1

京都大学大学院農学研究科

食品生物科学専攻

准教授 保川 清

耐熱性モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素の作製とその応用

2

DNA 合成酵素（DNA polymerase）

RNA

DNA primer

DNA依存性 DNA 合成酵素(DNA polymerase)

RNA依存性 DNA 合成酵素(Reverse transcriptase, 逆転写酵素)

DNA

DNA primer

逆転写酵素はＲＮＡを鋳型としてDNAを合成する。

3

逆転写活性

逆転写酵素がもつ２つの活性

RNA

DNA

RNase H活性

RNA-DNA ヘテロ二本鎖

DNA primer

逆転写酵素は逆転写活性と RNase H活性をもつ。

4

逆転写酵素の活性部位

Palm

Fingers

RNase H

Connection

Thumb

逆転写活性の活性部位

RNase H 活性の活性部位

5

・in vitroでのDNA合成に利用された。・耐熱性酵素が好熱菌で発見された。

DNA 合成酵素（DNA polymerase）の歴史

1950年

1960年

1970年

1980年

1990年

2000年

・RNAウイルスで発見された。

・PCRが開発された。

・大腸菌で発見された。

・RNA増幅法が開発された。

・in vitroでのcDNA合成に利用された。

DNA依存性 DNA合成酵素(DNA ポリメラーゼ)

RNA依存性 DNA 合成酵素(Reverse transcriptase, 逆転写酵素)

耐熱性の逆転写酵素は発見されていない。

6

RNA増幅法

逆転写酵素

RNAポリメラーゼ

PCR

DNAポリメラーゼ

標的DNA標的DNA 標的RNA

RNA分解

標的RNA

RNA分解

95℃

72℃

40℃

7

モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（MMLV RT）

トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（AMV RT)

モノマー α, βヘテロダイマー

NH2

NH2

COOH

COOH

α

β

NH2 COOH

Palm

Fingers

RNase H

Connection

Thumb

実用化されている逆転写酵素

ＭＭＬＶ RTとＡＭＶ RTが分子生物学的研究や臨床診断に実用化されている。

Pal

mFi

nger

s

RN

ase

HC

onne

ctio

nTh

umb

Inte

gras

e

8

高温ではＲＮＡは二次構造をとらない。しかし、逆転写酵素の熱安定性が低いため高温で反応できない。したがって、逆転写酵素の熱安定化が望まれる。

ATGCGCAT

RNAの二次構造

TACGCGTA

AMV RT

MMLV RT

10分間の熱処理で活性が50％に低下する温度 （T50 ）

47°C

44°C

K. Yasukawa et al. J. Biochem. (2008) 143, 261-268

RNAの二次構造と逆転写反応

×cDNA合成反応が止まる

9

タンパク質工学によるタンパク質の熱安定化

T4ファージ リゾチ－ム

W. A. Basse et al. (2010)Protein Sci.19,631-641

サーモライシン

K. Yasukawa and K. Inouye (2007) Biochim. Biophys. Acta1774, 1281-1288

あらゆる残基に変異が導入された。熱安定性をあげる変異はわずかでその効果も小さい。しかし、変異を組み合わせると効果が大きくなる。

変異（S-S結合導入、静電結合導入、疎水性コアの高密度化）を組み合わせると、熱安定性が大きく向上した。(逆転写酵素はこれらの方法では熱安定化されなかった。)

10

AMV RT

MMLV RT

鋳型プライマー非存在下 鋳型プライマー存在下

47°C

44°C

逆転写酵素の熱安定性

52°C

47°C

（＋5ºC）

（＋3ºC）

T50

鋳型プライマーはAMV RTとMMLV RTの熱安定性を向上させた。このことから、逆転写酵素の熱安定性は、鋳型プライマーとの結合が強くなれば向上すると考えた。

K. Yasukawa et al. J. Biochem. (2008) 143, 261-268T50 ：10分間の熱処理で活性が50％に低下する温度

11

O

O

P

Base

O O O

OH

O

PO

O

Base

O

OH

–

O–

O

Base

O

OHO

OH

O

PBase

OOO–

O

O

PBase

OOO–

DNA

RNA 鋳型プライマー

鋳型プライマーはリン酸基をもつため負電荷を帯びている。

DNA RNA

12

部位特異的変異によるMMLV RTの熱安定化

MMLV RTの鋳型プライマーとの結合部位に正電荷を導入すると、鋳型プライマーとより強く結合し、熱安定性が向上すると考えた。

MMLV RT MMLV RT

鋳型プライマー

13

D108

E117D114

Q84

E123

D124

E302

E286

W313

L435

E69

D108

E117D114

Q84

E123

D124

E302

E286

W313

N454L435

鋳型プライマーと相互作用する部位に位置する12アミノ酸残基がそれぞれリシン（K）、アルギニン（R）、アラニン（A）に置換された合計36種の変異型MMLV RTを作製した。

変異を導入したアミノ酸残基

アミノ酸残基の略称

E：グルタミン酸D：アスパラギン酸Q：グルタミンW：トリプトファンL：ロイシンN：アスパラギン

14

E69A, E69K, E69R,Q84A, Q84K, Q84R,D108A, D108K, D108R,D114A, D114K, D114R,E117A, E117K, E117R,E123A, E123K, E123R,D124A, D124K, D124R,E286A, E286K, E286R,E302A, E302K, E302R,W313A, W313K, W313R,N454A, N454K, N454R,L435A, L435K, L435R,D524A

作製した変異型MMLV RT

Palm

Fingers

RNase H

Connection

Thumb

D524は524番目のアスパラギン酸残基。RNase H活性に必須。この残基に変異が導入されると、

RNase H活性が消失するとともに、熱安定性が向上することが知られている。

15

変異型酵素の逆転写活性

0

2

4

6

8

WT

D52

4AE6

9AE6

9KE6

9RQ

84A

Q84

KQ

84R

D10

8AD

108K

D10

8RD

114A

D11

4KD

114R

E117

AE1

17K

E117

RE1

23A

E123

KE1

23R

D12

4AD

124K

D12

4RE2

86A

E286

KE2

86R

E302

AE3

02K

E302

RW

313A

W31

3KW

313R

L435

AL4

35K

L435

RN

454A

N45

4KN

454R

比活性x 10-4(units/mg)

ほとんどの変異型酵素が野性型酵素（WT)と同じ活性を有した。

16

変異型酵素の熱安定性

24種の変異型酵素が野性型酵素（WT)より高い熱安定性を有した。さらに、6種の変異型酵素がD524Aより高い熱安定性を有した。

0

5

10

15

20

25

1

WTD524AE69AE69KE69RQ84AQ84KQ84RD108AD108KD108RE114AE114KE114RE117AE117KE117RE123AE123KE123RD124AD124KD124RE286AE286KE286RE302AE302KE302RW313AW313KW313RL435AL435KL435RN454AN454KN454R

WT

D52

4AE6

9AE6

9KE6

9RQ

84A

Q84

KQ

84R

D10

8AD

108K

D10

8RE1

14A

E114

KE1

14R

E117

AE1

17K

E117

RE1

23A

E123

KE1

23R

D12

4AD

124K

D12

4RE2

86A

E286

KE2

86R

E302

AE3

02K

E302

RW

313A

W31

3KW

313R

L435

AL4

35K

L435

RN

454A

N45

4KN

454R

25

0

10

5

20

15

熱処理後の残存活性（％）

17

多重変異による熱安定化

0

5

10

15

20

25

1

WTD524AE69AE69KE69RQ84AQ84KQ84RD108AD108KD108RE114AE114KE114RE117AE117KE117RE123AE123KE123RD124AD124KD124RE286AE286KE286RE302AE302KE302RW313AW313KW313RL435AL435KL435RN454AN454KN454R

WT

D52

4AE6

9AE6

9KE6

9RQ

84A

Q84

KQ

84R

D10

8AD

108K

D10

8RE1

14A

E114

KE1

14R

E117

AE1

17K

E117

RE1

23A

E123

KE1

23R

D12

4AD

124K

D12

4RE2

86A

E286

KE2

86R

E302

AE3

02K

E302

RW

313A

W31

3KW

313R

L435

AL4

35K

L435

RN

454A

N45

4KN

454R

25

0

10

5

20

15

熱処理後の残存活性（％）

•WT（野性型酵素）•D524A•MM3：E286R/E302K/L435R•MM4：E286R/E302K/L435R/D524A

Mar

ker

kDa

97.266.4

44.3

29.0

WT

D52

4AM

M3

MM

4

熱安定性を向上させる変異を組み合わせ、MM3とMM4を作製した。

精製した酵素の電気泳動

18

0

20

40

60

80

100

120

WT、D524A、MM3、MM4の活性と熱安定性

MM3とMM4はWTに比べ顕著に高い熱安定性を有した。

（WTの比活性を100％としたときの相対活性）

活性 熱安定性

（熱処理前の活性を100％とした時の相対活性）

相対活性（％）

相対活性（％）

D524A

WT

MM3

MM4

D524A

WT

MM3

MM4

0

20

40

60

80

100

120

1.414

63

102

19

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25

反応初速度の鋳型プライマー濃度依存性

MM3とMM4のKm（ミカエリス定数）は野性型酵素（WT）の30-40%であった。したがって、MM3とMM4の鋳型プライマーとの親和性はWTよりも高いと考えられる。

鋳型プライマー (μM)

初速度(nMs-1)

Km kcat kcat/Km(μM) (s-1) (μM-1 s-1)

WT 8.4 ± 2.0 (1.0) 13.0 ± 1.2 (1.0) 1.5 ± 0.2 (1.0)

D524A 5.2 ± 1.2 (0.6) 9.2 ± 0.7 (0.7) 1.8 ± 0.3 (1.2)

2.2 ± 1.1 (0.3) 5.6 ± 0.6 (0.4) 2.5 ± 1.1 (1.7)3.3 ± 0.7 (0.4) 6.6 ± 0.4 (0.5) 2.0 ± 0.3 (1.3)

MM3MM4

○：WT、△：D524A、 ●：MM3、▲：MM4

カッコ内の数値はWTを100%としたときの相対値

Km：ミカエリス定数。値が小さいほど、鋳型プライマーとの親和性が強いことを示す。kcat：分子活性。基質が十分存在するときの酵素の活性を示す。

20

熱失活

2

3

4

5

0 5 10 15

ln[相対活性

(%)]

熱処理時間 (分)

48ºC

2

3

4

5

0 5 10 15

50ºC 52ºC

2

3

4

5

0 5 10 15

100%

33%

10%

熱処理時間 (分) 熱処理時間 (分)

2

3

4

5

0 5 10 15

2

3

4

5

0 5 10 15

54ºC 56ºC 58ºC

2

3

4

5

0 5 10 15

ln[相対活性

(%)]

熱処理時間 (分) 熱処理時間 (分) 熱処理時間 (分)

100%

33%

10%

○：WT、△：D524A、 ●：MM3、▲：MM4

熱安定性はMM4＞MM3＞D524A＞WTであった。

21

熱失活（アレニウスプロット）

MM4

熱安定性はMM4＞MM3＞D524A＞WTであった。

ln[kobs(s-1)]

1/T x 103 (K-1)

温度 (⁰C)

58 56 54 52 50 48

-9

-8

-7

-6

-5

-4

3.02 3.04 3.06 3.08 3.10 3.12

T50 (℃) Ea (kJ mol-1)

WT 45.1 ± 4.2 241 ± 46

D524A 47.5 ± 1.1 279 ± 15

54.2 ± 3.1 298 ± 42

55.9 ± 1.5 322 ± 22

MM3MM4

T50 (℃) Ea (kJ mol-1)

WT 45.1 ± 4.2 241 ± 46

D524A 47.5 ± 1.1 279 ± 15

54.2 ± 3.1 298 ± 42

55.9 ± 1.5 322 ± 22

MM3MM4

T50 ：10分間の熱処理で活性が50％減少する温度

Ea ：熱失活における活性化エネルギー

WT

D524AMM3

kobs：熱失活の速度定数。この値が大きいほど熱失活が速いことを意味する。

22

cDNA合成活性の測定

ｃDNA合成： 27 pg/ml RNA、1 mg/ml E. coli RNA、0.2 mM プライマー、200 mM(each) dNTP、25 mM Tris-HCl (pH 8.3)、50 mM KCl、2 mM DTT、5 mM MgCl2、5 nM AMV RT or 15 nM MMLV RT、 46-64℃ 30分間

5’ 3’

PCR： 95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 60秒、30サイクル

3’ 5’

2％アガロース電気泳動

RNA：インビトロ転写で合成したcesA RNA（Bacillus cereusの毒素合成遺伝子のmRNAの一部、1014 塩基) をモデルRNAとして使用

RNA5’ 3’ 5’

GATGCACGACAATGCCACTAACGCTGTGGCGAGTGTTAAGGTGT

3’

K. Yasukawa et al. (2010) Enz. Microb. Technol. 46, 391-396K. Yasukawa et al (2010) Biosci. Biotechnol. Biochem. in press

23

cDNA合成活性の反応温度依存性

WT

D524A

MM4

44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64

[E]o = 5 nM温度（℃）

MM3とMM4を用いることにより、WTよりも高温でcDNAが合成できた。

MM3

24

従来の高性能MMLV RT

製品名 開発企業

AffinityScript RT Agilent Technologies/Stratagene

SuperScript II RT Life Technologies

SuperScript III RT Life Technologies

25

高性能MMLV RT

耐熱化の方法／忠実化の方法 変異の内容

M5 WTへのランダム変異による耐熱化 E69K/E302R/W313F/L435G/N454K

M6 M5のRNase H活性消失による耐熱化 E69K/E302R/W313F/L435G/N454K/D524N

Mut2 RNase H活性消失による耐熱化 D524G/E562Q/D583N

Mut3 Mut2への変異による忠実化 不明

MM3 正電荷導入による耐熱化 E286R/E302K/L435R

MM4 MM3のRNase H活性消失による耐熱化 E286R/E302K/L435R/D524A

製品名 学術論文*での名称

AffinityScript RT M5, M6

SuperScript II RT Mut2

SuperScript III RT Mut3

*Arezi et al. (2010) Anal. Biochem. 400, 301-303

26

各MMLV RTの比較•耐熱性： MM4 > MM3, M6 > M5

•忠実度： 不明 （WTの読み間違いは30,000回に1回）

•RNA増幅法（RNase H活性が必須）への使用：可： MM3, M5不可： MM4, M6, Mut2, Mut3

0

20

40

60

80

100

120

WT D524A NM4 NM5 MM3 MM4

残存活性（％）

120

0

60

40

100

80

20残存活性（％）

WT D524A MM3 MM4 M5 M6

50℃で15分間熱処理したときの残存活性

TP-

TP+製品名 学術論文での名称

AffinityScript RT M5, M6

SuperScript II RT Mut2

SuperScript III RT Mut3

27

実用化に向けた課題

• MM3、MM4の性能評価• cDNA合成反応の忠実度• cDNA合成反応の至適温度•有機溶媒による阻害•鋳型プライマーとの親和力•生産性•保存安定性

•新たな耐熱性MMLV RTの取得

28

想定される用途・業界

• 酵素メーカー：

耐熱性MMLV RTを生産し販売する。

• 診断薬メーカー：

耐熱性MMLV RTを使用した検査薬を開発・販売する。

企業への期待

•開発： MM3、MM4の性能評価、販売

•共同研究：•新たな耐熱型MMLV RTの取得•他の核酸関連酵素の耐熱化

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本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：変異型逆転写酵素、それをコードす

る核酸、変異型逆転写酵素の製造

方法、核酸関連酵素の熱安定性の

向上方法、逆転写方法、逆転写反

応キットおよび検査キット

• 出願番号 ：特願2010-●●●●• 出願人 ：京都大学

• 発明者 ：保川 清

30

産学連携の経歴

• 2007年-2008年 JSTシーズ発掘試験に採択

お問い合わせ先

関西TLO株式会社

アソシエイト 橋本 和彦

ＴＥＬ ０７５－７５３－９１５０

ＦＡＸ ０７５－７５３－９１６９

e-mail hashimoto@kansai-tlo.co.jp