様々な培養基材表面で均一な細胞凝集塊を大量に形成させるためのマスクシート

東京大学東京大学東京大学東京大学 先端科学技術研究センター先端科学技術研究センター先端科学技術研究センター先端科学技術研究センター

教授教授教授教授 生田生田生田生田 幸士幸士幸士幸士

講師講師講師講師 池内池内池内池内 真志真志真志真志

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胚様体の大量生産が必要

幹細胞

分化誘導幹細胞の培養 胚様体形成

2

従来の胚様体培養手法

ハンギングドロップ

細胞懸濁液をディッシュの天井に吊した状態

○○○○ 細胞サイズの制御が可能

☓☓☓☓ 煩雑な操作が伴う

細胞同士の凝集により，自発的に胚様体が形成

○○○○ 大量生産が可能

☓☓☓☓ 胚様体サイズが不均一

細胞非接着性培養基材

大量・均質生産は困難大量・均質生産は困難3

目的

胚様体培養の初期条件

１．播種数

２．播種密度

を、胚様体1個オーダーで

コントロールする

4

5mm

本技術のマスクシート（複数条件用）

１．テーパ—形状を有する多数の貫通孔

２．表面：細胞超低接着性

３．柔軟・自己接着性

特徴

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マスクシートマスクシートマスクシートマスクシート

細胞培養皿など細胞培養皿など細胞培養皿など細胞培養皿など

貫通孔貫通孔貫通孔貫通孔

幹細胞幹細胞幹細胞幹細胞②細胞播種②細胞播種

①基材に貼付①基材に貼付

③胚様体形成③胚様体形成胚様体胚様体胚様体胚様体

ポイント

・任意の基材面に置くだけ– 接着剤不要

・これ以降は、従来通りのプロトコルが適用可能

ポイント

・任意の基材面に置くだけ– 接着剤不要

・これ以降は、従来通りのプロトコルが適用可能

本技術を用いた培養プロトコル例

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本手法本手法

②残留なし

高再現性・高効率

①基材の選択自由

本技術のメリット①

従来手法従来手法

①基材の選択不可

低接着シャーレ・温度応答性シャーレetc.

インサートゲル（コラーゲン等）

②細胞が残留・効率低下・再現性低下

ポリスチレン,ガラスetc.

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y [mm]

x [mm] 細胞（懸濁液濃度 C [mm-3]）

マスクシート

培養皿

t [mm]

① 1ウェルあたりの細胞数 = C t x2

C:細胞濃度(/mm3)， t：溶液深さ(mm)，x：上部開口径(mm)

② ウェル内の細胞密度 = C t x2/ y2

y：下部開口径(mm)

1回の播種操作で、複数条件下で胚様体培養

本技術のメリット②

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応用① 胚様体形成の至適条件検討6h6h6h6h

24h24h24h24h

168h168h168h168h

200mm

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

140.0

160.0

0.0E+00 1.0E+05 2.0E+05 3.0E+05 4.0E+05 5.0E+05 6.0E+05 7.0E+05

上部開口面積

クラスタ直

径下部開口下部開口下部開口下部開口φ280φ280φ280φ280umumumum

下部開口下部開口下部開口下部開口φ240φ240φ240φ240umumumum

下部開口下部開口下部開口下部開口φ180φ180φ180φ180umumumum

下部開口下部開口下部開口下部開口φ140φ140φ140φ140umumumum

[mm]

[mm2]

１．胚様体サイズ。

2．至適な播種密度域が存在する。9

応用②大量生産用マスクシート

同一サイズ・形状の貫通孔を大量に配置．400個/cm2同一サイズ・形状の貫通孔を大量に配置．400個/cm2

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Day0 Day1 Day2 Day3 Day4

iPS細胞の胚様体形成

従来手法（HD)

従来手法（HD)

Yukawa H. et al.,Biomaterials 2011

Day0 Day1 Day2 Day3 Day4

本手法本手法

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胚様体大量生産の実証

1cm2あたりの回収個数

従来手法(HD)の10倍の生産効率従来手法(HD)の10倍の生産効率

胚様体形状の均一性

Yukawa H. et al.,Biomaterials 2011

回収

個数

本技術長

短径

の差

(μm)

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想定される用途

・スクリーニングモデルとしてのがん細胞凝集塊の大量作製

・幹細胞の均一な胚様体形成による分化誘導の効率化

・電極基板との組み合せによる脳モデル，心筋モデルの培養・解析

・生体に安全な基材であるので、例えば皮膚等に微粒子をパターニングすることもできる。

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実用化に向けた課題

•現在、手作業で作製しているため、大量生産に適した製造手法を開発しなければならない。

・表面を保護するため、現状、ウェットな状態での保管が必要である。実用化に向けて、乾燥状態で保存できる処理手法を開発中。

・一部培養基材には接着が弱いため、接着面の素材を検討中。

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企業への期待

•培養用の基材を取り扱っている企業は、本技術と既存の基材を組み合わせることで、3次元培養製品が容易に開発できると思われる。

•乾燥状態で親水性を維持できる表面処理や、新水表面への接着技術を持つ企業との共同開発を期待。

•大量の細胞塊を必要とする用途にも有用。15

本技術に関する知的財産権

•発明の名称 ：任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法とその方法に使用するマスク材

•登録番号 ：特許第5231909号

•出願人 ：科学技術振興機構

•発明者 ：生田幸士、池内真志

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お問い合わせ先

【ライセンスについて】

科学技術振興機構

知的財産戦略センター 桑島 健

ＴＥＬ０３－５２１４ － ８４８６

e-mail takeshi.kuwajima@jst.go.jp

【技術内容について】

東京大学 先端科学技術研究センター 池内真志

ＴＥＬ０３－５４５２ － ５１６２

e-mail ikeuchi@micro.rcast.u-tokyo.ac.jp

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