XXI Ciclo di dottorato
Medicina materno infantile, pediatria dello sviluppo e dell’educazione, perinatologia
Ruolo del glutine nella risposta autoanticorpale mucosale:
celiachia e cardiomiopatia dilatativa
Dottoranda: Quaglia Sara
La cardiomiopatia dilatativa
L’indicazione principale per il trapianto di cuore
Eziologia
40%
20%
10%
30%
Idiopatica
Fattori genetici o famigliari
Sostanze cardiotossiche
Autoimmune
Celiachia e autoimmunità
5,1
10,5
16,7
27
34
0
10
20
30
40
<2 2-4 4-12 12-20 >20
Prevalence (%) of autoimmune disorders in coeliacs by age at diagnosis
Celiachia e cardiomiopatia
Cardiomyopathy Associated With Celiac DiseaseNisheeth K, Robert D. Patrik S.Mayo Clin Proc. 2005;80(5):674-676
Idiopathic dilated cardiomyopathy associated
with coeliac disease: the effect of a gluten-free diet
on cardiac performanceM. Curione, M. Barbato, F. Viola, P. Francial, L. De Biase, S. Cucchiara
DlGEST LIVER DIS 2002;34:866-69
Prevalence of coeliac disease in idiopathic dilated cardiomyopathy
M Curione, M Barbato et.al
Lancet 1999; 354:222-3
Costruzione librerie anticorpali totali da mucosa intestinale
Due soggetti con cardiomiopatia dilatativa e celiachia
Biopsia RNA cDNA
Amplificazioni VH, Vk, Vλ
Paz 1 Paz 2
~400bp
VKVH Vλ VKVH Vλ
BsshII
XhoINheI
linker
VH VL
Assemblaggio
scFv
Clonaggio
Trasformazione
Vettore fagmidicopDAN5
GeneIIIVLVH
bla
DH5αF’
Titolo librerie 106
~800bp
~800bp
Controllo colonie trasformate
Cloni stabili e NON deleti
VH+VK Paz 1 VH+Vλ Paz 1 VH+VK Paz 2 VH+Vλ Paz 2
Finger
Buona diversità
Libreria anticorpale
DH5αF’
Fago helper
Infezione
Selezioni su antigeni
Table 1. Autoantigens of cardiac autoantibodies in patientswith DCM
Sarcolemmal proteinsMyosinActinTropomyosinTroponin IMitochondrial proteinsAdenine nucleotide carrierNicotinamide-adenine dinucleotide dehydrogenaseUbiquinol–cytochrome-c reductaseLipoamide dehydrogenasePyruvate dehydrogenaseFlavinylated proteinHeat-shock proteinsHsp70Hsp60Hsc70Membrane receptorsb1-AdrenoceptorMuscarinic receptorTroponin I
Okazaki et al. TRENDS in Molecular Medicine
Auto-antigeni candidati:
•Cuore specifici(proteine del sarcolemma,miosina…)
•Proteine mitocondriali
•Heat shock proteins
•Recettori di membrana(recettore β1-adrenergico,recettore muscarinico…)
Autoimmunità nella cardiomiopatia dilatativa
Libreria anticorpale
DH5αF’
Fago helper
Infezione
Selezioni su antigeni
Miosina
Recettore adrenergico β1
Purificazione DNA plasmidico
Eco RI Hind III
Digestione e purificazione da gel
di agarosio
mRNA
Retro-trascrizione
cDNA
ECII loop del β1-AR
Purificazione
Amplificazione
Ligazione
Trasformazione batterica
2h 3h 4h O/NNI
≈52 Kd
1 2 3 4
≈ 52 Kd
Purificazione proteicaMBP- dominio IIEC
Passaggio lisato cellulare
Impaccamento della resina
Eluizione del II dominio
Dialisi
Concentrazione
Quantificazione proteica
Abbiamo deciso di comprarlo come peptide di sintesi
Ci siamo rivolti a due ditte:
• La prima dopo mesi di tentativi ha rinunciato
• La seconda ha riscontrato problemi ma continua a provare
PROBLEMI CON LA PRODUZIONE DEL RECETTORE
Poco prodotto
Non ben purificato
Noi aspettiamo fiduciosi
Selezione su miosina
Libreria Paz.1 Cloni positivi trovati 34/90
Libreria Paz.2 Cloni positivi trovati 30/90
Libreria Ctrl.- Cloni positivi trovati 7/90
Selezionate: Da selezionare
Libreria di soggetto celiaco senza cardiomiopatia
Miosina muscolare di coniglio e miosina cardiaca porcina
Prova di selezione di una libreria di paziente su miosina cardiaca porcina
Risultato:
87 cloni positivi su 90
Problema laboratoristico? Iperamplificati o favoriti alcuni cloni?
L’antigene non è pulito e crea problemi di legami aspecifici?
Riflessioni
Omologia con la miosina umana:
Miosina muscolare di coniglio vs miosina muscolare umana : omologia 95%
MIosina muscolare di coniglio vs miosina cardiaca umana : omologia 81%
Miosina cardiaca porcina
vs
miosina cardiaca umana
omologia 95%
Selezione su antigeni di controllo
Abbiamo deciso di provare a selezionare la libreria dei nostri pazienti su antigeni di
controllo positivi e negativi .
Antigene controllo positivo tTg
Antigene controllo negativo BSA
Selezione su tTg
Libreria paz 1 39/90
Libreria paz 2 37/90
Selezione su BSA
Libreria paz 2 0/90
Ruolo del glutine nella risposta mucosale
Uno dei due pazienti si è sottoposto ad una II biopsia dopo un anno di dieta senza glutine
Costruzione della libreria totale IgA
Selezione di questa sugli antigeni già utilizzati