봉독약침과 녹용약침이 mia 유도 골관절염 흰쥐에 미치는 영향 · 5)...

한방재활의학과학회지 제20권 제1호 (2010년 01월)

JOrientalRehabMed2010;20(1):61-77

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￭ 접 수 :2010년 1월 6일, 수정 :2010년 1월 13일, 채택 :2010년 1월 18일￭ 교신저자 :최진봉,광주광역시 남구 월산동 동신대학교 광주한방병원 한방재활의학과

Tel:(062)350-7219,E-mail:[email protected]

봉독약침과 녹용약침이 MIA 유도 골관절염 흰쥐에

미치는 영향

김환영⋅최진봉

동신대학교 한의과대학 한방재활의학과교실

Effects of Bee Venom and Cervi Cornu Parvum

Pharmacoacupuncture in Monosodium Iodoacetate(MIA)-Induced

Osteoarthritis Rat

Whan-Young Kim, O.M.D., Jin-Bong Choi, O.M.D.

Dept. of Oriental Rehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Dong-Shin University

Objectives:

ThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofBeeVenom(BV)andCerviCornuParvumpharmacoacupuncture(CC)inmonosodium

iodideinducedarthritisrats.

Methods:

Thesubjectsweredividedinto5groups;Normal,Control(notreatmentafterMIA),BV(BeeVenompharmacoacupuncture100㎕ dailyatDokbi

(ST35)afterinducingMIA),CC(CerviCornuParvumpharmacoacupuncture100㎕ dailyatDokbi(ST35)afterinducingMIA)andBV+CC(BeeVenom

pharmacoacupunctureandCerviCornuParvumpharmacoacupuncture100㎕ dailyatDokbi(ST35)afterinducingMIA).

Aftereachoperation,thepresentauthorobservedthemotorbehaviorrecovery,hematological(ProstaglandinE2,AST,ALT),histologicaland

immunologicalchanges.Ratsweretestedatthe7th,14thand21stday.

Results:

Resultsareasfollows.

1.Alltheexperimentalgroupswereimprovedcomparedwithcontrolgroupinplantartest.

2.Alltheexperimentalgroupswereimprovedcomparedwithcontrolgroupintouchtestforsensoryevaluator.

3.AlltheexperimentalgroupsweresignificantlydecreasedcomparedwithcontrolgroupinprostaglandinE2.

4.Inhistologicalobservations,kneejointinalltheexperimentalgroupswereimprovedcomparedwithcontrolgroup.

5.Inimmunologicalobservations,alltheexperimentalgroupsweresignificantlydecreasedcomparedwithcontrolgroupinCOX-1,2.

Conclusions:

ItcanbesuggestedthatBeevenomandCerviCornuParvumpharmacoacupuncturemayimprovemotorbehavior,hematological,histologicaland

immunologicalfindingsinMIA-inducedosetoarthritisrats.Especially,combinationofthesetwotreatmentswillbesomewhatbetterinosteoarthritis

recoveryandmotorfunctionimprovement.

Keywords:BeeVenom,CerviCornuParvum,Osteoarthritis


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Ⅰ. 서 론

관절염은 관절을 침범하는 모든 염증을 일컫

는 용어로써 여러 관절에 비특이적인 염증성 반

응을 만성적으로 야기하여 동통과 강직을 나타내

는 질환이다.대표적으로는 골관절염과 류마토이

드 관절염을 들 수 있는데,만성질환의 대명사로

알려진 것처럼 긴 경과를 가지면서 점차 진행되

고 대개의 경우 악화되는 예후를 보이며,통증으

로 인한 일상생활의 장애가 심하다1,2).

특히 골관절염은 유리질 연골의 변성을 가져

오는 관절병증으로 관절연골의 소실과 골비대,

골증식체의 생성을 특징으로 하며 퇴행성 관절질

환,골관절증,비대성 골관절염으로 불린다3).

최근 관절염에 대한 치료법의 하나로 봉독약

침과 녹용약침이 폭넓게 사용되고 있는데4),봉독

약침과 녹용약침은 봉독과 녹용의 유효성분을 추

출하여 질병과 관련된 혈위에 주입하여 침 치료

와 약재의 생화학적 작용을 치료에 응용하는 신

침요법의 하나로5,6)진통

7),소염

7,8)및 면역증강

9,10)

등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

봉독약침이 관절염에 미치는 영향에 대한 임

상적 연구로는 김11),이 등

12)이 슬관절염의 통증,

부종,염증 억제에서 유의한 효과가 있다고 보고

하였고,실험적 연구로는 정13),서 등

14)이 슬관절

의 collagen및 adjuvant유발 관절염에서 통증과

부종의 감소에 유의한 효과가 있다고 하였으며,

이 등15)이 사람의 말초혈액에서 채취 분리한 수

지상세포와 Tcell에서 면역증강에 유의한 효과

가 있음을 보고하였다.

녹용약침이 관절염에 미치는 임상적 연구로는

박 등16)이 슬관절의 통증억제,일상생활지수의

개선 등을 보고하였고,실험적 연구로는 이 등8)

이 iNOS와 NO의 생성을 억제하여 항산화,항염

증의 유의한 효과가 있음을,김 등10)이 T-cell의

IL-2,INF-γ,TNF-α의 생산을 억제하고 관절내

항체형성을 지연시키는 효과가 있음을 보고하였

다.

이처럼 봉독약침과 녹용약침은 관절염에 유의

한 효과가 있는 것으로 보고되고 있으나,봉독약

침과 녹용약침의 비교 및 병행사용의 효과에 대

한 연구는 부족한 실정이다.

이에 봉독 약침과 녹용 약침이 monosodium

iodoacetate(이하 MIA)유도 관절염 흰쥐의 관절

에 미치는 영향을 알아보고자 동물행동학적 반응

평가,통각역치,혈청학적 평가,조직학적 평가,

면역화학적 방법 등의 방법으로 관찰하여 유의한

결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 실 험

1.재료

1) 동물

체중이 약 290±5g의 Sprague-Dawley계 흰쥐

(8～9주령,웅성,대한실험동물)를 각 군당 16마

리씩 총 80마리를 사용하였다.사육실의 온도는

25±1℃,습도 55±10%를 유지하였으며,명암은

12시간 주기로 하였다.고형 사료와 물은 자유롭

게 먹도록 하였다.

2) 군 분류

군 분류는 정상군(Normalgroup,n=16),퇴행

성관절염이 유발된 대조군(Controlgroup,n=16),

BV군(Beevenomgroup,n=16),CC군(Cervicornu

parvum group,n=16),BV+CC군(Beevenom and

봉독약침과 녹용약침이 MIA유도 골관절염 흰쥐에 미치는 영향

63

Cervicornuparvumgroup,n=16)으로 무작위 할

당하였다.

정상군과 대조군은 21일 동안 1일 1회 동량의

생리 식염수를 주사하였고,BV는 Beevenom

acupuncture100㎕,CC는 Cervicornuparvum

pharmacoacupuncture를 100㎕,BV+CC는 Bee

venomacupuncture100㎕과 Cervicornuparvum

pharmacoacupuncture100㎕를 21일 동안 1일 1

회씩 주 5회 흰쥐의 슬관절 犢鼻(ST35)부위에

주사하였다(TableⅠ,Fig.1).

Group Number Compositionofexperimental

Normal 16 Normalgroup

Control 16MIA-inducedosteoarthritis(OA)groupandnotreatment

BV 16OAinducedandtreatedwithBeeVenomacupuncture

CC 16OAinducedandtreatedwithCerviCornuParvumpharmacoacupuncture

BV+CC 16OAinducedandtreatedwithBeeVenomacupuncture and CerviCornu Parvumpharmacoacupuncture

TableⅠ.ClassificationofExperimentalGroups

1～14days 1～21days

MIAinjection&

Histopathological

evaluation

․Normalgroup

․Controlgroup

․BVgroup

․CCgroup

․BV+CCgroup

Measurementofbehavioral

test

Histopathologicalstain

Immunohistochemicaltest

Fig.1.Designofexperiment.

2.약침액 및 모델

1) 약침액의 제조

선행연구와 임상상 활용되는 투여량을 참조하여

봉독약침과 녹용약침은 1%농도가 되도록 제조하

였다.제조는 봉독과 녹용약침을 생리 식염수에 희

석하여 0.45㎛와 0.2㎛ poresizemembrane

filter를 이용하여 차례로 여과 과정(Fig.2)을 거

쳐 신선하게 보관하였다가 실험에 사용하였다.

Crudepowderbufferedinsaline

Membranefilter0.45㎛ poresize

Sampleforpharmacoacupuncture

Fig.2.ProcedureforfilteringCerviCornuParvum

pharmacoacupuncturesolution.

2) 약침 혈위 선정 및 약침 시술 방법

퇴행성관절염을 유발시킨 후 동물에서의 취혈

원칙을 참조하여 인체의 犢鼻(ST35)에 상응하는

부위인 슬개골의 외측 2㎜ 부위에서 취혈 하였

다17,18).약침 시술은 동물의 피부로부터 2㎜ 내

외의 깊이로 각 부위에 100㎕ 용량 되도록 주입

하였다.약침 주입기로는 용량 1.0㎖의 1회용 주

사기(주사침 26guage,보인메디카,한국)를 사용

하였다.

3) 관절염 모델

퇴행성관절염 유발은 Dunham 등19)의 방법을

인용하여관절염을유발하였다.실험 동물실에서적

응된 흰쥐를 마취 챔버(Royalmedical,한국)에 넣

고,70%N2O,21.5%O2,2.0%enflurane을 혼합시

킨 가스로 흡입마취 후,monosodium iodoacetate


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(I2512,Sigma,Poole,UK)를 슬관절 내에 주사

(intra-articularinjection)하였다.MIA는 0.9%sterile

saline에 용해하여 한 관절당 50㎕씩 3㎎을 주

사하였으며,대조군은 동일한 위치에 saline50

㎕씩을 주사하였다.MIA주사 후 3∼4일까지 실

질성 염증이 관찰되어졌으며,일반적인 건강상태

를 관찰하였으나 특별한 임상 소견은 없었다.관

절염 유발에 관한 병리학적 평가는 퇴행성관절염

유발 전,주사 후 3,7,14일째에 각각 4마리씩 부

검하여 퇴행성관절염 유발 정도를 조직학적 방법

을 통해 확인하였다.

3.평가 방법

1) 족저부 통증 평가(Plantar test)20)

실험군에서 퇴행성관절염 유발전과 유발 후 7,

14,21일째 행동학적 평가를 시행하였다.열성 통

각과민에 대해서는 족저부 통증 검사를 이용하여

흰쥐의 후족 족저부를 적외선 열방사 장치(열원

50℃)위에 위치시켜 회피반응을 보이기까지의

시간을 0.1초 단위로 측정하여 회피반응의 잠복

기를 구하였다.

2) 접촉 감각 평가(Touch test sensory evaluator)21)

실험군과 대조군 모두에서 골관절염 유발 전과

유발 후 7,14,21일째 기계적 자극에 대한 통각

역치를 구하기 위하여,vonFreyfilament(North

CoastMedicalInc.,Touch-TestTMSensoryEvaluator,

USA)를 이용하여 흰쥐의 회피반사 유발횟수를

측정하였다.Monofilament를 사용하여 점상 자극

(punctatestimulation)을 가하였다.자극은 발바

닥의 근위부에 주었으며,측정 시 monofilament

의 끝이 흰쥐의 발바닥 면에 수직으로 접촉된 상

태에서 약간 휘어질 정도로 6초씩 적용하였으며,

자극을 가했을 때 갑작스런 발의 회피 반응을 보

이거나 발을 핥을 경우 양성 반응으로 하였으며,

흰쥐의 적응을 막기 위해 실험간 간격은 최소 2

분으로 하였다.기계적 자극은 monofilament의

굵기가 가는 것부터 굵은 것으로 순서대로 자극

하였으며,3회 측정하여 최소 압통각을 유발하는

값을 역치 수준으로 하여 측정하였다.퇴행성관

절염 유발 전,유발 후 7,14,21일에 검사를 실시

하였다.

3) 혈청에서 Prostaglandin E2(PGE2)의 농도 측정

혈청에서 PGE2의 측정은 Model680(BIO-RAD

Inc.,Japan)의 기기에 PGE2 assaykit(R & D

SystemInc.,Minneopolis,USA)를 사용하여 정량

하였다.치료 종료 후 21일째에 각 군으로부터 심

장 채혈하여 혈청을 분리한 뒤,먼저 Calibrator

Diluent RD5-39를 비특이적 결합(nonspecific

binding,NSB)을 한 well에 150㎕씩 첨가하고,

CalibratordiluentRD5-3950를 첨가하여 zero

standard(B0)well을 만들었다.다음으로 microplate

well에 sample과 100㎕의 standard용액을 첨가

하고,blank와 NSBwell을 제외한 나머지 well에

50㎕의 1차 항체 용액(primaryantibodysolution)

을 첨가하고,blank를 제외한 나머지 well에 50

㎕의 PGE2Conjugate를 처리하였다.마지막으로

실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 수세 용액

(washbuffer)으로 깨끗이 세척한 후 암실에서

substratesolution을 각각의 well에 200㎕ 첨가

하여 30분간 반응시켰다.마지막으로 50㎕의 정

지용액(stop solution)을 첨가하여 반응시킨 후

ELISA reader(Bio-Rad,Hercules,Calif)로 450

nm에서 흡광도를 측정하였다.


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4) 혈청학적 검사

실험 종료 후 간독성을 확인하기 위해 모든 흰

쥐를 경추탈골하고 심장천자로 약 3㎖ 정도의

혈액을 채취한 다음 원심분리기로 10분간 3,500

rpm에서 원심 분리하여 혈청을 분리하였다.

AST,ALT활성도는 검사 분석 측정을 위한 시약

(ELITECH,DivisionofSEPPIM SA.France)으로

생화학분석기(RM 2060-18,EltecCo.,Italy)를 사

용하여 측정하였다.

5) 병리조직학적 평가 및 특수염색

(1)조직처리

실험 종료 후 흰쥐를 경추 탈골하여 해부용 고

정 틀에 고정시켰다.병리조직학적 관찰을 위해

슬관절,간 및 신장을 채취하였다.간과 신장은

고정을 위해 4%paraformaldehyde에 고정하였으

며,슬관절은 적출 즉시,10%포르말린(formalin)

에 24시간 고정하였고,10% formicacid로 24시

간 간격으로 72시간 동안 용액을 교환하면서 탈회

를 실시하였다.파라핀 블록의 제작과 냉각은 자

동 포매장치(Tissue-Tex4701,SakuraCo.,Japan)

를 사용하였다.제작된 블록은 회전식 미세박절

기(RotaryMicrotome2040,SakuraCo.,Japan)를

사용하여 조직을 수직방향으로 5μm 두께로 연

속 절편하여,부유 온수조와 신전기 과정을 거쳐

슬라이드에 부착시켰다.제작된 조직 슬라이드는

염증성 침윤(infiltration)정도를 평가하기 위해

Hematoxylin&Eosin(H&E)염색을 실시하였고,연

골층의 퇴행성 정도를 측정하기 위하여 Safranin-O

fastgreen염색을 실시하여 관찰하였다.

(2)Hematoxylin&Eosin(H&E)염색

박절한 조직 절편은 탈 파라핀 과정을 거쳐

Hematoxylin(HHS32,Sigma,StLouis,USA)&

Eosin(HT110232,Sigma,StLouis,USA)으로 염

색 한 다음 1%Hcl,70%A/C용액에 3～5회 담

근 후,다시 흐르는 수돗물에 수세하고 1%암모

니아수에 5～10회 담구어 핵을 청화시킨 다음 탈

수 및 투명 과정을 거친 후 봉입하였다.

(3)Safranin-Ofastgreen염색

실험군 사이의 세포외 기질 변화를 관찰하기

위하여,기질인 당단백의 sulfur기에 반응하는 원

리를 이용한 SafraninO-fastgreen염색법을 실

시하였다.박절한 조직 절편은 탈 파라핀과 함수

처리 과정을 거친 후 Weigert’sironhematoxylin

(HT110232,Sigma,StLouis,USA)용액에 10분

간 반응시킨 후 수세하고,0.02%fastgreen(FCF)

용액(F7258,Sigma,StLouis,USA)에 5분간 염색

하였다.1%aceticacid용액에 반응시킨 후 0.1%

SafraninO(S2255,Sigma,StLouis)용액에 염색

하였다.SafraninO-fastgreen으로 염색된 슬라

이드는 5분 동안 세척하여 핵이 청명한 색이 되

도록 하고,탈수 및 투명 과정을 거친 후 봉입하

였다.

(4)조직학적 관찰 및 평가

광학현미경(OlympusBX50,OlympusOptical

Co.,Japan)을 사용하여 각각의 조직 절편의 염증

세포의 침윤정도,연골과 뼈의 파괴 유무,세포

파괴 유무를 관찰하였으며,현미경에 장착된 디

지털 CCD카메라(Foculus,Germany)로 각 군의

조직들을 촬영하였다.퇴행성관절염 부분의 정도

를 평가하기 위하여 Galois22)가 수정한 Mankin's

score를 측정하였다.Mankin'sscore는 2명의 독

립된 관찰자에게 단계에 대해 설명한 후 등급을

매기게 하였다.이 점수는 조직 구조(structure),

세포형(cellularity),SafraninO-fastgreen염색,

연골세포층의 두께(thickness of hypertrophic


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chondrocyte layer),골 재형성과 골파괴(bone

remodellingandosteolysis)등으로 구분화하여

점수화하였다(TableⅡ).

Grade State

Structure

0 Normal

1 Pannusandsurfaceirregularities

2 Cleftstotransitionalzone

3 Clefttoradialzone

4 Clefttocalcifiedzone

5 Completedisorganization

Cellularity

0 Normal

1 Diffusehypercellularity

2 Cloning

3 Hypocelluarity

Stain

0 Normal

1 Slightreduction

2 Moderatereduction

3 Severereduction

Thicknessofhypertrophicchondrocytelayergrade

0 Normal

1 Moderatedecrease

2 Totaldecrease

Boneremodellingandboneosteolysisweregrade

0 No

1 Yes

Respectively

0 No

1 Yes

TableⅡ.ScaleofOsteoarthritisLesion(Mankin'sScore)

6) 면역조직화학 염색

퇴행성관절염 유발 모델에서 약침 치료 후 파

라핀 포매 후 5μm 두께로 박절한 절편은 염증

과 통증에 관련한 단백질 발현을 알아보기 위해

면역조직화학 반응 검사를 실시하였다.약침을

처리한 관절조직과 척수의 면역조직학적 염색은

조직의 탈 파라핀 과정을 끝낸 후 면역조직화학

염색을 위한 전 처리 과정으로 3%의 endogenous

peroxidase를 사용하여 차단시켜주고,0.15%triton

X-100을 첨가한 PBS용액을 사용하여 조직의 투

과성을 높여 조직 내부에 1차 항체 용액이 잘 흡

수되도록 하였다.1% normalblockingserum으

로 1시간 정도 처리하여 비특이적 반응을 차단한

후,0.01M PBS로 여러 번 세척하였다.관절에

anti-COX-1(1:500,SantaCruz,CA),anti-COX-2

(1:500,SantaCruz,CA)를척수에c-fos(1:500,Sigma,

USA),substanceP(1:500,SantaCruz,CA)를 4

℃에서 반응 시킨 후 0.01M PBS로 여러 차례 수

세하였다.Anti-biotinylateduniversalsecondary

(PK-8800,Vectastain,USA)로 1시간 동안 반응시

켰으며,0.01M PBS로 수세과정을 거쳐 10분간

DAB(3,3’-Diaminobenzidine,60382248,ZYMED

Lab,Germany)로 발색 반응을 유도하였다.0.01

M PBS로 10분씩 3회,증류수로 10분씩 3회 수세

한 후 조직을 슬라이드에 올려 Hematoxylin으로

3분간 염색한 후 흐르는 물에서 수세하고 80%,

90%,100%에탄올에 반응시키고,100%xylene에

조직을 처리하여 탈수 및 투명 과정을 거쳤다.그

후 슬라이드는 mountingmedia를 이용하여 봉입

을 실시하였다.COX-1,COX-2,c-fos,Substance

P발현정도는면역조직화학법으로처리한조직절편

을 광학현미경 하에서 다음과 같이 반정량적 방법

(semiquantitativemanner)으로 구분하여 negative(-),

mild(+),moderate(++),severe(+++)로 평가하였

다.

4.통계처리

본 실험의 통계학적 분석은 SPSSforwindows

ver.12.0을 사용하였다.시간에 따른 실험군들 사이

의 통계적 유의성 검정을 위하여 one-wayANOVA

를 실시하였으며,사후검정으로 Duncaǹstest를

사용하였다.각 실험군의 측정시기에 따른 차이

를 검정하기 위하여 Pairedt-test를 실시하였다.


67

분석 시 유의 수준은 p-value값이 0.05미만인 경

우에만 유의성을 인정하였다.

Ⅲ. 성 적

1.봉독약침과 녹용약침의 안전성 및 MIA 안

정성 평가

1) 간 독성에 미치는 영향

봉독과 녹용약침이 간에 미치는 영향을 알아

보기 위해 혈액학적 검사를 통해 ALT와 AST를

조사하였다.

ALT는 정상군이 56±7.8IU/L인데 비하여 대

조군에서 70±6.9IU/L로 유의하게 증가되었으나,

BV군은 67±10.1IU/L,CC군은 63±11.6IU/L,

BV+CC군은 60±9.6IU/L로 대조군에 비해 유의

하게 감소하였다(p


68

A.NormalGroup B.ControlGroup

C.BVGroup D.CCGroup

E.BV+CCGroupFig.5.EffectofBVandCCtreatmentonthehistological

changeofliverineachgroup(21days,H&Estain,

×100).OtherlegendsarethesameasFig.3.

(2)신장의 형태적 변화

봉독과 녹용약침이 흰쥐의 신장 사구체 형태

에 미치는 영향을 알아보기 위해 H&E염색으로

관찰하였다.단층 편평상피로 구성된 사구체낭과

신소체들이 잘 관찰되는 정상군과 비교하여 대조

군과 실험군들 모두에서 신장의 조직학적 소견은

정상군과 거의 유사하였다(Fig.6).

A.NormalGroup B.ControlGroup

C.BVGroup D.CCGroup

E.BV+CCGroupFig.6.EffectofBVandCCtreatmentonthehistological

changeofkidneyineachgroup(21days,H&E

stain,×100).OtherlegendsarethesameasFig.3.

3) MIA로 유도된 퇴행성관절염의 조직학적 소견

MIA주사 유발 전,유발 후 3,7,14일째 관절

연골의 침습 정도를 확인하기 위하여 흰쥐의 우측

슬관절을 H&E염색 및 SafraninO-fastgreen염

색로 관찰하였다.MIA처리 전에 정상 관절 조직

은 연골의 침습이나 염증성 소견이 전혀 관찰되지

않았다.주사 3일째 슬관절의 연골 부분에서 염증

성 소견이 확인되었다.7일째에는 proteoglycan의

소실이 모든 구획에서 관찰되었다.MIA주사 14

일째에서 연골의 심부층까지 많은 소실을 관찰하

였다(Fig.7,8).


69

A.MIA-nontreatmentB.MIA-treated3day

C.MIA-treated7dayD.MIA-treated14dayFig.7.Histologicalanalysisofarticularcartilagepre-

andpost-monosodiumiodoacetatetreatment(H&E

stain,×200).

A.MIA-nontreatmentB.MIA-treated3day

C.MIA-treated7day D.MIA-treated14dayFig.8.Histologicalanalysisofsynovialtissueandarticular

cartilagepre-andpost-monosodium iodoacetate

treatment(SafraninO-fastgreenstain,×200).

2.봉독약침과 녹용약침의 유효성 평가

1) 족저부 통증 평가

열성통각 과민을 평가하기 위한 족저부 통증

검사에서 봉독과 녹용 약침 처치 전 대조군은

12.48±3.90sec,BV군은 12.58±1.90sec,CC군은

13.45±3.90sec,BV+CC군은 13.72±3.90sec로 나

타났다.봉독과 녹용 약침 처치 후 7일째,대조군

은 14.47±1.70sec,BV군은 17.84±3.88sec,CC군

은 18.22±5.71sec,BV+CC군은 21.64±4.49sec로

투여 전에 비하여 회피반응의 잠복기가 지연되는

것을 확인할 수가 있었다.특히,BV+CC군이 다

른 실험군에 비해 시간이 지남에 따라 회피반응

의 잠복기가 지연되는 것을 관찰할 수 있었다.

투여 후 14일째,대조군은 13.44±3.00sec,BV군

은 18.42±4.45sec,CC군은 21.72±5.93sec로 유의

한 변화를 보였고,BV+CC군에서도 22.56±6.74

sec로 유의한 변화를 보였다(p＜0.05).투여 후 21

일째,대조군은 14.45±2.60sec,BV군은 22.41±

8.66sec,CC군은 23.46±5.62sec로 유의한 변화

를 보였으며,BV+CC군에서도 26.31±7.46sec로

유의한 변화를 보였다(p＜0.05)(TableⅢ).

Group Pre 7days 14days 21days

Control12.48±3.90† 14.47±1.70† 13.44±3.00† 14.45±2.60†

BV 12.58±1.90† 17.84±3.88*† 18.42±4.45*‡ 22.41±8.66*‡

CC 13.45±3.90† 18.22±5.71*‡ 21.72±5.93*‡ 23.46±5.62*‡

BV+CC 13.72±3.90† 21.64±4.49*‡ 22.56±6.74*‡ 26.31±7.46*‡

Valuesareshowedmean±SD

Valuewithdifferentsuperscriptsinthesamecolumnare

significant(p


70

째 대조군은 3.21±0.64,BV군은 4.31±0.45,CC군

은 3.38±0.36,BV+CC군은 4.5±0.82으로 나타났다.

치료 후 14일째 대조군은 3.36±0.36,BV군은 4.78

±0.63,CC군은 4.07±0.74,BV+CC군은 5.09±0.54

로 실험군들 간에 유의한 차이를 보였다(p


71

4) 병리조직학적 평가

실험 종료 후 21일에 흰쥐의 연골의 변화를 보

기 위하여 흰쥐의 우측 슬관절 조직을 H&E와

SafraninO-fastgreen염색으로 관찰하였다.실

험 종료 후 21일째 H&E염색과 SafraninO-fast

green에 의해 연골의 침습 정도를 확인한 결과

대조군에서 슬관절의 연골 부분에 미약한 염증성

소견이 발견되었다.이 염증은 활액막의 부종에

의한 것으로 보여 진다.BV군,CC군,BV+CC군

에서는 경등도의 활막염이 관절낭 부분에서 관찰

되었으며,proteoglycan의 소실이 관찰되었고,관

절의 일부 구획에서 손상세포들이 관찰되었으나,

연골층이 대조군에 비해 많이 호전됨을 확인할

수 있었다(Fig.11).

Mankin'sscore22)는 실험 종료 후 21일째에서

대조군은 8.4±1.6점,BV군은 6.8±0.7점,CC군은

6.0±1.0점,BV+CC군은 5.1±0.8점으로 14일째부터

CC군과 BV+CC군에서 유의하게 점수가 감소하

였고,약침 치료 이후에 관절 연골의 조직 파괴

정도가 호전되었다(TableⅥ,Fig.12).

A.ControlGroup B.BVGroup

C.CCGroup D.BV+CCGroupFig.11.EffectofBVandCConthehistopathological

change in knee jointofarthritisrats.After

experimentalperiod(21days,SafraninO-fast

greenstain,×200).

Group Control BV CC BV+CC

Mankin'sScore 8.4±1.6 6.8±0.7* 6.0±1.0* 5.1±0.8*

Valuesareshowedmean±SD

TestedbyOne-wayANOVAandmultiplecomparisontest.

OtherlegendsarethesameasFig.3.

*:statisticallysignificantascomparedwithcontrolgroup

(p


72

GroupDayofexamination

1stday 7thday 14thday 21thday

Control ++3 +++4 +++4 ++3

BV ++3 ++3 +2 +2

CC ++3 ++3 ++3 +2

BV+CC ++3 ++2 +2 -1

-1:Negative,+2:Mildexpressed,++3:Moderateexpressed,

+++4:Severeexpressed

TableⅦ.ChangeofCOX-1ExpressioninEachGroup


C.CCGroup D.BV+CCGroupFig.13.ChangeofCOX-1expressionineachgroup

(21days,×200).

6) COX-2의 면역조직화학적 변화

슬관절 부분 연골세포에서의 cyclooxyganase-2

(COX-2)발현을 관찰하여 본 결과 COX-2는 진

한 갈색으로 관찰되었다.정상군은 COX-2발현

이 전혀 보이지 않았으며,대조군은 21일째에는

COX-2발현 반응이 감소하긴 하였으나 발현이

지속됨을 보였다.모든 실험군에서는 1일과 7일

에 높은 COX-2양성 반응을 보이다가 14일부터

감소되어 21일에는 많이 감소되었다(TableⅧ,

Fig.14).

GroupDayofexamination

1stday 7thday 14thday 21thday

Control ++3 ++3 ++3 ++3

BV ++3 +++4 ++3 +2

CC ++3 ++3 ++3 +2

BV+CC ++3 ++3 +2 -1

-1:Negative,+2:Mildexpressed,++3:Moderateexpressed,

+++4:Severeexpressed

TableⅧ.ChangeofCOX-2ExpressioninEachGroup


C.CCGroup D.BV+CCGroupFig.14.ChangeofCOX-2expressionineachgroup

(21days,×200).

Ⅳ. 고 찰

퇴행성 관절염은 관절 연골이 닳아 없어지면

서 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환으로

노쇠현상이나 과대한 체중과 관계가 깊으며 퇴행

성 관절질환,골관절염이라고도 불린다2).퇴행성

슬관절염은 골관절염의 호발 부위로 관절 연골의

퇴행성 변화는 고령에 기인하는 것 외에도 슬관

절부의 병변이나 손상,비만증,내반슬,외반슬

등 기계적 부하 축의 이상,감염증 또는 여러 가

지 관절염 등에 의해서도 발병된다.초기 증상으

로는 슬관절의 동통과 이상음이 들리고,계단 오

르내리기,기립하기 힘들게 되며,만성적으로 활

액막의 비후,관절액의 증가,근육 경련 등이 오


73

고 결국 근육위축,운동제한,관절 잠김과 같은

소견이 나타난다3,23).퇴행성 관절염은 병리적 진

행 과정을 멈출 수 없을 뿐만 아니라 통증이 기

능장애의 주된 원인이 되므로 통증 감소를 치료

의 일차 목표로 삼는다24,25).

퇴행성 관절염의 염증 및 통증을 유발시키는 병

리적 기전은 연골세포 대사의 변화로 인한 관절연

골의 미란(erosion),연골하 골의 경화,관절 주위

골의 과잉형성,관절의 변형 등인데26)실험적으로

통증을 유발시키는 prostaglandin(PG)의 생성은

LPS,SNP또는 물리적,퇴행적 변화에 의한 자극

이 관절에 가해지면서 윤활액 내의 macrophage

migrationinhibitoryfactor(MIF)의 증가27),염증

성 전사인자인 nuclearfactor-κB의 활성과 염증

효소 cyclooxygenase(COX)-1와 cyclooxygenase

(COX)-2,inducednitricoxidesynthesis(iNOS)의

증가28)등이 관련되어 진다.

봉독약침과 녹용약침은 약재의 효능을 직접적

으로 활용하여 염증 및 통증을 억제하는 치료법

으로 임상에서 폭넓게 사용되고 있는데4),주로

류마토이드 관절염29),슬관절염

16,30),요추 추간판

탈출증31)등의 질환에서 효과를 발휘하는 것으로

보고되고 있다.이는 봉독의 유효 성분인 melitin

이 윤활막에서 염증 반응에 관여하는 COX-2및 신

경세포의 산화적 손상을 유발하는 nitricoxide(NO)

등을 생성하는 iNOS와 통증 유발 물질인 PGE2

의 발현을 억제하고,기타 유효성분인 apamin과

MCDpeptide가 면역기능을 증가시켜 관절의 염

증성 상태를 억제 또는 개선하기 때문이다32).또

한 녹용은 leucine,methionine,lycine,glycine,

proline,glutamicacid등 17종의 aminoacid와

수종의 무기원소로 밝혀진 동물성 약재33)로 구성

성분과 항염증 및 소염에 관련된 직접적인 관련

인자에 대한 보고는 부족한 편이나,실험적으로

LPS유발 관절염의 윤활관절막내의 MIF,COX-2,

iNOS및 PGE2의 발현을 억제하며,윤활관절세포

의 세포증식을 감소시키고,혈관 신생성을 조절

하는 효과가 있는 것으로 보고되고 있다8,10,34).

봉독은 꿀벌의 독낭에 들어있는 약 40여 가지

유효성분으로 구성된 물질로 性味는 苦,辛,有毒

하며,祛風除濕,止疼痛,解痙平喘,消腫降壓하는

효능이 있고,녹용은 사슴과에 속한 척추동물인

梅花鹿 또는 馬鹿 및 同屬 근연동물의 雄鹿頭上

의 未骨化된 帶毛茸의 幼角으로 性味는 甘鹹,溫

有毒하며,補肝陽,益精髓,强筋骨 등의 효능이

있다33).봉독약침과 녹용약침은 봉독과 녹용의

유효성분을 추출하여 질병과 관련된 혈위에 주입

하여 침 치료와 약재의 생화학적 작용을 치료에

응용하는 신침요법의 하나이다5,6).

연구에 사용된 MIA 모델은 연골세포의

glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase활동

을 억제하여 연골의 구조적인 통합을 저해함으로

써 관절 연골에서 점차적으로 조직학적 및 형태

학적 변화를 일으키는 방법이며,MIA모델은 사

람과 유사한 퇴행성 관절염 모델을 형성한다35,36).

기존의 Freund'sincompleteadjuvant를 이용한

다발성 관절염 모델은 자가면역질환(autoimmune

disease)의 환경을 조성하여 류마티스 관절염

(rheumatoidarthritis)모델로 많이 사용되어지

며,MIA관절염 모델은 활막의 비후와 염증세포

의 침윤을 특징적으로 반복 진행하게 되어 관절

의 연골과 골을 파괴시켜 관절의 변형을 유도하

여37,38)퇴행성 관절염 모델로 사용되어지고 있다.

본 연구에서는 MIA를 사용하여 모델을 제작하여

퇴행성 관절염 모델이 안정적으로 이루어지는지

알아보았다.

봉독약침과 녹용약침이 MIA 유도 관절염 흰

쥐의 관절에 미치는 영향을 상호 비교하여 보고

자 각각의 약침을 관절에 처치한 뒤 동물행동학

적 반응 평가,통각역치,조직학적 평가,면역화


74

학적 방법 등을 시행하였다.

행동학적인 검사 결과에서 족저부 통증 검사

결과 대조군에 비하여 회피반응의 잠복기가 실험

군들에서 지연되어 열성통각 과민이 감소되는 것

으로 나타났으며,21일째는 BV군이나 CC군 보다

BV+CC군에서 보다 유의하게 통증에 대한 과민

도가 둔화되는 것으로 나타났다.

통증의 변화를 계측하기 위해 시행하였던 접

촉 감각 평가 검사 결과는 관절염 유발 전 슬관

절 및 족저부의 염증과 통증이 관절염 유도로 인

해 심해짐에 따라 민감해져 모든 실험군에서 역

치 값이 상승하였는데,유발 후에는 모든 실험군

에서 역치 값이 급격히 낮아짐을 볼 수 있었다.

또한,치료적 후 시간이 지날수록 족부의 역치

값이 증가하는 것으로 보아 염증과 통증반응이

감소되고 있음을 확인할 수 있었다.특히 21일째

에 역치 값이 유의하게 증가하였다(p


75

한 것으로 나타났다.그러나,이번 실험에서는 조

직학적 관찰만을 시행하여 독성 및 대사과정에서

의 안정성 확보를 위해서는 추가적인 연구도 필

요할 것으로 사료된다.

이상의 결과들을 종합해 볼 때 봉독약침과 녹

용약침은 MIA유도 관절염 흰쥐의 통증을 억제

하며,PGE2의 농도를 억제하고,면역조직화학적

평가에서 COX-1,COX-2의 발현을 억제하는 효

과가 있었으며,병리조직학적으로 관절 연골의

염증 및 연골세포 소실을 억제하는 효과가 있었

다.특히 이러한 효과는 봉독약침과 녹용약침의

병용투여에서 효과적인 것으로 나타났는데,봉독

과 녹용의 항염증,진통 효과가 배가된 것으로

사료되나 상승효과인지에 대해서는 추가적인 연

구가 필요하다.

Ⅴ. 결 론

봉독약침과 녹용약침의 MIA 유도 관절염 흰

쥐의 관절에 미치는 영향을 상호 비교하여 보고

자 동물행동학적 반응 평가,통각역치,조직학적

평가,면역화학적 방법 등의 방법으로 관찰한 결

과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1.족저부 통증 평가에서 실험군 모두 대조군

에 비해 유의하게 통증이 개선되었으며,

BV+CC군에서 보다 유의하게 개선되었다.

2.접촉 감각 평가에서 실험군 모두 대조군에

비해 유의하게 역치 값이 상승하였으며,

BV+CC군에서 보다 유의하게 상승하였다.

3.혈중 PGE2의 농도는 실험군 모두 대조군에

비해 유의하게 감소하였으며,BV+CC군에

서 보다 유의하게 감소하였다.

4.슬관절의 병리조직학적 평가에서 실험군 모

두 대조군에 비해 유의하게 퇴행성관절염

점수가 감소하였다.

5.슬관절의 COX-1,2의 발현양상이 실험군 모

두 대조군에 비해 감소하였다.

참고문헌

1.대한병리학회.병리학.서울:고문사.1997:1166-70.

2.대한정형외과학회.정형외과학.서울:최신의학사.

2006:195-201,517.

3.MerckResearchLaboratories.머크 임상의학 진

단 및 치료.서울:도서출판 한우리.2002:487.

4.백승일,안중철,김영진,김형석,권기록.대한침

구학회지에 게재된 약침관련논문의 유형 분석.

대한침구학회.대한침구학회지.2006;23(6):24-5.

5.대한약침학회.약침요법 시술지침서.서울:한성

인쇄.1999:187-94.

6.대한약침학회.약침요법총론.대한약침학회.1999;

264.

7.배철우,송호섭.인체활막세포를 대상으로한 봉

독약침의 염증 치료 기전 연구.대한침구학회.

대한침구학회지.2004;21(3):121-31.

8.이현진,조현석,황민섭,정찬영,이동건,김은

정,김갑성,김경호.녹용약침이 백서의 제2형

Collagen유발 관절염에서 iNOS발현과 NO

생성 억제에 미치는 영향.대한침구학회.대한

침구학회지.2008;25(5):105-16.

9.이승덕,김갑성.우슬 및 봉독약침이 생쥐의

LPS유발관절염의 세포성면역반응에 미치는 영

향.대한침구학회.대한침구학회지.1999;16(3)


76

:287-315.

10.김진규,김갑성.TypeⅡ Collagen으로 유발된

관절염에 대한 녹용약침의 억제효과에 관한

연구.대한침구학회.대한침구학회지.2002;19(6)

:155-70.

11.김행범,이로민,이민호,최양식,김종인,이윤호,

이재동.퇴행성 슬관절염 환자에서 근육 내 봉

독약침과 피내 봉독약침의 효능 비교연구.대

한침구학회.대한침구학회지.2008;25(2):151-64.

12.이상훈,이현종,백용현,김수영,박재경,홍승재,

양형인,김건식,이재동,최도영,이두익.봉독

약침이 류마티스 관절염 환자의 관절 통증,

종창 및 급성 염증 반응에 미치는 영향.대한

침구학회.대한침구학회지.2003;20(2):77-84.

13.정인태,백용현,박동석,최도영.봉독약침이

Collagen유발 관절염에 미치는 진통효과 및

그 기전 연구.대한침구학회.대한침구학회지.

2005;22(1):99-108.

14.서동민,박동석,강성길.봉독약침이 Adjuvant

유발 관절염에 미치는 진통효과 및 그 기전

에 관한 연구.대한침구학회.대한침구학회지.

2003;20(2):85-97.

15.이한성,정석희,이종수.류마토이드 관절염에

대한 봉독약침액의 면역조절능력에 관한 연구.

한방재활의학과학회.한방재활의학과학회지.2007

;17(2):55-66.

16.박은주,신정철,나건호,이동현,한상균,윤여충,

채우석,조명래.녹용약침의 퇴행성 슬관절염

에 대한 임상적 연구.대한침구학회.대한침구

학회지.2004;21(2):275-86.

17.박희수.腧穴硏究鍼灸學.서울:의성당.1996:73.

18.임종국.艾灸生體反應의 文獻的考察.서울:동

양의학.1976:63-8.

19.DunhamJ,ChayenJ,BitenskyL,Mehdizadeh

S,OlderJ.Testingdrugsonhumanosteoarthritic

articularcartilage.CellBiochem Funct.1994

Jan;12(1):63-8.

20.HargreavesK,DubnerR,BrownF,Flores

C,JorisJ.Anewandsensitivemethodfor

measuringthermalnociceptionincutaneous

hyperalgesia.Pain.1988Jan;32(1):77-88.

21.ZahnPK,SlukaKA,BrennanTJ.Excitatory

aminoacidreleaseinthespinalcordcaused

byplantarincisionintherat.Pain.2002Nov

;100(1-2):65-76.

22.GeobelJC,BolbosR,PinzanoA,Schaeffer

M,RengleA,GaloisL,EtienneS,NetterP,

LoeuilleD,BeufO,GilletP.Invivoratknee

cartilagevolumemeasurementusingquantitative

high resolution MRI(7T):feasibility and

reproducibility.Biomed MaterEng.2008;

18(4-5):247-52.

23.RobertK.Snider.EssentialsofMusculoskeletal

Care.서울:한우리.1999:324-6.

24.이재호.관절염/비만 건상상태 평가 도구.가

정의학회지.2003;24(4):376-85.

25.BellamyN.Outcomemeasurementinosteoarthritis

clinicaltrials.JRheumatolSuppl.1995;43:49-51.

26.해리슨 내과학 편찬위원회 편.내과학.서울:

정담.1997:1821-7.

27.MorandEF.Newtherapeutictargetininflammatory

disease:macrophagemigrationinhibitoryfactor.

KInternalmedicine.2005;35:419-26.

28.SampeyAV,HallPH,MitchellRA,MetzCN,

Morand EF.Regulation of synoviocytes

phospholipaseA2andcycloxygenase2by

macrophage migration inhibitory factor.

ArthritisRhuem.2001;44:1273-80.

29.황유진,이건목,황우준,서은미,장종덕,양귀

비,이승훈,이병철.봉약침을 이용한 류마토


77

이드 관절염의 임상적 연구.대한침구학회.

대한침구학회지.2001;18(5):33-42.

30.왕오호,안규법,임진강,장형석.퇴행성슬관절

염의 봉독약침 치료효과에 대한 임상적 고찰.

대한침구학회.대한침구학회지.2001;18(3):35-47.

31.배은정,조현열,진재도,신민규,한상균,양기영,

황규정,신영일,이현,이병렬.봉독약침병행

치료한 요추추간판탈출증 환자의 임상 고찰.대

한침구학회.대한침구학회지.2002;19(1):54-64.

32.E.S.Assem,G.Atkinson.Histaminerelease

byMCDP(401),apeptidefrom thevenom

ofthehoneybee.Brit.Pharmacol.1973:337-8.

33.전국한의과대학 본초학교실.본초학.서울:영림

사.1991:204-5.

34.정용래,이승덕,변혁,박인식,정찬영,이창환,

김갑성.녹용약침이 LPS유발 관절염의 윤활

관절막내 과다염증반응 조절에 미치는 영향.

대한침구학회.대한침구학회지.2007;24(4):167-81.

35.JanuszM.J.,HookfinE.B.,HeitmeyerS.A.,

WoessnerJ.F.,FreemontA.J.,HoylandJ.A.,

BrownK.K.,HsiehL.C.,AlmsteadN.G.,DeB.,

NatchusM.G.,PikulS.,TaiwoY.O.Moderation

ofiodoacetate-inducedexperimentalosteoarthritis

inratsbymatrixmetalloproteinaseinhibitors.

OsteoarthritisCartilage.2001;9(8):751-60.

36.GuzmanR.E.,EvansM.G.,BoveS.,Morenko

B.,KilgoreK.Mono-iodoacetate-inducedhistologic

changesinsubchondralboneandarticular

cartilageofratfemorotibialjoints:ananimal

modelofosteoarthritis.ToxicolPathol.2003;

31(6):619-24.

37.BoissierM.C.,BessisN.Therapeuticgenetransfer

forrheumatoidarthritis.Reumatismo.2004;

56(1Suppl1):51-61.

38.GoldringS.R.Pathogenesisofboneerosion

inrheumatoidarthritis.CurrOpinRheumatol.

2002;14:406-10.

39.CryerB,DuboisA.Theadventofhighlyselective

inhibitorsofcyclooxygenase-areview.Prostaglandins

otherLipidMediat.1998;56(5-6):341-61.

40.HortonJK,WilliamsAS,Smith-PhillipsZ,Martin

RC,ÒBeirneG.Intracellularmeasurementof

prostaglandinE2:Effectofanti-inflammatory

drugscyclooxygenaseactivityandprostanoid

expression.AnalBiochem.1999;271(1):18-28.

41.심재영.봉독약침이 RAW 264.7세포의 COX-2,

p83,ERK및 JNK에 미치는 영향.경원대학

교 대학원.2003.

봉독약침과 녹용약침이 mia 유도 골관절염 흰쥐에 미치는 영향 · 5)...

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