116

腸管出血性大腸菌O2:K1:H7(VT2+)に よる

溶血 性尿毒症症候群の散発事例

大田原赤十字病院小児科

小林 靖 明 前 山 克 博 志貴 祐 二

大阪府立公衆衛生研究所

塚 本 定 三

国立小児医療研究センター

永井 照 美,Yuan PEINA,中 尾 浩史,竹 田 多 恵

(平成4年9月14日 受付)

(平成4年11月10日 受理)

Key words: E. coli 02 : Kl : H7, hemolytic uremic syndrome,

verotoxin enterohaemorrhagic E. coli

要 旨

1992年2月,栃 木県 に おい て溶血 性尿 毒症 症候群(HUS)患 児(1歳8ヵ 月女児)か ら-ESckerickiacoli

O2:K1:H7が 分離 された.本 大 腸菌 はVerocellに 対 して細胞 毒性 を示 し,PCR法 に よってVT2の み

を産生 してい る こ とが確認 された.本 菌 よ りLPSを 抽 出精 製 し,こ れ に対 す る患者抗 体 をELISAで 調

べ た結 果,抗 体上 昇が観 察 され た.ま た,VT1とVT2に 対す る抗体 も調 べ た結果,VT2の みに 明か な抗

体 上昇 が観 察 され,本 疾患 の原 因菌 で あ った と思 われ た.こ れ まで 国内 で報告 された腸 管 出血 性大腸 菌

(EHEC)の いず れ の血 清 型 に も属 さない新 しい もの と思わ れた.患 児 は下痢 に ひ きつ づ き第15病 日ごろ

よ り典 型的HUSの 症 状 を呈 したが,第40病 日に は軽快 退院 した.

序 文

HUSは 溶血性貧血,血 小板減少,急 性腎不全を

3主 徴 とする疾患で,近 年,治 療法の改善により

死亡率 も数%と 低下 したが,な お,小 児科領域で

は難 治性 の疾 患で あ る.本 疾患 の原 因 として

EHECと の関連が示 されたのは1983年Karmali

らの論文1)が最初であるが,そ の後の調査研究に

よ り2)～12),下痢血便に続発す るHUSと の因果関

係は確実になった.予 想以上に国内 も本菌で汚染

されていることがわかってきた11)12)が,その検出

は尚,特 定の研究所,研 究室レベルでしか行われ

て お らず,本 菌 感 染 症 の実 数 は か な りの 数 に の ぼ

る こ とが 予 想 され る.本 菌 の も う1つ の 診 断 上 の

問題 は,患 者 の便 中 に排 出 され る期 間 が 短 い こ と

で あ る.Milfordら は 第0～3病 日で 約6割,第

11～13病 日で は2割 に しか 検 出で きな い と報 告 し

て い る10).こ れ を 補 うべ く,Chartら は 患 者 血 清 中

のEHEC菌 体 に 対 す る抗 体 を 測 定 す る こ と が 有

用 で あ る こ とを 提 案 した13).我 々 も これ を 追 試 確

認 し,応 用 実 施 して い る12).し か し,EHECに 属

す る大 腸 菌 の0血 清 型 は多 数 あ り11)14),国 内 で 報

告 さ れ た だ け で も0157の 他 に,026,0111,0128,

0143,0145が あ る.さ らに,1991年,都 内 の 集 団

事 例 か らOUT:H19が,1992年1月 に は 埼 玉 で

018:H(-)が,2、 月に はOUT:H(-)が 広

島 で 分 離 され て い る15).血 清 に よ る抗 体 検 査 を 行

別 刷 請 求 先:(〒154)東 京 都 世 田 谷 区 太 子 堂3-35 -31

国立小児病院小児医療研究センター感染

症研究部 竹田 多恵

感染症学雑誌 第67巻 第2号

O2:K1:H7大 腸菌 に よ るHUS症 例 117

う上で も,国内に分布するEHECの 血清型は重要

な情報で ある.今 回われわれが分離 した02:

K1:H7は ヒトからの分離報告 は国内で初めてで

あり,海 外でも稀である.

材料および方法

(1)症 例

1歳8ヵ 月女児.1992年2月20日 か ら下痢が7

日間持続.血 便は認めなかった.3月3日 から眼

瞼浮腫の出現.同6日 近医にて血尿,蛋 白尿も指

摘 され,同 日大田原赤十字病院小児科に紹介入院

となった.自 宅は水道水を使用 しているが,週 に

1日 実家(那 須郡小川町)で 井戸水を飲用 してい

た.入 院前に抗生剤の内服はない.

入院時,体 温38.1℃.軽 度眼瞼浮腫および眼瞼

結膜貧血.i頸部か ら腹部にかけて数個の点状出血.

四肢 の浮 腫 は明瞭 では なかった.検 査 結果 は

Table1に 示 したように,貧 血,血 小板数減少,破

砕赤血球が認め られた.網 状赤血球の増加 とハプ

トグロビンの減少から,溶血性貧血が示唆 された.

BUNとLDHの 高値,尿 蛋白,尿 潜血等か ら腎機

能障害が認め られた.尿 量は入院当日および翌日

で各々187m1,136mlと 乏 尿傾 向が続 き,血 清

Table 1 Laboratory data on admission

*( ): Normal value

BUNは 第3病 日 さ ら に32.2mg/dlと 悪 化 し た

が,過 度 の 輸 液 は避 け,利 尿 剤 の 併 用 で 尿 量 の 増

加 が み られ る よ うに な り腎 機能 は漸 次 改 善 した.

血 小 板 数,ヘ モ グ ロ ビ ン値 も改 善 され,眼 瞼 浮 腫,

点 状 出 血 も入 院 後6日 ま で に 消 失 した.経 過 中 に

け い れ ん な どの 中枢 神 経 症 状 は 認 め な か った.入

院 後5日 間AM-PCの 内 服 を 行 い,他 にdipyr-

idamoleの 内 服 を併 用 した.

入 院 後25日 目に は,ヘ モ グ ロ ビン10.89/dl,血 小

板 数27.6×104/mm3,BUN9.8mg/dl,LDH720

1U/l,尿 タ ソ パ ク(-),尿 潜 血(±)と 改 善 を 認

め,退 院 した.

(2)EHECの 検 索

入 院 時 の便 培 養 か ら得 られ た 大 腸 菌10株 を 用 い

てPCRに よ りVT遺 伝 子 の 検 索 を 行 っ た.PCR

に 用 い たVT用 のprimerお よ びprotocolは 山

崎 ら の方 法18)に 準 じた.

(3)Vero毒 素 の生 物 学 的 性 状 試 験

分 離 した 大 腸 菌 をTryptic Soy Broth(Difco)

で37℃18時 間 振 と う培 養 し,培 養 上 清 と菌 体 抽 出

液(超 音 波 破 砕 に よ り得 た)を 各 々2段 階 希 釈 し,

常 法 に よ り17)Verocellに 作 用 させ た.細 胞 に試 料

を 作 用 させ た 後,5日 間 観 察 して 細 胞 致 死 効 果 を

示 す 試 料 の最 大 希 釈 倍 数 を 求 め た.

(4)大 腸 菌 の 血 清 型 別 お よ び生 化 学 的 性 状

大 腸 菌 の0型 別 は,市 販 の診 断 用 免 疫 血 清(デ

ソ カ生 研)を 用 い て の生 菌 で の ス ラ イ ド凝 集 反 応,

お よび 自家 調 製 した 大 腸 菌 抗0血 清(01～0170)

を用 い て の100℃,60分 加 熱 菌 に よ る試 験 管 内 定 量

凝 集 反 応 に よ り実 施 した.K1抗 原 に つ い て は,抗

K1血 清 に よ る 生 菌 で の ス ラ イ ド凝 集 反 応 お よ び

英 国 のCentral Public Health LaboratoryのB.

Rowe博 士 か ら分 与 さ れ たA～Eの5種 類K1特

異 フ ァー ジに よ る溶 菌 性 の 有 無 で 調 べ た18).H型

別 は 自家 調 製 した 抗H血 清(H1～H56)に よ り,

常 法 に 従 っ て行 った19).生 化 学 的 性 状 はEwing19)

の記 載 に準 じて 実 施 した.

(5)患 者 血 清 中 の 大 腸 菌LPS抗 体 お よ びVT

抗 体 の検 出

大 腸 菌026,0111,0128のLPSは 市 販 品

(Difo)を 用 い た.0143,0145,0157お よび 本 患

平成5年2月20日

118 小林 靖明 他

者 か ら 分 離 し た 大 腸 菌02か ら のLPSはWest-

phal法20)で 調 製 した.こ れ ら7種 のLPSを 固 相

と したELISA21)でIgM classの 抗 体 を調 べ た.

VT抗 体 は 精 製 したVT1お よ びVT2を 固 相 と し

てIgG classの 抗 体 をELISAで 調 べ た12).

成 績

(1)EHECの 検 出

入 院 時(第15病 日)の 患 者 便 よ り分 離 した 大 腸

菌10株 をVTIとVT2に 共 通 のprimerを 用 い て

PCRを 行 った 結 果,1株 の み か ら遺 伝 子 増 幅(0.5

kb)が 認 め られ た(Fig.1a) .こ れ をVT1お よ び

VT2を 各 々識 別 す るprimerで 再 びPCRを 行 っ

た 結 果Fig.1bに 示 す よ うにVT2の み の 遺 伝 子

(0.8kb)が 増 幅 され た.

(2)Vero細 胞 毒 性

VT2遺 伝 子 が 陽 性 で あ った株 の培 養 上 清 と菌 体

抽 出 液 をVero cellに あ て,5日 聞観 察 した 結 果,

両 者 か ら約32倍 希 釈 まで 明 か な 細 胞 致 死 効果 が 観

察 さ れ た.

(3)大 腸 菌 の 血 清 型 別 と生 化 学 的 性 状

分 離 したVT2陽 性 大 腸 菌 は市 販 の 診 断 用 血 清

の いず れ に も凝 集 しな か った た め,自 家 調 製 した

0型 別 用 血 清 を 用 い て調 べ た と ころ,02血 清 に強

く凝 集 した.ま た,H型 別 で はH7と の み 明 瞭 な凝

集 が観 察 さ れ た.さ らに,分 離 菌 ぱ 抗K1血 清 に凝

集 し,か つ,5種 類 のK1特 異 フ ァ ー ジす べ て に溶

菌 した た め,K1抗 原 を 持 っ て い る こ と が 判 明 し

Fig. 1 Detection of 521-bp and 805-bp amplified

products by PCR with primers for VT common

(a), and for VT, or VT2 genes (b), respectively.

M; molecular markers (Haelll-digested

ψX174DNA), VT1; E. coli O157: NM (VT1+

control), VTz; E. coli 0157: H7 (VT2+control),

VT-; E. coli 026 (VT- control), lanel to 5: E.coli strains isolated in this study .

a

b

Table 2 Biochemical characteristics of enterohaemorrhagic E . coli 02

K1: H7

感染症学雑誌 第67巻 第2号

O2:Kl:H7大 腸 菌 に よ るHUS症 例 119

た.こ のことから,分 離菌の血清型はO2:K1:

H7と 決定 した.生 化学的性状はTable 2に 示 し

た.分 離菌は多 くの大腸菌が示す性状 と一致 して

いた.

(4)大 腸-菌LPSお よびVTに 対す る患者血清

中の抗体価

7種 のLPSお よびVT1,VT2を 各々固相 とし

たELISAで 調べた結果,7種 類のLPSの うち分

離菌O2:K1:H7か ら調製 したLPSに 対 しての

み抗体上昇がみ られた.ま たVT抗 体は入院時

(第15病 日)よ りすでにVT2に 対 してのみの抗体

が観察され,VT1抗 体は44病 日でも陰性であった.

考 察

1990年10月 に埼玉県某幼稚園で発生した腸管出

血性大腸菌感 染症集団事例がきっかけとなって,

国内で も本大腸菌に対する関心が高まり,そ の分

離報告 は増加 しつつある.本 大腸菌感染症の報告

はカナダ,ア メ リカ,英 国などの先進国に多 く,

しかも近年,HUS症 例が増加の傾向にある22)23)こ

とからも,本 菌感染症はこうした国で増加傾向に

あると考えられる.し かし,本 菌は重症化をきた

した頃には検出率がきわめて低いことをわれわれ

も経験している.本 症例は下痢の初発がみられて

15日 目にHUSを 発症 した.HUSが 疑われた直後

に便培養を行 ったが,分 離した大腸菌10株 の うち,

1株 のみがPCRでVT陽 性であった.重 症化に

陥った患者か らのEHEC検 出はかな りたんねん

に多 くのコロニーを検索する必要がある.菌 が陰

性で も血清学的抗体検索が診断上有用であること

はChartら13)が 報告している通 りであるが,そ の

ためにも国内に存在す るEHECの0血 清型の種

類を把握 しておくことは必須である.1991年 の1

年間に国内で分離 され,予 研病原微生物検出情報

誌に掲載されたEHECは86件 にのぼるが,そ の0

血清型の うちわけは0157が 約65%,次 いで0111,

026,0128が それぞれ26%,2%,2%の 頻度で

検 出されている.こ の4種 のLPS抗 体を調べる

だけで も9割 以上はカバーできることになるが,

尚不完全である.今 回分離 したEHECも 国内の分

離例 と して は初 め ての02:K1:H7血 清 型 で

あった.O2:H7のEHECは ウシからの分離報告

は あ る が11)患 者 分 離 株 と し て はKarmaliが 総

説14)に わ ず か に 記 載 し て い る もの の,海 外 で も稀

で あ る.な お,今 回 分 離 したO2:K1:O7 EHEC

は そ のVT産 生 性 が きわ め て 不 安 定 で,2代 継 代

培 養 に よ って7株 中5株 が 陰 性 化 し た.Levine

ら5)がHUS患 者 か ら分 離 した 大 腸 菌 の 中 に02:

K1:H7が あ った と記 載 し て い る が,EHEC用 の

DNA probeで は陰 性 で あ った と述 べ て い る.本

大 腸 菌 に お け るVT遺 伝 子 の 不 安 定 性 に よ る の

か も しれ な い.

文 献

1) Karmali, M. A., Steele, B. T., Petric, M. and

Lim, C.: Sporadic cases of hemolytic uremic

syndrome associated with fecal cytotoxin and

cytotoxin-producing Escherichia coli. Lancet, i:

619-620, 1983.

2) Karmali, M. A., Petric, M. & Lim, C.; The

association between idiopathic hemolytic

uremic syndrome and infection by verotoxin-

producing Escherichia coli. J. Infect. Dis., 151:

775-782, 1985.

3) Neill, M. A., Agosti, J. & Rosen, H.: Hemorr-

hagic colitis with Escherichia coli 0157: H7

preceding adult hemolytic uremic syndrome.

Arch. Intern. Med., 145: 2215-2217, 1985.

4) Gransden, W. R., SusanDamm, M. A., Anderson,

J. D., Carter, J. E.& Lior, H.: Further evidence

associating hemolytic uremic syndrome with

infection by Verotoxin-producing Escherichia

coli 0157: H7. J. Infect. Dis., 154: 522-524,

1986.

5) Levine, M. M., Xu, J., Kaper, J. B., Lior, H.,

Prado, V., Tall, B., Nataro, J., Karch, H. &

Wachsmuth, K.: A DNA probe to identify

enterohemorrhagic Escherichia coli of 0157: H7

and other serotypes that cause hemorrhagic

colitis and hemolytic uremic syndrome. J.

Infect. Dis., 156: 175-182, 1987.

6) Scotland, S. M., Rowe, B., Smith, H. R., Will-

shaw, G. A. & Gross, R. J.: Vero cytotoxin-

producing strains of Escherichia coli from chil-

dren with haemolytic uraemic syndrome and

their detectin by specific DNA probes. J. Med.

Microbiol., 25: 237-243, 1988.

7) Pai, C. H., Ahmed, N., Lior, H., et al.:

Epidemiology of sporadic diarrhea due to

verocytotoxin-producing Escherichia coli: A

two-year perspective study. J. Infect. Dis., 157:

1054-1057, 1988.

平成5年2月20日

120 小林 靖明 他

8) Ostroff, S. M., Kobayashi, J. M. & Lewis, J. H.:Infections with Escherichia coli 0157: H7 in

Washington state. J. A. M. A., 262: 355-359,1989.

9) Kleanthous, H., Smith, H. R., Scotland, S. M.,Gross, B. R., Taylor, C. M. & Milford, D. V.:Haemolytic uraemic syndromes in British Isles,1985-1988: Association with verocytotoxin

producing Escherichia coli. Part 2: Mi-crobiological aspects. Arch. Dis. Child., 65: 722-727

, 1990.

10) Milford, D. V., Taylor, C. M., Guttridge, B., Hall,

S. M., Rowe, B. & Kleanthous, H.:

Haemolytic uraemic syndromes in the British

Isles 1985-8: Association with verocytotoxin

producing Escherichia coli. Part 1: Clinical and

epidemiological aspects. Arch. Dis. Child., 65:

716-721, 1990.

11) 伊 藤 武, 甲斐 明 美: Vero細 胞 毒 素 産 生 性 大 腸

菌 の細 菌 学 的特 徴 と感 染症. メデ ィヤサ ー クル,

36: 149-161, 1991.

12) 竹 田 多恵, 他: 溶 血 性 尿毒 症 症 候群 (HUS) と腸

管 出血 性 大 腸 菌 (EHEC) の関 連 性 に関 す る血清 学

的 検 討. 小 児 感染 免 疫, 4: 11-14, 1992.

13) Chart, H., Smith, H. R., Scotland, S. M., et al.:Serological identification of Escherichia coli

0157: H7 infection in haemolytic uraemic syn-drome. Lancet, i: 138-140, 1991.

14) Karmali, M. A.: Infection by verocytotoxin-

producing Escherichia coli. Clin. Microbiol.Rev., 2: 15-38, 1989.

15) 病原微生物検 出情報 月報. 国立予研発行

16) 山崎伸二, 白井宏政, 西渕光昭, 竹 田美文: Vero

毒 素 産 生 性大 腸 菌 のPCR (DNA増 幅) 法 に よ る

迅 速 診 断. 日本 細 菌学 誌, 46: 280, 1991.

17) Yutsudo, T., Nakabayashi, N., Hirayama, T. &Takeda, Y.: Purification and some properties

of a Vero toxin from Escherichia coli 0157: H7that is immunologically unrelated to Shigatoxin. Microb. Pathog., 2: 21-30, 1987.

18) Gross, R. J., Cheasty, T. & Rowe, B.: Isolation

of bacteriophages specific for the K1 polysac-charide antigen of Eschericia coll. J. Clin.

Micribiol., 6: 548-550, 1977.19) Ewing, W. H.: Edwards and Ewing's

identification of Enterobacteriaceae, 4th Ed.,

Elsevier Science Publishing Co., New York,1986.

20) Westphal, 0. & Jann, K.: Bacterial

lipopolysaccharide: Extraction with phenol,water and further applications of the proce-

dure. Meth. Carbohydr. Chem., 5: 83-91, 1965.21) 中尾 浩 史, 永 井 照美, 竹 田 多恵, 五 十嵐 隆, 山 中

龍 宏, 小林 登: LPS-ELISAに よ るE. coli 0157

感 染 症 の血 清 診 断 の試 み. 日本 細 菌 学誌, 47: 276,

1992.

22) Tarr, P. I. & Hickman, R. O.: Hemolyticuremic syndrome epidemiology : A population-based study in Kingcounty, Washington, 1971

to 1980. Pediatr., 80: 41-45, 1987.23) Martin, D. L., MacDonald, K. L., White, K. E.,

Soler, J. T. & Osterholm, M. T.: Theepidemiology and clinical aspects of the

hemolytic uremic syndrome in Minnesota. N.Engl. J. Med., 323: 1161-1167, 1990.

感染症学雑誌 第67巻 第2号

O2:K1:H7大 腸 菌 に よるHUS症 例 121

Sporadic Case of Hemolytic Uremic Syndrome Associated with Verotoxin

Producing Escherichia coli 02:K1:H7

Yasuaki KOBAYASHI, Katsuhiro MAEYAMA & Yuji SHIKIDepartment of Pediatrics, Ootawara Red Cross Hospital

Teizo TSUKAMOTOOsaka Prefectural Institute of Public Health

Terumi NAGAI, Yuan PEINA, Hiroshi NAKAO & Tae TAKEDADepartment of Infectious Diseases Research, National Children's Medical Research Center

Cases of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are being increasingly reported in Japan.Bacteriological isolation of EHEC has been a constant problem because the organism is shed for a shortduration after onset on illness and generally during the prodromal stages. In order to ease thediagnosis of EHEC infections in this country, we have developed a LPS-based solid phase enzymelinked immunosorbent assay for serological diagnosis of the infection. Adequate knowledge on theprevalence of EHEC serogroups in Japan is mandatory for the success of such a diagnostic test. 0157 iscurrently the prominent serogroup associated with EHEC infections in Japan followed by 0111, 026and 0128 in that order of prevalence.

In February 1992, a 1 year-old infant developed hemolytic uremic syndrome (HUS) 15 days laterthe prodrome of watery diarrhoea. Stool sample obtained on day 15 was cultured for detection ofEHEC. Ten colonies of E. coli picked from MacConkey agar plate were examined by the polymerasechain reaction (PCR) using primers specific for both verotoxins (VT1 and VT2). Of the 10 colonies, onlyone was positive for the VT2 gene. The strain was confirmed to be cytotoxic on cultured Vero cells.The strain agglutinated with antisera of E. coli 02, Ki and with 117 serogroups. As of date, none ofsuch strains of 02:K1:H7 EHEC has been reported in Japan. The patient's sera was found to be

positive for antibodies against LPS from the homologous isolate as well as against VT2. The patientrecovered uneventfully from HUS 40 days after the onset of the disease and was discharged from thehospital.

平成5年2月20日