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北国新聞会館20階ホール、7月28日、2007年

金沢大学理学部物理学科（自然科学研究科）

CREST　（日本科学技術振興機構）

安藤　敏夫

Myosin V, 240 nm, 30 ms/ frameMyosin V, 240 nm, 30 ms/ frame

日本海イノベーション会議　第１回フォーラム　

分子の動きを高速でとらえる顕微鏡の開発

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様　々　な　生　命　現　象① 個体発生 ② 好中球の貧食

③ 細胞内タンパク質の動態 ④ アクチン線維の滑り運動

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大きさのスケール

m mm μm nm pm

細胞 ウィルス

タンパク質

原子

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タンパク質とはアミノ酸からでできた物質

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生物分子機械生物分子機械

モータ蛋白質、モータ蛋白質、AAA AAA 蛋白質蛋白質,,　　DNADNA結合蛋白質結合蛋白質

Myosin VI

Actin

Kinesin Dynein

Microtubules

TubulinKataninFtsH

Microtubules

Holliday-Junction DNA

Myosin V

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タンパク質の動的振舞いの情報を得る手段

水中水中

高空間分解能高空間分解能

１分子を対象１分子を対象

高時間分解能高時間分解能

X線結晶構造解析X線結晶構造解析

電子顕微鏡電子顕微鏡

NMRNMR

スペクトロスコピースペクトロスコピー

光学顕微鏡光学顕微鏡

原子間力顕微鏡原子間力顕微鏡

3

2

3

2

2

1

Binnig (1986)

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原子間力顕微鏡（原子間力顕微鏡（AFMAFM））の原理の原理

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フィードバック制御の遅れフィードバック制御の遅れ

c

cfπQ

s

sfπQ

cf21

pτ

1.2 MHz in water, 200 pN/nm

L=6 μm, w=2 μm, d=90 nm

Active Damping

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振幅

位相

周波数

機械を思いどおりに高速に動かすのは難しい

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入力 出力

力 変位

G(ω)

機械を思いどおりに高速に動かす工夫

G(ω)G(ω)1

G(ω)

H(ω)

+

フィードフォワード型補償 フィードバック型補償

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振動抑制補償の効果

入　力入　力 出　力出　力

補償前

補償後

補償前補償前

補償後補償後

X-スキャナー

Ｚ-スキャナー

100 kHz

500 kHz

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80 ms/frame

針で試料に「やさしく」触ることは難しい

タンパク質はとてもデリケート

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60 ms/frameMyosin VActo-myosin V

Head

AFMが捉えたタンパク質のダイナミックな動作

Dynein C GroEL

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ミオシンＶ：　細胞内の物質輸送を担うタンパク質

T. Sakamoto et al. BBRC. 272:586-590 (2000)

蛍光顕微鏡像

AFM像

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ATP ADP + Pi

化学エネルギー 力学的エネルギー

ATP分解反応ATP分解反応

構造変化構造変化

Actinとの結合Actinとの結合

カップリング

力学的仕事力学的仕事

共　役

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アクチンアクチン--ミオシンＶミオシンＶ 相互作用相互作用

低イオン強度

矢じり構造

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30nm

ＡＴＰがないときＡＴＰがないとき

Imaging Rate: 100 ms/frame

イオン強度

マイナス端

プラス端

矢じり構造矢じり構造

In ADP

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In 50uM AMPIn 50uM AMP・・PNPPNP

両足の結合両足の結合

30nmイオン強度

前足-AMP・PNP後ろ足

AMP・PNPなし

プラス端マイナス端

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In ATP: In ATP: ミオシンＶの歩行運動ミオシンＶの歩行運動

20 20 uMuM ATP, 300 ATP, 300 mMmM NaClNaCl 30nm

Imaging Rate: 100ms/frame

20

前前 足足 のの 屈屈 曲曲With 8uM ATPWith 8uM ATP

With 20uM ATPWith 20uM ATP30nm

前足の屈曲が前方への力を生む前足の屈曲が前方への力を生む

M・ADP・Pi M・ADP

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なぜ後ろ足しかアクチンに結合できないか？

+－

ATPなし、ADP結合状態

ATPなし、ADP結合状態では、マイナス端を指すよう

な矢じり構造でしかアクチンに結合できない

ATPなし、ADP結合状態では、マイナス端を指すよう

な矢じり構造でしかアクチンに結合できない

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ATP分解反応の進行と歩行運動とのカップリング

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ミオシンＶの歩行運動の機序

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シャペロニン GroEL-GroES の結合・解離のダイナミクス

試料のセットアップGroEL

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0.25 s/frame

シャペロニン GroEL-GroES の結合・解離のダイナミクス

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スイッチング

主要中間体

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ストレプトアビジン基板ストレプトアビジン基板ビオチン化タンパク質

His-タグ　タンパク質

800nm × 800nmz scale: 4nm

300nm × 300nmz scale: 2nm

100nm × 100nmz scale: 2nm

タンパク質の選択的固定を可能に

ストレプトアビジンの２次元結晶

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脂質で作る平面２重層膜

リン脂質

リポソーム

基板に支えられた平面２重層膜

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Speed: ×20

1 s/frame,

800×800 nm

脂質平面２重層膜の形成過程

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脂質平面２重層膜の流動性の脂質依存性

DPPC-(DOPC-Biotin) DPPC-(DPPC-Biotin)

不飽和炭化水素 飽和炭化水素

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バクテリオロドプシンの紫膜

光のエネルギーでプロトンを排出

35 ×35 nm2

35 nm

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Cyt

opla

smic

site

Extr

acel

lula

rsite

40 nm

40 nm

10 nm

10 nm

(a) (b)

(c) (d)

バクテリオロドプシン

40 ms/frame

15 ms/frame

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探針・試料間相互作用力の更なる低減化

イメージング速度の更なる高速化

将来の展望

カンチレバーが主要な制限因子

cf ckor

唯一の解 非接触高速AFM

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非接触高速AFMは可能か？非接触高速AFMは可能か？

G. Shekhawat and V.P. Dravid (2005)

Scanning Near-field Ultrasound Holography (SNFUH)

音波は試料表面に沿っている？

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探針は非接触でも表面を感じる！！

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■■ ナノメータ世界の高速観察ナノメータ世界の高速観察

高速AFMの大きな波及効果

新しいナノサイエンス・ナノテクノロジーの創成

■■ 表面の迅速評価装置表面の迅速評価装置

■■ 大表面へのナノ構造の形成大表面へのナノ構造の形成

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Kanazawa UniversityKanazawa University

Kansai Advanced Research CenterKansai Advanced Research Center

大岩和弘

OlympusOlympus

戸田明敏

内橋貴之（准教授） FF-control, Photo-thermal, Phase Imaging

古寺哲幸（PD） Dynamic PID, Active damping, Myosin V

山下隼人（D1） Photo-thermal, membrane imaging

宮城 篤（D3） Dynein C, Nucleosome Imaging

中北　諒（卒業生） Scanner, Active damping

坂下　満（卒業生） Drift Compensation, Software

山本大輔（PD） Lipid Bilayers, GroEL-ES Imaging

北沢正志 榊原　斉

谷口雅昭（PD） GroEL Mutation, RuvAB Imaging

Cantilevers Dynein C Prep.

高橋尚久（M2） Phase Imaging, nc-AFM