연구개발 필요성 – 경제적 측면

천식환자 : 세계 3억 5천만명, Big-7 8% (6천만명) (GINA Report, ‘06)

세계 시장 : 2005년 (151억 달러) -> 2010년 (208억 달러)

- 성장율 : 14.4% (‘05), 13.8% (’07 예측) (Visiongain Report, 2006)

미국 (’02, 세계의약품시장동향)시장 : 64억 달러Respiratory Steroids : 6.5억 달러Bronchodilator : 29.5억 달러Singular : 10억 달러

한국 (’03, 한국기술거래소)시장 : 820억원흡입제: 270억원항류코트리엔제 : 150억원

융합적 전략에 의한 신개념 천식 진료기술 개발이 필요

저용량 흡입 스테로이드+ 서방형 테오필린

+ 서방형 테오필린저용량 흡입 스테로이드

+ 류코트리엔조절제

+ 항 IgE+ 류코트리엔조절제중간/ 고용량

흡입 스테로이드류코트리엔

조절제

+ 경구스테로이드

중간/ 고용량흡입 스테로이드

+ 지속성 베타2 항진제

저용량 흡입 스테로이드+ 지속성 베타2 항진제

저용량 흡입스테로이드

하나 이상추가

하나 이상추가

한가지선택

한가지선택

질병 조절제

(2단계 이상

부터 사용)

(필요할 때) 속효성 베타2 항진제 흡입

천식 교육/ 환경 조절

5 5 단계단계4 4 단계단계3 3 단계단계2 2 단계단계1 1 단계단계

치료치료 단계단계내림 올림

1차권장치료

일반적인 천식의 치료는 환자의 천식조절 정도에 따라 2 또는 3단계부터시작하며 3개월 이상 조절이 되면 치료 단계를 낮출 수 있다.

4단계 이상의 치료가 필요한 경우에는 천식 전문의에게 의뢰하는 것이 좋으며, 따라서 4 단계 이상의 환자들은 중등도에 따른 치료를 분류하는 근거가 된다.

4단계이상의 치료를 요하는 천식환자군과 그 이하로 조절이 잘 되는 군을정확하게 분류할 수 있는 의료용 진단기술이 개발될 경우 천식환자의 치료에큰 도움을 줄 수 있다.

연구개발 필요성 – 기술적 측면

현 기술상태의 취약성

◦ 현 상태의 취약성은 천식환자의 초기 치료단계 판정이 임상적 증상의 관찰 및

의사의 직관에 주로 의지하고 있으므로 정확성이 부족할 수 있으며, 정확한 치료

단계의 판정을 위하여서는 의사와 환자가 약물치료에 다른 천식조절의 상태를 보

면서 상당기간의 Trial and error를 겪어야 한다는 점이다.

향 후 전망

◦ 따라서 말초혈액의 유전자분석를 통하여 천식환자의 치료단계의 정확한 판정에

도움을 줄 수 있다면 최종적 치료단계의 판정을 위한 Trial and error 기간을 줄

이고 의사와 환자 모두에게 만족스러운 결과를 줄 수 있다.

◦ 이러한 장점이 충분히 만족된다면 환자의 말초혈액 유전자분석을 통한 천식의

치료단계 판별기술은 의료현장에서 활용될 수 있으며 추가적인 연구를 거쳐 궁극

적으로 의료용 분석서비스 품목으로 자리매김 할 수 있다.

현 기술상태의 취약성 및 향후전망

과제목표 :

천식환자의 말초혈액 유전자분석을 활용한 천식치료단계 판별기술 개발

과제내용:

천식환자의 임상자료 data base와 인체 sample bank를 구축한다.

치료단계별 천식환자의 말초혈액에서 RNA를 분리하고 Bio-chip으로분석하여 치료단계별로 차이를 보이는 유전자군을 선별한다.

선별된 유전자군을 대상으로 천식의 치료단계별 차이를 분석 및 검증한다.

관련 특허를 출원하고 임상진료에의 유용성을 평가한다.

과제목표 및 과제내용

연구수행체계

연구수행 결과 요약

천식환자 및 대조군말초혈액 RNA 확보 및 분석

천식환자 및 대조군 모집환자140건 대조군 40건

천식 임상자료 Data base 구축 및 말초혈액 시료 확보

말초혈액으로 부터 RNA 분리, QC, Microarray 분석, Real time PCR

천식진단용 유전자 마커및 이를 이용한 천식 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 (출원번호 10-2010-0058661)

기초의학-임상의학-기업협력연구를 위한 질병바이오마커 연구센터 설립

인력양성 박사1, 석사1

연구결과의 특허출원및 기타성과

천식후보유전자 발굴 및검증, 천식단계판정 활용

천식후보유전자 18종 발굴및 1건 검증

40명의 천식환자를 대상으로 천식단계판정에 활용

진단정확도 70% 달성

평가항목

(주요성능 Spec)

단

위

비중

(%)

개발

목표치연구결과

목표

달성도평가방법

1. 후보유전자발굴 건 25 10 18 180 %

Bio-chip 으로

발굴된 후보유

전자의 수

2. 후보유전자검증 건 25 11

(KCTD1)100 %

천식환자 및 대

조군을 대상으

로 통계분석된

유전자의 수

3. 천식단계판정

활용건수명 25 30 40 133 % 환자수(명)

4. 진단정확도 % 25 70 70 100 % 정확도(%)

연구개발목표 달성도 요약

천식환자 140건 + 대조군 40건 : DNA, RNA, Plasma

시료 DB 관리

Labeling

초저온 보관 (-70 0C)

Sampling

연구수행 결과 : 인체시료 확보

성별 연령폐기능

FEV1abs

폐기능

FEV1%

대조군

C1 남성 56세 3.10 97

C2 남성 52세 2.79 86

C3 남성 56세 3.26 108

C4 남성 63세 3.10 112

C5 남성 66세 2.77 97

3.00±0.21 100±10.3

저단계 천식

L1 남성 56세 3.33 108

L2 남성 52세 2.66 85

L3 남성 70세 - -

L4 남성 64세 2.11 88

L5 남성 67세 1.76 73

2.46±0.68 88.5±14.5

고단계 천식

H1 남성 63세 2.84 95

H2 남성 56세 2.29 86

H3 남성 58세 2.70 93

H4 남성 53세 1.47 52

H5 남성 62세 3.12 114

2.48±0.64 88±22.6

연구수행 결과 : Microarray 분석을 피험자

연구수행 결과 : QC of RNA samples

2.1

Ratio (28s/18s)

10.0Sample

RIN

2.1

Ratio (28s/18s)

10.0Sample

RIN

Test case and standard ladder

천식환자 말초 혈액으로부터 분리한 total RNA의 quality를 측정

Agilent 2100 Bioanalyzer를 이용한 totalRNA의 quality 측정

RNA 시 료 는 migration pattern 및 peak pattern,28s/18sribosomal RNA의 비율 그리고 OD260/OD230 비율등을 고려하여 평가한것이며, 매우 엄격한 기준을 통과한다. 세포주로부터 추출한 경우: OD260/OD230>2.0 조직으로부터 추출한 경우: OD260/OD230>1.8의 기준을 통과하여야 한다.

Agilent Human whole genome 4 X 44K chip

대조군과 천식 환자의 비교 고단계와 저단계천식의 비교

MA plot

Scatterplot

연구수행 결과 : Scanning and Basic analyses

Hierarchical Clustering : 전체 유전자 분석

○ 건강인의 발현량에 대한 경증 및 중증천식환자 발현량의 상대적 비율을

비교함으로써, TRIM64, NCRNA00158, KCNB2, RIOK1, KCTD1, ZNF136, YIPF7,

PTPRG, LECT2, UGT2B11, MOBKL2B, POTED, LOC644192, ADAD1, ASH1L,

ZNF776, CHRNB1, DLEC1 등 18종의 유전자를 선별하였다.

○ TRIM64, NCRNA00158, KCNB2, RIOK1, KCTD1, ZNF136, YIPF7, PTPRG,

LECT2, UGT2B11, MOBKL2B, POTED, LOC644192, ADAD1, ASH1L 등 15종 유전

자의 발현 수준은 대조군<저단계천식환자<고단계천식환자로 천식의 단계가

진행됨에 따라 증가함이 관찰되었다.

○ ZNF776, CHRNB1, DLEC1 등 3종 유전자의 발현 수준은 대조군>저단계천식

환자>고단계천식환자로 천식의 단계가 진행됨에 따라 감소함이 관찰되었다.

의미있게 변화하는 유전자의 선별

Gene Distance Matrix (GDM, 유전자 거리 분석)

- 유전자간에 발현 양상의 유사성을 분석한 데이터로서 발현양상의 차이(거리)을 0~1 사이의 수로 표현한다.

- 검은색(0)에 가까울 수록 유전자 발현 양상의 차이가 없고, 붉은색(1)에 가까울 수록 차이가 많음을 표현한다.

- 분석결과는 고단계 천식환자에서 발현양이 증가하는 15종과 저단계 천식환자에서 발현량이 증가하는 3종의

2 group으로 확연하게 구분됨을 보여주고 있다.

** 가운데 흰색은 자신과의 비교를 나타내는 부분

고단계 천식환자에서발현이 증가하는 유전자

저단계 천식환자에서발현이 증가하는 유전자

- 선택된 18종의 유전자 혹은 유전자에서 생성된 단백질 사이의 상호작용을 여러 데이타베이스의 정보를 이

용하여 분석

- 데이타베이스

(1) 유전자 및 단백질 : NCBI, UniProt

(2) 기능 : KEGG, GO

(3) 유전자와 단백질 사이의 작용

: DIP, BIND, HPRD

- 사각형 : 유전자, 원형 : 단백질

- 분홍색 : 18개의 선정된 유전자

Molecular Interaction Analysis

- 분석 대상이 되는 유전자 집단에 대하여 통계적인 유전자 온톨로지 (ontology) 분석 및 트리 (tree) 구조로

표현한 데이터

- 중심부의 ‘Gene Ontology’를 최상위로 하여 세분화된 기능을 가지로 표시함

- 노란색 : 선정된 18개의 유전자 중 해당하는 기능에 포함될 경우 표시

Estrogen Catabolic Process : 18개 유전자 중 UGT2B11이 포함됨

(예 1)

Gated Channel Activity : 18개 유전자 중 KCNB2, KCTD1, CHRNB1이 포함됨

(예 2)

Gene Ontology Analysis

GO Term Gene

estrogen catabolic process UGT2B11

postsynaptic membrane organization CHRNB1

cation channel activity KCNB2, KCTD1, CHRNB1

gated channel activity KCNB2, KCTD1, CHRNB1

metal ion transmembrane transporter activity KCNB2, KCTD1, CHRNB1

voltage-gated potassium channel complex KCNB2, KCTD1

voltage-gated potassium channel activity KCNB2, KCTD1

ion channel activity KCNB2, KCTD1, CHRNB1

substrate specific channel activity KCNB2, KCTD1, CHRNB1

passive transmembrane transporter activity KCNB2, KCTD1, CHRNB1

channel activity KCNB2, KCTD1, CHRNB1

Gene Ontology Analysis

Neuroactive Ligand-Receptor Interaction

Pathway Analysis

Steroid Hormone Biosynthesis

Pathway Analysis

Tight Junction

Pathway Analysis

Retinol Metabolism in Animals

Pathway Analysis

Ascorbate and Aldarate Metabolism

Pathway Analysis

Drug Metabolism • Cytochrome P450

Pathway Analysis

Drug Metabolism • Other Enzymes

Pathway Analysis

Lysine Degradation

Pathway Analysis

Metabolism of Xenobiotics by Cytochlome P450

Pathway Analysis

Pentose and Glucuronate Interconversions

Pathway Analysis

Porphyrin and Chlorophyll Metabolism

Pathway Analysis

Starch and Sucrose Metabolism

Pathway Analysis

선정된 18개 유전자의 발현 양상의 유사성을 근거로 clustering 분석을 수행하였다.

- 저단계 및 고단계천식 (Asthma)환자에 대한 유전자 발현량을 대조군 값으로 나눈 값을 대상으로 분석을

수행한 결과는 아래와 같다.

- Clustering 분석결과는 선정된 18종의 유전자를 통하여 저단계 천식환자 5인과 고단계 천식환자 5인이

완전히 구분할 수 있음을 제시하고 있다.

Intensity

Decrease Increase

저단계 천식환자 고단계 천식환자

고단계천식에서 감소

고단계천식에서 증가

Clustering Analysis

○ 대조군 및 천식환자 총 60명으로부터 말초혈액 RNA를 분리함.-40~70세의 대조군 20명, 저단계 천식 16명, 고단계 천식 24명으로부터 말초혈액 RNA를 분리하였다.

○ Real time PCR 방법을 사용한 말초혈액 RNA 정량-상기 60명의 말초혈액에서 microarray로 발굴된 후보 유전자 중 KCTD1 유전자의 mRNA를 정량한 결과는 다음과 같다.

대조군

(n=20)

저단계천식

(n=16)

고단계천식

(n=24)

평균 ± 표준편차 1.00 ± 0.26 1.13 ± 0.24 1.39 ±0.34

대조군 vs 저단계천식 p = 0.145대고군 vs 고단계천식 p = 0.000저단계천식 vs 고단계천식 p = 0.011

Real time PCR 방법을 사용한 말초혈액 RNA 정량

KCTD1

expression흡연량_개피 FEV1%

KCTD1

expression

Pearson상관

계수

1 0.553* -0.332*

유의확률(양쪽) 0.014 0.048

N 40 19 36

흡연량_개피 Pearson상관

계수

0.553* 1 -.147

유의확률(양쪽) 0.014 .125

N 19 201 110

FEV1% Pearson상관

계수

-0.332* -.147 1

유의확률(양쪽) 0.048 .125

N 36 110 291

말초혈액 KCTD1 발현량과 임상지표와의 상관분석

로지스틱 회귀분석을 통한 천식단계 판별 평가

성별, 연령, KCTD1 발현양을 독립변수로 천식 단계 판별에 활용 가능성을 평가

한 결과는 아래의 도표와 같다.

성별과 연령은 유의확률 p>0.05로 천식단계에 관련성이 없었지만, KCTD1 발현

량은 유의확률 p>0.012로 천식단계에 의미있는 영향을 주고 있음이 발견되었다.

EXP(B) = 77.5로서 KCTD1 발현량이 1단위 증가하면 고단계 천식일 확률이 평균

77.5 배 증가함을 의미한다.

B S.E, Wals 자유도유의

확률Exp(B)

EXP(B)에대한95%신

뢰구간

하한 상한

변수

성별(1) -1.259 .904 1.942 1 0.163 0.284 .048 1.668

연령_만 .007 .036 .032 1 0.858 1.007 .937 1.081

KCTD1 4.350 1.732 6.310 1 0.012* 77.492 2.601 2308.44

상수항 -4.896 2.951 2.752 1 0.097 0.007

로지스틱 회귀분석을 통한 천식단계 판별 평가

로지스틱회귀분석을 통한 단계예측 분석에서 전체 40명의 환자중 중 28명의 천

식단계를 정확히 분별하여 분류정확률 70%를 나타내었다.

예측

분류정확%저단계 고단계

관찰

저간계 9 7 56.3

고단계 5 19 79.2

전체퍼센트 70.0

연구결과의 특허 출원천식 진단용 유전자 마커 및 이를 이용한 천식 진단에 필요한 정보를 제공하는방법. 출원번호 10-2010-0058661 (출원일 2010.6.21.)

산업화 활용방안

1. 선별된 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 코딩하는 뉴클레오타

이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 천식

진단용 키트

2. 선별된 유전자 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 코딩하는 뉴클레

오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브가 고정된 천식 진단용 마이크

로어레이

3. 상기 키트 및 마이크로어레이를 사용하여 천식환자에게서 천식단계의 정확

한 판단에 관한 유전적 기초 자료를 제공하는 분석 서비스

말초혈액 유전자 검사를 통하여 천식환자의 치료단계의 정확한 판정에 도움

을 줄 수 있다면 치료단계의 판정을 위한 Trial and error 기간을 줄이고 의

사와 환자 모두에게 만족스러운 결과를 줄 수 있다.

이러한 장점이 충분히 만족된다면 환자의 말초혈액 분석을 통한 천식치료단

계 판정 기술은 의료용 진단검사 서비스 품목으로 자리매김 할 수 있다.

의사의 임상적

관찰

+

말초혈액

유전자분석

Before After

Drug A

Drug B

Drug C

Drug D

No response

Untolerable

Rebound

Responsive

미래형 천식치료

Drug D

Responsive