 growth suppressing activity. FEBS Lett 2000;481:159-163.
[126] Russo MA, Paolillo M, Sanchez-Hernandez Y, Curti D, Ciusani E, Serra M, Colombo L, Schinelli
S A small-molecule RGD-integrin antagonist inhibits cell adhesion, cell migration and induces anoikis
in glioblastoma cells. Int J Oncol 2013;42:83-92.
[127] Saito Y, Nishio K, Ogawa Y, Kinumi T, Yoshida Y, Masuo Y, Niki E Molecular mechanisms of 6-
hydroxydopamine-induced cytotoxicity in PC12 cells: involvement of hydrogen peroxide-dependent
and -independent action. Free Radic Biol Med 2007;42:675-685.
[128] Salcedo-Tello P, Ortiz-Matamoros A, Arias C GSK3 Function in the Brain during Development,
Neuronal Plasticity, and Neurodegeneration. Int J Alzheimers Dis 2011;2011:189728.
[129] Sariola H, Saarma M Novel functions and signalling pathways for GDNF. J Cell Sci
2003;116:3855-3862.
99
[130] Schneider C, King RM, Philipson L Genes specifically expressed at growth arrest of
mammalian cells. Cell 1988;54:787-793.
[131] Schueler-Furman O, Glick E, Segovia J, Linial M Is GAS1 a co-receptor for the GDNF family of
ligands? Trends in Pharmacological Sciences 2006;27:72-77.
[132] Seppala M, Depew MJ, Martinelli DC, Fan C-M, Sharpe PT, Cobourne MT Gas1 is a modifier
for holoprosencephaly and genetically interacts with sonic hedgehog. Journal of Clinical Investigation
2007;117:1575-1584.
[133] Seppala M, Xavier GM, Fan CM, Cobourne MT Boc modifies the spectrum of
holoprosencephaly in the absence of Gas1 function. Biology Open 2014;3:728-740.
[134] Shah SM, Patel CH, Feng AS, Kollmar R Lithium alters the morphology of neurites
regenerating from cultured adult spiral ganglion neurons. Hear Res 2013;304:137-144.
[135] Simoneau AR, Spruck CH, 3rd, Gonzalez-Zulueta M, Gonzalgo ML, Chan MF, Tsai YC, Dean M,
Steven K, Horn T, Jones PA Evidence for two tumor suppressor loci associated with proximal
chromosome 9p to q and distal chromosome 9q in bladder cancer and the initial screening for GAS1
and PTC mutations. Cancer Res 1996;56:5039-5043.
[136] Spagnuolo R Gas1 is induced by VE-cadherin and vascular endothelial growth factor and
inhibits endothelial cell apoptosis. Blood 2004;103:3005-3012.
[137] Stebel M, Vatta P, Ruaro ME, Del Sal G, Parton RG, Schneider C The growth suppressing gas1
product is a GPI-linked protein. FEBS Lett 2000;481:152-158.
[138] Storch A, Kaftan A, Burkhardt K, Schwarz J 6-Hydroxydopamine toxicity towards human SH-
SY5Y dopaminergic neuroblastoma cells: independent of mitochondrial energy metabolism. J Neural
Transm (Vienna) 2000;107:281-293.
[139] Su D, Gudas LJ Gene expression profiling elucidates a specific role for RARgamma in the
retinoic acid-induced differentiation of F9 teratocarcinoma stem cells. Biochem Pharmacol
2008;75:1129-1160.
[140] Sun XL, Chen BY, Zhao HK, Cheng YY, Zheng MH, Duan L, Jiang W, Chen LW Gas1 up-
regulation is inducible and contributes to cell apoptosis in reactive astrocytes in the substantia nigra
of LPS and MPTP models. J Neuroinflammation 2016;13:180.
[141] Takahashi M, Yasutake K, Tomizawa K Lithium inhibits neurite growth and tau protein kinase
I/glycogen synthase kinase-3beta-dependent phosphorylation of juvenile tau in cultured
hippocampal neurons. J Neurochem 1999;73:2073-2083.
100
[142] Tang M, Villaescusa JC, Luo SX, Guitarte C, Lei S, Miyamoto Y, Taketo MM, Arenas E, Huang EJ
Interactions of Wnt/beta-catenin signaling and sonic hedgehog regulate the neurogenesis of ventral
midbrain dopamine neurons. J Neurosci 2010;30:9280-9291.
[143] van Roeyen CR, Zok S, Pruessmeyer J, Boor P, Nagayama Y, Fleckenstein S, Cohen CD, Eitner
F, Grone HJ, Ostendorf T, Ludwig A, Floege J Growth arrest-specific protein 1 is a novel endogenous
inhibitor of glomerular cell activation and proliferation. Kidney Int 2013;83:251-263.
[144] van Roeyen CRC, Zok S, Pruessmeyer J, Boor P, Nagayama Y, Fleckenstein S, Cohen CD, Eitner
F, Gröne H-J, Ostendorf T, Ludwig A, Floege J Growth arrest–specific protein 1 is a novel endogenous
inhibitor of glomerular cell activation and proliferation. Kidney International 2012;83:251-263.
[145] Varner JA, Emerson DA, Juliano RL Integrin alpha 5 beta 1 expression negatively regulates cell
growth: reversal by attachment to fibronectin. Mol Biol Cell 1995;6:725-740.
[146] Voigt A, Zintl F Effects of retinoic acid on proliferation, apoptosis, cytotoxicity, migration, and
invasion of neuroblastoma cells. Med Pediatr Oncol 2003;40:205-213.
[147] Wang H, Zhou X, Zhang Y, Zhu H, Zhao L, Fan L, Wang Y, Gang Y, Wu K, Liu Z, Fan D Growth
arrest-specific gene 1 is downregulated and inhibits tumor growth in gastric cancer. FEBS J
2012;279:3652-3664.
[148] Wang K, Zhu X, Zhang K, Zhou F, Zhu L Gas1 Knockdown Increases the Neuroprotective Effect
of Glial Cell-Derived Neurotrophic Factor Against Glutamate-Induced Cell Injury in Human SH-SY5Y
Neuroblastoma Cells. Cell Mol Neurobiol 2016;36:603-611.
[149] Wang K, Zhu X, Zhang K, Zhou F, Zhu L Gas1 Knockdown Increases the Neuroprotective Effect
of Glial Cell-Derived Neurotrophic Factor Against Glutamate-Induced Cell Injury in Human SH-SY5Y
Neuroblastoma Cells. Cellular and Molecular Neurobiology 2015;
[150] Wang L, Mear JP, Kuan CY, Colbert MC Retinoic acid induces CDK inhibitors and growth arrest
specific (Gas) genes in neural crest cells. Dev Growth Differ 2005;47:119-130.
[151] Wang W, Yang Y, Ying C, Li W, Ruan H, Zhu X, You Y, Han Y, Chen R, Wang Y, Li M Inhibition of
glycogen synthase kinase-3beta protects dopaminergic neurons from MPTP toxicity.
Neuropharmacology 2007;52:1678-1684.
[152] Xue YQ, Ma BF, Zhao LR, Tatom JB, Li B, Jiang LX, Klein RL, Duan WM AAV9-mediated
erythropoietin gene delivery into the brain protects nigral dopaminergic neurons in a rat model of
Parkinson's disease. Gene Ther 2010;17:83-94.
[153] Yasuhara T, Hara K, Sethi KD, Morgan JC, Borlongan CV Increased 8-OHdG levels in the urine,
serum, and substantia nigra of hemiparkinsonian rats. Brain Res 2007;1133:49-52.
101
[154] Zarco N, Bautista E, Cuellar M, Vergara P, Flores-Rodriguez P, Aguilar-Roblero R, Segovia J
Growth Arrest Specific 1 (GAS1) Is Abundantly Expressed in the Adult Mouse Central Nervous System.
Journal of Histochemistry & Cytochemistry 2013;61:731-748.
[155] Zarco N, González-Ramírez R, González RO, Segovia J GAS1 induces cell death through an
intrinsic apoptotic pathway. Apoptosis 2012;17:627-635.
[156] Zhang L, He S, Guo S, Xie W, Xin R, Yu H, Yang F, Qiu J, Zhang D, Zhou S, Zhang K Down-
regulation of miR-34a alleviates mesangial proliferation in vitro and glomerular hypertrophy in early
diabetic nephropathy mice by targeting GAS1. Journal of Diabetes and its Complications
2014;28:259-264.
[157] Zhang W, Smith A, Liu JP, Cheung NS, Zhou S, Liu K, Li QT, Duan W GSK3beta modulates
PACAP-induced neuritogenesis in PC12 cells by acting downstream of Rap1 in a caveolae-dependent
manner. Cell Signal 2009;21:237-245.
[158] Zhang YW, Zheng Y, Wang JZ, Lu XX, Wang Z, Chen LB, Guan XX, Tong JD Integrated analysis
of DNA methylation and mRNA expression profiling reveals candidate genes associated with cisplatin
resistance in non-small cell lung cancer. Epigenetics 2014;9:896-909.
[159] Zhao L, Pan Y, Gang Y, Wang H, Jin H, Tie J, Xia L, Zhang Y, He L, Yao L, Qiao T, Li T, Liu Z, Fan D
Identification of GAS1 as an epirubicin resistance-related gene in human gastric cancer cells with a
partially randomized small interfering RNA library. J Biol Chem 2009;284:26273-26285.