Download - Uji Kualitatif Dna
1
METODE UJI KUALITATIF DNA DENGAN ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
Oleh:
GATI WINDIASTIKA, SP. MP (Calon Pengawas Benih Tanaman)
Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya
Pengujian DNA tanaman merupakan suatu teknik biologi molekular
yang digunakan untuk kepentingan pengujian terhadap materi uji
berdasarkan profil DNA-nya. Pengujian DNA memanfaatkan profil DNA, yaitu
sekumpulan data yang menggambarkan susunan DNA yang dianggap khas
untuk individu yang menjadi sampel. Dalam pengujian DNA, hanya sebagian
kecil berkas DNA yang dipakai untuk pengujian. Sasaran utamanya adalah
bagian DNA yang berisi pengulangan urutan basa. Pengujian DNA yang
meliputi analisis secara kuantitatif dan kualitatif, merupakan tahap lanjutan
pengujian yang harus dilakukan setelah diperoleh isolasi DNA tanaman. Hal
ini dilakukan untuk menentukan kemurnian suatu galur atau kultivar serta
untuk menguji masuknya materi genetik tertentu (misalnya dalam mendeteksi
materi transgenik) ke dalam populasi.
Uji kualitatif DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis dari hasil
isolasi DNA. Metode elektroforesis merupakan teknik yang dapat digunakan
untuk menggambarkan pergerakan molekul-molekul bermuatan dalam medan
listrik ke arah elektroda dengan muatan berlawanan atau teknik yang
didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga di
bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan dalam
elektroforesis adalah gel agarosa, suatu polisakarida yang diekstraksi dari
berbagai jenis ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu melakukan
separasi DNA dengan kisaran ukuran yang luas. Elektroforesis gel agarosa
digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari
100 basepairs dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis
poliakrilamid dapat memisahkan 1 basepairs dan dijalankan secara vertikal.
Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan
2
DNA (sekuensing). Berikut ini perbedaan antara elektroforesis gel agarosa
dengan poliakrilamid:
Tabel 1. Perbedaan Elektroforesis Gel Agarosa dan Poliakrilamid
ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA ELEKTROFORESIS GEL
POLIAKRILAMID
1. Dapat memisahkan fragmen
DNA antara 100bp – 50kb
tergantung dari konsentrasi gel
agarose yang digunakan
2. Power lebih rendah
3. Medan gerak biasanya horisontal
4. Mempunyai laju pemisahan lebih
cepat
1. Lebih effektif untuk pemisahan
fragmen DNA antara 5-500bp
2. Power ekstrim tinggi
3. Medan gerak secara vertikal dan
listriknya konstan
4. Ukuran perbedaan DNA yang
terpisah sampai 1bp
5. Pembuatannya lebih sulit
dibanding gel agarose, karena
biasanya digunakan poliakrilamid
dengan resolusi yang tinggi.
A. CARA KERJA ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-
sumur pada gel agarosa dan diletakkan pada kutub negatif. Apabila dialiri
arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan
bergerak ke kutub positif. Gel agarosa dengan tebal 0,5 cm akan memaksa
DNA dengan ukuran 5 sampai 60 kb bergerak melewati celah kerangka
agarosa yang membentuk pori-pori dengan ukuran tertentu sesuai dengan
konsentrasi agarosa. Laju migrasi atau kecepatan pergerakan DNA dalam
medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA, tergantung dari
muatan dan berat molekul DNA.
Sebelum dilakukan elektroforesis, sampel perlu ditambahkan larutan
pemberat (loading buffer) yang terdiri dari polietilenglikol atau gliserin,
bromfenol biru dan aquades. Penambahan gliserin ini akan menaikkan
densitas sampel sehingga akan masuk ke dalam sumuran gel agarosa
dengan baik. Sedangkan bromfenol biru merupakan pewarna yang dapat
digunakan untuk mengidentifikasi jalannya sampel pada gel agarosa.
Setelah proses elektroforesis selesai, selanjutnya dilakukan proses
pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat.
Penambahan Etidhium Bromida (EtBr) pada proses visualisasi akan mengikat
DNA sehingga migrasi DNA dapat terdeteksi jika dikenai sinar ultraviolet.
3
Larutan EtBr akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita
fragmen DNA akan terlihat di bawah lampu ultraviolet. Larutan EtBr ini
digunakan sebagai alat untuk mengidentifikasi dan mengukur semi-kualitatif
fragmen DNA yang terseparasi dalam gel. Selain itu larutan EtBr akan terikat
diantara dua untai ganda DNA dan berinteraksi diantara basa molekul DNA,
sehingga menyebabkan pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar kuning
jingga bila disinari ultraviolet pada panjang gelombang yang pendek karena
pewarna ini mengandung zat fluoresence.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel agarosa
akan tampak setelah proses pewarnaan. Satu lajur merupakan arah
pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita yang berjarak sama dari sumur gel
pada akhir elektroforesis mengandung molekul yang bergerak di dalam gel
selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti
bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda
(marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda
dapat digunakan untuk menentukan panjang amplikon atau ukuran molekul
dalam pita sampel dengan mengelektroforesis marka tersebut pada lajur di
gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat
dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya.
B. FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KECEPATAN MIGRASI DNA
Kecepatan migrasi selama DNA bergerak menembus gel agarosa
dipengaruhi oleh beberapa faktor utama, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding
yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan
fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya, misal DNA linier lebih
cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel
adalah berbanding terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan
basa-basa.
2. Konsentrasi Gel Agarosa
Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan bergerak sesuai
dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan.
4
Tabel 2. Konsentrasi Gel Agarosa dan Ukuran Molekul DNA
No Konsentrasi Gel Agarose (%) Effisiensi Range Pemisahan
Pada DNA Linier (kb)
1 0,3 60 – 5
2 0,6 20 – 1
3 0,7 10 – 0,8
4 0,9 7 – 0,5
5 1,2 6 – 0,4
6 1,5 4 – 0,2
7 2,0 3 – 0,1
3. Konformasi DNA
Laju migrasi juga tergantung pada bentuk atau konformasi DNA, kita tahu
bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular, circular-
opened dan linier. Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang
sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju
migrasi ini karena:
a. konsentrasi gel agarosa
b. kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan
c. densitas kembaran superheliks pada bentuk super-helix circular
d. pada beberapa kondisi bentuk super-helix circular lebih cepat
dibanding bentuk linier
e. tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat,
maka pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat
tajam, contoh untuk bentuk super-helix circular
f. konsentrasi EtBr kritis antara 0,1mg/ml-0,5ml/mg
4. Penggunaan Voltage dan Arah Dari Bidang Elektris
Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional.
Idealnya untuk DNA ± 2kb pada gel agarosa bergerak ± 5v/cm. Arah dari
bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang
sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA
akan berubah juga.
5. Komposisi Basa DNA atau Temperatur
Elektroforesis DNA pada gel agarosa tidak dipengarui oleh komposisi
basa DNA maupun oleh suhu kamar saat gel dijalankan. Sehingga dalam
gel agarosa mobilitas elektroforesis fragmen DNA dengan berbagai
ukuran tidak berubah antara 4oC dan 30oC. Pada umumnya gel agarosa
dijalankan pada temperatur kamar. Namun gel yang mengandung
5
agarosa kurang dari 1,5% adalah sangat lunak, sehingga paling baik bila
dijalankan pada 4oC supaya gel cukup keras.
6. Keberadaan Pewarna DNA
Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence
untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela
pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai
15%. Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan
cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan
untuk mendeteksi single atau double-stranded asam nukleat (DNA atau
RNA). PERHATIAN! EtBr ini powerful mutagen, sehingga pengguna
harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja dan lindungi mata
dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.
7. Komposisi Buffer Elektroforesis
Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang
digunakan untuk pembuatan gel agarosa, misal:
a. Tris-acetate: umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling
rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa baik
elektroelusi maupun gel ekstraksi.
b. Tris-borat: resolusi cukup baik, tetapi untuk mengisolasi kembali DNA
dari agarosa kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarosa.
C. PROSEDUR ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
Elektroforesis dengan gel agarosa merupakan metode standar untuk
memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul
DNA. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan pemisahan
fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya dengan menggunakan arus
listrik. Prosedur elektroforesis dengan gel agarosa ialah sebagai berikut:
1. Siapkan gel agarosa 0,8 – 1 %. Misal untuk gel agarosa 1 % pada
cetakan ukuran besar, maka bubuk agarosa ditimbang sebanyak 0,7
gram kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer (Gambar 1).
2. Selanjutnya dilarutkan dengan TAE buffer sebanyak 70 ml (Gambar 2).
6
Gambar 1. Bubuk Agarosa Dimasukkan
Dalam Erlenmeyer
Gambar 2. Penambahan Larutan
Buffer TAE
Gambar 3. Erlenmeyer Ditutup dengan
Plastik Wrapping
Gambar 4. Erlenmeyer Dipanaskan
Dalam Microwave
3. Erlenmeyer ditutup dengan plastik wrapping dan diberi lubang kemudian
dipanaskan dalam microwave hingga agarosa larut (Gambar 3 dan 4).
4. Setelah agarosa larut yang ditandai dengan larutan berubah menjadi
bening, dinginkan selama 1-2 menit hingga temperatur hangat-hangat
kuku atau sekitar 80oC.
5. Kemudian larutan agarosa dituangkan dalam cetakan yang telah diatur
keseimbangan posisinya dan telah dipasang sisirnya. Tuangkan dari
sebelah pojok kanan bawah dan dibiarkan memadat selama 30-45 menit
pada suhu ruang (250C) (Gambar 5).
6. Apabila gel telah mengeras, sisir diambil kemudian gel dan cetakannya
dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis dan dituang TAE buffer
sampai gel terendam, sekitar 1 mm di atas gel (Gambar 6).
7. Sampel yang akan dielektroforesis dicampur loading buffer dengan
komposisi 2 μl DNA dan 1 μl loading buffer. Semuanya dicampur dengan
pipet mikro kemudian diinjeksikan ke dalam sumur pada gel agarosa
(Gambar 7).
7
Gambar 5. Larutan Agarosa Dituangkan
Dalam Cetakan
Gambar 6. Gel dan Cetakan
Dimasukkan Ke Dalam Chamber
Gambar 7. Sampel Dimasukkan Pada
Masing-Masing Sumuran
Gambar 8. Proses Running Gel
Agarosa
Gambar 9. Perendaman Gel Agarosa
Pada Larutan TAE yang Telah Ditambahkan EtBr
Gambar 10. Proses Dokumentasi
Pada Chemidoc Gel Imaging
8. Hubungkan elektroda dengan power supply yang dialiri arus listrik 50 Volt
hingga proses running selesai (sekitar 60 menit) atau mencapai sekitar
1,5 cm dari batas bawah gel agarosa (Gambar 8).
9. Setelah selesai, matikan dan ambil gel. Kemudian rendam gel agarosa
sekitar 15-20 menit pada larutan TAE yang telah ditambahkan 5 µl EtBr 1
mg/ml (Gambar 9).
8
10. Pindahkan gel agarosa ke UV-translluminator dan amati hasilnya.
Selanjutnya hasil didokumentasikan dengan menggunakan Chemidoc
Gel Imaging (Gambar 10).
Elektroforesis gel agarosa juga dapat digunakan untuk mengamati hasil
PCR DNA. Perbandingan komposisi yang digunakan antara loading buffer
dan sampel adalah 1 : 5. Marker yang digunakan memiliki ukuran 1 kb
sebanyak 1 μl.
DAFTAR PUSTAKA
Brown, T. A. 2003. Pengantar Kloning Gen, diterjemahkan oleh Prasena.
Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta. p.11-15. Haryana. 1989. Petunjuk Laboratorium Rekayasa Genetika. UGM Press.
Yogyakarta. Natow. 2010. Isolasi DNA. Available on http://miraclebiology.blogspot. com.
Diakses tanggal 27 Maret 2012. Mahmuddin. 2010. Elektroforesis Gel Agarosa. Available on http://
mahmuddin.wordpress.com/2010/08/31/elektroforesis-gel-agarosa. Diakses tanggal 27 Maret 2012.
Puspalarasti. 2011. Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitas. Available on http://puspalarasati.wordpress.com/author/puspalarasati.Diakses tanggal 27 Maret 2012.
Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA. 1 : 112-113.
Wongsosupantio. 1992. Elektroforesis Gel Protein. Pusat Antar Universitas. UGM. Yogyakarta. p.1-4, 12-13.